Zastosowanie klasycznego warunkowania śladowego mrugnięcia okiem do oceny dysfunkcji hipokampa w szczurzym modelu zaburzeń ze spektrum alkoholowych płodów

Tuan D. Tran; Aenia Amin; Keith G. Jones; Ellen M. Sheffer; Lidia Ortega; Keith Dolman

doi:10.3791/55350

Artykuł metodologiczny

Zastosowanie klasycznego warunkowania śladowego mrugnięcia okiem do oceny dysfunkcji hipokampa w szczurzym modelu zaburzeń ze spektrum alkoholowych płodów

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55350

⸱

5 sierpnia 2017

Tuan D. Tran¹^,² , Aenia Amin¹^,² , Keith G. Jones² , Ellen M. Sheffer¹ , Lidia Ortega¹ , Keith Dolman²

¹Department of Psychology, East Carolina University, ²Multidisciplinary Studies Program in Neuroscience, East Carolina University

W tym artykule

Podsumowanie

Klasyczne warunkowanie (ECC) zostało użyte do oceny zależnego od hipokampa uczenia się asocjacyjnego u dorosłych szczurów, którym podawano wysokie stężenie (11,9% v/v) alkoholu podczas wczesnego rozwoju mózgu noworodka. Ogólnie rzecz biorąc, procedury ECC są solidnymi narzędziami diagnostycznymi do wykrywania dysfunkcji mózgu w wielu środowiskach psychologicznych i biomedycznych.

Streszczenie

Nowonarodzonym szczurom podawano stosunkowo wysokie stężenie alkoholu etylowego (11,9% v/v) w dniach poporodowych 4-9, w czasie, gdy mózg płodu ulega szybkim zmianom organizacyjnym i jest podobny do przyspieszonych zmian w mózgu, które występują w trzecim trymestrze u ludzi. Ten model płodowych zaburzeń ze spektrum alkoholowego (FASD) powoduje poważne uszkodzenie mózgu, naśladując ilość i wzorzec upijania się, który występuje u niektórych ciężarnych matek alkoholiczek. Opisujemy zastosowanie klasycznego warunkowania śladowego mrugnięcia okiem (ECC), wariantu uczenia się asocjacyjnego wyższego rzędu, do oceny długotrwałej dysfunkcji hipokampa, która jest zwykle obserwowana u dorosłego potomstwa narażonego na działanie alkoholu. W wieku 90 dni gryzonie zostały chirurgicznie przygotowane za pomocą elektrod rejestrujących i stymulujących, które mierzyły aktywność elektromiograficznych (EMG) mrugnięć z mięśnia lewej powieki i dostarczały łagodny wstrząs odpowiednio do lewego oka. Po 5-dniowym okresie rekonwalescencji przeszli 6 sesji śledzenia ECC w celu określenia asocjacyjnych różnic w uczeniu się między szczurami narażonymi na działanie alkoholu a szczurami kontrolnymi. Trace ECC jest jedną z wielu możliwych procedur ECC, które można łatwo modyfikować przy użyciu tego samego sprzętu i oprogramowania, dzięki czemu można oceniać różne systemy neuronowe. Ogólnie rzecz biorąc, procedury ECC mogą być stosowane jako narzędzia diagnostyczne do wykrywania patologii neuronalnej w różnych układach mózgowych i różnych stanach, które obrażają mózg.

Wprowadzenie

Trudno sobie wyobrazić, że w dzisiejszych czasach, przy lepszej opiece zdrowotnej i łatwiejszym dostępie do usług medycznych, nadużywanie alkoholu pozostaje poważnym globalnym problemem zdrowotnym. Niestety wykazano, że kobieta w ciąży spożywająca duże ilości alkoholu może urodzić dziecko z ciężkimi uszkodzeniami mózgu i zaburzeniami neurorozwojowymi utrzymującymi się przez całe życie, co jest widoczne u osób cierpiących na zespół alkoholowy płodu (FAS)¹^,²^,³. U kobiet z potwierdzoną historią spożywania alkoholu w czasie ciąży rozwijający się płód jest również podatny na niewielkie ilości alkoholu lub różne wzorce jego spożycia, które powodują zmienne różnice w stężeniu alkoholu we krwi. W tym drugim przypadku dzieci mogą nie wykazywać tak ciężkich zaburzeń morfologicznych lub neurobehawioralnych jak osoby z FAS, ale nadal mogą cierpieć na dożywotnie niepełnosprawności poznawcze i zaburzenia emocjonalne o stopniu od łagodnego do ciężkiego³^,⁴. Łącznie FAS oraz mniej nasilone formy prenatalnych zaburzeń wywołanych alkoholem stanowią grupę zaburzeń ze spektrum alkoholowego płodu (FASDs). Nic dziwnego, że FASDs są całkowicie możliwe do zapobieżenia, jednak zdumiewające jest to, że szacunki wskazują, iż w populacjach, w których nadużywanie alkoholu jest powszechne, pozostają one główną niegenetyczną przyczyną niepełnosprawności neurologicznej i poznawczej, dotykając od 2% do 5% dzieci w USA oraz w krajach europejskich, takich jak Francja i Szwecja. W odniesieniu do zapadalności na sam FAS w USA, częstość występowania wynosi od 2 do 7 na 1 000 żywych urodzeń⁵, co sugeruje, że całkowita zapadalność na FASDs jest znacznie wyższa niż w przypadku FAS.

Badania z zakresu neuroobrazowania przeprowadzone u dzieci z FASD wykazały występowanie nieprawidłowości w budowie mózgu, takich jak cieńsze ciało modzelowate⁶, mniejszy przedni robak móżdżku⁷ oraz mniejszy hipokamp⁸. Nieprawidłowości te leżą u podstaw niektórych długoterminowych zaburzeń neuropoznawczych obserwowanych u dzieci z FASD. Dokładne powiązania między zmiennością zmian w mózgu wywołanych spożyciem alkoholu przez matkę a zmiennością w profilu (tj. rodzajem, zakresem) konkretnych deficytów neuropoznawczych nie zostały jeszcze jednoznacznie określone. Niemniej jednak, jako punkt wyjścia, hipokamp jest doskonałym obiektem do badania podatności na prenatalne działanie alkoholu. Rzeczywiście, dzieci z FASD wykazują deficyty w zachowaniach zależnych od hipokampa, takich jak uczenie się przestrzenne⁹^,¹⁰ oraz opóźnione przypominanie sobie obiektów¹¹.

Modele gryzoni w badaniach nad FASD okazały się nieocenione w wyjaśnianiu mechanizmów prowadzących do zaburzeń neuropoznawczych obserwowanych u dzieci z FASD. Przyjęty przez nas, dobrze ugruntowany model ekspozycji typu binge polega na podawaniu alkoholu szczurom w 4.–9. dobie po urodzeniu.¹²^,¹³, okres, w którym mózg przechodzi gwałtowny proces tworzenia synaps i kontaktów dendrytycznych, co odpowiada 24. tygodniowi rozwoju płodu ludzkiego i trwa do 3.^rd trymestr¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷Ten konkretny model indukuje znaczną utratę neuronów hipokampa¹⁸^,¹⁹ oraz neurony w wielu innych obszarach mózgu, takich jak móżdżek¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³, którym towarzyszą ciężkie zaburzenia funkcji poznawczych obejmujące różne domeny²¹^,²⁴^,²⁵Zaburzenia poznawcze wynikające z wczesnej ekspozycji na alkohol u szczurów można oceniać na różne sposoby, w szczególności za pomocą klasyczne warunkowanie mrugania okiem (ECC). ECC to paradygmat wykorzystywany od ponad wieku do naukowych badań nad fundamentalnymi podstawami uczenia się²⁶^,²⁷ i w związku z tym stanowi przydatną metodę lepszego zrozumienia niekorzystnych następstw neuropoznawczych wynikających z płodowej ekspozycji na alkohol. Jest to bardzo elastyczny paradygmat, który pozwala badaczom na zastosowanie różnorodnych procedur ECC, z których każda może zostać zbadana u wielu gatunków ssaków wznoszących się w skali filogenetycznej (od myszy do ludzi) oraz na różnych etapach rozwoju mózgu²⁸^,²⁹^,³⁰^,³¹Ponadto fundamentalne obwody neuronalne pośredniczące w uczeniu się asocjacyjnym w tym paradygmacie znajdują potwierdzenie w raportach eksperymentalnych i neuropsychologicznych dotyczących tych samych gatunków.²⁶^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷.

W niniejszej pracy zaprezentowano jedną z form ECC – tzw. śladowe (trace) ECC (Rycina 1). Aby zapewnić odpowiedni kontekst, zostało ono porównane z bardziej tradycyjną formą – opóźnionym (delay) ECC. Paradygmat ECC został opracowany na wzór warunkowania klasycznego z udziałem psów, przeprowadzonego po raz pierwszy przez laureata Nagrody Nobla, fizjologa Iwana Pawłowa. Pawłow odkrył, że pewne bodźce, takie jak dźwięki, nie wywołują naturalnie ślinienia, ale gdy poprzedzają one podanie pokarmu i nakładają się na nie, reakcja ślinotwórcza może zostać wzmocniona poprzez wielokrotne prezentowanie obu bodźców, pod warunkiem zachowania tej zależności dźwięk-pokarm. Jest to przykład opóźnionego ECC, opartego na założeniu, że siła asocjacji jest zapośredniczona przez bezpośrednią bliskość czasową obu bodźców, co czyni warunki uczenia się optymalnymi dla zwierzęcia. Badacz testował również inne warianty zależności dźwięk-pokarm, takie jak wyłączenie dźwięku i pozostawienie okresu „śladu” przed podaniem pokarmu. Gdy te dwa bodźce były wystarczająco rozdzielone w czasie, psom znacznie trudniej było wywołać reakcję ślinienia przed podaniem pokarmu. Brak bezpośredniej ciągłości między wyłączeniem dźwięku a podaniem pokarmu jest zatem przykładem śladowego ECC. Ponieważ gryzonie nie ślinią się naturalnie na obecność pokarmu, zamiast niego stosuje się bodźce bardziej adekwatne dla tego gatunku, takie jak lekki wstrząs elektryczny; gryzonie nie wykazują również naturalnych obronnych reakcji mrugania w odpowiedzi na dźwięki. W tym kontekście procedury ECC u gryzoni polegają na prezentowaniu dźwięku o określonym poziomie decybeli i parowaniu go w określony sposób z lekkim wstrząsem elektrycznym mięśnia okrężnego oka (orbicularis oculi) lub mięśnia skroniowego (temporalis) w celu wywołania reakcji mrugania. Dźwięk jest uznawany za bodziec warunkowy (CS), natomiast wstrząs za bodziec bezwarunkowy (US). W opóźnionym ECC najpierw prezentowany jest CS; bodziec ten pozostaje aktywny przez określony czas. Następnie podawany jest US. Te dwa bodźce nakładają się na siebie przez określony czas, a następnie kończą się jednocześnie; wynikająca z podania US reakcja mrugania jest uznawana za reakcję bezwarunkową (UR). W tej procedurze gryzonie uczą się mrugać jakiś czas po prezentacji CS, ale tuż przed podaniem US, aby antycypować ten awersyjny bodziec. Wyuczona reakcja mrugania nazywana jest reakcją warunkową (CR). W przypadku śladowego ECC, CS i US są oddzielone przedziałem czasu pozbawionym bodźców, znanym jako interwał śladu; nie nakładają się one czasowo, jak ma to miejsce w opóźnionym ECC. Podczas tego interwału zwierzę musi zrealizować wymagania asocjacyjne między bodźcami. Podobnie jak w opóźnionym ECC, uczenie się zachodzi, gdy zwierzę konsekwentnie wykazuje reakcję mrugania po wyłączeniu CS, ale bezpośrednio przed podaniem US. W wyniku określonej liczby treningów nabywania (parowanie CS z US) powstają krzywe uczenia się (tj. na podstawie różnych pomiarów CR). Badania z wykorzystaniem modeli z uszkodzeniami oraz neuroobrazowania wykazują, że skuteczne uczenie się w opóźnionym ECC zależy od nienaruszonej sieci neuronowej między móżdżkiem a pniem mózgu³⁸^,³⁹^,⁴⁰, podczas gdy śladowe ECC jest procedurą wyższego rzędu, która wymaga dodatkowego zaangażowania neuronów hipokampa⁴¹^,⁴²^,⁴³^,⁴⁴ oraz innych struktur korowych⁴⁵^,⁴⁶. Ze względu na wymagania dotyczące czasu niezbędne do skutecznego nabycia śladowych CR, zadanie to jest również trudniejsze do opanowania (nawet dla osobników zdrowych).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Klasyczne warunkowanie mrugania okiem z odstępem (trace eyeblink classical conditioning). Przedstawiony został rzeczywisty przebieg fali reprezentatywny dla dorosłego szczura z grupy kontrolnej bez intubacji (UC). Najpierw prezentowany jest sygnał dźwiękowy CS (85 dB, 2,8 kHz) przez 380 ms. Następuje odstęp (trace interval) trwający 500 ms, podczas którego nie występują żadne bodźce. Następnie podawany jest wstrząs US (1,6 mA) przez 100 ms. Skuteczna nauka w tym zadaniu następuje, gdy częstotliwość (%) lub amplituda (w woltach) mrugania okiem w oknie czasowym odpowiedzi warunkowej (CR) (całkowity okres CR) wzrasta w wielu sesjach treningowych. W szczególności gryzonie z nienaruszonym hipokampem zazwyczaj wykazują więcej dobrze zsynchronizowanych CR (adaptacyjne CR) bezpośrednio przed wystąpieniem wstrząsu US (w oknie 200 ms). Pomiarowi podlegają również reakcje przestrachu (SR) w ciągu pierwszych 80 ms po wystąpieniu sygnału CS oraz reakcje bezwarunkowe (UR). Nieasocjacyjne SR są zazwyczaj niskie lub nie występują u dobrze wytrenowanych gryzoni, podczas gdy UR powinny charakteryzować się wysoką częstotliwością i amplitudą. Zadanie to wymaga, aby gryzoń nauczył się powiązać zakończenie CS z początkiem US (podczas odstępu), co sprawia, że jest ono z natury trudniejsze do opanowania w porównaniu z warunkowaniem ECC z opóźnieniem (delay ECC). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

