Method Article

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/55345

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Institute of Immunology, Section Molecular Immunology, University of Heidelberg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synapsa immunologiczna to obszar komunikacji między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen (APC). Limfocyty T polaryzują receptory powierzchniowe i białka w kierunku synapsy immunologicznej, aby zapewnić stabilne wiązanie i wymianę sygnału. Do badania synapsy immunologicznej wykorzystano klasyczną mikroskopię konfokalną, TIRF lub mikroskopię superrozdzielczą. Ponieważ metody te wymagają ręcznego pozyskiwania obrazu i czasochłonnej kwantyfikacji, obrazowanie rzadkich zdarzeń jest trudne. W tym miejscu opisujemy przepływ pracy, który umożliwia analizę morfologiczną dziesiątek tysięcy komórek. Synapsy immunologiczne są indukowane między pierwotnymi ludzkimi limfocytami T w preparatach panleukocytów a komórkami Raji załadowanymi enterotoksyną B (SEB) Staphylococcus aureus jako APC. Akwizycja obrazu odbywa się za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej, zwanej również mikroskopią przepływową, która łączy w sobie cechy cytometru przepływowego i mikroskopu fluorescencyjnego. Zapewniona jest kompletna strategia bramkowania do identyfikacji par limfocytów T / APC i analizy synaps immunologicznych. Ponieważ ten przepływ pracy umożliwia analizę synaps immunologicznych w nieoczyszczonych preparatach panleukocytów, a zatem wymaga tylko niewielkiej objętości krwi (tj. 1 ml), można go zastosować do próbek od pacjentów. Co ważne, kilka próbek może być przygotowywanych, mierzonych i analizowanych równolegle.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T limfocyty są głównymi regulatorami adaptacyjnego układu odpornościowego i są aktywowane przez peptydy antygenowe, które są prezentowane w kontekście głównych kompleksów zgodności tkankowej (MHC). Pełna aktywacja limfocytów T wymaga dwóch sygnałów: sygnału kompetencji za pośrednictwem kompleksu receptora limfocytów T specyficznego dla antygenu (TCR)/CD3 oraz sygnału kostymulującego za pośrednictwem receptorów dodatkowych. Oba sygnały są generowane w wyniku bezpośredniego oddziaływania limfocytów T z komórkami prezentującymi antygen (APC). Dojrzałe APC dostarczają sygnał kompetencyjny do aktywacji limfocytów T przez kompleksy peptydowe MHC i eksprymują ligandy kostymulujące (np. CD80 lub CD86), aby zapewnić postęp aktywacji komórek T1. Jedną z ważnych funkcji kostymulacji jest przegrupowanie cytoszkieletu aktynowego class2,3,4. Korowa F-aktyna jest stosunkowo statyczna w spoczynkowych limfocytach T. Stymulacja limfocytów T przez APC zawierające antygen prowadzi do głębokiej rearanżacji cytoszkieletu aktynowego. Dynamika aktyny (tj. szybkie okręgi polimeryzacji/depolimeryzacji aktyny) umożliwia limfocytom T wytwarzanie sił, które są wykorzystywane na przykład do transportu białek lub organelli. Co więcej, cytoszkielet aktynowy jest ważny dla rozwoju specjalnej strefy kontaktu między limfocytami T a APC, zwanej synapsą immunologiczną. Ze względu na znaczenie cytoszkieletu aktynowego dla synapsy immunologicznej, niezbędne stało się opracowanie metod ilościowego określania zmian w cytoszkielecie aktynowym limfocytów T5,6,7,8,9.

Za pomocą pomocy cytoszkieletu aktyny, receptory powierzchniowe i białka sygnałowe są segregowane w supramolekularne klastry aktywacji (SMAC) w synapsie immunologicznej. Stabilność synapsy immunologicznej jest zapewniona przez wiązanie receptorów z wiązkami F-aktyny, które zwiększają elastyczność cytoszkieletu aktynowego. Wykazano, że tworzenie synaps immunologicznych ma kluczowe znaczenie dla generowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Szkodliwe skutki wadliwego tworzenia synaps immunologicznych in vivo zostały po raz pierwszy uświadomione u pacjentów cierpiących na zespół Wiskotta-Aldricha (WAS), chorobę, w której zaburzona jest polimeryzacja aktyny i jednoczesne tworzenie synaps immunologicznych10. Pacjenci z WAS mogą cierpieć na egzemę, ciężkie nawracające infekcje, choroby autoimmunologiczne i czerniaki. Pomimo tego odkrycia nie wiadomo obecnie, czy tworzenie synaps immunologicznych różni się w limfocytach T osób zdrowych i pacjentów cierpiących na defekty immunologiczne lub choroby autoimmunologiczne.

