Artykuł metodologiczny

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/55351

⸱

14 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Transfusion Research Center, Belgian Red Cross-Flanders, 2Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 3Blood Service, Belgian Red Cross-Flanders, 4Department of Public Health and Primary Care, KULeuven - University of Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroprzepływowe modele hemostazy oceniają funkcję płytek krwi w warunkach hydrodynamicznego ścinania, ale w obecności antykoagulantów, ta analiza jest ograniczona tylko do odkładania płytek krwi. Skomplikowany związek między zależnym od Ca2+ krzepnięciem a funkcją płytek krwi wymaga starannego i kontrolowanego ponownego zwapnienia krwi przed analizą. Nasza konfiguracja wykorzystuje kanał mieszający w kształcie litery Y, który dostarcza skoncentrowany bufor Ca2 + / Mg2 + do przepływającej krwi tuż przed perfuzją, umożliwiając szybkie ponowne zwapnienie bez zastoju próbki. Dziesięciokrotna różnica prędkości przepływu między oboma zbiornikami minimalizuje rozcieńczenie. Ponownie zwapniona krew jest następnie perfundowana w komorze analitycznej pokrytej kolagenem, a znakowanie różnicowe umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym zarówno osadzania się płytek krwi, jak i fibryny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii wideo. System korzysta wyłącznie z dostępnych na rynku narzędzi, co zwiększa szanse na standaryzację. Rekonstytucja krwi małopłytkowej z płytkami krwi z bankowanych koncentratów ponadto modeluje transfuzję płytek krwi, udowadniając jej zastosowanie w tej dziedzinie badań. Przykładowe dane wykazały, że początek krzepnięcia i odkładanie fibryny były liniowo zależne od stężenia płytek krwi, co potwierdza związek między hemostazą pierwotną i wtórną w naszym modelu. W przedziale czasowym 16 minut perfuzji aktywacja kontaktowa nie nastąpiła, pomimo ponownego zwapnienia do normalnych poziomów Ca2+ i Mg2+. Gdy czynnik krzepnięcia XIIa był hamowany przez inhibitor trypsyny kukurydzianej, ten przedział czasowy był jeszcze dłuższy, co wskazuje na znaczny zakres dynamiczny, w którym można ocenić zmiany w prokoagulacyjnym charakterze płytek krwi. Koimmobilizacja czynnika tkankowego z kolagenem znacznie skróciła czas do wystąpienia krzepnięcia, ale nie jego tempo. Możliwość badania czynnika tkankowego i/lub ścieżki kontaktowej zwiększa wszechstronność i użyteczność testu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemostaza pierwotna i wtórna były pierwotnie konceptualizowane jako dwa względnie rozdzielne procesy biochemiczne. Hemostaza pierwotna była postrzegana jako główny czynnik przyczyniający się do warunków przepływu tętniczego, z kluczową rolą dla płytek krwi, podczas gdy hemostaza wtórna dominowała nad krzepnięciem pod wpływem przepływu krwi żylnej, umożliwiając kaskadzie proteazy tworzenie nierozpuszczalnej fibryny. Ostatnie kilka dekad znacznie zmieniło ten tradycyjny pogląd, uznając, że aktywacja i krzepnięcie płytek krwi są współzależne i są równie ważnymi procesami podczas fizjologicznej i patologicznej hemostazy we wszystkich (nieekstremalnych) środowiskach hydrodynamicznych. Pogląd ten został przeniesiony do kliniki, gdzie coraz częściej stosuje się testy opracowane w celu kompleksowego pomiaru krzepnięcia krwi pełnej, choć pozostaje wiele pytań dotyczących istotności, stosowalności i użyteczności1.

Niedawno opublikowaliśmy analizę funkcjonalną koncentratów płytek krwi przy użyciu mikroprzepływowych komór przepływowych pokrytych fibrylarnym kolagenem w modelu transfuzji in vitro2, z próbkami zawierającymi normalne ilości czerwonych krwinek, osocza i płytek krwi. Metoda ta wykorzystuje krew przeciwzakrzepową heparyną lub hirudyną, co oznacza brak lub ograniczony udział hemostazy wtórnej, która jest zależna od wytwarzania trombiny i zjonizowanego wapnia (Ca2+). Aby wspomóc tworzenie trombiny, a tym samym objąć wszystkie aspekty hemostazy przepływem mikroprzepływowym, opracowaliśmy metodę uzupełniającą na tej samej platformie technicznej, teraz obejmującą wolny Ca2+. W ten sposób można badać odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny, ponownie w modelu transfuzji płytek krwi, w celu oceny jakości koncentratu płytek krwi.

W tej metodzie, płytki krwi i fibrynogen są znakowane fluoroforami, które mają całkowicie oddzielone widma emisyjne. Dwukolorowa mikroskopia wideo w czasie rzeczywistym pozwala następnie na analizę pierwotnej adhezji płytek krwi, a także inicjacji krzepnięcia i odkładania fibryny. Ważną zmienną w tego typu testach jest ponowne zwapnienie, ponieważ dodanie Ca2+ do krwi statycznej przed perfuzją nieuchronnie spowoduje koagulację w pojemniku zainicjowaną kontaktowo. Ta inicjacja spowoduje odchylenie odczytu z powodu zatkania rurek i wlotów biochipów przed perfuzją. Dlatego w naszej metodzie krew przeciwzakrzepowa cytrynianem i bufor zawierający Ca2 + są pompowane oddzielnie przez górne nogi komory wlotowej w kształcie litery Y. Składniki są mieszane podczas perfuzji przed wprowadzeniem do komory analitycznej pokrytej samym kolagenem lub w połączeniu z rekombinowanym czynnikiem tkanki ludzkiej (rhTF). Dostosowując prędkości przepływu oddzielnych pomp i stężenie Ca2+ w buforze, następuje 10% rozcieńczenie końcowej próbki krwi.