W niniejszej pracy demonstrujemy niekorzystne skutki funkcjonalne noworodkowej ekspozycji na alkohol podawany w sposób przypominający binge drinking, oceniane za pomocą procedury śledzącego uwarunkowania klasycznego (trace ECC), w której podawany jest sygnał dźwiękowy CS o natężeniu 85 dB (2,8 kHz) trwający 380 ms, po czym następuje wstrząs US o natężeniu 1,6 mA trwający 100 ms, a bodźce te są rozdzielone okresem śledzenia trwającym 500 ms. W poprzednich badaniach analizujących interwencję choliną oraz suplementację żelazem w łagodzeniu skutków noworodkowej ekspozycji na alkohol opisaliśmy użyteczność tego testu behawioralnego¹⁸^,⁴⁷. W rzeczywistości trace ECC może być wykorzystywane jako narzędzie diagnostyczne do oceny patologii hipokampa wywołanej noworodkową ekspozycją na alkohol. Przewagą tej metody nad opóźnionym uwarunkowaniem klasycznym (delay ECC) jest większa czułość w wykrywaniu zaburzeń funkcji hipokampa, które są upośledzone u ludzi z FASDs.

Zastosowanie ECC wykracza daleko poza dziedzinę badań nad płodowym zespołem alkoholowym. Wiele wariantów ECC (np. opóźnienie, ślad, złożoność, odwrócenie) może być wykorzystanych do wyjaśnienia ontogenetycznych różnic w uczeniu się na różnych etapach rozwoju, neurobiologicznych podstaw uczenia się asocjacyjnego u ssaków, a także podatności różnych układów mózgowych na liczne zagrożenia, w tym (ale nie tylko) teratogeny, toksyny środowiskowe, urazy czaszkowo-mózgowe, choroby neurodegeneracyjne oraz zaburzenia psychiatryczne.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z zasadami określonymi przez IACUC Uniwersytetu East Carolina. Szczury rasy Long-Evans uzyskano z samic kopulowanych z samcami hodowlanymi. Szczury z trzech grup badawczych (patrz 1.1) pochodziły z miotów tej samej matki. Uzyskano pięć miotów, a każdy z nich został zredukowany do 8 młodych w 3. dniu po urodzeniu (PD). Pozostałe dwa młode z każdego miotu przypisano do osobnych eksperymentów. W badaniu uwzględniono potomstwo obu płci (jedno zwierzę na grupę ekspozycyjną). W badaniu przeanalizowano łącznie N = 27 dorosłych osobników; 3 szczury zostały wykluczone z powodu uszkodzenia przewodów 3T (patrz 3.1.1), których nie udało się naprawić w 1. dniu treningu ECC.

1. Przygotowanie grup, materiałów i roztworów

W 3. dniu po urodzeniu (PD 3) oddzielć młode od matki i umieść je na termoregulowanej podkładce grzewczej z wodą, aby utrzymać ciepło. Zastosuj procedurę losowego przydziału, aby podzielić szczury na jedną z trzech grup: (1) intubowaną alkoholem (AI); (2) kontrolną z intubacją pozorowaną (SI); lub (3) kontrolną nieintubowaną (UC). Przeprowadź zatwierdzone procedury identyfikacji, takie jak tatuowanie łap nietoksycznym tuszem za pomocą igły 30G x 1/2 in zgodnie ze schematem numeracji. Po zakończeniu tatuowania zwróć młode do matki.
Przygotuj rurkę(i) do intubacji wewnątrzżołądkowej, używając polietylenu (PE) w rozmiarach 50 i 10. Całkowita długość rurki zależy od preferencji użytkownika i może zostać odpowiednio dostosowana.
1. Używając mikronożyczek chirurgicznych, odetnij odcinek 3 in rurki PE-50 oraz odcinek 6 in rurki PE-10.
2. Ostrożnie przymocuj rurkę PE-50 do sterylnej igły hipodermicznej 22 G x 1 in.
3. Wsuń jeden koniec rurki PE-10 w otwarty koniec rurki PE-50. Aby ułatwić wsunięcie rurki PE-10 do rurki PE-50, może być konieczne wykonanie skośnego cięcia na końcówce rurki PE-10.
4. Odetnij mały fragment rurki PE-50 (około 2-3 mm) i nałóż go na otwarty koniec rurki PE-10. Będzie on służył jako ogranicznik wizualny.
5. Przechowuj gotową rurkę do intubacji wewnątrzżołądkowej w świeżym 70% alkoholu izopropylowym, aby zachować sterylność.
Przeprowadź procedury aseptyczne w celu przygotowania roztworu mleka treściwego w butelkach o pojemności 50 mL. Roztwór mleka treściwego opiera się na formule żywieniowej opracowanej przez West i współpracowników (1984)⁴⁸. Przechowuj butelki w temperaturze -18 °C do momentu użycia. Przed użyciem rozmroź dwie butelki mleka w ciepłej wodzie.
1. Pobierz 7,16 mL 95% etanolu (USP) za pomocą sterylnej strzykawki i dodaj do jednej butelki mleka 50 mL. W ten sposób powstanie 11,9% v/v roztwór alkoholu, który podaje się młodym szczurom podczas dwóch pierwszych karmień w ciągu dnia (patrz 2.1.1); całkowita dzienna dawka alkoholu wynosi 5,25 g/kg/day. Została ona opracowana tak, aby dostarczyć alkohol w objętości (0,0278 mL/g na karmienie) w formie wzbogaconego roztworu mleka.
  UWAGA: Ilość tę można dostosować w zależności od wielkości miotu i przewidywanego zużycia w ciągu 3-4 dni. Ilość dodanego alkoholu musi zostać odpowiednio skorygowana, aby otrzymać roztwór 11,9% v/v.
2. Dobrze wstrząśnij butelką i odpowiednio ją opisz (np. 11,9% v/v etanol w mleku).
3. Odpowiednio opisz drugą butelkę mleka (bez dodatku alkoholu) (np. samo mleko) i wykorzystaj ją do karmień uzupełniających, zgodnie z opisem w 2.1.1.
4. Przechowuj obie butelki z mlekiem w lodówce.

2. Neonatalna ekspozycja na alkohol (dni postnatalne 4-9)

Szczenięta grup AI i SI poddawać łącznie 4 intubacjom dziennie, zaczynając od PD 4. Zachować 2 h odstępu między kolejnymi intubacjami. Ponieważ szczenięta AI są intubowane rzeczywistym roztworem, każda z ich intubacji jest uznawana za karmienie.
1. Szczenięta AI intubować roztworem 11,9% v/v alkoholu etylowego w mleku podczas dwóch pierwszych karmień w ciągu dnia, a następnie intubować je samym mlekiem podczas dwóch ostatnich karmień w celu uzupełnienia wzrostu.
2. Szczenięta SI intubować 4 razy co dwie godziny bez podawania roztworu, aby zapewnić taki sam czas ekspozycji na rurkę PE-10, jak w przypadku szczeniąt AI. Grupa UC nie poddawana jest żadnym intubacjom.
Odebrać szczenięta od matki i umieścić je na termoregulowanej podgrzewaczce wodnej, aby utrzymać ciepło. Zważyć każde szczenię i zapisać jego masę ciała (w g). Skorzystać z przygotowanej wcześniej tabeli karmienia, aby określić objętość intubacji dla każdego szczenięcia AI i odnotować ją w arkuszu rejestracyjnym.
1. Umieścić roztwór 11,9% v/v alkoholu etylowego w mleku w łaźni wodnej i dobrze wstrząsnąć.
2. Procedura intubacji wewnątrzkalutricznej:
  1. Rurkę do intubacji wewnątrzkalutricznej przechowywaną w 70% alkoholu izopropylowym dokładnie przepłukać ciepłą wodą.
  2. Pobrać odpowiednią ilość roztworu za pomocą sterylnej strzykawki 1 mL.
  3. Zanurzyć końcówkę rurki do intubacji (koniec PE-10) w świeżym oleju kukurydzianym (ułatwia to wprowadzanie).
  4. Zmierzyć długość rurki PE-10 od pyska szczenięcia do żołądka. Dostosować korek PE-50, aby służył jako punkt zatrzymania.
  5. Ostrożnie wprowadzić rurkę PE-10 do pyska szczenięcia, prowadząc ją w dół przełyku, lekko przechodząc przez zwieracz przełykowo-żołądkowy, aż do żołądka. Obejrzeć szczenię, ustabilizować je i powoli docisnąć tłok strzykawki, aby podać roztwór.
    UWAGA: Aby uniknąć przypadkowego wprowadzenia rurki do tchawicy, najpierw skierować rurkę tak, aby wygięła się i zetknęła z miękkim podniebieniem przed przesunięciem do przodu. Użyć podniebienia jako prowadnicy, ponieważ rurka naturalnie odbije się od tego obszaru i zostanie skierowana w dół przełyku. W przeciwnym razie każde znaczne odchylenie końcówki w kierunku brzuszny może spowodować jej wejście do tchawicy. W przypadku niepewności co do pozycji wprowadzenia najlepiej usunąć rurkę i nie kontynuować intubacji – rurkę należy wprowadzić prawidłowo przy następnej próbie.
  6. Ostrożnie usunąć rurkę PE-10 i sprawdzić, czy u szczenięcia nie wystąpił cofanie się roztworu, krwawienie lub obrażenia fizyczne. Jeśli szczenię jest zdrowe, oddać je do miotu. Cała procedura intubacji trwa mniej niż 1 min na każde szczenię i około 4 min łącznie dla 4 szczeniąt poddawanych intubacji w każdym miocie (2 AI, 2 SI).
  7. Procedura intubacji wewnątrzkalutricznej dla szczeniąt SI: Postępować zgodnie z tą samą procedurą wprowadzania PE-10 co w przypadku szczeniąt AI, ale bez podawania roztworu, przez ten sam czas (1 min).
  8. Wszystkie szczenięta oddać do matki natychmiast po zakończeniu procedur u ostatniego szczenięcia w miocie. Oddać matkę do wiwarium do czasu następnej sesji karmienia (za 2 h).
  9. Rurkę do intubacji wewnątrzkalutricznej przepłukać ciepłą sterylną wodą i umieścić ponownie w 70% alkoholu izopropylowym do przechowywania. Rurkę należy dobrze przepłukać wodą przed każdą sesją karmienia.
  10. Powtórzyć kroki od 2.2 (z wyjątkiem ważenia szczeniąt) do 2.2.2.9 dla drugiej sesji karmienia. Podczas dwóch ostatnich karmień intubować szczenięta AI samym mlekiem, stosując te same objętości intubacji określone w punkcie 2.2.
Ważyć szczury w regularnych odstępach czasu, np. w PD 15 (otwarcie oczu), PD 21 (odsadzenie), PD 30, PD 60 oraz PD 90 (operacja), aby uzyskać reprezentatywne krzywe wzrostu.