Mikroskopia fluorescencyjna, w tym mikroskopia konfokalna, TIRF i mikroskopia superrozdzielcza, została wykorzystana do odkrycia architektury synapsy immunologicznej11,12,13,14. Wysoka rozdzielczość tych układów oraz możliwość wykonywania obrazowania żywych komórek umożliwia zbieranie dokładnych, czasoprzestrzennych informacji o cytoszkielecie aktynowym oraz białkach powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych w synapsie immunologicznej. Wiele wyników opiera się jednak na analizie zaledwie kilkudziesięciu limfocytów T. Ponadto limfocyty T muszą zostać oczyszczone do tego typu mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak w przypadku wielu pytań badawczych ogromne znaczenie ma użycie nieoczyszczonych komórek, a nie jak najwyższa rozdzielczość. Jest to istotne, jeśli analizowane są limfocyty T od pacjentów, ponieważ ilość oddawanej krwi jest ograniczona i może zaistnieć potrzeba równoległego przetwarzania wielu próbek.

Stworzyliśmy mikroskopijne metody, które pozwalają na analizę cytoszkieletu aktynowego w synapsie immunologicznej w ludzkim systemie15,16,17. Metody te opierają się na obrazowej cytometrii przepływowej, zwanej również mikroskopią przepływową18. Jako hybryda wielospektralnej cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej, obrazowa cytometria przepływowa ma swoje mocne strony w analizie parametrów morfologicznych i lokalizacji białek w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak panleukocyty z krwi obwodowej. Wprowadziliśmy metodologię, która umożliwia nam ilościowe oznaczanie F-aktyny w koniugatach limfocytów T/APC ludzkich limfocytów T z próbek krwi pełnej, bez konieczności czasochłonnych i kosztownych etapów oczyszczania17. Przedstawiona tutaj technika obejmuje cały przebieg pracy, od pobrania próbki krwi do ilościowego określenia F-aktyny w synapsie immunologicznej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pan-leukocytów

  1. Pobrać 1 ml krwi obwodowej od zdrowego dawcy (lub pacjenta) w strzykawce z heparyną. Upewnij się, że oddanie krwi zostało zatwierdzone przez właściwą komisję etyczną.
  2. Wymieszać 1 ml ludzkiej krwi obwodowej z 30 ml buforu do lizy ACK (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3 i 0,1 mM EDTA, pH 7,0) w probówce o pojemności 50 ml i inkubować przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Napełnić probówki PBS i odwirować przy 300 x g przez 6 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 30 ml buforu do lizy ACK.
  4. Powtarzać kroki 1.2 i 1.3 aż do momentu, gdy supernatant będzie klarowny. Na koniec umyć komórki w PBS, odwirować przy 300 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki hodowlanej (RPMI1640 + 10% FCS). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 60 minut.

2. Wczytywanie komórek Raji za pomocą SEB

  1. Przygotuj dwie probówki Falcon o pojemności 15 ml z 1,5 x 106 komórek Raji w probówce. Odwirować komórki (300 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej) i wyrzucić supernatant.
  2. Ponownie zawiesić komórki w pozostałej pożywce (około 50–100 μl), dodać 1,9 μl (1,9 μG) SEB i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodać 5 ml pożywki hodowlanej, odwirować komórki (300 x g przez 6 minut w temperaturze pokojowej) i ponownie zawiesić osad w pożywce hodowlanej (RPMI1640 + 10% FCS) o gęstości 1 x 106 komórek/ml.

3. Indukcja synaps immunologicznych i protokół barwienia

  1. Odpipetować 500 μl preparatu komórek Raji załadowanych SEB do probówki FACS i 500 μl preparatu niezaładowanych komórek Raji do innej probówki FACS. Dodać 650 μl panleukocytów do każdej probówki i odwirować komórki (300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 150 μl pożywki hodowlanej (RPMI1640 + 10% FCS). Inkubować w temperaturze 37 °C (zazwyczaj przez 45 minut).
  2. Delikatnie wiruj komórki (10 s przy 1,000 obr./min) i dodaj 1,5 ml paraformaldehydu (1,5%) podczas wiru, aby utrwalić komórki. Zatrzymaj utrwalanie, dodając 1 ml PBS + 1% BSA. Osadzać komórki (300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS + 1% BSA po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  3. Osad (300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej) i ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu przepuszczalności komórek (płytka 96-dołkowa, w kształcie litery U).
  4. Umyj komórki w PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny za pomocą wirowania (300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej) i ponownie zawieś osad komórkowy w 50 μl PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny zawierającej przeciwciała lub związki znakowane fluoroforem (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) i DAPI (1:3,000)).
  5. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Umyj komórki 3 razy, dodając 1 ml PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 60 μl PBS w celu obrazowania cytometrii przepływowej.

