Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Preparacja, tomografia komputerowa i analizy morfometryczne baculum

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55342

⸱

19 marca 2017

 ,  , 
1Molecular and Computational Biology, University of Southern California (USC), 2Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

Wiele struktur biologicznych nie ma łatwo definiowalnych punktów orientacyjnych, co utrudnia zastosowanie nowoczesnych metod morfometrycznych. Tutaj ilustrujemy metody badania baculum myszy (kości w penisie), w tym sekcję i skanowanie mikrotomografią komputerową, a następnie metody obliczeniowe do definiowania półpunktów orientacyjnych, które są używane do ilościowego określania zmienności rozmiaru i kształtu.

Streszczenie

Nowoczesna morfometria dostarcza potężnych metod do ilościowego określania zmienności rozmiaru i kształtu. Podstawowym wymaganiem jest lista współrzędnych, które definiują punkty orientacyjne; Jednak takie współrzędne muszą reprezentować struktury homologiczne w różnych próbkach. Podczas gdy wiele obiektów biologicznych składa się z łatwych do zidentyfikowania punktów orientacyjnych, aby spełnić założenie o homologii, wielu z nich brakuje takich struktur. Jednym z potencjalnych rozwiązań jest matematyczne umieszczenie na obiekcie półpunktów orientacyjnych, które reprezentują ten sam region morfologiczny we wszystkich próbkach. W tym miejscu ilustrujemy niedawno opracowany potok do matematycznego definiowania półpunktów orientacyjnych z baculum myszy (kości penisa). Nasze metody powinny mieć zastosowanie do szerokiego zakresu obiektów.

Wprowadzenie

Dziedzina morfometrii obejmuje różnorodność metod ilościowego określania wielkości i kształtu formy biologicznej, co jest fundamentalnym krokiem w badaniach naukowych1,2,3,4,5,6. Tradycyjnie, analiza statystyczna rozmiaru i kształtu rozpoczyna się od zidentyfikowania punktów orientacyjnych w strukturze biologicznej, a następnie pomiaru odległości liniowych, kątów i stosunków, które można analizować w ramach wielowymiarowych. Morfometria geometryczna oparta na punktach orientacyjnych to podejście, które zachowuje przestrzenne położenie punktów orientacyjnych, zachowując informacje geometryczne z gromadzenia danych poprzez analizę i wizualizację5. Uogólniona analiza prokrustowa (GPA) może być zastosowana do usunięcia różnic w lokalizacji, skali i obrocie punktów orientacyjnych, aby uzyskać wyrównanie między próbkami, które minimalizuje ich kwadratowe różnice - to, co pozostaje, to odmienność kształtu7.

Ważnym pojęciem każdej analizy morfometrycznej jest homologia, czyli idea, że można wiarygodnie zidentyfikować punkty orientacyjne reprezentujące biologicznie znaczące i dyskretne cechy, które odpowiadają między próbkami lub strukturami. Na przykład ludzkie czaszki mają wyrostki homologiczne, otwory, szwy i przewody, które mogą umożliwić analizy morfometryczne. Niestety, identyfikacja odpowiadających im punktów orientacyjnych jest trudna w przypadku wielu struktur biologicznych, zwłaszcza tych o gładkich powierzchniach lub krzywych8,9,10.

Podchodzimy do tego problemu poniżej, używając geometrii obliczeniowej. Ogólny przepływ pracy polega na wygenerowaniu trójwymiarowego skanu obiektu, który można przedstawić jako chmurę punktów, a następnie obróceniu i przekształceniu tej chmury punktów tak, aby wszystkie próbki były zorientowane we wspólnym układzie współrzędnych. Następnie matematycznie definiujemy półpunkty orientacyjne z konkretnych regionów obiektu. Dyskretne półpunkty orientacyjne umieszczone w takich regionach są biologicznie arbitralne11. Przeprowadzanie GPA i późniejszych analiz statystycznych może prowadzić do powstania niepożądanych artefaktów8,12, ponieważ arbitralnie rozmieszczone punkty orientacyjne mogą nie być biologicznie homologiczne. Dlatego pozwalamy tym pół-punktom orientacyjnym matematycznie się "ślizgać". Ta procedura minimalizuje różnicę potencjałów między konstrukcjami. Jak argumentowano w innym miejscu, zastosowany tutaj algorytm przesuwania jest odpowiedni do ilościowego określania podobnych obszarów anatomicznych, w których brakuje łatwych do zidentyfikowania odpowiednich punktów orientacyjnych3,6,8,10,11,12. Te metody mają swoje ograniczenia13, ale powinny być przystosowane do obiektów o różnych rozmiarach i kształtach.