3. Wytwarzanie i modyfikacja elektrod

Przygotować jedną „głowicę” (headstage) do elektromiografii (EMG) dla każdego szczura (Rysunek 2). Głowica umożliwia rejestrację reakcji mrugania za pomocą systemu do badania mrugania (Rysunek 4).
1. Zbudować głowicę składającą się z dwóch przewodów ze stali nierdzewnej powlekanych politetrafluoroetylenem (PTFE) o rozmiarze 3T (każdy o długości 5 cm), jednego przewodu ze stali nierdzewnej powlekanego PTFE o rozmiarze 10T (5 cm), trzech męskich pinów kontaktowych oraz jednego izolatora gniazda mikrolistwy przyciętego do 3 otworów (patrz 3.1.4).
2. Zdjąć powłokę PTFE z przewodu 10T, chwytając go w środku ząbkowaną pęsetą precyzyjną i usuwając powłokę w obu kierunkach gładką pęsetą precyzyjną. Upewnić się, że z tego przewodu usunięto wszystkie ślady powłoki.
  1. Zaciśnąć jeden koniec przewodu 10T na pinie kontaktowym za pomocą dentystycznych szczypiec z ząbkowaną platformą; będzie on służył jako przewód uziemiający. Ostrożnie przytrzymać przewód 3T gładką pęsetą precyzyjną w odległości 1 do 1,5 mm od jednego z końców. Zdjąć powłokę PTFE na odcinku 1 do 1,5 mm, pozostawiając resztę powłoki nienaruszoną. Zaciśnąć pin kontaktowy na odsłoniętym końcu przewodu 3T.
  2. Wykonać te same czynności dla drugiego przewodu 3T. Oba przewody będą służyć jako dodatni i ujemny przewód elektrod rejestrujących EMG.
3. Przeprowadzić testy pociągania wszystkich przewodów, aby upewnić się, że są one solidnie przymocowane do pinów. Należy uważać, aby nie zgiąć ani nie uszkodzić przewodów.
4. Odciąć fragment listwy izolatora gniazda do 3,5 otworu (przecinając środek czwartego otworu) za pomocą ostrza ściągacza do przewodów. Przyciąć ten fragment do dokładnie 3 pełnych otworów i w razie potrzeby oszlifować obie strony. Pomaga to zapewnić dostępność 3 pełnych otworów. Wsunąć zestawy pin-przewód do trzech otworów mikrolistwy, aż zaciśnięte końce zrównają się z dolną krawędzią fragmentu izolatora. Zestaw 10T musi znajdować się w jednym z zewnętrznych otworów mikrolistwy, a nie w środkowym.
Zmodyfikować bipolarne elektrody stymulujące (Rysunek 2).
1. Przeznaczyć dla każdego szczura jedną bipolarną elektrodę stymulującą. Elektroda ta podaje niewielką ilość prądu elektrycznego za pomocą izolatora stymulacji (patrz system do badania mrugania) jako wstrząs US podczas ECC. Elektrody są nabywane od producenta w formie skręconej i są ekranowane.
2. Rozkręcić dwa metalowe przewody 2-3 razy, aby nadać im kształt litery V (rozstaw 5 mm), a następnie za pomocą gładkiej pęsety precyzyjnej wyprostować każdy „ząbek” w stopniu maksymalnym. Zdrapać 1 mm ekranowania z końcówki każdego ząbka (z każdej strony) za pomocą żyletki. Sprawdzić każdy ząbek pod kątem nierówności i zgięć i w razie potrzeby je skorygować, nie zdrapując dodatkowego ekranowania.
Usunąć olej produkcyjny i zanieczyszczenia z głowic EMG i elektrod bipolarnych, myjąc je w 95% alkoholu etylowym. Pozostawić do wyschnięcia, a następnie wysterylizować w autoklawie.

figure-protocol-1
Rycina 2: Elektrody do zapisu elektromiograficznego (EMG) oraz elektroda bipolarna. Gotowy przedwzmacniacz EMG (po prawej, pomarańczowy) składa się z trzech męskich pinów stykowych, dwóch przewodów z powłoką PTFE o rozmiarze 3T, jednego przewodu z powłoką PTFE o rozmiarze 10T oraz zmodyfikowanego paska mikrostrip. Trzy przewody mają długość około 5 cm każdy i są zacisnięte na pinach stykowych. Gotowa elektroda bipolarna (po prawej, biała) została rozpleciona, wyprostowana i uformowana w kształt litery V (rozstaw 5 mm). Ekranowanie zostało usunięte z końcówek obu wypustek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Procedura operacji powiek (90. dzień po urodzeniu)

Przygotowanie materiałów (szczegółowe informacje o zaopatrzeniu znajdują się w sekcji Materiały), zwierząt, obszaru chirurgicznego i niechirurgicznego:
1. Zautoklawować narzędzia i materiały chirurgiczne – liczba w nawiasach ( ) wskazuje przybliżoną ilość potrzebną na dorosłego szczura lub pomiar: narzędzia chirurgiczne (1 zestaw na 4 szczury, zgodnie z zatwierdzeniem przez ECU IACUC), gaziki (3-4), patyczki z watą (5-6), owijka 20 x 20 (4 na sesję chirurgiczną), tygiel porcelanowy (1), mikroszpatułka ze stali nierdzewnej (1), sól fizjologiczna 0,9% (1 butelka do płukania), szalka Petriego (1) oraz śruby ze stali nierdzewnej 0-80 (3/szczur).
2. Inne potrzebne sterylne materiały: ostrze chirurgiczne rozmiar 10 (1 na 4 szczury), pole chirurgiczne (1 na szczura), weterynaryjna maść oftalmiczna, powidona jodu (1 butelka do płukania), igła hipodermiczna 26G x 3/8" (2), niklowany uchwyt wiertarski z wiertłem #55, niklowany płaski śrubokręt jubilerski (ostrze 1,8-2 mm).
3. Przygotować sterylną strefę składowania wszystkich narzędzi i materiałów chirurgicznych, używając zatwierdzonego środka dezynfekującego klasy badawczej/medycznej. Umieścić materiały w tej przestrzeni, gdy obszar będzie gotowy.
4. Przygotować sterylną przestrzeń chirurgiczną, używając zatwierdzonego środka dezynfekującego klasy badawczej/medycznej. Przestrzeń ta zawiera termoregulowaną podkładkę grzewczą z wodą, aparat stereotaktyczny wyposażony w maskę do znieczulania szczurów, sterylizator koralikowy oraz parownik izofluranu (do znieczulenia). Parownik posiada rurki prowadzące do maski do znieczulenia oraz do komory indukcyjnej znajdującej się w oddzielnej przestrzeni do niejałowych procedur przygotowania zwierząt; każda rurka jest sterowana osobnym zaworem.
5. Dokładnie umyć ręce i przedramiona mydłem przeciwdrobniczym. Bez dotykania wnętrza, otworzyć wstępnie wszystkie elementy zapakowane w torebki lub owijki do sterylizacji. Założyć sterylne rękawiczki zgodnie z procedurą aseptyczną i przenieść wszystkie istotne elementy do strefy chirurgicznej. Ustawić wiertło na odpowiedniej głębokości w uchwycie (ok. 2 mm) i przygotować śrubokręt. Przykryć sterylne materiały sterylną owijką do momentu rozpoczęcia operacji.
6. Przygotować przestrzeń niejałową z wagą, elektrycznym trymerem do futra, sterylnymi strzykawkami 1 mL z igłami 26G x 3/8 in (1 na szczura), dziennikiem operacji oraz buprenorfiną (stężenie 0,03 mg/mL) w dawce 0,1 mL/100 gramów.
  UWAGA: Buprenorfina jest półsyntetycznym opioidem z grupy III wg DEA i musi być odpowiednio zabezpieczona w zamknięciu oraz ewidencjonowana.
7. Sprawdzić poziom gazu w parowniku izofluranu; w razie potrzeby dolać gazu. Na razie pozostawić pokrętła przepływu i mieszanki w pozycji wyłączonej. Otworzyć butlę z O₂ i upewnić się, że gazu wystarczy na wszystkie operacje.
8. Zważyć każdego szczura i zapisać masę ciała w dzienniku operacji. Skorzystać z tabeli wstrzykiwania buprenorfiny, aby określić odpowiednią objętość iniekcji.
9. Otworzyć zawór parownika prowadzący do komory indukcyjnej i pozostawić zamkniętym zawór do maski chirurgicznej. Ustawić mieszankę na 3 i przepływ na 3 (3% izofluranu z 100% O₂ jako gazu nośnego przy objętości 3 L/min).
10. Umieścić szczura w komorze indukcyjnej i poczekać, aż osiągnie odpowiednią płaszczyznę znieczulenia (spowolniony oddech, brak odruchu z łap, brak odruchu mrugania). Wyjąć szczura z komory po osiągnięciu płaszczyzny znieczulenia.
11. Ogolić głowę za pomocą trymera, odsłaniając wystarczającą ilość skóry w miejscu nacięcia oraz lewą powiekę. W razie potrzeby ponownie umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej, aby ponownie osiągnęło płaszczyznę znieczulenia przed kontynuacją strzyżenia.
12. Zdezynfekować odsłoniętą skórę, stosując naprzemienne przecieranie alkoholem izopropylowym i powidonem jodu trzy razy. W razie potrzeby ponownie umieścić zwierzę w komorze indukcyjnej, aby ponownie osiągnęło płaszczyznę znieczulenia przed przeniesieniem na stół operacyjny.
Operacja
1. Otworzyć zawór parownika prowadzący do maski znieczulającej i zamknąć zawór do komory indukcyjnej. Dostosować mieszankę do 2,5 i przepływ do 2 (2,5% izofluranu z 100% O₂ jako gazu nośnego przy objętości 2 L/min). Przenieść szczura do aparatu stereotaktycznego i postępować zgodnie ze standardowymi procedurami mocowania głowy do pręta siekaczy i prętów usznych (przykład opisany w Geiger et al., 2008⁴⁹).
2. Wykonać przedsurgicalną iniekcję buprenorfiny (SC) i ostrożnie wyrzucić igłę (bez nakładki) do pojemnika na odpady ostre. Nałożyć na szczura sterylne pole chirurgiczne, odsłaniając tylko obszar operacyjny i izolując go od reszty ciała.
3. Założyć maskę chirurgiczną, czepek chirurgiczny, fartuch chirurgiczny, gogle oraz wszelkie inne środki ochrony osobistej wymagane przez IACUC. Dokładnie umyć i wyszorować ręce i przedramiona mydłem przeciwdrobniczym. Założyć sterylne rękawiczki zgodnie z procedurą sterylną.
4. Za pomocą patyczka z watą nałożyć niewielką ilość maści oftalmicznej do obu oczu, aby zapobiec ich wysychaniu.
5. Przystąpić do operacji, gdy szczur wykazuje odpowiednią płaszczyznę znieczulenia. Monitorować szczura nieprzerwanie przez cały czas trwania operacji i okresowo sprawdzać poziom izofluranu. Odpowiednio regulować pokrętła przepływu i mieszanki w trakcie operacji w zależności od reakcji szczura na znieczulenie.