Korzystając z tego rozszerzonego protokołu, pokazujemy udział czynnika krzepnięcia XII (FXII) i stężenia płytek krwi w inicjacji szlaku kontaktowego pod przepływem. Nasze dane pokazują również, że poprzez powlekanie rhTF kolagenem, szlak czynnika tkankowego może być mierzony jednocześnie.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi dotyczącymi badań na próbkach ludzkich, a od wszystkich zaangażowanych dawców uzyskano świadomą zgodę. Zgodę na opisane tu eksperymenty uzyskano od instytucjonalnej komisji rewizyjnej Szpitala Uniwersyteckiego w Antwerpii (numer zgody 16/10/120).

UWAGA: Wskaźniki temperatury zawsze dotyczą temperatury pokojowej, chyba że jest to określone.

1. Konfiguracja mikrofluidyki

  1. Przygotuj kanały komory przepływu mikroprzepływowego, rurki i kołki łączące
    1. Zawiesić fiolkę z kolagenem przez mieszanie wirowe, a następnie rozcieńczyć w izotonicznym roztworze glukozy dostarczonym przez producenta do końcowego stężenia 50 μg/mL.
      UWAGA: Używaj kolagenu ścięgien koni, składającego się głównie z włókien typu I. Kolagen koni typu I jest często określany jako kolagen "Horm" i jest złotym standardem dla tego typu testów, zarówno ze względów historycznych, jak i biologicznych. Można również stosować kolagen ludzki typu III, ale te włókienka gorzej się pokrywają, a odpowiedź płytek krwi nie jest tak silna. Można również stosować inne powierzchnie powłokowe, takie jak czynnik von Willebranda, fibrynogen, fibronektyna, laminina, witronektyna, trombospondyna-1 lub kombinacje tych3.
    2. Weź nowy, jednorazowy biochip mikroprzepływowy z ośmioma prostymi, równoległymi kanałami i wymiarami w mm 0,4 szer. x 0,1 wys. x 20 l. Odpipeuj 0,8 μl kolagenu do kanału (kanałów) biochipa na jednym końcu i oznacz go jako wylot. Wypełnij tylko 5/6 długości kanału, aby włókna kolagenowe nie były pokryte na wlocie kanału, ponieważ może to spowodować zatkanie, które utrudnia sprawną perfuzję.
    3. Inkubować biochip w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 godziny w wilgotnym i szczelnie zamkniętym pojemniku.
    4. Aby zbadać koagulację za pośrednictwem czynnika tkankowego (zewnętrznego) w połączeniu ze szlakiem kontaktowym (wewnętrznym), pokryj kanały kolagenem i rekombinowanym czynnikiem tkanki ludzkiej (rhTF).
      1. Rozcieńczyć rhTF w 10 mM soli fizjologicznej buforowanej kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) (HBS; 0,9% (w/v) NaCl, pH 7,4, 1:3,000, stężenie podstawowe: 4,5 nM).
      2. Usuń roztwór powlekający kolagen przez wylot. Odpipetować 0,8 μl rhTF w HBS (rozcieńczenie 1/500 stężenia podstawowego, stężenie końcowe: 9 pM) do wylotu kanału, wypełniając 5/6 długości kanału, podobnie jak w przypadku strategii powlekania kolagenem.
      3. Inkubuj biochip przez dodatkowe 30 minut w nawilżonym i szczelnie zamkniętym pojemniku.
    5. Wypełnij powleczone kanały buforem blokującym (1,0% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% (w/v) glukozy w HBS), zaczynając od drugiego końca (oznaczonego jako wlot). Wypełnij równą liczbę kanałów w kształcie litery Y tym samym buforem blokującym w biochipie mieszającym.
      1. Upewnij się, że wszystkie kanały i ramiona kanałów są całkowicie wypełnione buforem blokującym. Inkubuj oba biochipy przez co najmniej 1 godzinę w nawilżonym i szczelnie zamkniętym pojemniku.
    6. Dla każdego używanego kanału przygotuj dwie rurki o długości 8 cm, jedną o długości 2 cm i jedną o długości 46 cm. Umieść kołek na jednym końcu z trzech mniejszych rurek i na obu końcach najdłuższej rurki.
  2. Przygotuj pompę płuczącą
    1. Przepłucz wszystkie fluidyki pompy i podłączone rurki wodą destylowaną.
    2. Odtłuść odlew biochipa za pomocą precyzyjnej chusteczki bezpyłowej i denaturatu, aby usunąć odciski i kurz.
    3. Napełnij wszystkie rurki buforem blokującym przed podłączeniem ich do biochipów.
    4. Zamocuj powlekany biochip na stoliku mikroskopu automatycznego. Zamocuj biochip do mieszania na tej samej wysokości co stolik mikroskopu za pomocą laboratoryjnego podnośnika nożycowego.
    5. Połącz powlekany biochip z biochipem mieszającym za pomocą najdłuższej rurki o długości 46 cm. Upewnij się, że oba biochipy znajdują się w pewnej odległości, tak aby rurki tworzyły elastyczną, ale prostą linię.
    6. Podłącz strójkę złącza strzykawki do rurki kompatybilnej z Luer pompy płuczącej. Podłącz go do wolnego końca rurki o średnicy 2 cm, a drugi koniec przymocuj do wylotu powlekanego biochipa.
    7. Przymocuj dwie 8-centymetrowe rurki do wlotu biochipa mieszającego za pomocą jego kołków. Umieścić wolny koniec każdej rurki w fiolce HBS. Przepłukać wszystkie rurki i wszystkie kanały 1 ml HBS.
      UWAGA: HBS przepływa z fiolki przez 8-centymetrową rurkę do wióra mieszającego i przez 46-centymetrową rurkę do powlekanego wióra (przepływającego od części niepowlekanej do powlekanej) dzięki sile ciągnącej pompy płuczącej. Ten krok usuwa bufor blokujący i słabo przylegający kolagen (lub rhTF w podwójnie powlekanych biochipach).
  3. Przygotuj pompy perfuzyjne
    1. Otwórz oprogramowanie sterownika pomp perfuzyjnych. Zainicjuj pompy, klikając dwukrotnie ikonę strzykawki w oprogramowaniu.
    2. Należy wybrać rodzaj strzykawki, która będzie używana: strzykawki o pojemności 1 ml do buforu krzepnięcia i strzykawki o pojemności 2 ml do krwi rozpuszczonej.
  4. Podłączyć strzykawki do konstrukcji biochipa
    1. Odłącz pompę płuczącą i wszystkie przewody, z wyjątkiem jednego łączącego dwa biochipy. Odłączony przewód jest ponownie używany w następujących krokach.
    2. Podłącz 2-centymetrowy przewód ze stykiem złącza strzykawki do zamka Luer grubościennego przewodu odpływowego. Napełnij grubościenny rurkę standardowym roztworem pepsyny za pomocą strzykawki.
      UWAGA: Dodanie pepsyny do rurki odpływowej hamuje i lizuje krzepnięcie po perfuzji, a tym samym zapobiega zatykaniu się systemu na zapleczu.
    3. Zabezpiecz otwarty koniec grubościennej rurki za pomocą Kocher clamp. Umieść pod spodem odpowiedni pojemnik na odpady z wybielaczem, aby zebrać przepływ.
    4. Przymocuj rurkę za pomocą kołka do wylotu powlekanego biochipa.

