Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

11.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55345

⸱

7 stycznia 2019

 ,  , 
1Institute of Immunology, Section Molecular Immunology, University of Heidelberg

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Streszczenie

Synapsa immunologiczna to obszar komunikacji między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen (APC). Limfocyty T polaryzują receptory powierzchniowe i białka w kierunku synapsy immunologicznej, aby zapewnić stabilne wiązanie i wymianę sygnału. Do badania synapsy immunologicznej wykorzystano klasyczną mikroskopię konfokalną, TIRF lub mikroskopię superrozdzielczą. Ponieważ metody te wymagają ręcznego pozyskiwania obrazu i czasochłonnej kwantyfikacji, obrazowanie rzadkich zdarzeń jest trudne. W tym miejscu opisujemy przepływ pracy, który umożliwia analizę morfologiczną dziesiątek tysięcy komórek. Synapsy immunologiczne są indukowane między pierwotnymi ludzkimi limfocytami T w preparatach panleukocytów a komórkami Raji załadowanymi enterotoksyną B (SEB) Staphylococcus aureus jako APC. Akwizycja obrazu odbywa się za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej, zwanej również mikroskopią przepływową, która łączy w sobie cechy cytometru przepływowego i mikroskopu fluorescencyjnego. Zapewniona jest kompletna strategia bramkowania do identyfikacji par limfocytów T / APC i analizy synaps immunologicznych. Ponieważ ten przepływ pracy umożliwia analizę synaps immunologicznych w nieoczyszczonych preparatach panleukocytów, a zatem wymaga tylko niewielkiej objętości krwi (tj. 1 ml), można go zastosować do próbek od pacjentów. Co ważne, kilka próbek może być przygotowywanych, mierzonych i analizowanych równolegle.

Wprowadzenie

T limfocyty są głównymi regulatorami adaptacyjnego układu odpornościowego i są aktywowane przez peptydy antygenowe, które są prezentowane w kontekście głównych kompleksów zgodności tkankowej (MHC). Pełna aktywacja limfocytów T wymaga dwóch sygnałów: sygnału kompetencji za pośrednictwem kompleksu receptora limfocytów T specyficznego dla antygenu (TCR)/CD3 oraz sygnału kostymulującego za pośrednictwem receptorów dodatkowych. Oba sygnały są generowane w wyniku bezpośredniego oddziaływania limfocytów T z komórkami prezentującymi antygen (APC). Dojrzałe APC dostarczają sygnał kompetencyjny do aktywacji limfocytów T przez kompleksy peptydowe MHC i eksprymują ligandy kostymulujące (np. CD80 lub CD86), aby zapewnić postęp aktywacji komórek T1. Jedną z ważnych funkcji kostymulacji jest przegrupowanie cytoszkieletu aktynowego class2,3,4. Korowa F-aktyna jest stosunkowo statyczna w spoczynkowych limfocytach T. Stymulacja limfocytów T przez APC zawierające antygen prowadzi do głębokiej rearanżacji cytoszkieletu aktynowego. Dynamika aktyny (tj. szybkie okręgi polimeryzacji/depolimeryzacji aktyny) umożliwia limfocytom T wytwarzanie sił, które są wykorzystywane na przykład do transportu białek lub organelli. Co więcej, cytoszkielet aktynowy jest ważny dla rozwoju specjalnej strefy kontaktu między limfocytami T a APC, zwanej synapsą immunologiczną. Ze względu na znaczenie cytoszkieletu aktynowego dla synapsy immunologicznej, niezbędne stało się opracowanie metod ilościowego określania zmian w cytoszkielecie aktynowym limfocytów T5,6,7,8,9.