6. Za pomocą ostrza skalpela wykonać nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki w kierunku przednio-tylnym. Nacięcie to powinno odsłonić wystarczający obszar przed oczami (tj. odsłonić kość czołową) i obszar nieco za szwem jagodowym.
7. Ostrożnie zeskrobać okostną z wierzchu czaszki, aby nie spowodować nadmiernego krwawienia. Usunąć nadmiar tkanki łącznej i krwi za pomocą patyczka z watą.
8. Wywiercić otwór za pomocą wiertła w uchwycie, zaczynając bezpośrednio za szwem czołowym na jednej z kości ciemieniowych. Usunąć krew i odłamki kostne patyczkiem z watą. Chwycić śrubę 0-80 za gwint pęsetą anatomiczną i przymocować ją do otworu śrubokrętem jubilerskim; dokręcić śrubę tylko tyle, by nie uszkodzić tkanki korowej mózgu (zazwyczaj 3-4 pełne obroty).
9. Postępować zgodnie z procedurami opisanymi w 4.2.8, aby przymocować dwie kolejne śruby 0-80 do czaszki: jedną bezpośrednio za szwem czołowym przeciwległej kości ciemieniowej i jedną bezpośrednio przed prawym szwem jagodowym. Ustalono, że 3 śruby są wystarczające do zakotwiczenia cementu dentystycznego (patrz 4.2.18) do czaszki, ponieważ czwarta śruba (przed lewym szwem jagodowym) utrudniłaby umieszczenie elektrody bipolarnej.
10. Wyjąć wzmacniacz (headstage) EMG z szalki Petriego. Ustawić wzmacniacz tak, aby przewód 10T znajdował się po prawej stronie szczura. Zgiąć przewód 10T ku górze, tak aby był równoległy do dolnej krawędzi mikrostripu. Lekko zgiąć go w prawą stronę, aby przewód mógł obejść przednią i tylną śruby 0-80. Odłożyć go, ale w zasięgu ręki.
11. [Zakładając, że operator jest praworęczny] W lewej ręce trzymać pęsetę chirurgiczną 3-calową, a w prawej pęsetę chirurgiczną 4-calową. Chwycić górną skórę w miejscu nacięcia lewego oka pęsetą 4-calową i skierować pęsetę 3-calową w stronę kącika tego oka; chwycić skórę w tym kąciku. Utrzymać chwyt pęsetą 3-calową, puszczając pęsetę 4-calową.
12. Wziąć jedną igłę 26G x 3/8 in i wprowadzić ją przez kącik powieki; obrócić igłę tak, aby ścięta strona była skierowana do góry. Użyć pęsety mikrodyssekcyjnej z platformą, aby wprowadzić środkowy przewód 3T do otworu igły. Przesunąć go przez otwór o kilka centymetrów, nie wprowadzając go całkowicie; przewód ten jest przewodem ujemnym.
13. Wykonać procedury opisane w 4.2.11 i 4.2.12, aby wprowadzić zewnętrzny przewód 3T w środkową część powieki; przewód ten jest przewodem dodatnim.
14. Chwycić obie igły jedną ręką, a wzmacniacz drugą ręką (lub pęsetą). Wyciągnąć igły z powieki, prowadząc wzmacniacz w tym samym kierunku jednym ciągłym ruchem. W razie potrzeby obrócić wzmacniacz tak, aby przewód 10T był skierowany w stronę prawego oka zwierzęcia; nie dopuścić do skrzyżowania się przewodów 3T. Użyć pęsety z cienkimi końcami, aby upewnić się, że przewód dodatni znajduje się w środku powieki.
15. Ustawić wzmacniacz tak, aby był wycentrowany między oczami i znajdował się w optymalnej pozycji na kości czołowej, przed obustronnie wkręconymi śrubami. Trzymać wzmacniacz jedną ręką, a pęsetę 3-calową drugą ręką. Owinąć przewód 10T wokół jednej lub obu śrub po stronie przewodu 10T.
16. Wziąć pęsetę 3-calową do jednej ręki, a pęsetę 4-calową do drugiej. Użyć pęsety 3-calowej do chwycenia skóry w miejscu nacięcia w kierunku lewej skroni. Użyć pęsety 4-calowej do stworzenia małej „kieszonki” poprzez oddzielenie skóry (tj. powięzi powierzchownej) od mięśnia skroniowego. Użyć nożyczek irydowych, aby wyciąć więcej tkanki łącznej, kierując się w stronę kącika lewego oka, aby zwiększyć rozmiar tej kieszonki. Należy uważać, aby nie wejść zbyt głęboko i nie przeciąć naczyń krwionośnych.
17. Wziąć elektrodę bipolarną i uformować przewody tak, aby można było je dopasować do krzywizny mięśnia skroniowego, podczas gdy dwa kolce znajdują się (grzbietowo i brzusznie) za lewym okiem (patrz wideo), a dolny koniec elektrody bipolarnej może być umieszczony bezpośrednio na czaszce. Pozostawić wystarczający odstęp między wzmacniaczem a tą elektrodą, aby wtyczki kabla komutatora (Rycina 3) mogły zostać podłączone bez przeszkód.
18. Wsypać proszek cementu dentystycznego do tygla – zacząć od około 1/3 tygla, a następnie dostosować ilość w razie potrzeby. Dodać składnik płynny, aż konsystencja stanie się wodnista, i wymieszać składniki szpatułką. Gdy konsystencja cementu stanie się bardziej lepka, nałożyć go w miejscu nacięcia – przykrywając wszystkie brzegi skóry marginesem co najmniej 1/8 in.
  1. Nałożyć wystarczającą ilość cementu, aby ustabilizować wzmacniacz i elektrodę bipolarną, nie uniemożliwiając szczurowi zamknięcia obu oczu. Szybko wytrzeć cały cement, który skapnął na niepożądane obszary futra szczura.
19. Upewnić się, że co najmniej 4-5 zwojów elektrody bipolarnej pozostało niezakrytych cementem, tak aby można było przykręcić wtyczkę bipolarną (Rycina 3). Usunąć nadmiar cementu ze wzmacniacza – góra mikrostripu i trzy piny kontaktowe muszą być czyste. Cement twardnieje szybko i może łatwo uniemożliwić pełne sprzężenie którejkolwiek z tych elektrod z wtyczkami kabla komutatora. Użyć pęsety anatomicznej do usunięcia nadmiaru częściowo zaschniętego cementu.
20. Odczekać do stwardnienia cementu; stanie się on przezroczysty. Użyć mikronożyczek dyssekcyjnych, aby odciąć nadmiar długości z dwóch przewodów 3T, pozostawiając kilka centymetrów zapasu do pracy.
21. Chwycić pęsetę mikrodyssekcyjną z platformą w lewej ręce, a pęsetę mikrodyssekcyjną z cienkimi końcami w prawej. Chwycić jeden przewód 3T lewą pęsetą nieco przed powieką. Prawą pęsetą odsunąć powiekę do góry, aby odsłonić więcej przewodu 3T i utrzymać ją w tej pozycji. Puścić lewą pęsetę i chwycić wzmacniacz lewą ręką (upewniając się, że jest już stabilny). Użyć prawej pęsety, aby zdjąć część izolacji PTFE, co pozwoli przewodowi na kontakt z mięśniem okrężnym oka (orbicularis oculi).
  UWAGA: Należy uważać, aby nie ciągnąć zbyt mocno za przewód 3T, ponieważ może on odłączyć się od pinu kontaktowego. Jeśli przewód się odłączy, nie będzie możliwe zastąpienie pinu kontaktowego, ponieważ stwardniały cement nie oddzieli się swobodnie od czaszki bez spowodowania złamania kości.
22. Wykonać kroki opisane w 4.2.21, aby usunąć nadmiar PTFE z drugiego przewodu 3T.
23. Chwycić dwie pęsety mikrodyssekcyjne zgodnie z opisem w 4.2.21 (z platformą w lewej, z cienkimi końcami w prawej). Ustawić lewą pęsetę nieco przed jednym z przewodów 3T, pozostawiając miejsce na prawą pęsetę bezpośrednio przed powieką. Chwycić przewód obiema pęsetami.
  1. Utworzyć „haczyk”, trzymając prawą pęsetę nieruchomo i obracając lewą pęsetę do góry i w stronę powieki; wykonać to jednym ruchem. Ostrożnie puścić prawą pęsetę, a następnie lewą.
    UWAGA: Zahaczenie elektrod o powieki pomaga zminimalizować możliwość ich ocierania o rogówkę. Minimalizuje to również ryzyko przerwania przewodu w dowolnym momencie fazy testów behawioralnych. Choć zahaczanie nie zapobiega całkowicie ocieraniu się przewodu o rogówkę u wszystkich zwierząt, zazwyczaj nie wykazują one oznak uszkodzenia oka, co potwierdzają wysokie amplitudy mrugania (mierzone oscyloskopem cyfrowym w 5.1.7) oraz codzienne pooperacyjne obserwacje stanu zdrowia (nadmierne łzawienie, częściowe zamknięcie powieki, brak ruchomości z powodu uszkodzenia oka). Jeśli szczur wykazuje początkowe oznaki dyskomfortu, jest znieczulany izofluranem (patrz 4.1.10), a jego elektrody są ponownie badane i/lub repozycjonowane. Stosuje się maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki. Szczura obserwuje się codziennie pod kątem powikłań ocznych po zabiegu; w przypadku ich utrzymywania się należy skonsultować się z weterynarzem. Szczury, u których wystąpią ciężkie powikłania oczne, których nie można skorygować poprzez repozycjonowanie elektrod lub leczenie weterynaryjne, są humanitarnie uśmiercane zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi ECU IACUC.
24. Wykonać kroki opisane w 4.2.23 dla drugiego przewodu 3T. Odciąć nadmiar przewodu za pomocą mikronożyczek dyssekcyjnych.
25. Jedną ręką zwolnić szczura z prętów usznych, podtrzymując jego ciało drugą ręką. Sprawdzić, czy na głowie nie ma krwi lub zanieczyszczeń, w razie potrzeby oczyścić i podać pooperacyjną iniekcję buprenorfiny.
26. Umieścić szczura w pojemniku rekonwalescencyjnym z źródłem ciepła (takim jak termoregulowana podkładka grzewcza z wodą), aby wspomóc powrót do sprawności. Zapisać czas zakończenia operacji w dzienniku oraz wszelkie istotne uwagi dotyczące szczura podczas zabiegu. Monitorować prawidłowość oddychania szczura; gdy przyjmie on pozycję sternalną lub zacznie się poruszać, można go przenieść do klatki macierzystej.
27. Ponownie wysterylizować narzędzia (z wyjątkiem pęset mikrodyssekcyjnych – mogą one ulec uszkodzeniu) za pomocą sterylizatora koralikowego i upewnić się, że obszar chirurgiczny pozostaje aseptyczny; powtórzyć procedury aseptyczne, jeśli wykonywanych jest wiele operacji powiek.