4. Akwizycja obrazu za pomocą cytometru przepływowego

UWAGA: Poniższa procedura pozyskiwania obrazów i analiza danych są oparte na obrazowaniu cytometrii przepływowej przy użyciu oprogramowania takiego jak imagestream (IS100), INSPIRE i IDEAS. Można jednak również stosować inne cytometry przepływowe i oprogramowanie analityczne.

  1. Otwórz oprogramowanie analityczne na komputerze podłączonym do obrazowego cytometru przepływowego i kliknij opcję Initialize Fluidics (Zainicjuj płyny) w menu Instrument (Instrument). Zastosuj koraliki na prawym porcie, gdy zostaniesz o to poproszony.
  2. Załaduj domyślny szablon z menu Plik i kliknij Uruchom/Instalacja. Wybierz Koraliki z menu rozwijanego Widok.
  3. Dostosuj oświetlacz jasnego pola, klikając Ustaw intensywność, jeśli wskazana wartość jest mniejsza niż 200.
  4. Uruchom procedurę kalibracji i testu na karcie Pomoc, klikając przycisk Rozpocznij wszystko.
  5. Kliknij Flush/Lock/Load i zastosuj próbki w lewym porcie, gdy zostaniesz o to poproszony. Po załadowaniu komórek do cytometru przepływowego otwórz klasyfikator komórek i dostosuj wartości w następujący sposób: górna granica intensywności szczytowej na poziomie 1,022 dla każdego kanału, dolna granica intensywności szczytowej na poziomie 50 dla kanału 2 (DAPI) i kanału 5 (CD3-Pe-TxR), dolna granica obszaru na poziomie 50 dla kanału 1 (rozproszenie boczne) i górna granica na poziomie 1,500.
  6. Zmień moc lasera wzbudzenia na 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) i 647 nm (90 mW) w zakładce Ustawienia.
  7. Przełącz menu rozwijane Widok między komórkami i koralikami, aby ocenić klasyfikator komórek i dostosowanie mocy lasera.
    nuta: Upewnij się, że wszystkie komórki i pary komórek znajdują się w widoku komórki, a grudki komórek, szczątki i obrazy z nasyconymi pikselami znajdują się w widoku zanieczyszczeń, zmieniając klasyfikatory komórek i/lub moc lasera wzbudzającego.
  8. Zdefiniuj nazwę próbki i liczbę obrazów do pobrania (15 000–25 000 dla próbek i 500 dla kontrolek kompensacji) na karcie Ustawienia. Kliknij Uruchom/Ustawienia, aby rozpocząć pobieranie.