Za pomocą pomocy cytoszkieletu aktyny, receptory powierzchniowe i białka sygnałowe są segregowane w supramolekularne klastry aktywacji (SMAC) w synapsie immunologicznej. Stabilność synapsy immunologicznej jest zapewniona przez wiązanie receptorów z wiązkami F-aktyny, które zwiększają elastyczność cytoszkieletu aktynowego. Wykazano, że tworzenie synaps immunologicznych ma kluczowe znaczenie dla generowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych. Szkodliwe skutki wadliwego tworzenia synaps immunologicznych in vivo zostały po raz pierwszy uświadomione u pacjentów cierpiących na zespół Wiskotta-Aldricha (WAS), chorobę, w której zaburzona jest polimeryzacja aktyny i jednoczesne tworzenie synaps immunologicznych10. Pacjenci z WAS mogą cierpieć na egzemę, ciężkie nawracające infekcje, choroby autoimmunologiczne i czerniaki. Pomimo tego odkrycia nie wiadomo obecnie, czy tworzenie synaps immunologicznych różni się w limfocytach T osób zdrowych i pacjentów cierpiących na defekty immunologiczne lub choroby autoimmunologiczne.

Mikroskopia fluorescencyjna, w tym mikroskopia konfokalna, TIRF i mikroskopia superrozdzielcza, została wykorzystana do odkrycia architektury synapsy immunologicznej11,12,13,14. Wysoka rozdzielczość tych układów oraz możliwość wykonywania obrazowania żywych komórek umożliwia zbieranie dokładnych, czasoprzestrzennych informacji o cytoszkielecie aktynowym oraz białkach powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych w synapsie immunologicznej. Wiele wyników opiera się jednak na analizie zaledwie kilkudziesięciu limfocytów T. Ponadto limfocyty T muszą zostać oczyszczone do tego typu mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak w przypadku wielu pytań badawczych ogromne znaczenie ma użycie nieoczyszczonych komórek, a nie jak najwyższa rozdzielczość. Jest to istotne, jeśli analizowane są limfocyty T od pacjentów, ponieważ ilość oddawanej krwi jest ograniczona i może zaistnieć potrzeba równoległego przetwarzania wielu próbek.

Stworzyliśmy mikroskopijne metody, które pozwalają na analizę cytoszkieletu aktynowego w synapsie immunologicznej w ludzkim systemie15,16,17. Metody te opierają się na obrazowej cytometrii przepływowej, zwanej również mikroskopią przepływową18. Jako hybryda wielospektralnej cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej, obrazowa cytometria przepływowa ma swoje mocne strony w analizie parametrów morfologicznych i lokalizacji białek w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak panleukocyty z krwi obwodowej. Wprowadziliśmy metodologię, która umożliwia nam ilościowe oznaczanie F-aktyny w koniugatach limfocytów T/APC ludzkich limfocytów T z próbek krwi pełnej, bez konieczności czasochłonnych i kosztownych etapów oczyszczania17. Przedstawiona tutaj technika obejmuje cały przebieg pracy, od pobrania próbki krwi do ilościowego określenia F-aktyny w synapsie immunologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pan-leukocytów

  1. Pobrać 1 mL krwi obwodowej od zdrowego dawcy (lub pacjenta) do strzykawki z heparyną. Należy upewnić się, że uzyskano zgodę właściwej komisji etycznej na pobranie krwi.
  2. Wymieszać 1 mL ludzkiej krwi obwodowej z 30 mL buforu lizującego ACK (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3 oraz 0,1 mM EDTA, pH 7,0) w probówce o pojemności 50 mL i inkubować przez 8 min w temperaturze pokojowej.
  3. Uzupełnić probówki buforem PBS i wirować przy 300 x g przez 6 min. Odessać supernatant i resuspendować osad w 30 mL buforu lizującego ACK.
  4. Powtarzać kroki 1.2 i 1.3 do momentu, aż supernatant stanie się przejrzysty. Następnie przemyć komórki w PBS, wirować przy 300 x g przez 6 min w temperaturze pokojowej i resuspendować osad komórkowy w 2 mL pożywki hodowlanej (RPMI1640 + 10% FCS). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 60 min.