5. Procedura klasycznego warunkowania mrugania okiem

figure-protocol-2
Rysunek 3: Zmodyfikowana komora do warunkowania instrumentalnego w celu warunkowania mrugania okiem. Szczury są ssakami poruszającymi się swobodnie, dlatego w celu utrzymania kontaktu sygnału elektrycznego z EMG oraz wtyczek bipolarnych przymocowanych do głowy stosowany jest obrotowy komutator. Komutator jest przymocowany do ramienia wspornika, który jest przeciwważony w celu zmniejszenia nacisku na szczura. Tweeter piezoelektryczny (głośnik) emituje ton o częstotliwości 2,8 kHz i natężeniu 85 dB; wartości te są regularnie kalibrowane. Pianka akustyczna wspomaga tłumienie hałasu otoczenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 4: System warunkowania mrugania okiem. Ten zbudowany na zamówienie system składa się z jednostki integratora EMG, która filtruje i wzmacnia sygnały przychodzące od szczurów, jednostki sterowania bodźcami, która dostarcza różne bodźce oprócz tonów i wstrząsów, przedwzmacniacza dla każdej komory operacyjnej w celu zwiększenia wzmocnienia sygnału EMG oraz izolatora bodźców dla każdej komory operacyjnej; zapewnia on zmienne poziomy wstrząsów (w mA). Cyfrowy oscyloskop (niebędący częścią standardowego systemu mrugania) jest wykorzystywany do celów diagnostycznych podczas habituacji i nabytego odruchu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Trening habituacji i nabywania rozpocząć 5 dni po operacji. Każdemu szczurowi zapewnić jeden dzień oswojenia oraz habituacji do aparatury treningowej, która składa się z zmodyfikowanej komory warunkowania instrumentalnego umieszczonej w większej komorze wyciszonej (Rysunek 3) – a następnie przeprowadzić 6-dniowy trening nabywania reakcji. Sesje habituacji i nabywania reakcji należy przeprowadzić z wykorzystaniem systemu badania mrugania opracowanego na zamówienie (Rycina 4).
1. Utwórz plik dziennika treningowego i wydrukuj go do codziennego prowadzenia zapisów. W dzienniku tym grupa szczurów powinna zostać przydzielona pseudolosowo (lub za pomocą innej metody randomizacji) do ich klatek treningowych.
2. Włącz system eyeblink, komputer i uruchom oprogramowanie eyeblink. Ta wersja oprogramowania posiada różne moduły (lub aplikacje), które działają niezależnie. Uruchom moduł Animal, aby utworzyć plik *.RAT zawierający informacje o badanych osobnikach (numer sesji, identyfikator zwierzęcia, płeć, masę ciała i numer klatki). Pojedynczy plik RAT obsługuje do czterech szczurów, co stanowi grupę badawczych osobników. Wprowadź odpowiednie wartości i zapisz plik. Utwórz oddzielny plik RAT dla każdej grupy szczurów przeznaczonej do treningu.
3. Przenieś szczury z wiwarium do pomieszczenia badawczego i zamknij drzwi. Każdego szczura oswoj przez 5 min.
4. Przenieś szczura do wyznaczonego pudełka i podłącz wtyki EMG oraz bipolarne z kabla komutatora do odpowiadającego im przedwzmacniacza EMG i elektrody bipolarnej na głowie zwierzęcia.
  UWAGA: Przy pierwszym kontakcie z kablem komutatora szczur może stawiać opór i wykazywać oznaki stresu. Należy obchodzić się ze zwierzęciem ostrożnie i wprowadzać przerwy pomiędzy nieudanymi próbami podłączenia, aby zredukować poziom stresu.
5. Użyj obrotowego komutatora 360° przy jednoczesnym zachowaniu przesyłu i odbioru sygnału elektrycznego podczas swobodnego poruszania się szczura wewnątrz klatki. Posiada ono 5 kanałów (3 dla elektrod EMG, 2 dla elektrod bipolarnych) prowadzących do jednostki EMG Integrator, która filtruje i wzmacnia surowy sygnał.
6. Upewnij się, że szczur porusza się swobodnie i nie jest ograniczany przez ciężar zespołu kabla komutatora ani ramienia wspornika. W razie potrzeby wyreguluj przeciwwagę z tyłu wspornika. Sprawdź, czy wszystkie wtyczki są dobrze osadzone, a następnie zamknij drzwiczki klatki. Powtórz tę samą procedurę podłączenia i kontroli dla wszystkich szczurów.
7. Użyj oscyloskopu, aby obserwować aktywność EMG pod kątem sygnałów nieprawidłowych (np. aktywności elektrycznej o wysokiej częstotliwości i/lub wysokiej amplitudzie) oraz systemu monitoringu wideo, jeśli jest dostępny, aby sprawdzić stan zwierząt (np. aktywność motoryczną, wrażliwość na otoczenie, oznaki bólu). Wszelkie zaobserwowane problemy odnotuj w dzienniku treningowym.
8. Pozostawić szczury w komorach na 10 min w celu habituacji, a następnie przenieść je z powrotem do klatek macierzystych.
9. Wyczyścić i zdezynfekować komory operacyjne, zamieść podłogę oraz wyczyścić stół (stoły). Procedury te należy przeprowadzać po każdej sesji.
Trening nabywania odbywa się przez 6 kolejnych dni (sesji).
1. Dzień 1: Przenieś szczura do wyznaczonego pudełka i podłącz wtyczki EMG oraz bipolarne z kabla komutatora do odpowiedniego przedwzmacniacza EMG i elektrody bipolarnej na jego głowie. Przeprowadź te same procedury, które wskazano w punktach 5.1.6 i 5.1.7.
2. Włącz izolatory stymulacji i ustaw natężenie prądu na 0,4 mA (4% z 10 mA, jak pokazano na filmie). Izolatory dostarczają prąd elektryczny naprzemiennie (tj. z próby na próbę) pomiędzy grzbietowym a brzusznym zębem elektrody bipolarnej. Pomaga to zmniejszyć zmęczenie włókien mięśniowych (w każdym miejscu aplikacji) podczas wielokrotnego podawania bodźca.
3. Obserwuj wszystkie reakcje mrugania oraz wykazaną tolerancję w każdej próbie dla wszystkich szczurów. Po każdej drugiej próbie zwiększaj natężenie bodźca bezwarunkowego (US) w postaci wstrząsu o 0,4 mA dla każdego szczura, aż do osiągnięcia wartości 1,6 mA (w próbach 7 i 8). Upewnij się, że wszystkie szczury reagują prawidłowo w swoich klatkach, że wszystkie ustawienia wzmocnienia i wzmocnienia sygnału są stałe oraz że sygnały elektryczne z nich pochodzące są prawidłowe (tj. występuje niski lub niewielki szum EMG). Przez wszystkie dni treningu nabywania stosuj natężenie bodźca bezwarunkowego US wynoszące 1,6 mA.
  UWAGA: Jeśli szczur wykazuje oznaki bólu przy danym poziomie wstrząsu (np. wysokie podskoki, wspinanie się po ścianach, bieganie w kółko), próbę przerywa się, a zwierzę wraca do poprzedniego ustawienia natężenia prądu (niższego o 0,4 mA) na dwie próby. Następnie szczur ponownie otrzymuje wyższą wartość wstrząsu, której wcześniej nie tolerował; w przypadku wykazania tolerancji, podaje się coraz wyższe wartości, aż do osiągnięcia 1,6 mA. Jeśli zwierzę nie toleruje żadnej z tych wartości, przez cały okres treningu stosuje się kolejną niższą wartość (w przyrostach 0,4 mA), która jest tolerowana.
4. Użyj oscyloskopu, aby zaobserwować aktywność EMG w poszukiwaniu sygnałów nieprawidłowych (np., wysoką częstotliwość i/lub wysoką amplitudę aktywności elektrycznej) oraz system wideonadzoru do monitorowania ich stanu (np., aktywność motoryczna, wrażliwość na środowisko, oznaki bólu).
  UWAGA: Wyjaśnienie zapisu ECC: Reprezentatywna epoka próbna z zarejestrowanymi przebiegami EMG została przedstawiona w Rycina 1 a szczegółowa procedura śledzenia ECC została wyjaśniona w materiale wideo. Plik treningowy warunkowania śledzącego jest skonfigurowany tak, aby przeprowadzić 100 prób (90 prób z parowaniem CS-US oraz 10 prób z samym CS na każde 10^th próba) ze średnim odstępem między próbami wynoszącym 30 s. Cała sesja treningowa trwa około 52 min (przy założeniu braku przerw). Wszystkie szczury w sesji 1 są naiwne i będą wykazywać zróżnicowane krzywe uczenia się (określane na podstawie ekspresji odruchów warunkowych), w miarę postępów w kilkudniowym treningu.
5. Rozpoczęcie szkolenia: Uruchom moduł oprogramowania Blink. Po wyświetleniu odpowiedniego monitu wybierz właściwy plik RAT oraz plik szkoleniowy dla "ślad" warunkowanie mrugania okiem
6. Zapisz godzinę rozpoczęcia oraz imię i nazwisko eksperymentatora w dzienniku treningowym. Na tym etapie monitoruj wszystkie parametry: prawidłowe sygnały EMG, właściwe reakcje mrugania na szokowy bodziec bezwarunkowy (US) (tj. silne/częste reakcje bezwarunkowe), stan zdrowia zwierząt oraz prawidłowe działanie sprzętu. Wszelkie istotne uwagi odnotuj w dzienniku treningowym.
7. Gromadzenie danych odbywa się automatycznie za pomocą oprogramowania w postaci plików RAW (jeden plik na szczura na dzień). Pliki RAW zawierają amplitudę EMG (w woltach), liczbę częstotliwości, latencję oraz dane powierzchniowe dla reakcji przestrachu (SR), reakcji bezwarunkowych (UR) oraz reakcji warunkowych (CR; całkowitych i adaptacyjnych). Artefakt wstrząsu maskuje pierwsze 100 ms okresu UR, w związku z czym dane UR znajdują się wyłącznie w ostatnich 140 ms tego okresu.
8. Po zakończeniu treningu oprogramowanie zostanie automatycznie zamknięte. Należy wyjąć wszystkie szczury z boksów treningowych i przenieść je z powrotem do wiwarium.
9. Powtórz kroki 5.2.5 – 5.2.6 dla wszystkich kolejnych dni treningu. Przed uruchomieniem modułu Blink w danym dniu zaktualizuj numer sesji w pliku RAT. Pozwoli to na utworzenie nowych plików RAW dla wszystkich szczurów w tym dniu. Każdy szczur powinien mieć 6 plików RAW, zakładając, że żaden z nich nie został wykluczony z treningu.
Przetwórz pliki RAW i utwórz plik przefiltrowany do analizy statystycznej.
1. Uruchom moduł analizy (Analysis). Przejrzyj każdą sesję dla każdego szczura w ujęciu poszczególnych prób w celu zidentyfikowania prób problematycznych. Jest to wykonywane w celu wyeliminowania prób, które mogą być obarczone błędami z różnych przyczyn (np., nadmierna aktywność bazowa przed CS, nadmierny ruch, odłączenie elektrody, problemy z okablowaniem/przewodami). Oprogramowanie posiada algorytmy, które pomagają eksperymentatorowi w wykrywaniu i usuwaniu "nieudane badania kliniczne" z bycia częścią przefiltrowanego zbioru danych.
2. Zaimportuj przefiltrowane dane do programu arkusza kalkulacyjnego i przeprowadź odpowiednie analizy statystyczne.

Wyniki

Oprogramowanie do badania mrugania okiem pozwala na uzyskanie obszernego i kompleksowego zestawu danych dla wielu rodzajów pomiarów. Dla zwięzłości, w niniejszym badaniu przedstawiamy reprezentatywne wyniki dla miar uczenia się i wydajności, obejmujące procent adaptacyjnej odpowiedzi warunkowej (CR), amplitudę adaptacyjnej CR, procent odpowiedzi bezwarunkowej (UR) oraz amplitudę UR. Wybrano okres adaptacyjnej CR, ponieważ reprezentuje on nabywanie odpowiednio zsynchronizowanych reakcji mrugania okiem w wyniku powtarzalnego treningu, co jest efektem zwiększonej plastyczności synaptycznej w hipokampie podczas warunkowania z odstępem czasowym (trace ECC)⁵⁰^,⁵¹^,⁵². Miary UR wybrano w celu wyjaśnienia, czy deficyty uczenia się w trace ECC wywołane przez alkohol w okresie noworodkowym wynikały z zaburzeń uczenia się asocjacyjnego, czy z zaburzeń w reagowaniu na wstrząs jako bodziec bezwarunkowy (US) – co mogłoby wskazywać na różnice motywacyjne lub motoryczne, a nie na różnice w uczeniu się między grupami badawczymi. Dane dla każdego pomiaru analizowano za pomocą mieszanych testów ANOVA 2 (Płeć) x 3 (Grupa noworodkowa) x 6 (Sesja), gdzie Sesja była czynnikiem z powtarzanymi pomiarami. Istotne główne efekty leczenia noworodków analizowano za pomocą testów post hoc Tukeya, a istotne interakcje za pomocą testów efektów prostych. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy minimalnym poziomie istotności alfa 0,05, a wyniki na wykresach przedstawiono jako średnia ± SEM.

Zaczynając od pomiaru procentowego adaptacyjnej reakcji warunkowej (CR), analiza ANOVA wykazała istotny główny efekt grupy noworodkowej, F(2,21) = 11,69, p <0,001, ale brak istotnego głównego efektu płci (p = 0,71) lub istotnej interakcji między tymi czynnikami (p = 0,20). Zgodnie z oczekiwaniami, procent adaptacyjnej CR wzrastał w ciągu sześciu sesji treningowych, F(5, 105) = 81,15, p <0,001, a różnice między grupami noworodkowymi były zależne od poziomu sesji, F(10, 105) = 4,58, p <0,001. Nie stwierdzono innych istotnych interakcji z udziałem czynnika sesji. Podobnie w przypadku amplitudy adaptacyjnej CR, ponownie wystąpił istotny główny efekt grupy noworodkowej, F(2,21) = 22,32, p <0,001, ale brak istotnego głównego efektu płci (p = 0,21) lub istotnej interakcji między tymi czynnikami (p = 0,48). Amplituda CR również istotnie wzrastała w ciągu sześciu sesji treningowych, F(5, 105) = 59,27, p <0,001, a różnice między grupami noworodkowymi były zależne od poziomu sesji, F(10, 105) = 4,31, p <0,001. Ogólnie rzecz biorąc, oba pomiary CR wykazały istotne różnice między średnimi grup, a średnie te różniły się znacząco w różnych sesjach treningowych. Aby potwierdzić, które grupy różniły się istotnie, przeprowadzono testy post hoc Tukeya, które wykazały, że szczury z intubacją alkoholową (AI) osiągały istotnie gorsze wyniki w obu pomiarach CR niż szczury kontrolne nieintubowane (UC) i szczury z intubacją pozorowaną (SI) (p <0,01 dla procentu CR; p <0,001 dla amplitudy CR), które nie różniły się od siebie (p >0,05). Testy efektów prostych przeprowadzone dla istotnych interakcji Grupa noworodkowa x Sesja dla obu pomiarów CR potwierdziły, że szczury AI wykazywały istotnie większe upośledzenie w nabywaniu CR począwszy od sesji 2 aż do sesji 6 w porównaniu do szczurów UC i SI (wszystkie p <0,05), które nie różniły się od siebie przez sześć sesji. Jedynym wyjątkiem była amplituda adaptacyjnej CR dla szczurów SI, która nie zaczęła różnić się istotnie od szczurów AI aż do sesji 3. Wyniki te przedstawiono na Rysunku 5A, 5B.

Nie stwierdzono istotnych różnic w pomiarach UR ze względu na płeć, grupę noworodkową ani interakcje tych czynników z czynnikiem sesji. Te negatywne wyniki wskazały, że każda grupa była w stanie w równym stopniu wywoływać reakcje mrugania w odpowiedzi na szokowy US, a deficyty uczenia się obserwowane u szczurów AI nie były uwarunkowane różnicami motywacyjnymi lub motorycznymi w mruganiu (Rycina 6A, 6B).

figure-results-1
Rysunek 5: Nabywanie śladowej reakcji warunkowej (średnia ± SEM). Wczesna ekspozycja na alkohol (grupa AI) znacząco wpłynęła na nabywanie procentowej wartości (A) oraz amplitudę (B) adaptacyjnej reakcji warunkowej (CR). Śladowe ECC jest z natury trudne do nabycia, dlatego wartości te są stosunkowo niższe dla wszystkich grup – w przypadku ECC z opóźnieniem w modelach FASD u gryzoni wartości procentowe mogą osiągać 80-85%²¹^,⁵³. Niemniej jednak procedura śladowego ECC jest bardziej obciążająca dla hipokampa, który jest podatny na działanie alkoholu podczas wczesnego rozwoju mózgu. * = p <0.05, ** = p <0.01, *** = p <0.001 pomiędzy szczurami UC i AI; wielkości próby podano w nawiasach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 6: Nabywanie reakcji bezwarunkowych (średnia ± SEM). Wydajność mrugania okiem (procent UR i amplituda UR) nie różniła się istotnie między grupami. Brak różnic wskazuje, że intensywność wstrząsu stosowana podczas treningu nabywania nie wpłynęła w sposób zróżnicowany na motywację szczurów AI ani na ich zdolność do wywoływania obronnych reakcji mrugania w odpowiedzi na wstrząs, w porównaniu z obiema grupami kontrolnymi (UC i SI). Wielkości prób podano w nawiasach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Nowonarodzone młode szczurów, które otrzymywały alkohol etylowy w 4-9 dniu po urodzeniu, wykazywały śladowe upośledzenie warunkowania mrugania oczami w wieku dorosłym. Odkrycia te potwierdzają ideę, że alkohol jest teratogenem o trwałym szkodliwym wpływie na funkcjonowanie hipokampa. Ogólnie rzecz biorąc, warunkowa odpowiedź w procedurze śladowej była niższa u szczurów narażonych na alkohol w porównaniu ze szczurami w obu grupach kontrolnych. Na asocjacyjne zaburzenia uczenia się u szczurów narażonych na działanie alkoholu nie miały wpływu różnice motywacyjne lub motoryczne (tj. brak różnic w mruganiu do intensywności szoku).