Tutaj ilustrujemy, jak ta metoda została zastosowana w niedawnym badaniu myszy baculum14, kości w penisie, która została zdobyta i utracona wiele niezależnych razy podczas ewolucji ssaków15. Omawiamy sekcję i przygotowanie określonej kości, baculum (Protokół 1), generowanie obrazów mikroCT (Protokół 2) oraz konwersję tych obrazów do formatu, który umożliwia całą dalszą geometrię obliczeniową (Protokoły 3 i 4). Po tych krokach każdy okaz jest reprezentowany przez ~100K współrzędnych x-y-z. Następnie przechodzimy przez serię transformacji, które skutecznie wyrównują wszystkie próbki do wspólnej orientacji (Protokół 5), a następnie definiujemy półpunkty orientacyjne z wyrównanych próbek (Protokół 6). Protokoły 1-4 powinny być podobne niezależnie od analizowanego obiektu. Protokoły 5 i 6 zostały zaprojektowane specjalnie dla baculum, ale mamy nadzieję, że poprzez wyszczególnienie tych kroków, badacze będą w stanie wyobrazić sobie modyfikacje, które byłyby istotne dla ich obiektu zainteresowania. Na przykład, modyfikacje tych metod zostały zastosowane do badania kości miednicy i żeber wielorybów16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury i personel zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Kalifornii (IACUC), protokół #11394.

1. Sekcja i przygotowanie baculum

  1. Poddaj eutanazji dojrzałego płciowo samca myszy poprzez nadmierną ekspozycję na dwutlenek węgla, zgodnie z protokołami określonymi przez odpowiedni Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC).
  2. Połóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i wysuń penisa, wywierając nacisk kciukami bocznie do otworu napletka.
  3. Gdy penis jest przedłużony, rozciągnij tkankę przez napletek tak daleko, jak to możliwe.
  4. Nożyczkami przetnij ciało prącia prącia proksymalnie do żołędzi prącia, w którym znajduje się baculum.
  5. Przenieś wypreparowanego penisa do probówki o pojemności 1,7 ml i dodaj 200 μl wody z kranu. Upewnij się, że penis jest całkowicie zanurzony w płynie.
  6. Inkubować tkankę w wodzie o temperaturze ~50 °C przez 3-5 dni.
  7. Po prawidłowej inkubacji należy usunąć otaczającą tkankę z baculum za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym. Delikatnie spryskaj 70% etanolem, aby odepchnąć pozostałą tkankę i oczyścić kość.
  8. Umieść wypreparowaną baculum w nowej probówce do mikrowirówki z otwartą nakrętką. Pozostaw nakrętkę otwartą O/N, aby wysuszyć kość.

2. Skanowanie mikrotomografią komputerową

  1. Wciśnij cylindryczny uchwyt do skanowania mikrotomografii komputerowej w cegiełkę pianki florystycznej, aby utworzyć cylinder z pianki florystycznej.
  2. Wyjmij cylinder pianki florystycznej i pokrój plastry o grubości ~2-5 cm.
  3. Wepchnij wysuszoną baculę do pianki florystycznej, na obrzeżach pojedynczego plasterka, aby zminimalizować zakłócenia podczas skanowania. W protokole 4 należy zwrócić uwagę na dokładne ułożenie kości, co pozwoli na właściwą identyfikację poszczególnych okazów.
  4. Delikatnie umieść plaster z osadzonymi kośćmi w uchwycie mikrotomografii komputerowej.
  5. Uzyskaj skany mikrotomografii komputerowej. W przypadku mysiego bacula14 użyliśmy skanera uCT50 (Scanco Medical AG, Bruttisellen, Szwajcaria) w Centrum Obrazowania Molekularnego USC przy następujących ustawieniach: 90 kVp, 155 μA, filtr Al 0,5 mm, 750 projekcji na 180 (pokrycie 360), czas naświetlania 500 ms i rozmiar woksela 15,5 mm.