2. Obciążanie komórek Raji SEB

  1. Przygotować dwie probówki typu Falcon o pojemności 15 mL, zawierające odpowiednio 1,5 x 106 komórek Raji w każdej probówce. Wirować komórki (300 x g przez 6 min w temperaturze pokojowej) i odrzucić nadsącz.
  2. Resuspendować komórki w pozostałym medium (około 50–100 µL), dodać 1,9 µL (1,9 µG) SEB i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min. Dodać 5 mL medium hodowlanego, wirować komórki (300 x g przez 6 min w temperaturze pokojowej), a następnie resuspendować osad w medium hodowlanym (RPMI1640 + 10% FCS) do uzyskania zagęszczenia 1 x 106 komórek/mL.

3. Protokół indukcji synaps immunologicznych i barwienia

  1. Do jednej probówki FACS pipetujemy 500 µL zawiesiny komórek Raji obciążonych SEB, a do drugiej probówki FACS 500 µL zawiesiny nieobciążonych komórek Raji. Do każdej probówki dodajemy 650 µL przeciwciał pan-leukocytowych i wirujemy komórki (300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej). Odcinamy nadsącz i resuspendujemy osad w 150 µL pożywki hodowlanej (RPMI1640 + 10% FCS). Inkubujemy w 37 °C (zazwyczaj przez 45 min).
  2. Komórki delikatnie mieszamy na wortexie (10 s przy 1,000 rpm) i podczas mieszania dodajemy 1,5 mL paraformaldehydu (1,5%), aby utrwalić komórki. Fiksację przerywamy poprzez dodanie 1 mL PBS + 1% BSA. Komórki wirujemy (300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej), a po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej resuspendujemy osad komórkowy w 1 mL PBS + 1% BSA.
  3. Komórki wirujemy (300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej) i resuspendujemy w 100 µL PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny na 15 min w temperaturze pokojowej w celu permeabilizacji komórek (płytka 96-dołkowa, dno w kształcie litery U).
  4. Komórki przemywamy w PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny z wykorzystaniem wirowania (300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej) i resuspendujemy osad komórkowy w 50 µL PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny zawierającej przeciwciała lub związki znakowane fluoroforami (CD3-PE-TxRed (1:30), Phalloidin-AF647 (1:150) oraz DAPI (1:3,000)).
  5. Komórki inkubujemy w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 min. Komórki przemywamy 3 razy, dodając po 1 mL PBS + 1% BSA + 0,1% saponiny. Wirujemy przy 300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Komórki resuspendujemy ponownie w 60 µL PBS do analizy w przepływowej cytometrii obrazowej.

4. Pozyskiwanie obrazów za pomocą cytometru przepływowego

UWAGA: Poniższa procedura pozyskiwania obrazów oraz analiza danych opierają się na cytometrii przepływowej z obrazowaniem z wykorzystaniem oprogramowania takiego jak imagestream (IS100), INSPIRE oraz IDEAS. Można jednak użyć również innych cytometrów przepływowych i oprogramowania do analizy.