2. Przygotowanie próbek krwi

  1. Zbierz krew od zdrowego ochotnika i oddziel jej składniki4
    1. Zebrać krew do opróżnionego pojemnika z kwasem etylenodiamino-tetraoctowym (EDTA). Próbki tej należy używać wyłącznie do wykonywania pełnej morfologii krwi (CBC) przy użyciu automatycznego analizatora hematologicznego.
    2. Zbierz krew do opróżnionych pojemników z cytrynianem sodu. Wymagane jest 5 ml krwi na kanał.
    3. Umieść próbkę(i) na poziomym rotatorze w oczekiwaniu na rozpuszczenie krwi.
      UWAGA: Test należy wykonać w ciągu 3 godzin od upuszczania krwi. Koncentrat płytek krwi i próbki krwi pełnej są zgodne z grupą krwi ABO/RhD.
    4. Wirować przez 13 minut przy 250 x g w celu przygotowania osocza bogatopłytkowego (PRP). Nie używaj hamulca wirówki, aby zapobiec zakłóceniu luźno zapakowanego granulatu.
    5. Przenieś PRP do świeżej stożkowej probówki wirówkowej. Wirować przez 10 minut przy 4 500 x g (z hamulcem) w celu osadzenia płytek krwi i przygotowania osocza ubogiego w płytki krwi (PPP). Wyrzucić osadek płytek krwi. Inkubować PPP w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.
    6. Przenieś upakowane czerwone krwinki do świeżej stożkowej probówki, perforując dno oryginalnej igły 21 G.
      UWAGA: Resztkowa liczba płytek krwi w upakowanej frakcji krwinek czerwonych wynosi 11 ±4 x 103 na μL (średnia ± SD, n = 10).
  2. Odtworzyć krew
    1. Oznaczyć hematokryt upakowanych krwinek czerwonych przygotowanych w kroku 2.1.6 za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.
    2. Określ stężenie płytek krwi w koncentracie płytek krwi, który zostanie wykorzystany do analizy, za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.
    3. Oblicz objętość upakowanych czerwonych krwinek, koncentratu płytek krwi i PPP, które dadzą 40% hematokrytu i 250 x 103 płytki krwi / μl w końcowej objętości 2,5 ml. Wymieszaj je, aby przygotować rozpuszczoną krew i wykonaj morfologię krwi,
      UWAGA: W zależności od pytania badawczego można użyć innych docelowych mian komórek.
    4. Przygotować "ślepą" próbkę kontrolną, w której objętość koncentratu płytek krwi jest zastąpiona tą samą objętością soli fizjologicznej w celu określenia stężenia "endogennych" płytek krwi (tj. płytek krwi niepochodzących z banku krwi).
  3. Oznaczyć odtworzoną krew pod kątem płytek krwi i fibrynogenu
    1. Odmierzyć pipetą 13 μl roztworu fibrynogenu znakowanego Alexa Fluor 405 o stężeniu 10,7 mg/ml (końcowe stężenie 70 μg/ml) do probówki i dodać 1 ml odtworzonej krwi.
      UWAGA: Fibrynogen został oznaczony przy użyciu dostępnego na rynku zestawu zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Wymieszać kolejny 1 ml rozpuszczonej krwi w probówce zawierającej 2 μl 1 mM DiOC6 (1 μM stężenie końcowe) lub zawierające 2 μL 5 mM kalceiny AM (5 μM stężenie końcowe). Dodać go do probówki zawierającej krew z fibrynogenem, uzyskując końcową objętość 2 ml krwi barwionej płytkami krwi i fibrynogenem.
      UWAGA: Wybór barwnika może zależeć od pytania badawczego lub preferencji badacza5. Należy pamiętać, że wzbudzenie dowolnego barwnika może powodować artefakty fotochemiczne.
    3. Delikatnie wymieszaj, odwracając. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Przygotować bufor do krzepnięcia
    1. Przygotować bufor krzepnięcia zawierający 10 mM CaCl2 i 3,75 mM MgCl2 w HBS. Przygotować 1 ml buforu krzepnięcia na jeden kanał.
    2. Przefiltruj i wysterylizuj bufor krzepnięcia przez filtr 0,2 μm. Podgrzej go do 37 °C.