5. Analiza danych

  1. Przenieś surowe pliki obrazów (.rif) do komputera do analizy danych i otwórz oprogramowanie do analizy.
  2. Utwórz macierz wynagrodzeń, postępując zgodnie z instrukcjami z listy rozwijanej Wynagrodzenie. Zapisz macierz wynagrodzeń jako comp_Date.ctm.
  3. Otwórz przykładowy plik obrazu RAW (.rif) i zastosuj plik comp_Date.ctm w wyświetlonym oknie, aby utworzyć skompensowane pliki obrazów (.cif) i domyślny plik analizy danych (.daf).
  4. Otwórz skompensowany plik obrazu. Przekonwertuj obrazy na tryb kolorów i dostosuj tabele odnośników, aby uzyskać optymalne widoczne kolory na pasku narzędzi Właściwości galerii obrazów. Uzyskanie obrazu scalonego RGB przy użyciu karty Kompozyt na pasku narzędzi Właściwości galerii obrazów.
  5. Otwórz Menedżera masek z listy rozwijanej Analiza. Utwórz maski definiujące limfocyty T i synapsę immunologiczną w następujący sposób:
    1. Wybierz maskę limfocytów T: "(Fill(Threshold_Ch05, 60)". Wybierz maskę doliny: "Dolina(Ch02,3)". Wybierz maskę synapsy komórek T: "Maska komórek T AND Dolina(M02,Ch02, 3)".
  6. Otwórz Menedżera funkcji z listy rozwijanej Analiza. Oblicz następujące cechy:
    1. Aby uzyskać całkowitą ekspresję CD3 w komórkach T, wybierz "Intensity_T-cells_Ch5". Aby uzyskać całkowitą ilość F-aktyny w komórkach T, wybierz "Intensity_T-cells_Ch6". Jako ekspresję CD3 w synapsie immunologicznej wybierz "synapse_Ch5 komórek Intensity_T". Aby określić ilość F-aktyny w synapsie immunologicznej, wybierz "synapse_Ch6 komórek Intensity_T".
    2. Aby obliczyć obszar komórek T, wybierz "Area_T komórek". Aby obliczyć obszar synapsy immunologicznej komórek T, wybierz "synapsa komórek Area_T".
  7. Określ wzbogacenie F-aktyny i CD3 w synapsie immunologicznej, korzystając z równania w Menedżerze funkcji:
    figure-protocol-1
  8. Zastosuj następującą strategię bramkowania, używając histogramów i wykresów kropkowych z obszaru Analiza (aby uzyskać więcej informacji, zobacz Referencje 17 i 19):
    1. Odrzuć nieostre komórki, kreśląc "Gradient RMS_M2_Ch2" na histogramie; ustaw próg na 15.
    2. Wykreśl intensywność SSC w funkcji CD3 na wykresie punktowym. Ustaw bramkę na zdarzenia CD3-dodatnie.
    3. Wykreśl "Współczynnik proporcji" M02 (plama DAPI) w porównaniu z obszarem M02 (plama Dapi). Bramka na podkoszulkach limfocytów T i odpowiednio parach komórek. Popraw dla prawdziwych par komórek przy użyciu obszaru maski synapsy, jak opisano wcześniej17,19.
    4. Określ ilość F-aktyny w podkoszulkach limfocytów T i limfocytach T par limfocytów T / APC oraz procent F-aktyny w synapsie immunologicznej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem opisanej tutaj metody jest ilościowe określenie wzbogacenia białek (np. F-aktyny) w synapsie immunologicznej między zastępczymi APC (komórkami Raji) a limfocytami T w nieoczyszczonych panleukocytach pobranych z próbek krwi ludzkiej o małej objętości (1 ml). Zrzut ekranu na rysunku 1 przedstawia przegląd krytycznej strategii bramkowania tej metody. Pokazuje galerię obrazów po lewej stronie i obszar analizy po prawej stronie (Rysunek 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj przepływ pracy umożliwia ilościowe określenie synaps immunologicznych między ludzkimi limfocytami T (ex vivo) a APC. Warto zauważyć, że jako źródła limfocytów T wykorzystano panleukocyty poddane lizie erytrocytów, dzięki czemu etapy oczyszczania komórek T stały się zbędne. Linia komórkowa chłoniaka B-komórkowego Raji służyła jako zastępcze APC. Niesie to ze sobą znaczące korzyści, ponieważ umożliwia porównania między dawcami krwi po stronie limfocytów T synapsy immunologicznej. Co więcej, autologiczne...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca została sfinansowana przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (DFG) grantami nr. SFB-938-M oraz SA 393/3-4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
>Multifuge 3 SRHeraeus
RPMI 1640LifeTechnologies#11875085500 mL
FCSPan Biotech#3302-P101102
Polistyrenowa rurka z okrągłym dnemFalcon#3520545 mL
KulturflascheThermo Scientific#178883
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigmaD8662
Albumina surowicy bydlęcejRoth#8076.3
SaponinaSigmaS7900
ParaformaldehydSigma Aldrich#16005
FACS SaponinaPBS 1% BSA 0,15 Saponina
ReaktiosgefaBSarstedt72.699.0020,5 mL
KoralikprędkościAmnis#400041
Minishaker MS1IKA Działa  MS1
MikrotiterplatteGreiner Bio One#65010196U
Enterotoksyna SEBSigma AldrichS4881
DAPISigma AldrichD95421:3000
CD3-PeTxRInvitrogenMHCD0317 1:30
Sondy molekularnePhalloidin-AF647A222871:150
IS100AmnisObrazowanie cytometru przepływowego
IDEASOprogramowanie Amnis
INSPIREOprogramowanieAmnis
płucząca

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
  2. Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
  3. Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
  4. Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68(2016).
  5. Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
  6. Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
  7. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  8. Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
  9. Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
  10. Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
  13. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421(2012).
  14. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  15. Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
  16. Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
  17. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  18. Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
  19. Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
  20. Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
  21. Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
  22. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immune SynapseImaging Flow CytometryT Cell APC ConjugatesCD3 Expression AnalysisF actin EnrichmentPan leukocyte PreparationSEB loaded Raji CellsGating StrategyProtein QuantificationHuman Blood Sample

Related Articles