  1. Uruchom oprogramowanie analityczne na komputerze podłączonym do cytometru przepływowego z obrazowaniem i kliknij menu Initialize Fluidics of the Instrument. Na prośbę programu wprowadź kuleczki do prawego portu.
  2. Wczytaj domyślny szablon z menu File i kliknij Run/Setup. Z rozwijanego menu View wybierz Beads.
  3. Jeśli wskazana wartość jest niższa niż 200, dostosuj iluminator pola jasnego, klikając Set Intensity.
  4. Uruchom procedurę kalibracyjną i testową w zakładce Assist, klikając Start All.
  5. Kliknij Flush/Lock/Load i na prośbę programu wprowadź próbki do lewego portu. Po załadowaniu komórek do cytometru przepływowego otwórz Cell Classifier i dostosuj wartości w następujący sposób: górna granica intensywności piku na 1,022 dla każdego kanału, dolna granica intensywności piku na 50 dla kanału 2 (DAPI) i kanału 5 (CD3-Pe-TxR), dolna granica pola na 50 dla kanału 1 (side scatter) oraz górna granica na 1,500.
  6. W zakładce Setup zmień moc lasera wzbudzającego na 405 nm (15 mW), 488 nm (200 mW) oraz 647 nm (90 mW).
  7. Przełączaj rozwijane menu View między Cells a Beads, aby ocenić ustawienia klasyfikatora komórek i moc lasera.
    UWAGA: Poprzez zmianę ustawień klasyfikatora komórek i/lub mocy laserów wzbudzających upewnij się, że wszystkie komórki i pary komórek znajdują się w widoku Cell View, a skupiska komórek, debris i obrazy z nasyconymi pikselami znajdują się w widoku Debris View.
  8. W zakładce Setup określ nazwę próbki oraz liczbę obrazów do pozyskania (15,000–25,000 dla próbek i 500 dla kontroli kompensacji). Kliknij Run/Setup, aby rozpocząć akwizycję.