3. Test perfuzji

  1. Skoncentruj optykę mikroskopu na włóknach kolagenowych przylegających do dna kanału. Użyj kontrastu fazowego lub różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC). Wybierz opcję "Ustaw bieżące Z dla wybranych regionów kafelków" w oprogramowaniu eksperymentalnym, aby cyfrowo ustalić wybrane pole skupienia.
  2. Zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) w wybranym kanale za pomocą oprogramowania do akwizycji mikroskopu.
    UWAGA: Zwrot z inwestycji może być dowolnym obszarem powierzchni dowolnie wybranym w kanale perfuzyjnym. Zaleca się, aby nie analizować tworzenia się skrzeplin i wytwarzania fibryny w pobliżu wlotu i wylotu, aby uniknąć uzyskania obrazów nierównomiernie rozłożonych skrzeplin. Powierzchnia ROI powinna zawierać znaczną liczbę skrzeplin, aby umożliwić wyrównanie zmienności sygnału przez poszczególne płytki krwi. Lokalizacja ROI w płaszczyźnie xy kanału jest zawsze ustalana i określana przed perfuzją. W razie potrzeby niepowlekana część kanału może zostać uwzględniona w analizie w celu określenia, czy płytki krwi wiążą się niespecyficznie z tworzywem biochipowym.
  3. Przygotowanie próbek do perfuzji
    1. Zamontować strzykawkę o pojemności 1 ml zawierającą 1 ml wstępnie podgrzanego buforu krzepnięcia w pompie perfuzyjnej.
    2. Wymieszać wstępnie podgrzaną rozpuszczoną krew, delikatnie odwracając i wsypać 2 ml do strzykawki o pojemności 2 ml.
    3. Upewnij się, że całe powietrze zostało usunięte z obu strzykawek i podłącz każdą z nich do 8-centymetrowego przewodu za pomocą kołka złącza strzykawki.
    4. Zalać łączniki i rurki obu strzykawek z dużą prędkością (400 μl/min) i zatrzymać, gdy wszystko zostanie wypełnione buforem krzepnięcia lub krwią.
      UWAGA: Po zalaniu rurki, bufor krzepnięcia i odtworzona krew zostaną natychmiast zmieszane w kanale w kształcie litery Y biochipa mieszającego po rozpoczęciu eksperymentu, unikając wprowadzania powietrza do komór perfuzyjnych.
  4. Za pomocą kołków przymocuj drugi koniec obu rurek do podzielonych nóg kanału w kształcie litery Y w biochipie do mieszania. Dolna część nogi służy do perfuzji buforu krzepnięcia, a górna noga do rekonstytucji krwi.
  5. Rozpocznij eksperyment od zainicjowania perfuzji z prędkością 4,4 μl/min dla buforu krzepnięcia i 44 μl/min dla krwi rozpuszczonej. Zdejmij Kocher clamp na wylocie rurki odpływowej, aby umożliwić perfuzję.
    UWAGA: Natężenie przepływu można zmieniać w zależności od pytania badawczego. Uruchom stoper, aby określić czas między rozpoczęciem eksperymentu a rozpoczęciem akwizycji obrazu w czasie rzeczywistym.
  6. Rejestruj obrazy co 10 s przez 30 minut w czasie rzeczywistym za pomocą oprogramowania do akwizycji i eksperymentowania mikroskopu. Rozpocznij nagrywanie, gdy mieszanina rozpuszczonej krwi i buforu krzepnięcia dostanie się do powlekanego biochipa zamontowanego na stoliku mikroskopowym.
    UWAGA: W zależności od konfiguracji eksperymentalnej można używać innych szeregów czasowych. Użyj powiększenia 100X (obiektyw 10X i obiektywy 10X).

4. Zakończenie eksperymentu

  1. Zakończ pompowanie i akwizycję obrazu po 30 minutach lub wcześniej, jeśli sygnał jest nasycony. Odłącz wszystkie rurki i strzykawki i wyrzuć je jako odpady niebezpieczne biologicznie.

5. Analiza danych

  1. Określ kinetykę wzrostu skrzepliny (zielona fluorescencja) i tworzenia fibryny (fioletowa fluorescencja) za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Następujące polecenia są specyficzne dla używanego tutaj oprogramowania:
    1. Otwórz wtyczkę Przetwarzanie: zszywanie, aby zszyć obrazy obok siebie w punkcie czasowym.
    2. Otwórz wtyczkę Analiza obrazu, aby określić pokrycie powierzchni płytek krwi.
    3. Otwórz wtyczkę Measure. Zdefiniuj ROI, rysując obszar prostokąta zawierający wszystkie włókna skrzeplin i fibryny; w tym protokole ROI to prostokąt o wymiarach 637 mm2,
      Wybierz kartę Wszystkie widoki, aby uwzględnić wszystkie zarejestrowane punkty czasowe.
    4. Użyj narzędzia Utwórz tabele, aby automatycznie wygenerować arkusz kalkulacyjny, który będzie zawierał średnią wartość intensywności fluorescencji wybranego obszaru prostokąta w każdym punkcie czasowym.
    5. Zapisz arkusze kalkulacyjne w formacie xml.
  2. Otwórz arkusz kalkulacyjny w programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych w celu przeprowadzenia dalszych obliczeń.
    1. Odejmij wartość początkową (tło) wszystkich danych.
    2. Wykreślić sygnał fluorescencyjny jako funkcję czasu perfuzji zarówno dla barwników zielonych (płytki krwi), jak i fioletowych (fibryna).
      UWAGA: Weź pod uwagę czas między inicjalizacją pompy a faktycznym punktem początkowym akwizycji obrazu. Tworzenie skrzepliny jest na ogół procesem dwuetapowym w tym modelu: (1) "powolna" adhezja płytek krwi (tj. adhezja) do unieruchomionego kolagenu, a następnie (2) wzrost skrzepliny spowodowany krzepliną z "szybkim" wzrostem zarówno wiązania płytek krwi (tj. akumulacji), jak i odkładania się fibryny (tj. krzepnięcia) (ryc. 1).
    3. Obliczyć nachylenie adhezji i akumulacji płytek krwi za pomocą regresji liniowej; nachylenie to daje kinetykę wzrostu skrzepliny płytkowej w każdej fazie jej powstawania.
    4. Oblicz nachylenie krzepnięcia fibryny i ekstrapoluj tę linię, aby przeciąć oś X, określając moment wystąpienia.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza surowych danych w czasie rzeczywistym jest opisana na rysunku 1. Po pierwsze, płytki krwi przylegają do powierzchni reaktywnej, powodując stały wzrost zarejestrowanej zielonej fluorescencji (ryc. 1A, i), zwanej adhezją. Podczas tej fazy fluorescencja fioletowa jest niewielka, co wskazuje, że fibryna nie jest lub jest tylko marginalnie utworzona (ryc. 1B). Po rozpoczęciu krzepnięcia, fibryna fluoryzująca na fioletowo odkłada się szybko (iii), a w tym czasie fluorescencja zielonych płytek krwi wzrasta mniej więcej w tym samym tempie, co określa się tutaj jako akumulację płytek krwi (ii). Pojedynczy eksperyment zwraca zatem trzy szybkości wzrostu fluorescencji (i, ii i iii) jako zastępczy marker prędkości, z jaką zachodzi odkładanie się płytek krwi i fibryny w tym modelu. Ponadto ekstrapoluje się moment początku krzepnięcia (moment-of-onset (iv)), który jest wyznacznikiem potencjału prokoagulacji płytek krwi.