Chociaż TRACE ECC jest użytecznym narzędziem diagnostycznym do wyjaśniania neuropatologii hipokampa wywołanej prowokacją, wyniki tej metody muszą być umieszczone we właściwym kontekście. Po pierwsze, kluczowe elementy proceduralne tej demonstracji obejmowały celowe dostarczanie alkoholu w znanym oknie podatności rozwijającego się mózgu, wytwarzanie elektrod, które umożliwiają rejestrowanie aktywności elektromiograficznej i zapewniają wstrząs, chirurgiczne wszczepienie wspomnianego sprzętu oraz późniejsze testy na zwierzętach przy użyciu paradygmatu uczenia się, który ocenia funkcję poznawczą będącą przedmiotem zainteresowania. Na każdym etapie procesu należy zachować ostrożność, aby nie wyrządzić niepotrzebnej/niezamierzonej szkody gryzoniom i regularnie monitorować ich objawy zdrowotne. Ich wyniki behawioralne stanowią "okno" do poznania, konstruktu psychologicznego, który jest dokładnie opisany tylko wtedy, gdy ich zdrowie nie jest zagrożone przez błędy eksperymentalne obejmujące dawkowanie alkoholu, wady sprzętowe lub implantację chirurgiczną. W związku z tym każdy element proceduralny w procesie badawczym musi być wdrożony w sposób rzetelny, aby zapewnić ekstrapolację wyników ECC na wyniki badań na ludziach. Po drugie, paradygmat ECC zapewnia wgląd w naturę uczenia się asocjacyjnego, ale należy zachować ostrożność, aby nie rozszerzać wyników za pomocą tego podejścia i szeroko przypisywać je do innych domen poznawczych - takich jak pamięć robocza, wspomnienia krótko- i długoterminowe oraz świadomość - chyba że ktoś włączył jakiś aspekt tych domen do badania ECC za pomocą projektu eksperymentalnego. Na przykład, w tej demonstracji zbadano fazę akwizycji śladowego uczenia się ECC, ale nie zbadano zachowania pamięci u szczurów po zakończeniu treningu. Pamięć jest zatem niezależnym procesem psychologicznym, który powinien być oceniany nie tylko w procesie uczenia się). Z założenia można włączyć interwał zatrzymywania pamięci, aby ocenić zdolność pamięci krótkotrwałej lub długotrwałej. Po trzecie, uznanie, że istnieją^{równoległe systemy} pamięci, które mogą działać jednocześnie z czynnikami motywacyjnymi, empirycznymi i hormonalnymi, które przyczyniają się do zachowania, jest niezbędne do zrozumienia, że kojarzenie (podczas ECC) jest tylko jednym z wielu procesów, które ujawniają, co jest "dobre" lub "złe" w uczeniu się. Wreszcie, śladowe ECC nie jest zadaniem zależnym wyłącznie od hipokampa, ponieważ inne obszary mózgu mogą pośredniczyć w jakimś składniku CR. W związku z tym zrozumienie interakcji między różnymi obwodami neuronalnymi i/lub rodzajem parametrów bodźca, które są wykorzystywane w badaniu, musi być brane pod uwagę przy formułowaniu implikacji na podstawie dyskretnych wyników. Móżdżek, na przykład, również przyczynia się do śledzenia ECC, gdzie wpływa na charakterystykę topograficzną CR i czas CR, szczególnie gdy ISI jest krótkotrwały. Śladowe ECC nie występuje u ludzi z uszkodzeniem móżdżku, którzy są badani z długim odstępem między śladami (1000 ms), ale występuje u tych, którzy otrzymują krótszy odstęp śladowy (400 ms)³⁴. Ponadto obustronne zmiany grzbietowej przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC), które są ukierunkowane na przedni zakręt obręczy i przyśrodkowe obszary ziarniste u myszy, zapobiegają nabywaniu śladowych CRs⁵⁵, podczas gdy zniszczenie ogonowego mPFC u królików daje podobne wyniki⁴⁶. Odkrycia te podkreślają również znaczenie uwzględnienia różnic między gatunkami w udziale przedczołowym w uczeniu się asocjacyjnym napędzanym przez móżdżek i pień mózgu, takim jak śladowe ECC. Podczas gdy narażenie noworodków na alkohol podczas PD 4-9 niekorzystnie wpłynęło na nabycie śladowych CR 500 ms u dorosłych szczurów w tym badaniu i innych^47,56, nie jest to ten sam przypadek w przypadku noworodków narażonych na działanie alkoholu, które doświadczają 300-milisekundowego okresu śladowego, nawet gdy prowokacja była prowokowana stosunkowo wysoką dawką alkoholu (5 g / kg)⁵⁷, sugerując, że upośledzenie śladowe u szczurów narażonych na działanie alkoholu zależy od czasu trwania interwału śladowego.

W tym badaniu podkreślono, że hipokamp jest niezwykle ważny dla pośredniczenia w śladowym ECC, a gdy jest zagrożony ekspozycją noworodków na alkohol, wykazuje uszkodzenia związane z neuronami, co znajduje odzwierciedlenie w upośledzeniu nabywania śladowych CR. Należy jednak ostrzec, że obwody móżdżkowo-pniowe pnia, w szczególności jądro międzyporodowe, są niezbędne dla wielu aspektów ECC, w tym dla nabywania, wyrażania i cech topograficznych CR, w zależności od rodzaju zadania ECC, w tym śladu ECC 36,40,55,58,59. Rzeczywiście, ten obwód neuronalny oddziałuje z hipokampem w celu kierowania ekspresją CR podczas form ECC wyższego rzędu, takich jak ślad ECC⁶⁰. Nie jest do końca jasne, czy narażenie na alkohol we wczesnym okresie rozwoju mózgu wpływa konkretnie na funkcję hipokampa w śladowym ECC. Wiele różnych obszarów mózgu jest podatnych na wczesną chorobę alkoholową, w tym mPFC, móżdżek i hipokamp 18,19,23,47,61,62, i jest bardzo prawdopodobne, że alkohol zaburza funkcjonowanie tych struktur w różnym stopniu i na różne, ale funkcjonalnie ważne różnice w wielu procedurach ECC. Pomimo pułapek związanych z interpretacją wyników badań śladowych ECC, wykazano, że skuteczne nabycie śladowych CR zależy przynajmniej od nienaruszonego hipokampa, co potwierdzają badania zmian u zwierząt 42,44,63,64,65. Procedura ta pozostaje zatem bardzo cennym podejściem do wykazywania powiązań między rozwojową ekspozycją na alkohol a śladowymi reakcjami warunkowanymi, ponieważ obwody neuronalne leżące u jej podstaw są znacznie lepiej poznane niż w przypadku innych zadań zależnych od hipokampa, takich jak uczenie się miejsca w labiryncie wodnym Morrisa, rozpoznawanie nowych obiektów oraz warunkowanie strachu kontekstowego i śladowego.

ECC, jako behawioralna metoda "oznaczania" poznania, ma szerokie zastosowanie w dziedzinie neuroterapii rozwojowej. Rzeczywiście, ostatnie odkrycia z naszego laboratorium potwierdzają pogląd, że rozwijający się hipokamp jest wysoce wrażliwy na działanie alkoholu, które można złagodzić za pomocą różnych strategii interwencyjnych^18,47. Kluczową korzyścią jest to, że dzięki lepszemu zrozumieniu śladowych deficytów uczenia się ECC wywołanych alkoholem, mogą one przewidywać inne problemy w funkcjach opartych na hipokampie poza uczeniem się asocjacyjnym - szczególnie te, o których wiadomo, że są zapośredniczone przez ten sam obwód neurologiczny hipokampa.