5. Analiza danych

  1. Przenieś surowe pliki obrazów (.rif) na komputer do analizy danych i uruchom oprogramowanie analityczne.
  2. Utwórz macierz kompensacji zgodnie z instrukcjami w menu rozwijanym Compensation. Zapisz macierz kompensacji jako comp_Data.ctm.
  3. Otwórz surowy plik obrazu próbki (.rif) i zastosuj plik comp_Date.ctm w wyświetlanym oknie, aby wygenerować skompensowane pliki obrazów (.cif) oraz domyślny plik analizy danych (.daf).
  4. Otwórz skompensowany plik obrazu. Przełącz obrazy w tryb kolorów i dostosuj tabele wyszukiwania (lookup tables) w pasku narzędzi Image Gallery Properties, aby uzyskać optymalne kolory widoczne. Wygeneruj obraz scalony RGB, korzystając z karty Composite w pasku narzędzi Image Gallery Properties.
  5. Otwórz menedżera masek (Mask Manager) z menu rozwijanego Analysis. Utwórz maski definiujące limfocyty T oraz synapsę immunologiczną w następujący sposób:
    1. Wybierz maskę limfocytów T: "(Fill(Threshold_Ch05, 60)." Wybierz maskę doliny (valley mask): "Valley(Ch02,3)." Wybierz maskę synapsy limfocytów T: "T-cell mask AND Valley(M02,Ch02, 3)."
  6. Otwórz menedżera cech (Feature Manager) z menu rozwijanego Analysis. Oblicz następujące cechy:
    1. Dla całkowitej ekspresji CD3 w limfocytach T wybierz "Intensity_T-cells_Ch5." Dla całkowitej ilości F-aktyny w limfocytach T wybierz "Intensity_T-cells_Ch6." Dla ekspresji CD3 w synapsie immunologicznej wybierz "Intensity_T-cell synapse_Ch5." Dla ilości F-aktyny w synapsie immunologicznej wybierz "Intensity_T-cell synapse_Ch6."
    2. Aby obliczyć powierzchnię limfocytu T, wybierz "Area_T-cells." Aby obliczyć powierzchnię synapsy immunologicznej limfocytu T, wybierz "Area_T-cell synapse."
  7. Wyznacz wzbogacenie F-aktyny i CD3 w synapsie immunologicznej, korzystając z równania w menedżerze cech:
    Wzory wzbogacenia F-aktyny i CD3, metoda obliczeń dla analizy intensywności synapsy limfocytów T.
  8. Zastosuj następującą strategię bramkowania (gating), korzystając z histogramów i wykresów kropkowych z obszaru Analysis (szczegóły znajdują się w referencjach 17 i 19):
    1. Odrzuć komórki poza ogniskowaniem, przedstawiając "Gradient RMS_M2_Ch2" na histogramie; ustaw próg na 15.
    2. Przedstaw SSC w stosunku do intensywności CD3 na wykresie kropkowym. Ustaw bramkę na zdarzenia CD3-dodatnie.
    3. Przedstaw "Aspect ratio" dla M02 (barwienie DAPI) w stosunku do powierzchni M02 (barwienie DAPI). Odpowiednio bramkuj singlety limfocytów T oraz pary komórek. Skoryguj wyniki dla rzeczywistych par komórek, korzystając z powierzchni maski synapsy, jak opisano wcześniej17,19.
    4. Wyznacz ilość F-aktyny w singletach limfocytów T oraz w limfocytach T tworzących pary limfocyt T/APC, a także procent F-aktyny w synapsie immunologicznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Głównym celem opisanej tutaj metody jest kwantyfikacja wzbogacenia białek (np. , F-aktyny) w synapsie immunologicznej pomiędzy zastępczymi APC (komórki Raji) a limfocytami T w nieoczyszczonych pan-leukocytach pobranych z małymi objętościami (1 mL) próbek ludzkiej krwi. Zrzut ekranu na Rysunku 1 przedstawia przegląd kluczowej strategii bramkowania tej metody. Po lewej stronie widoczna jest galeria obrazów, a po prawej obszar analizy (Rysunek 1). G...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj przepływ pracy umożliwia ilościowe określenie synaps immunologicznych między ludzkimi limfocytami T (ex vivo) a APC. Warto zauważyć, że jako źródła limfocytów T wykorzystano panleukocyty poddane lizie erytrocytów, dzięki czemu etapy oczyszczania komórek T stały się zbędne. Linia komórkowa chłoniaka B-komórkowego Raji służyła jako zastępcze APC. Niesie to ze sobą znaczące korzyści, ponieważ umożliwia porównania między dawcami krwi po stronie limfocytów T synapsy immunologicznej. Co więcej, autologiczne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca została sfinansowana przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (DFG) grantami nr. SFB-938-M oraz SA 393/3-4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Multifuge 3 SRHeraeus
RPMI 1640LifeTechnologies#11875085500 mL
FCSPan Biotech#3302-P101102
Polistyrenowa rurka z okrągłym dnemFalcon#3520545 mL
KulturflascheThermo Scientific#178883
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem DulbeccoSigmaD8662
Albumina surowicy bydlęcejRoth#8076.3
SaponinaSigmaS7900
ParaformaldehydSigma Aldrich#16005
FACS SaponinaPBS 1% BSA 0,15 Saponina
ReaktiosgefaBSarstedt72.699.0020,5 mL
KoralikprędkościAmnis#400041
Minishaker MS1IKA Działa  MS1
MikrotiterplatteGreiner Bio One#65010196U
Enterotoksyna SEBSigma AldrichS4881
DAPISigma AldrichD95421:3000
CD3-PeTxRInvitrogenMHCD0317 1:30
Sondy molekularnePhalloidin-AF647A222871:150
IS100AmnisObrazowanie cytometru przepływowego
IDEASOprogramowanie Amnis
INSPIREOprogramowanieAmnis
płucząca

Bibliografia

  1. Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
  2. Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
  3. Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
  4. Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68(2016).
  5. Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
  6. Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
  7. Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
  8. Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
  9. Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
  10. Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
  11. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  12. Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
  13. Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421(2012).
  14. Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
  15. Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
  16. Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
  17. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  18. Basiji, D., O'Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
  19. Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
  20. Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
  21. Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
  22. Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Konjugaty limfocyt w T i APCanaliza ekspresji CD3wzbogacenie F aktynyprzygotowanie panleukocyt wkom rki Raji obci one SEBstrategia bramkowaniailo ciowe oznaczanie bia kaludzka pr bka krwi
Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.