3. Przetwarzanie MicroCT: Konwersja pliku . Stos DCM do pojedynczego pliku .xyz

UWAGA: Każdy skan mikrotomografu komputerowego wytwarza stos . DCM lub "dicom", pliki reprezentujące wycinki obrazu wykonane przez obiekt. Cała dalsza geometria obliczeniowa wymaga płaskich plików .xyz, które są po prostu plikiem tekstowym zawierającym cztery kolumny – współrzędne x, y i z każdego piksela oraz intensywność piksela w zakresie od -5 000 () do +5 000 (biały). Próg pikseli powyżej 3 000 zazwyczaj dobrze sprawdza się jako próg do definiowania kości.

  1. Zainstaluj język Python (www.python.org) i moduły PYTHON COMMANDS, DICOM, PYLAB, SYS i NUMPY.
  2. Otwórz "01_process_dicom.py"{Figshare} za pomocą dowolnego edytora tekstu. W sekcji Zmienne zmień odpowiednio ścieżkę, progi pikseli i nazwy katalogów.
  3. Uruchom "python 01_process_dicom.py". Postęp zostanie wydrukowany na ekranie. W każdym katalogu wymienionym w kroku 3.2 tworzony jest nowy plik o nazwie; Na przykład directory_name. PT3000.xyz, gdzie PT3000 wskazuje próg pikseli wskazany w kroku 3.2.

4. Przetwarzanie mikrotomografii komputerowej: Segmentacja indywidualnych próbek .xyz Pliki .xyz

  1. Zainstaluj język R (https://www.r-project.org/) z biblioteką RGL.
  2. Otwórz plik '02_segment_dicoms.r'{Figshare} za pomocą dowolnego edytora tekstu. W sekcji Zmienne zmień nazwę ścieżki tak, aby wskazywała plik .xyz utworzony w protokole 3 powyżej.
  3. Z poziomu R uruchom polecenie "source('02_segment_dicoms.r')" (bez podwójnych cudzysłowów).
  4. Po wyświetleniu trójwymiarowego obrazu pliku .xyz utworzonego w protokole 3 wprowadź liczbę próbek w całym pliku .xyz. Następnie oznacz i wybierz punkty z każdej próbki za pomocą funkcji przewijania i powiększania.
    UWAGA: W tle zostaną utworzone osobne pliki .xyz dla każdego próbnika. Pojawiają się one w katalogu o nazwie na przykład XYZ_FILES_PT3000, gdzie PT3000 wskazuje używany próg pikseli.

5. "Wyrównywanie" plików .xyz próbek do wspólnych współrzędnych.

  1. Otwórz skrypt Pythona "03_transform.py"{Figshare}, który wymaga dodatkowego modułu mattdean_modules.py{Figshare}, a także dwóch samodzielnych aplikacji: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) i "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm), które są używane przez ten skrypt.
  2. W sekcji Zmienne zidentyfikuj pełne nazwy ścieżek do mattdean_modules.py, rotate_path i qconvex_dir. Ponadto zidentyfikuj pełną ścieżkę do katalogu zawierającego poszczególne pliki .xyz utworzone w kroku 4.
  3. Uruchom polecenie 03_transform.py, które tworzy nowy plik dla każdej próbki z sufiksem . TRANSFORMED.xyz.

6. "Krojenie" wyrównanych plików .xyz próbek w celu identyfikacji pół-punktów orientacyjnych.

  1. Otwórz i uruchom skrypt Pythona "04_identify_landmarks.py"{Figshare}. W sekcji Zmienne zidentyfikuj pełne nazwy ścieżek do katalogu zawierającego pliki .TRANSFORMED.xyz. Ten skrypt identyfikuje 802 półpunkty orientacyjne, które można wykorzystać do ilościowego określenia rozmiaru i kształtu struktury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Współrzędne x-y-z półpunktów orientacyjnych (semi-landmarks) wygenerowane w Protokole 6 można bezpośrednio zaimportować do dowolnej analizy geometrycznej morfometrii opartej na punktach orientacyjnych17. Powyższy schemat obliczeniowy został zastosowany do badania baculum myszy14, a także kości miednicy i żeber wieloryba16. Więcej szczegółów na temat obliczeniowej definicji półpunktów orientacyjnych przedstawiono tutaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytyczne kroki w powyższym protokole to: 1) wypreparowanie bacula, 2) zebranie obrazów mikroCT, 3) konwersja danych wyjściowych mikroCT na płaski plik współrzędnych x-y-z, 4) segmentacja chmury punktów każdej próbki, 5) przekształcenie każdej próbki do znormalizowanego układu współrzędnych oraz 6) zdefiniowanie półpunktów orientacyjnych. Te kroki można łatwo zmodyfikować, aby dostosować je do różnych obiektów.

Metody te można prawdopodobnie zastosować do każdego obiektu, który jest zasadniczo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Tim Daley i Andrew Smith dostarczyli wielu użytecznych dyskusji obliczeniowych w początkowym okresie; Tim Daley napisał program, rotate_translate_cylindrical niezbędny do Protokołu 5. Zasoby obliczeniowe zostały dostarczone przez High Performance Computing Cluster na Uniwersytecie Południowej Kalifornii. Prace te były wspierane przez NIH grant #GM098536 (MDD).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nożyczki preparacyjneVWR470106-338Większość rozmiarów powinna działać
Kleszcze preparacyjne, cienka końcówka, zakrzywionaVWR82027-406
Probówka do mikrowirówek 1,7 mlVWR87003-294
Absolutny etanolFisher ScientificCAS 64-17-5Do rozcieńczenia do 70% do rozwarstwienia
Pianka kwiatowaHurtownia kwiatowa6002-48-07
Skaner uCT50 Scanco Medical AG, Bruttisellen, Szwajcaria

Bibliografia

  1. Slice, D. E. Geometrics morphometrics. Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).
  2. Slice, D. E. Modern morphometrics in physical anthropology. 6, Springer. (2005).
  3. Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , 2nd, Elsevier. (2012).
  4. Bookstein, F. Morphometric tools for landmark data: geometry and biology. , Cambridge University Press. (1991).
  5. Rohlf, F. J., Marcus, L. F. A Revolution in Morphometrics. Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).
  6. Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , Elsevier. (2004).
  7. Rohlf, F. J., Slice, D. E. Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks. Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).
  8. Gunz, P., Mitteroecker, P. Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces. Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).
  9. Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach. J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).
  10. Mitteroecker, P., Gunz, P. Advances in geometric morphometrics. Evol. Biol. 36 (2), 235-247 (2009).
  11. Bookstein, F. J. Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape. Med. Im. Anal. 1 (3), 225-243 (1997).
  12. Gunz, P., Mitteroecker, P., Bookstein, F. Modern morphometrics in physical anthropology. Slice, D. E. , Kluwer Press. 73-98 (2005).
  13. Oxnard, C., O'Higgins, P. Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology? Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).
  14. Schultz, N. G., et al. The genetic basis of baculum size and shape variation in mice. G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).
  15. Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution. Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).
  16. Dines, J. P., et al. Sexual selection targets cetacean pelvic bones. Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).
  17. Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data. Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Disekcja baculumanaliza morfometrycznadefiniowanie p punkt w charakterystycznychko pr cia myszyzmi kczanie tkanekekstrakcja ko ciuchwyt do tomografii komputerowej CTmonta w g bce florystycznejgeometria obliczeniowa
Preparacja, tomografia komputerowa i analizy morfometryczne baculum
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.