Zastosowanie śladowego ECC i jego innych wariantów (np. opóźnienie, odwrócenie, dyskryminacja, związek) w celu wyjaśnienia mechanizmów neurobiologicznych i systemów neuronalnych zaangażowanych w uczenie się asocjacyjne może zostać rozszerzone poza obszar badań nad alkoholem płodowym. Na przykład, paradygmat ten zyskał wiele uwagi w przypadkach ludzi i zwierzęcych modelach zaburzeń psychicznych, takich jak schizofrenia ^66,67, choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera^68,69 i nadużywanie narkotyków 70,71,72. Korzyści płynące z jej stosowania jako metody badawczej do oceny funkcji i dysfunkcji neuropoznawczych są zatem widoczne w wielu dyscyplinach psychologicznych i biomedycznych, w tym w neurobiologii.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem dla TDT od Fundacji Badań Medycznych nad Napojami Alkoholowymi (ABMRF).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Narażenie na alkohol noworodków
190 Proof Ethyl Alcohol (USP)	Pharmco-AAPER	225-36000 [ECU Medical Storeroom]	Można zastąpić; powinien być USP; unikaj używania 200-procentowego alkoholu etylowego
Pojemnik/kosz dla szczeniąt	Dowolny
olej kukurydziany	Dowolna
pompa do terapii podgrzewaną wodą klasy spożywczej z / Podkładki	Gaymar	TP-500	Aby utrzymać szczenięta w cieple; można zastąpić
Igły podskórne 22G x 1 cal, sterylne	dowolne
igły podskórne 30G x 1/2 cala, sterylne	dowolny
alkohol izopropylowy 70%	EMD Millipore	PX1840-4 [Fisher Scientific]	Można zastąpić; klasa odczynnika www.fishersci.com
Szczury Long-Evans (samice i samce)	Charles River Laboratories	N/A [ECU Dept. of Comparative Medicine]	Należy określić wiek i wagę; ceny różnią się w zależności od tych czynników www.criver.com
Mikro nożyczki preparacyjne, 3,5 cala, ostrza 23 mm Instrumenty	do badań biomedycznych	11-2200	Do cięcia rur PE brisurgical.comRurki
polietylenowe 10 (0,011 cala) dowód osobisty; 0,024 cala O.D.)	BD Diagnostic Systems	22-204008 [Fisher Scientific]	Można zastąpić www.fishersci.com
Rurka polietylenowa 50 (0,023 cala. dowód osobisty; 0,038 cala O.D.)	Systemy diagnostyczne BD	22270835 [Fisher Scientific]	Można zastąpić www.fishersci.com
Regulowany podgrzewacz wody lub podgrzewacz do butelek z mlekiem dla niemowląt	Dowolny		opcjonalny; pomaga w podgrzewaniu roztworów zimnego mleka
Strzykawki tuberkulinowe, sterylne, 1,0 ml	dowolne
Strzykawki tuberkulinowe, sterylne, 10 ml	dowolne		Może być używany do wyciągania alkoholu etylowego lub używania odpowiedniej wielkości mikropipety
Waga	Dowolna		powinna mieć dobrą rozdzielczość (w gramach jednostek)
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
EMG Produkcja scen czołowych i elektroda bipolarna Modyfikacja
Elektroda bipolarna, 2-kanałowa SS Twisted	Plastics One, Inc.	MS303/2-B/SPC WYBIERZ SS 2C TW .008"	Należy określić niestandardową długość 20 mm poniżej cokołu www.plastics1.com
Centi-Loc Strip Socket Insulator (aka, Micro Strip)	ITT Cannon / ITT Interconnect Solutions	CTA4-IS-60* lub CTA4-1S-60*	*W zależności od dostawcy; patrz www.onlinecomponents.com lub www.avnetexpress.avnet.com
Szczypce dentystyczne, ząbkowane	CMF Medicon	390.20.05	Może być zastąpiony; służy do zaciskania przewodów na męskich stykach stykowych www.medicon.de
Nożyczki do mikropreparacji, ostrza 3,5 cala, 23 mm	Instrumenty do badań biomedycznych	11-2200	Używaj tylko do cięcia drutów 3T; cięcie drutów 10T spowoduje uszkodzenie ostrza - zamiast tego użyj ostrza ściągacza izolacji brisurgical.com
Drut ze stali nierdzewnej pokryty PTFE, 10T (średnica 0,010 cala)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS10T	www.sigmundcohn.com
Drut ze stali nierdzewnej pokryty PTFE, 3T (średnica 0,003 cala)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS3T	www.sigmundcohn.com
Żyletka	Dowolna		Do usunięcia 1 mm z zębów elektrody bipolarnej
Relia-Tac Gniazdo stykowe, męskie	Interkonekt	220-P02-100	Patrz Allied Electronics Cat # 70144761 www.alliedelec.com
Pęseta, wysoka precyzja, ząbkowana, 4 3/4 cala	Mikroskopia elektronowa Sciences	78314-00D	Aby mocno chwycić drut 10T podczas zdejmowania izolacji z PTFE za pomocą gładkiej pęsety www.emsdiasum.com
Pęseta, wysoka precyzja, gładka, 4 3/4 w	Mikroskopii elektronowej Sciences	78313-00B	www.emsdiasum.com
Pęseta, ultra cienkie końcówki, 4 3/4 w	Mikroskopia elektronowa Nauki	78510-0	Aby usunąć 1 mm PTFE z jednego końca drutu 3T; chwyć osłoniętą część gładką pęsetą www.emsdiasum.com
Ściągacz izolacji, 16-26 AWG	Dowolna		Użyj końcówki ostrza do cięcia mikro pasków
Nazwa	>Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chirurgia powiek
Narzędzia chirurgiczne (wysokiej jakości stal nierdzewna)
2 x kleszcze opatrunkowe, 4 cale ząbkowane	instrumenty do badań biomedycznych	30-1205	Można zastąpić; dodatkowe kleszcze do chwytania elektrod/na zewnątrz tacy chirurgicznej brisurgical.com
Kleszcze opatrunkowe, 3 cale Ząbkowane	instrumenty do badań biomedycznych	30-1200	Może być zastąpiony brisurgical.com
Taca na instrumenty	Instrumenty do badań biomedycznych	24-1355	Można zastąpić brisurgical.com
Rękojeść noża nr 3, 5 w	Przyrządy do badań biomedycznych	26-1000	Można zastąpić brisurgical.com
Mikro kleszcze preparacyjne, 3,5 cala, Fine Points	Biomedyczne instrumenty badawcze	10-1630	Można zastąpić brisurgical.com
Mikro kleszcze preparacyjne, 3,5 cala, gładka platforma (0,3 x 5 mm)	Biomedyczne instrumenty badawcze	10-1720	brisurgical.com
Mikro nożyczki preparacyjne, 3,5 cala, Niezwykle delikatne, ostrza 15 mm	Instrumenty do badań biomedycznych	11-2000	Można zastąpić brisurgical.com
Zwykłe kleszcze do odłamków, 3,5 cala	Instrumenty do badań biomedycznych	30-1600	Można zastąpić brisurgical.com< / a>
# 10 Ostrze chirurgiczne ze stali nierdzewnej do uchwytu #3, sterylne	Dowolne		Można zastąpić
0-80 x 0,125 cala ze stali nierdzewnej	Plastics One, Inc.	0-80 x 0,125	Można podstawić www.plastics1.com
Podkładki do przygotowywania alkoholu, sterylne	Fisher Scientific	22-363-750 [Fisher Scientific	Można zastąpić www.fishersci.com
Betadine Powidon-Jod	Purdue Frederick Co.	6761815101 [Fisher Scientific]	Można zastąpić www.fishersci.com
Betadine Powidon-Jodowe Podkładki Przygotowawcze	Moore Medical	19-898-946 [Fisher Scientific]	Można zastąpić www.fishersci.com
Waciki z bawełnianą końcówką, autoklawowalne	dowolne		Zazwyczaj wiertło o długości 7,6 cm lub 15,2 cm
do imadła kołkowego, #55 (0,052 cala)	Każdy		metal powinien być odporny na rdzewienie i korozję Podkładki
z gazy, 2 cale x 2 cale	Fisher Scientific	22-362-178 [Fisher Scientific]	Można zastąpić www.fishersci.com
Rękawice lateksowe/nitrylowe/winylowe ogólnego przeznaczenia	dowolne
Sterylizator szklanych kulek	Dowolne		narzędzia sterylizacyjne między operacjami
Pompa do terapii podgrzewaną wodą z podkładkami x 2	Gaymar	TP-500	Może być zastąpiony; zalecane są oddzielne pompy - 1 do operacji, 1 do rekonwalescencji
Igły podskórne 26G x 3/8 cala, sterylne	dowolny
izofluran	Vedco	NDC 50989-150-12	Producent może zostać zastąpiony; Może być wymagana zgoda weterynaryjna
System waporyzatora izofluranowego, blat, nieoddychający	Parkland Scientific	V3000PK	Można zastąpić www.parklandscientific.com
Jubilerzy Śrubokręt z ostrzem 1,8-2 mm	Każdy		metal powinien być odporny na rdzewienie i korozję
Pakiet Ortho-Jet BCA (cement dentystyczny)	Lang Dental	B1334	Zawiera proszek (1 funt) i płyn www.langdental.com
Zbiornik tlenu z regulatorem ciśnienia, duży			lokalny dostawca
Tygiel porcelanowy, wysokoformowy, szkliwiony, 10 ml	CoorsTek, Inc.	07-965C [Fisher Scientific]	Może być zastąpiony przez Fisher FB-965-I Tygiel szerokokształtny www.fishersci.com
Puralube Weterynaryjna maść okulistyczna, sterylna	firma Henry Schein NC0144682	[Fisher Scientific]	Można zastąpić www.fishersci.com
Quatricide PV-15	Pharmacal	PV-15	Przeciwbakteryjny środek dezynfekujący; można zastąpić www.pharmacal.com
Maski anestezjologiczne na gaz dla szczurów do chirurgii stereotaktycznej	Stoelting Company	51610	www.stoeltingco.com
Aparat stereotaktyczny Rat z prętami usznymi (45 stopni)	Wszelkie		pręty 45 stopni są zalecane, aby zapobiec uszkodzeniu błony bębenkowej
Narzędzie chirurgiczne Roboz Mleko	chirurgiczne Roboz	[Fisher Scientific]	Może być zastąpiony; Do smarowania narzędzi podczas autoklawowania www.fishersci.com
Maszynka do strzyżenia włosów gryzoni	Dowolny
chlorek sodu	Fisher Scientific	S641-500 [Fisher Scientific]	Aby uzyskać 0,9% soli fizjologicznej; klasa odczynnika; USP www.fishersci.com
Mikroszpatułka ze stali nierdzewnej (ostrze: 0,75 l x 0,18 cala. W)	Fisher Scientific	21-401-15 [Fisher Scientific]	Można zastąpić www.fishersci.com
Imadło szpilkowe Starrett, 0,000 cala - 0,055 cala	Dowolna		niklowana lub równoważna zalecana odporność na rdzewienie i korozję
Sterylne rękawice chirurgiczne	Dowolne
okłady sterylizacyjne, 20 cali x 20 cali, autoklawowalne	Propper Manufacturing	11-890-8C [Fisher Scientific]	Przydatny do owijania materiałów do sterylizacji w autoklawie i na sterylnym polu podczas operacji www.fishersci.com
Obłobuła chirurgiczna, sterylna/autoklawowalna			być konieczne przycięcie na wymiar dla szczurów
Fartuch chirurgiczny*	Dowolny		*Jeśli jest to wymagane przez
maskę chirurgiczną IACUC	Dowolne
strzykawki tuberkulinowe, sterylne, 1,0 ml	Dowolna
waga			Powinna mieć dobrą rozdzielczość (w gramach jednostek)
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Eyeblink System and Components (zakładając system 4-gryzoni)
5-kanałowy komutator x 4	Plastics One, Inc.	SL2 + 3C	www.plastics1.com
elektrody bipolarnej, podwójny 305 x 4	Plastics One, Inc.	305-305 80CM TT2 (C)	Zapewnia końcówkę wtyczki do elektrody bipolarnej na szczurze i do komutatora; musi być zmodyfikowany www.plastics1.com
, 5-kanałowy, ekranowany, 26 AWG x 4	dowolny		Aby wyprodukować komutatorowy; musi być wykonany od podstaw
Komora na skrzynkę testową Operant (wewnątrz: 24 wys. x 23 szer. x 14 gł. cal) x 4	Med-Associates		Może być zastąpiony; wymiary wewnętrzne powinny wygodnie pasować do skrzynki testowej z miejscem na piankę akustyczną; pasuje do wentylatora - 55-60 dB www.med-associates.com
Eyeblink System i oprogramowanie	JSA Designs	N/A	Zastrzeżone i dostosowane do laboratorium badawczego
Rurki termokurczliwe (średnice 3/16 cala, 1/4 cala, 3/8 cala, 1/2 cala)	Dowolna		Do ochrony zmodyfikowanych końcówek i spawów lutowanych komutatorowych
Melamina Triple Peak Acoustical Foam z czarnym hypalonem (24 x 48 cali)	McMaster-Carr	9162T5	Można zastąpić; przyciąć tak, aby pasowało do 4 komór mieszkaniowych www.mcmaster.com
Skrzynka testowa Operant (zewnętrzna 12,5 dł. x 10 szer. x 13,5 cala wys.), kompletna x 4	Med-Associates	ENV-007	Z podłogą z siatki ze stali nierdzewnej i niestandardową górą (3 otwory pośrodku na komutatora) www.med-associates.com< / a>
oscyloskop (opcjonalnie)	Dowolny		Zalecane minimalne wymagania: pasmo analogowe 200 MHz, próbkowanie w czasie rzeczywistym 1 GS/s, 4 kanały; patrz www.picotech.com /td>
Piezoelektryczne głośniki wysokotonowe (głośniki) x 4 (7 x 3 cale)	MCM Electronics	53-805	Musi pasować do specyfikacji zakresu częstotliwości dla systemu mrugania (2500 Hz - 25 KHz) www.mcmelectronics.com
Stacja lutownicza, lut, topnik, cyna	Dowolna		Do 26 AWG do gniazd żeńskich (pasujących do męskich styków relia-tac) i wtyczek bipolarnych
Izolatory bodźców x 4	WPI International	A365	Jednostki te działają na bateriach alkalicznych 16-9 V; dostępna jest odpowiednia wersja akumulatora (A365R) www.wpiinc.com
elektrody tripolarnej do komutatora SL3C x 4	tworzywa sztuczne jeden, Inc.	335-335 80cm TT3 C	Zapewnia końcówkę wtyczki do sceny czołowej EMG na szczurze i do komutatora; musi być zmodyfikowany www.plastics1.comDiody
LED USB x 4	Żadne		światła oparte na USB nie powodują elektrycznego "szumu" z sygnałami EMG od szczurów www.plastics1.com
kamery internetowe x 4, oprogramowanie do nadzoru	Dowolny
komputer PC z systemem operacyjnym