W przypadku braku TF, inicjacja krzepnięcia jest powolna i przebiega głównie przez szlak kontaktowy, gdzie wewnętrzny kompleks tenazy aktywuje FX poprzez bezpośrednią aktywację FIX6 przez FXI i/lub FXII. Aby wykazać zależność od FXII, dodano 4 μM inhibitora trypsyny kukurydzianej (CTI) w celu zahamowania aktywowanego FXII (FXIIa)7. To zahamowanie nie wpłynęło na adhezję płytek krwi (ryc. 2A), ale krzepnięcie nie rozpoczęło się przez arbitralnie określony całkowity czas trwania eksperymentu perfuzjowego (ryc. 2B i dodatkowe wideo 1).

In vitro, ścieżka kontaktu może być zainicjowana przez obce materiały, takie jak szkło, lub w testach klinicznych z użyciem materiału mineralnego, takiego jak kaolin. In vivo, aktywowane płytki krwi dostarczają ładunek ujemny8 poprzez ekspozycję błony kwaśnych fosfolipidów9, takich jak fosfatydyloseryna, i/lub poprzez uwalnianie polifosforanów (polyP)10,11. Nasz mikroprzepływowy test w czasie rzeczywistym naśladuje to ostatnie, ponieważ w zakresie stężeń płytek krwi reakcja hemostatyczna zależała od liczby płytek krwi (ryc. 3). Zwiększając liczbę płytek krwi w odtworzonej próbce, szybkość adhezji (ryc. 3A), akumulacji (ryc. 3B, kolor zielony) i krzepnięcia (ryc. 3B, kolor fioletowy) wzrastała liniowo. Moment wystąpienia uległ znacznemu skróceniu (ryc. 3C) poprzez zwiększenie stężenia płytek krwi, co sugeruje, że do wywołania krzepnięcia wymagana jest progowa liczba (aktywowanych) zdeponowanych płytek krwi.

Jednak po uszkodzeniu tkanek in vivo, komórki zawierające TF zainicjują krzepnięcie krwi za pomocą zewnętrznego kompleksu tenazy FVIIa-TF w obecności Ca2+. Jest to naśladowane w naszym eksperymentalnym układzie poprzez powlekanie komór perfuzyjnych zawierających kolagen lipidowanym rhTF. W sparowanej analizie kanałów pokrytych tylko kolagenem lub w połączeniu z rhTF początek krzepnięcia był znacznie szybszy (ryc. 4A). Szybkość adhezji płytek krwi nie była liniowa, więc nie można było przeprowadzić regresji liniowej (dane nie pokazane). Zarówno szybkość krzepnięcia, jak i akumulacji płytek krwi nie różniły się w zależności od stanu (ryc. 4B-4C, film uzupełniający 2).

figure-results-1
Rysunek 1: Analiza regresji adhezji i krzepnięcia płytek krwi w mikroprzepływowych komorach perfuzyjnych. Rysunek ten wyjaśnia parametry uzyskane na podstawie surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym uzyskanych podczas zwapnionego przepływu krwi przez powierzchnię reaktywną. (A) Średnia intensywność zielonej fluorescencji pokazuje odkładanie się płytek krwi w funkcji czasu perfuzji. Krzywa opisuje proces bimodalny rozpoczynający się od (i) powoli rosnącej liniowej adhezji płytek krwi, po której następuje (ii) szybko rosnąca akumulacja liniowa. Obie liniowe części krzywej są regresyjne, a ich nachylenie opisuje dwie szybkości tworzenia się skrzepliny przez fluorescencję płytek krwi; (i) adhezja i (ii) akumulacja. (B) Średnia intensywność fluorescencji fioletowej wskazuje na odkładanie się fibryny w funkcji czasu. Podczas adhezji płytek krwi fluorescencja fioletowa jest zasadniczo nieobecna, podczas gdy szybko rozwija się po rozpoczęciu krzepnięcia. (iv) moment wystąpienia definiuje się jako przecięcie z osią x ekstrapolowanej regresji liniowej (iii) drugiej fazy powstawania skrzepliny przez fluorescencję fibryny, oznaczonej tutaj jako krzepliwość. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: W przypadku braku TF krzepnięcie w perfuzyjnych komorach przepływowych pokrytych kolagenem zależy od FXIIa. Perfuzję mikroprzepływową odtworzonej krwi zawierającej CTI lub bufor kontrolny (CONTROL) przeprowadzono z szybkością ścinania 1000 s-1 przez łącznie 30 minut. (A) Szybkość adhezji płytek krwi (s-1) nie była zależna od CTI. (B) Moment wystąpienia dla próbek poddanych działaniu CTI przekraczał limit 30 minut eksperymentu (pokazany jako linia przerywana), co wskazuje na zależność tego parametru od FXIIa. Słupki i kropki to wartości średnie, wąsy to odchylenie standardowe. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą sparowanego testu t. (NS = nieistotne, n ≥3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Koagulacja pod wpływem przepływu zależy od liczby płytek krwi. Eksperymenty perfuzji mikroprzepływowej przeprowadzono w komorach pokrytych kolagenem z rozpuszczoną krwią w obecnościCa2+ i zmiennych stężeniach płytek krwi (n ≥3). (A) Szybkość adhezji płytek krwi, (B), szybkość akumulacji płytek krwi (kolor zielony) i krzepnięcia (kolor fioletowy) oraz (C) moment wystąpienia są przedstawione jako funkcje stężeń płytek krwi w odtworzonej krwi. Kropki są wartościami średnimi, wąsy są odchyleniami standardowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Aktywacja zarówno TF, jak i koagulacji szlaku kontaktowego znacznie skraca moment wystąpienia krzepnięcia. Odtworzoną krew, w obecności Ca2+, perfundowano przez komory pokryte samym kolagenem lub kolagenem i rhTF w celu zbadania samego szlaku kontaktowego lub kombinacji szlaków kontaktowych i TF. (A) Moment rozpoczęcia krzepnięcia jest znacznie skrócony w komorach przepływowych zawierających TF. (B) Szybkość akumulacji płytek krwi podczas krzepnięcia i (C) szybkość krzepnięcia nie różnią się znacząco między samymi komorami przepływowymi pokrytymi kolagenem i rhTF. Słupki i kropki są wartościami średnimi; Wąsy są odchyleniami standardowymi. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą sparowanego testu t. (NS = nieistotne, *P <0,05, n ≥3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Wideo uzupełniające 1: W przypadku braku TF, krzepnięcie w komorach perfuzyjnych pokrytych kolagenem zależy od FXIIa. Rola szlaku kontaktowego jest określana w komorach perfuzyjnych pokrytych kolagenem. (A) Nałożona fluorescencyjna sekwencja obrazu osadzania się płytek krwi (zielony) i fibryny (genu) (fioletowy) przy braku CTI. (B) Ta sama sekwencja co w panelu A, ale z wyłączonym kanałem zielonym. (C) Nałożona sekwencja obrazu fluorescencji osadzania się płytek krwi (zielony) i fibryny (ogenu) (fioletowy) w obecności CTI. (D) Ta sama sekwencja co w panelu C, ale z wyłączonym zielonym kanałem. Kliknij tutaj aby pobrać ten film.

figure-results-6
Film uzupełniający 2: Aktywacja zarówno TF, jak i szlaku kontaktowego znacznie skraca moment krzepnięcia. Do zbadania roli TF wykorzystano komory przepływowe pokryte samym kolagenem lub kolagenem i rhTF. (A) Nałożona na siebie sekwencja obrazu fluorescencji osadzania się płytek krwi (zielony) i fibryny (genu) (fioletowy) w komorach przepływowych pokrytych tylko kolagenem. (B) Ta sama sekwencja co w panelu A, ale z wyłączonym kanałem zielonym. (C) Nałożona sekwencja obrazu fluorescencji osadzania się płytek krwi (zielony) i fibryny (ogenu) (fioletowy) w komorach przepływowych pokrytych zarówno kolagenem, jak i rhTF. (D) Ta sama sekwencja co w panelu C, ale z wyłączonym zielonym kanałem. Kliknij tutaj aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfuzja koncentratów płytek krwi jest przepisywana pacjentowi z małopłytkowością w celu zapobieżenia lub zatrzymania krwawienia. Jej wpływ kliniczny został niedawno podkreślony w historycznym przeglądzie ostrej białaczki12, przypominając, że zwiększone wskaźniki przeżycia pacjentów pediatrycznych w latach sześćdziesiątych i siedemdziesiątych można było w dużej mierze przypisać poprawie w medycynie transfuzji (płytek krwi). Koncentraty płytek krwi są również stosowane do tamowania krwawienia w ostrym urazie lub podczas operacji. W tych warunkach preferowane są płytki krwi o doskonałych właściwościach prokoagulacyjnych, które szybko inicjują hemostazę, ale koncentraty płytek krwi są przygotowywane z dawców dobrowolnych i, w przeciwieństwie do leków farmakologicznych, są standaryzowane tylko przez przygotowanie, a nie przez skład (chemiczny). W związku z tym kilka pytań w dziedzinie bankowania krwi pozostaje bez odpowiedzi, w tym te dotyczące optymalnych metod dawstwa, warunków przechowywania i praktyk transfuzjologicznych. W dziedzinie biologii płytek krwi (transfuzji) wiele pytań dotyczących usuwania komórek z krążenia, udziału przetoczonych płytek krwi w hemostazie lub ich immunologii również pozostaje bez odpowiedzi.

Dostępnych jest wiele technik laboratoryjnych do analizy funkcji płytek krwi, ale dotyczą one głównie pojedynczego aspektu funkcji płytek krwi, takiego jak agregacja lub degranulacja13. Aby szeroko ocenić płytki krwi i koncentraty płytek krwi, niezbędne są kompleksowe modele hemostazy, które muszą obejmować hydrodynamikę. Reologia krwi ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej interpretacji zachowania płytek krwi podczas hemostazy14,15 lub zakrzepicy16, nawet jeśli antykoagulacja uniemożliwia udział Ca2+ i / lub trombiny w obecności cytrynianu lub heparyny, odpowiednio2. Aby zbadać wzajemne oddziaływanie między krzepnięciem a funkcją płytek krwi w przepływie17,18, wymagane jest normalne wytwarzanie trombiny, a zatem również wolnego Ca2+. Konfiguracja eksperymentalna do badania hemostazy w tych warunkach jest złożona, ponieważ środki zapobiegające "artefaktowi" lub niekontrolowanej aktywacji krzepnięcia powinny być podejmowane w jak największym stopniu. Ponadto wiele wyspecjalizowanych grup badawczych korzysta ze sprzętu wykonanego na zamówienie19,20, co powoduje znaczną zmienność międzylaboratoryjną5. Typowymi ograniczeniami tego podejścia są stosowanie naczyń prostokątnych, niepulsacyjne profile przepływu oraz powłoki powierzchniowe niepochodzące od człowieka5. Opisany przez nas test wykorzystuje dostępne na rynku narzędzia i dlatego może nadawać się do standaryzacji.

Ponieważ reakcja kaskadowa krzepnięcia jest łatwo aktywowana, gdy krew nie jest zawarta w ludzkim ciele, kontrolowane ponowne zwapnienie jest kluczowym krokiem. Aby to osiągnąć, dodanie Ca2 + należy odłożyć na chwilę przed perfuzją na reaktywnej powierzchni kolagenu, ponieważ gdy bufor Ca2 + jest dostarczany luzem do krwi statycznej, nieuchronnie dochodzi do koagulacji, ostatecznie zatykając rurkę i zniekształcając interpretację danych (dane nie pokazane). Rozwiązaniem tego problemu jest oddzielne pompowanie buforu Ca2+ i krwi, co pozwala na mieszanie sił konwekcyjnych i dyfuzyjnych podczas perfuzji w drodze do komory analitycznej. Pełne wymieszanie uzyskuje się w 46-centymetrowym segmencie rurki między komorą mieszania i analizy. Długość ta została obliczona dla optymalnego czasu przebywania odczynników do wymieszania w oparciu o podstawowe prawa masy i transportu konwekcyjnego21 podczas perfuzji przy zastosowanym natężeniu przepływu (1000 s-1). Podejście to okazało się możliwe do kontrolowania i powtarzalności.

Kontaktowa aktywacja krzepnięcia jest czasami postrzegana jako artefakt prostego pobierania próbek krwi i należy jej unikać podczas interpretacji czasów krzepnięcia. Dlatego wykazaliśmy, że przy braku inhibitorów krzepnięcie wywołane kontaktem rozpoczyna się po 16,7 min (±3,7 min) perfuzji. W obecności CTI hamującego aktywację kontaktową za pośrednictwem FXIIa, krzepnięcie nie jest inicjowane podczas dowolnie określonego przebiegu eksperymentu (30 min). To okno eksperymentów jest wystarczająco długie, aby dostrzec próbki, które są pro- lub przeciwzakrzepowe. Mimo że krzepnięcie przez aktywację kontaktową może być niepożądaną konsekwencją kontaktu krwi ze sztucznymi powierzchniami, nasze dane wskazują na wyraźny wpływ płytek krwi na dawkę biologiczną. Może to być ważne dla medycyny transfuzjologicznej, ponieważ ostatnie odkrycia dotyczące FXII, polifosforanów płytek krwi10, dystrybucji fosfatydyloseryny22 i mikrocząstek płytek krwi23 faktycznie przewartościowały krzepnięcie szlaku kontaktowego jako ważny czynnik przyczyniający się do hemostazy, zwłaszcza w kontekście zakrzepicy24. Na przykład zmienna wydajność transfuzji płytek krwi u pacjentów lub zmienna ekspresja fosfatydyloseryny w bankowanych płytkach krwi może zatem powodować zmienność skuteczności terapeutycznej, jeśli okaże się, że skuteczna krzepnięcie zależy od tych czynników.

Poprzez komobilizację lipidowanego rhTF z kolagenem, zewnętrzna droga krzepnięcia lub szlak TF jest aktywowany podczas odkładania się płytek krwi na kolagenie. Rozszerza to test do najbardziej wszechstronnego trybu, jako modelu urazów, które powodują kontakt krwi z komórkami i tkankami zawierającymi TF. Nasze dane pokazują, że komobilizacja kolagenu i TF zmniejsza moment wystąpienia krzepnięcia, ale nie zmienia szybkości krzepnięcia. Warto zauważyć, że ilość rhTF unieruchomionej na powierzchni jest ważną zmienną w tym modelu25,26 i powinna być ustandaryzowana w ramach danego badania. W obecności CTI, szlak TF może być badany wyłącznie (nie pokazany), ponieważ zapobiega się aktywacji kontaktu.

Podsumowując, nasz układ eksperymentalny łączy model transfuzji przez rozpuszczenie krwi małopłytkowej z bankowanymi płytkami krwi oraz model hemostazy przez zależne od wapnia odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny pod wpływem przepływu hydrodynamicznego. Test ten zostanie wykorzystany do udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące prokoagulacyjnego charakteru nasypanych płytek krwi i wpływu technik przygotowania koncentratu płytek krwi na to.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Fundację Badań i Rozwoju Belgijskiego Czerwonego Krzyża-Flandryjskiej Służby Krwi. Dziękujemy, że wsparcie finansowe udzielone przez "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF - specjalny fundusz badawczy) z Uniwersytetu w Gandawie zostało udzielone projektowi z numerem umowy BOF30290744.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlBDA00434
Strzykawka 10 mlBD309604
Strzykawka 2 mlBD307727
Alexa Fluor 405Life TechnologiesA30100Postępowano zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą etykietowania wakutainera fibrynogenu
BD EclipseBecton, Dickinson and Company368650Igła do pobierania krwi z fabrycznie przymocowanym uchwytem
Rurka próżniowa BD z EDTA Becton, Dickinson and Company368856
probówkę próżniową BD z cytrynianem soduBecton, Dickinson and Company366575
Bufor blokującyw przygotowaniu domowymw przygotowaniu domowym1,0% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% (w/v) glukozy w HBS
Calcein AMSondy molekularneC1430
Bufor krzepnięciaw przygotowaniu domowymprzygotowanie we własnym zakresie10 mM CaCl2 i 3,75  mM MgCl2 w HBS
Probówka stożkowa 15 mlGreiner bio-one1888271
Probówka stożkowa 50 mlGreiner bio-one227261
Inhibitor trypsyny kukurydzianej (CTI)Laboratoria Badań EnzymatycznychCTI
Alkohol denaturowanyFiersT0011.5
DiOC6Sigma-Aldrich318426Jodek 3,3′-dihexyloxacarbocyjaniny - roztwór 1 mM w
pompie mikroprzepływowej DMSO ExigoCellixEXIGO-PC-FS7.0-MF
FibrinogenSigma-AldrichF3879Oznakowany we własnym zakresie z AF 405 - stężenie zapasowe 10,7  mg/ml
Analizator hematologicznySysmexpocH-100i
HEPES sól fizjologiczna buforowana (HBS)w domu przygotowaniew domu preparat10 mM 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy kwas (HEPES) buforowany sól fizjologiczna (0,9% (w/v) NaCl), pH 7,4
Horm CollagenTakeda/Nycomed1130630Natywny kolagen ścięgien koni (typ I)
Izotoniczny roztwór glukozy do rozcieńczania kolagenu to uzupełnione
Skrzynka nawilżanaCellixHUMID-BOX
Inkubacyjna łaźnia wodnaGFL1013
MikroskopZeissAxio Observer Z1wyposażony w kamerę colibri-LED i CCD o wysokiej rozdzielczości
Mirus Evo NanopumpCellix188-MIRUS-PUMP-EVOMultiflow8
MarkaA03429
Końcówki do pipet 100-1000Greiner bio-one740290
Końcówki do pipet 1-10EppendorfA08928
Końcówki do pipet 2-200Greiner bio-one739280
Wytrząsarka orbitalna z koncentratem płytek krwiHelmerPF-48i
Chusteczki precyzyjneKimtech5511
Roztwór pepsyny Instrument HannaHI7073L 2 g pepsyny na 75 ml roztworu, Białkowy roztwór czyszczący z pepsyną
Rekombinowany czynnik tkankowy InnovinDade BerhingB4212-40rhTF z syntetycznymi fosfolipidami
Mikroskop programowy ZeissN/AZEN 2012
Sterylne urządzenie dokująceWirówka stołowa Terumo BCTTSCD
Eppendorf521-0095
Wałek rurowyRatekBTR5-12V
Uszczelniacz do rurTerumo BCTAC-155
Vena8 złącze strzykawki pinCellixCONNECTORS-B1IC-PACK100
Vena8 Fluoro+ BiochipsCellix188V8CF-400-100-02P10Powlekany biochip
Vena8 IgłyCellixSS-P-B1IC-B1OC-PACK200
Vena8 Rurka CellixTUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F
VenaDelta Y1 BiochipsCellixVDY1-400-100-01-02Mieszalnik do biochipów
VortexVWR58816-121
ZEN2012 oprogramowanieZeiss
z pipetą

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levi, M., Hunt, B. J. A critical appraisal of point-of-care coagulation testing in critically ill patients. J. Thromb. Haemost. 13 (11), 1960-1967 (2015).
  2. Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J. Vis. Exp. (109), e53823(2016).
  3. Witt, S. M., et al. Identification of platelet function defects by multi-parameter assessment of thrombus formation. Nat. Commun. 5, 4257(2014).
  4. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol. Biol. 272, 13-28 (2004).
  5. Roest, M., et al. Flow chamber-based assays to measure thrombus formation in vitro: requirements for standardization. J. Thromb. Haemost. 9 (11), 2322-2324 (2011).
  6. Zwaal, R. F., Comfurius, P., Bevers, E. M. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim. Biophys. Acta. 1376 (3), 433-453 (1998).
  7. Dargaud, Y., Luddington, R., Baglin, T. P. Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor. J. Thromb. Haemost. 4 (5), 1160-1161 (2006).
  8. Bevers, E. M., et al. Defective Ca(2+)-induced microvesiculation and deficient expression of procoagulant activity in erythrocytes from a patient with a bleeding disorder: a study of the red blood cells of Scott syndrome. Blood. 79 (2), 380-388 (1992).
  9. Bevers, E. M., Comfurius, P., van Rijn, J. L., Hemker, H. C., Zwaal, R. F. Generation of prothrombin-converting activity and the exposure of phosphatidylserine at the outer surface of platelets. Eur. J. Biochem. 122 (2), 429-436 (1982).
  10. Muller, F., et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell. 139 (6), 1143-1156 (2009).
  11. Smith, S. A., et al. Polyphosphate modulates blood coagulation and fibrinolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (4), 903-908 (2006).
  12. Tiberghien, P., Follea, G., Muller, J. Y. Platelet Transfusions in Acute Leukemia. N. Engl. J. Med. 375 (1), 96-97 (2016).
  13. Deckmyn, H., Feys, H. B. Assays for quality control of platelets for transfusion. ISBT Science Series. 8 (1), 221-224 (2013).
  14. Sakariassen, K. S., Bolhuis, P. A., Sixma, J. J. Human blood platelet adhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII-Von Willebrand factor bound to the subendothelium. Nature. 279 (5714), 636-638 (1979).
  15. Alevriadou, B. R., et al. Real-time analysis of shear-dependent thrombus formation and its blockade by inhibitors of von Willebrand factor binding to platelets. Blood. 81 (5), 1263-1276 (1993).
  16. Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15 (6), 665-673 (2009).
  17. Stalker, T. J., et al. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network. Blood. 121 (10), 1875-1885 (2013).
  18. Swieringa, F., Kuijpers, M. J., Lamers, M. M., vander Meijden, P. E., Heemskerk, J. W. Rate-limiting roles of the tenase complex of factors VIII and IX in platelet procoagulant activity and formation of platelet-fibrin thrombi under flow. Haematologica. 100 (6), 748-756 (2015).
  19. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).
  20. Gutierrez, E., et al. Microfluidic devices for studies of shear-dependent platelet adhesion. Lab. Chip. 8 (9), 1486-1495 (2008).
  21. Hartman, R. L., McMullen, J. P., Jensen, K. F. Deciding whether to go with the flow: evaluating the merits of flow reactors for synthesis. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 50 (33), 7502-7519 (2011).
  22. Podoplelova, N. A., et al. Blood coagulation factors bound to procoagulant platelets are concentrated in their cap structures to promote clotting. , Blood. (2016).
  23. Der Meijden, P. E. V. an, et al. Platelet- and erythrocyte-derived microparticles trigger thrombin generation via factor XIIa. J. Thromb. Haemost. 10 (7), 1355-1362 (2012).
  24. Nickel, K. F., et al. The polyphosphate-factor XII pathway drives coagulation in prostate cancer-associated thrombosis. Blood. 126 (11), 1379-1389 (2015).
  25. Okorie, U. M., Denney, W. S., Chatterjee, M. S., Neeves, K. B., Diamond, S. L. Determination of surface tissue factor thresholds that trigger coagulation at venous and arterial shear rates: amplification of 100 fM circulating tissue factor requires flow. Blood. 111 (7), 3507-3513 (2008).
  26. Shen, F., Kastrup, C. J., Liu, Y., Ismagilov, R. F. Threshold response of initiation of blood coagulation by tissue factor in patterned microfluidic capillaries is controlled by shear rate. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (11), 2035-2041 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia wideo w czasie rzeczywistymtest hemostazykomora powlekana kolagenemkana mieszaj cy w kszta cie litery Yrekalcyfikacja wapniemznakowanie fluorescencyjne

Powiązane artykuły