Cooper NC9358575 Może Pakiet niestandardowy MS Windows

Bibliografia

Jones, K. L., Smith, D. W. Recognition of the fetal alcohol syndrome in early infancy. Lancet. 2, 999-1001 (1973).
Stratton, K. R., Howe, C. J., Battaglia, F. C. Fetal alcohol syndrome: Diagnosis, epidemiology, prevention, and treatment. , National Academy Press. (1996).
Streissguth, A. P., Barr, H. M., Martin, D. C., Herman, C. S. Effects of maternal alcohol, nicotine, and caffeine use during pregnancy on infant mental and motor development at eight months. Alcohol Clin Exp Res. 4 (2), 152-164 (1980).
Streissguth, A. P., O'Malley, K. Neuropsychiatric implications and long-term consequences of fetal alcohol spectrum disorders. Semin Clin Neuropsychiatry. 5 (3), 177-190 (2000).
May, P. A., et al. Prevalence and epidemiologic characteristics of FASD from various research methods with an emphasis on recent in-school studies. Dev Disabil Res Rev. 15 (3), 176-192 (2009).
Sowell, E. R., et al. Mapping callosal morphology and cognitive correlates: Effects of heavy prenatal alcohol exposure. Neurology. 57 (2), 235-244 (2001).
Sowell, E. R., et al. Abnormal development of the cerebellar vermis in children prenatally exposed to alcohol: Size reduction in lobules I-V. Alcohol Clin Exp Res. 20 (1), 31-34 (1996).
Autti-Ramo, I., et al. MRI findings in children with school problems who had been exposed prenatally to alcohol. Dev Med Child Neurol. 44 (2), 98-106 (2002).
Hamilton, D. A., Kodituwakku, P., Sutherland, R. J., Savage, D. D. Children with Fetal Alcohol Syndrome are impaired at place learning but not cued-navigation in a virtual Morris water task. Behav Brain Res. 143 (1), 85-94 (2003).
Uecker, A., Nadel, L. Spatial but not object memory impairments in children with fetal alcohol syndrome. Am J Ment Retard. 103 (1), 12-18 (1998).
Uecker, A., Nadel, L. Spatial locations gone awry: object and spatial memory deficits in children with fetal alcohol syndrome. Neuropsychologia. 34 (3), 209-223 (1996).
Goodlett, C. R., Lundahl, K. R. Temporal determinants of neonatal alcohol-induced cerebellar damage and motor performance deficits. Pharmacol Biochem Behav. 55 (4), 531-540 (1996).
Goodlett, C. R., Kelly, S. J., West, J. R. Early postnatal alcohol exposure that produces high blood alcohol levels impairs development of spatial navigation learning. Psychobiol. 15, 64-74 (1987).
Bayer, S. A., Altman, J., Russo, R. J., Zhang, X. Timetables of neurogenesis in the human brain based on experimentally determined patterns in the rat. Neurotoxicol. 14 (1), 83-144 (1993).
Dobbing, J., Sands, J. Quantitative growth and development of human brain. Arch Dis Child. 48 (10), 757-767 (1973).
West, J. R. Fetal alcohol-induced brain damage and the problem of determining temporal vulnerability: A review. Alcohol Drug Res. 7 (5-6), 423-441 (1987).
Zecevic, N., Rakic, P. Differentiation of Purkinje cells and their relationship to other components of developing cerebellar cortex in man. J Comp Neurol. 167, 27-48 (1976).
Rufer, E. S., et al. Adequacy of maternal iron status protects against behavioral, neuroanatomical, and growth deficits in fetal alcohol spectrum disorders. PLoS One. 7 (10), e47499(2012).
Tran, T. D., Kelly, S. J. Critical periods for ethanol-induced cell loss in the hippocampal formation. Neurotoxicol Teratol. 25 (5), 519-528 (2003).
Pierce, D. R., Goodlett, C. R., West, J. R. Differential neuronal loss following early postnatal alcohol exposure. Teratology. 40 (2), 113-126 (1989).
Tran, T. D., Jackson, H. J., Horn, K. H., Goodlett, C. R. Vitamin E does not protect against neonatal ethanol-induced cerebellar damage or deficits in eyeblink classical conditioning in rats. Alcohol Clin Exp Res. 29 (1), 117-129 (2005).
Goodlett, C. R., Peterson, S. D., Lundahl, K. R., Pearlman, A. D. Binge-like alcohol exposure of neonatal rats via intragastric intubation induces both Purkinje cell loss and cortical astrogliosis. Alcohol Clin Exp Res. 21 (6), 1010-1017 (1997).
Green, J. T., Tran, T. D., Steinmetz, J. E., Goodlett, C. R. Neonatal ethanol produces cerebellar deep nuclear cell loss and correlated disruption of eyeblink conditioning in adult rats. Brain Res. 956, 302-311 (2002).
Cronise, K., Marino, M. D., Tran, T. D., Kelly, S. J. Critical periods for the effects of alcohol exposure on learning in rats. Behav Neurosci. 115 (1), 138-145 (2001).
Tran, T. D., Cronise, K., Marino, M. D., Jenkins, W. J., Kelly, S. J. Critical periods for the effects of alcohol exposure on brain weight, body weight, activity and investigation. Behav Brain Res. 116 (1), 99-110 (2000).
Steinmetz, J. E. Brain substrates of classical eyeblink conditioning: A highly localized but also distributed system. Behav Brain Res. 110 (1-2), 13-24 (2000).
Thompson, R. F. The neurobiology of learning and memory. Science. 233 (4767), 941-947 (1986).
Ivkovich, D., Eckerman, C. O., Krasnegor, N. A., Stanton, M. E. Eyeblink classical conditioning: Vol. 1 Applications in humans. Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. , Kluwer Academic Publishers. 119-142 (2000).
Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. Eyeblink classical conditioning: Volume I - Applications in humans. , Kluwer Academic Publishers. (2000).
Woodruff-Pak, D. S., Steinmetz, J. E. Eyeblink classical conditioning: Volume II - Animal models. , Kluwer Academic Publishers. (2000).
Kishimoto, Y., et al. Implicit Memory in Monkeys: Development of a Delay Eyeblink Conditioning System with Parallel Electromyographic and High-Speed Video Measurements. PLoS One. 10 (6), e0129828(2015).
Chen, L., Bao, S., Lockard, J. M., Kim, J. K., Thompson, R. F. Impaired classical eyeblink conditioning in cerebellar-lesioned and Purkinje cell degeneration (pcd) mutant mice. J Neurosci. 16 (8), 2829-2838 (1996).
Freeman, J. H. Jr, Carter, C. S., Stanton, M. E. Early cerebellar lesions impair eyeblink conditioning in developing rats: Differential effects of unilateral lesions on postnatal day 10 or 20. Behav Neurosci. 109 (5), 893-902 (1995).
Gerwig, M., et al. Trace eyeblink conditioning in patients with cerebellar degeneration: Comparison of short and long trace intervals. Exp Brain Res. 187 (1), 85-96 (2008).
LaBar, K. S., Disterhoft, J. F. Conditioning, awareness, and the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 620-626 (1998).
McCormick, D. A., Steinmetz, J. E., Thompson, R. F. Lesions of the inferior olivary complex cause extinction of the classically conditioned eyeblink response. Brain Res. 359 (1-2), 120-130 (1985).
Clark, R. E., Zola, S. Trace eyeblink classical conditioning in the monkey: a nonsurgical method and behavioral analysis. Behav Neurosci. 112 (5), 1062-1068 (1998).
Anderson, B. J., Steinmetz, J. E. Cerebellar and brainstem circuits involved in classical eyeblink conditioning. Rev Neurosci. 5 (3), 251-273 (1994).
Thompson, R. F., Krupa, D. J. Organization of memory traces in the mammalian brain. Annu Rev Neurosci. 17, 519-549 (1994).
Miller, M. J., et al. fMRI of the conscious rabbit during unilateral classical eyeblink conditioning reveals bilateral cerebellar activation. J Neurosci. 23 (37), 11753-11758 (2003).
Geinisman, Y., et al. Remodeling of hippocampal synapses after hippocampus-dependent associative learning. J Comp Neurol. 417 (1), 49-59 (2000).
Ivkovich, D., Stanton, M. E. Effects of early hippocampal lesions on trace, delay, and long-delay eyeblink conditioning in developing rats. Neurobiol Learn Mem. 76 (3), 426-446 (2001).
Moyer, J. R. Jr, Deyo, R. A., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts trace eye-blink conditioning in rabbits. Behav Neurosci. 104 (2), 243-252 (1990).
Solomon, P. R., Vander Schaaf, E. R., Thompson, R. F., Weisz, D. J. Hippocampus and trace conditioning of the rabbit's classically conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 100 (5), 729-744 (1986).
Kronforst-Collins, M. A., Disterhoft, J. F. Lesions of the caudal area of rabbit medial prefrontal cortex impair trace eyeblink conditioning. Neurobiol Learn Mem. 69 (2), 147-162 (1998).
Weible, A. P., McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Cortical involvement in acquisition and extinction of trace eyeblink conditioning. Behav Neurosci. 114 (6), 1058-1067 (2000).
Thomas, J. D., Tran, T. D. Choline supplementation mitigates trace, but not delay, eyeblink conditioning deficits in rats exposed to alcohol during development. Hippocampus. 22 (3), 619-630 (2012).
West, J. R., Hamre, K. M., Pierce, D. R. Delay in brain growth induced by alcohol in artificially reared rat pups. Alcohol. 1 (3), 213-222 (1984).
Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880(2008).
Christian, K. M., Thompson, R. F. Neural substrates of eyeblink conditioning: acquisition and retention. Learn Mem. 10 (6), 427-455 (2003).
Kishimoto, Y., Nakazawa, K., Tonegawa, S., Kirino, Y., Kano, M. Hippocampal CA3 NMDA receptors are crucial for adaptive timing of trace eyeblink conditioned response. J Neurosci. 26 (5), 1562-1570 (2006).
Shors, T. J., et al. Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories. Nature. 410 (6826), 372-376 (2001).
Tran, T. D., Stanton, M. E., Goodlett, C. R. Binge-like ethanol exposure during the early postnatal period impairs eyeblink conditioning of short and long CS-US intervals in rats. Dev Psychobiol. 49 (6), 589-605 (2007).
Mizumori, S. J., Yeshenko, O., Gill, K. M., Davis, D. M. Parallel processing across neural systems: Implications for a multiple memory system hypothesis. Neurobiol Learn Mem. 82 (3), 278-298 (2004).
Siegel, J. J., et al. Trace Eyeblink Conditioning in Mice Is Dependent upon the Dorsal Medial Prefrontal Cortex, Cerebellum, and Amygdala: Behavioral Characterization and Functional Circuitry(1,2,3). eNeuro. 2 (4), (2015).
Murawski, N. J., Jablonski, S. A., Brown, K. L., Stanton, M. E. Effects of neonatal alcohol dose and exposure window on long delay and trace eyeblink conditioning in juvenile rats. Behav Brain Res. 236 (1), 307-318 (2013).
Lindquist, D. H. Hippocampal-dependent Pavlovian conditioning in adult rats exposed to binge-like doses of ethanol as neonates. Behav Brain Res. 242, 191-199 (2013).
Ivarsson, M., Svensson, P. Conditioned eyeblink response consists of two distinct components. J Neurophysiol. 83 (2), 796-807 (2000).
Woodruff-Pak, D. S., Lavond, D. G., Thompson, R. F. Trace conditioning: abolished by cerebellar nuclear lesions but not lateral cerebellar cortex aspirations. Brain Res. 348 (2), 249-260 (1985).
Takehara-Nishiuchi, K. The Anatomy and Physiology of Eyeblink Classical Conditioning. Curr Top Behav Neurosci. , (2016).
Mattson, S. N., Schoenfeld, A. M., Riley, E. P. Teratogenic effects of alcohol on brain and behavior. Alcohol Res Health. 25 (3), 185-191 (2001).
Goodfellow, M. J., Abdulla, K. A., Lindquist, D. H. Neonatal Ethanol Exposure Impairs Trace Fear Conditioning and Alters NMDA Receptor Subunit Expression in Adult Male and Female Rats. Alcohol Clin Exp Res. 40 (2), 309-318 (2016).
Beylin, A. V., et al. The role of the hippocampus in trace conditioning: Temporal discontinuity or task difficulty? Neurobiol Learn Mem. 76 (3), 447-461 (2001).
Port, R. L., Romano, A. G., Steinmetz, J. E., Mikhail, A. A., Patterson, M. M. Retention and acquisition of classical trace conditioned responses by rabbits with hippocampal lesions. Behav Neurosci. 100 (5), 745-752 (1986).
Weiss, C., Bouwmeester, H., Power, J. M., Disterhoft, J. F. Hippocampal lesions prevent trace eyeblink conditioning in the freely moving rat. Behav Brain Res. 99 (2), 123-132 (1999).
Brown, S. M., et al. Eyeblink conditioning deficits indicate timing and cerebellar abnormalities in schizophrenia. Brain Cogn. 58 (1), 94-108 (2005).
Sears, L. L., Steinmetz, J. E. Effects of haloperidol on sensory processing in the hippocampus during classical eyeblink conditioning. Psychopharmacology. 130 (3), 254-260 (1997).
Kronforst-Collins, M. A., Moriearty, P. L., Schmidt, B., Disterhoft, J. F. Metrifonate improves associative learning and retention in aging rabbits. Behav Neurosci. 111 (5), 1031-1040 (1997).
Woodruff-Pak, D. S., Finkbiner, R. G., Sasse, D. K. Eyeblink conditioning discriminates Alzheimer's patients from non-demented aged. Neuroreport. 1 (1), 45-48 (1990).
Oristaglio, J., Romano, A. G., Harvey, J. A. Amphetamine influences conditioned response timing and laterality of anterior cingulate cortex activity during rabbit delay eyeblink conditioning. Neurobiol Learn Mem. 92 (1), 1-18 (2009).
Scavio, M. J., Clift, P. S., Wills, J. C. Posttraining effects of amphetamine, chlorpromazine, ketamine, and scopolamine on the acquisition and extinction of the rabbit's conditioned nictitating membrane response. Behav Neurosci. 106 (6), 900-908 (1992).
Fortier, C. B., et al. Delay discrimination and reversal eyeblink classical conditioning in abstinent chronic alcoholics. Neuropsychology. 22 (2), 196-208 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

uczenie asocjacyjne elektromiograficzna aktywno mrugania okres ladu reakcja warunkowa reakcja bezwarunkowa adaptacyjne reakcje warunkowe

Zastosowanie klasycznego warunkowania śladowego mrugnięcia okiem do oceny dysfunkcji hipokampa w szczurzym modelu zaburzeń ze spektrum alkoholowych płodów

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły