Zapobieganie ludzkiej włośni w wielu krajach na całym świecie opiera się na laboratoryjnym badaniu próbek mięśni od wrażliwych zwierząt za pomocą metod trawienia, których metoda mieszadła magnetycznego jest uważana za złoty standard.
Artykuł metodologiczny
Metoda mieszadła magnetycznego do wykrywania larw włośni w próbkach mięśniowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Włośnica jest wyniszczającą chorobą u ludzi i jest spowodowana spożyciem surowego lub niedogotowanego mięsa zwierząt zarażonych larwami nicieni z rodzaju Trichinella. Najważniejszymi źródłami zakażeń ludzi na całym świecie są dziczyzna oraz wieprzowina lub produkty wieprzowe. W wielu krajach zapobieganie włośni u ludzi opiera się na identyfikacji zakażonych zwierząt poprzez sztuczne trawienie próbek mięśni z podatnych tusz zwierzęcych.
Istnieje kilka metod opartych na trawieniu mięsa, ale metoda z mieszadłem magnetycznym jest uważana za złoty standard. Metoda ta pozwala na wykrycie larw włośni za pomocą mikroskopii po enzymatycznym trawieniu próbek mięśniowych, a następnie etapach filtracji i sedymentacji. Chociaż ta metoda nie wymaga specjalnego i drogiego sprzętu, nie można stosować kontroli wewnętrznych. W związku z tym podczas całego badania należy stosować rygorystyczne zarządzanie jakością. Celem niniejszej pracy jest dostarczenie analitykom szczegółowych instrukcji postępowania i krytycznych punktów kontroli metody, w oparciu o doświadczenia Laboratorium Referencyjnego Unii Europejskiej ds. Pasożytów oraz Krajowego Laboratorium Referencyjnego Niemiec ds. Włośni.
Wprowadzenie
Nicienie z rodzaju Trichinella można wykryć w mięśniach poprzecznie prążkowanych ssaków, ptaków i na całym świecie. Te nicienie odzwierzęce mogą dotrzeć do ludzi, gdy spożywane jest surowe lub półsurowe mięso oraz produkty mięsne pochodzące od świń, koni i zwierząt łownych. Ta choroba odzwierzęca może być poważną chorobą u ludzi, charakteryzującą się patognomonicznymi oznakami i objawami, np. biegunką, gorączką, obrzękiem okołooczodołowym i bólem mięśni oraz możliwymi powikłaniami, takimi jak zapalenie mięśnia sercowego, choroba zakrzepowo-zatorowa i zapalenie mózgu1.
Trichinella spiralis jest najbardziej rozpowszechnionym czynnikiem etiologicznym infekcji włośni u dzikich i domowych zwierząt i powoduje większość infekcji u ludzi na całym świecie. W Europie, Afryce Północnej i Zachodniej oraz Azji Zachodniej Trichinella britovi jest kolejnym źródłem zakażeń u ludzi. Ponadto dziesięć innych taksonów jest rzadziej opisywanych jako czynniki wywołujące chorobę u ludzi i występuje w różnych regionach świata, zwykle u dzikich zwierząt2. Oprócz dzikich zwierząt, takich jak dziki, niedźwiedzie, morsy i borsuki, wieprzowina stanowi najważniejsze źródło infekcji u ludzi na całym świecie.
Najlepszym sposobem zapobiegania włośnicy jest powstrzymanie się od jedzenia surowych produktów mięsnych i gotowanie jakiegokolwiek mięsa, zwłaszcza dziczyzny, do bezpiecznej temperatury (> 65 °C przez 1 minutę, >tj. zmiana koloru mięsa z różowego na brązowy w środku produktu mięsnego)3. Unia Europejska i USDA określiły czas i temperaturę zamrażania i gotowania dla produktów wieprzowych, które mogą być używane do zabijania larw T. spiralis w mięsie4,5. Ponadto zalecenia dotyczące inaktywacji włośni w mięsie i produktach mięsnych zostały opublikowane przez Międzynarodową Komisję ds. Włośnicy6. W Europie, oprócz wprowadzenia kontrolowanych warunków przetrzymywania w komercyjnych stadach trzody chlewnej, w których ryzyko zakażenia włośniem jest znikome, zapobieganie włośni u ludzi opiera się na badaniu laboratoryjnym próbek mięśni zwierząt wrażliwych4.
Dla celów bezpieczeństwa żywności, testy trawienia są jedynymi wiarygodnymi procedurami bezpośredniego wykrywania larw włosienia w mięsie3,7. Nawet jeśli istnieje kilka wariantów testu trawienia, metoda mieszadła magnetycznego jest akceptowaną na całym świecie metodą referencyjną3,4,7. Test ten opiera się na wykrywaniu larw włosienia w tkankach mięśni prążkowanych. Po enzymatycznym trawieniu próbek mięśniowych i następujących po nim etapach filtracji i sedymentacji, larwy włośni są identyfikowane za pomocą mikroskopii. W zależności od zobowiązań handlowych i ustawodawstwa krajowego istnieje wiele niewielkich różnic w ogólnym protokole metody mieszadła magnetycznego. Szczegóły techniczne są oparte na wymaganiach UE4, ISO specifications8, ICT guidelines6 oraz doświadczeniach Laboratorium Referencyjnego Unii Europejskiej ds. Pasożytów (EURLP) i Niemieckiego Laboratorium Referencyjnego ds. Włośnicy.
Protokół
1. Przygotowania
- Pobieranie próbek
Uwaga: Metoda mieszadła magnetycznego może być stosowana do pojedynczych lub zbiorczych próbek mięśni.- Zbierz próbki z odpowiednich miejsc predylekcji i w odpowiedniej ilości9. Zapoznaj się z wymaganiami krajowymi lub zaleceniami ICT, OIE lub ISO.
- Na przykład w przypadku Unii Europejskiej należy pobrać próbkę o wadze 1 g ze słupka membranowego w miejscu przejścia do części ścięgnistej świń domowych. Upewnij się, że wszystkie próbki mięśni są wolne od tłuszczu i powięzi.
- Jeśli język jest testowany, usuń warstwę wierzchnią przed badaniem.
- Należy zachować ostrożność w przypadku zamrożenia próbek, ponieważ większość larw włośni nie jest odporna na zamarzanie i rozwija się po śmierci, jest mniej odporna na trawienie i ma tendencję do przyklejania się do ścianek pojemnika, co skutkuje zmniejszoną czułością testu.
Uwaga: W przypadku zamrożenia należy co najmniej podwoić wielkość próbki i wydłużyć czas sedymentacji (patrz poniżej).
- Zbierz próbki z odpowiednich miejsc predylekcji i w odpowiedniej ilości9. Zapoznaj się z wymaganiami krajowymi lub zaleceniami ICT, OIE lub ISO.
- Przygotowanie płynu wytrawiającego
- Dodać 25% HCl (16 ± 0,5 ml) do 2 l wody z kranu podgrzanej w temperaturze 46 - 48 °C do szklanej zlewki o pojemności 3 l. Zbyt niska temperatura powoduje niepełne trawienie; Zbyt wysoka temperatura dezaktywuje właściwości enzymatyczne pepsyny.
- Umieścić pręt mieszający w zlewce i wymieszać roztwór na rozgrzanej płytce (46 - 48 °C).
- Dodać 10 ± 0,2 g pepsyny (1:10 000 NF, 1:12 500 BP, 2 000 FIP) do kwaśnego roztworu.
Uwaga: Jakość pepsyny ma ogromne znaczenie, a aktywność enzymatyczna musi być certyfikowana przez producenta. Ze względów bezpieczeństwa laboratoryjnego oraz w celu utrzymania aktywności pepsyny należy przestrzegać kolejności dodawania składników płynu wytrawiającego.
- Przygotowanie próbki mięśniowej
- Posiekaj do 100 g próbek mięśni w blenderze lub młynku. Aby ułatwić mieszanie, dodaj do próbek 2 ml podgrzanej wody i miksuj z maksymalną prędkością przez 2-3 s.
- Przed drugim miksowaniem otwórz blender i przenieś dowolną próbkę mięśni z górnej krawędzi miski do miksowania na dół i powtórz miksowanie. Kontynuuj miksowanie seriami 2-3 s, aż nie pozostaną żadne widoczne kawałki mięsa.
Uwaga: Zbyt małe mieszanie może spowodować niepełne trawienie, podczas gdy zbyt duże mieszanie może uszkodzić larwy włosienia obecne w próbkach6.
2. Procedura
- Trawienie próbki mięśniowej
- Przenieść 1 l płynu wytrawiającego do cylindra. Zmielone mięso przełożyć do zlewki i rozprowadzić w płynie wytrawiającym za pomocą łyżki lub widelca. Dokładnie wypłukać pokrywę blendera, ostrze i miskę miksera z 500 ml podgrzanego płynu wytrawiającego do 3-litrowej zlewki.
Uwaga: Niepełne płukanie może spowodować utratę wrażliwości. - Przykryć zlewkę folią aluminiową i utrzymywać stałą temperaturę 44–46 °C, a następnie monitorować za pomocą termometru.
- Mieszaj płyn wytrawiający przez 30 minut, aby stworzyć głęboki wir bez rozpryskiwania, aż znikną cząstki mięsa. W zależności od rodzaju badanego mięsa (np. mięso dzikich zwierząt) należy wydłużyć czas trawienia maksymalnie do 60 min.
- Przenieść 1 l płynu wytrawiającego do cylindra. Zmielone mięso przełożyć do zlewki i rozprowadzić w płynie wytrawiającym za pomocą łyżki lub widelca. Dokładnie wypłukać pokrywę blendera, ostrze i miskę miksera z 500 ml podgrzanego płynu wytrawiającego do 3-litrowej zlewki.
- Filtracja i sedymentacja płynu wytrawiającego
- Aby określić ilość niestrawionej tkanki, ustaw wagę do zera, zważ sito przed użyciem i zanotuj jego wagę. Sito powinno być czyste i pozbawione jakichkolwiek cząstek tkanki, które mogłyby utrudnić larwom włośni dotarcie do lejka sedymentacyjnego. Sprawdź, czy lejek separacyjny jest wypoziomowany w pionie.
- Po wytrawieniu ostrożnie przelać płyn wytrawiający przez sito 180 μm do szklanego lejka do separacji. Szerokość szklanego lejka separacyjnego nie powinna być większa niż 55% długości, aby umożliwić dobrą sedymentację larw. Uważaj, aby nie dopuścić do przepełnienia.
- Aby uniknąć utraty wrażliwości, dokładnie wypłukać szklaną zlewkę i sito około 200 ml wody z kranu z wyciśniętej butelki do mycia i przenieść wodę z płukania do lejka do osadnika. Należy dokładnie opłukać brzegi zlewki o pojemności 3 l. Podnieś sitko i dokładnie spłucz obszar pod sitkiem.
- Oznaczanie ilości niestrawionych tkanek
Uwaga: Z powodu błędów w wykonaniu metody na sicie może pozostać tkanka mięśniowa, a także powięź i tkanka łączna, które są niestrawne. Ilość niestrawionej tkanki określa się podczas pierwszego 10-minutowego etapu sedymentacji (patrz 2.5). Dzięki temu sito może wyschnąć po około 30 minutach, ponieważ resztki wody mogą wpływać na określoną masę niestrawionej tkanki.- Połóż ręcznik papierowy na wadze i zważ sito z niestrawionymi tkankami.
- Odejmij masę sita przed filtracją od masy sita z niestrawionymi tkankami. Proces trawienia uważa się za zadowalający, jeżeli na sicie nie pozostaje więcej niż 5 % wyjściowej masy próbki (tj. 5 g/100 g materiału wyjściowego).
- Jeśli ilość niestrawionej tkanki przekracza 5%, powtórz test, używając świeżych próbek mięśni. Jeżeli pozostała tkanka składa się głównie z niestrawionej tkanki mięśniowej, a świeże próbki nie są dostępne, należy ponownie strawić niestrawione resztki i zbadać je dodatkowo z oryginalnymi próbkami.
- Sedymentacja płynu wytrawiającego
- Przefiltrowany płyn wytrawiający należy przechowywać w rozdzielaczu przez 30 minut. Pozostawione w spokoju larwy włośni osiądą na dnie lejka.
- Jeżeli stosuje się próbki zamrożone, należy wydłużyć czas sedymentacji do maksymalnie 60 minut.
- Po zakończeniu sedymentacji całkowicie otwórz kurek rozdzielacza separatora, aby co najmniej 40 ml płynu wytrawiającego szybko spłynęło do cylindra miarowego (80 ml, jeśli próbki mięśni zostały wcześniej zamrożone).
- Najpierw wpuść połowę płynu do cylindra, a następnie całkowicie otwórz kran w przeciwnym kierunku, aby umożliwić przepływ 10 ml płynu wytrawiającego. Na koniec otwórz kran w przeciwnym kierunku na kolejne 10 ml. Procedura ta zapewnia, że larwy włosienia nie zostaną uwięzione w kurku.
Uwaga: Potrzebna jest wystarczająca prędkość, aby larwy nie pozostały w rozdzielaczu, zmniejszając czułość.
- Sedymentacja płynu wytrawiającego w cylindrze
- Pozostaw osad w cylindrze na 10 minut, aby larwy mogły się osadzić. Usunąć 30 ml supernatantu przez odsysanie pipetą, nie naruszając 10 ml osadu.
- Aby zmniejszyć ilość włókien tkankowych w próbce, dodaj 30 ml wody z kranu do osadu i pozostaw na kolejne 10 minut. Powtarzaj, aż płyn będzie klarowny.
- Usunąć supernatant i przenieść 10 ml przemytego osadu do płytki Petriego z siatką lub ryniecki do liczenia larw. Przepłukać cylinder 10 ml wody z kranu, a następnie dodać wodę do próbki.
Uwaga: Ponieważ duże ilości zanieczyszczeń w próbce mogą uniemożliwić identyfikację larw włośni (rysunek 1), w razie potrzeby należy przeprowadzić dalsze czynności myjące.
- Badanie mikroskopowe
- Użyć trychinoskopu lub stereomikroskopu z podstopniowym źródłem światła przechodzącego o regulowanym natężeniu przy powiększeniu od 15 do 20 razy, aby zbadać próbki bezpośrednio po etapach mycia.
- Po przelaniu próbki na siatkowaną szalkę Petriego, należy systematycznie badać naczynie/miskę kratka po siatce. Jeśli nie zostaną znalezione żadne podejrzane struktury, delikatnie przesunąć płyn na siatkowej szalce Petriego lub w mieniu do liczenia larw w sposób okrężny, aby umożliwić larwy włośni, które mogły zostać przeoczone, zgromadzić się w środku szalki Petriego. Powtórz badanie.
- Jeśli zostanie znaleziona podejrzana struktura, zwiększ powiększenie do 40 - 100X. Usuń larwy włośni z naczynia/miski za pomocą pipety i zbierz w probówce z 90% etanolem.
- Po zbadaniu całego naczynia powtórz procedurę, zaczynając od delikatnego potrząśnięcia naczyniem/miską. Powtórz procedurę co najmniej trzy razy lub do momentu, gdy nie zostanie znalezionych więcej larw.
- Policz liczbę larw. Korelują z ilością tkanki mięśniowej badanej i obecnej w postaci larw na gram (lpg).
- Jeśli w płynie trawiennym znajduje się zbyt wiele larw, aby wiarygodnie określić liczbę larw, należy zwrócić płyn zawierający larwy do cylindra miarowego, spłukać wodą z kranu z wyciśniętej butelki do płukania i pozostawić larwy do osiadania na dnie.
- Po 10 minutach sedymentacji zredukować supernatant do określonej objętości (np. 10 ml). Aby określić dokładną objętość, przenieś supernatant do nowego cylindra za pomocą pipety.
- Zawiesić larwy jednorodnie w płynie przez energiczne potrząsanie. Podczas wytrząsania dodać 12 kropli 20 μl zawiesiny larwalnej na szalkę Petriego.
- Zbadaj każdą kroplę pod mikroskopem. Określić liczbę larw w 240 μl i usunąć najwyższą i najniższą liczbę. Ekstrapolować liczbę larw na całkowitą objętość (np. 10 ml) supernatantu.
Uwaga: Jakość stereomikroskopu ma ogromne znaczenie dla identyfikacji larw włosienia. - Po zebraniu larw do probówki za pomocą pipety, należy dokładnie sprawdzić, czy larwy nie przykleiły się do ścianki pipety, ale zostały przeniesione do probówki.
Uwaga: Dodatnie wyniki badań na obecność włośni w próbkach pobranych w puli muszą być prześledzone wstecz od próbki zbiorczej do tuszy pochodzenia. W tym przypadku wielkość puli powinna być stopniowo zmniejszana, aż do momentu zidentyfikowania tuszy z wynikiem dodatnim. Podczas tego procesu można również zwiększyć wielkość próbki, aby zwiększyć czułość. W przypadku gdy badanie próbki zbiorczej daje wynik dodatni lub niepewny, od każdej świni pobiera się kolejne 20 g próbki. Próbki o wadze 20 g pobrane od pięciu świń łączy się i bada przy użyciu opisanej metody. W ten sposób przebadane zostaną próbki z 20 grup po pięć świń. W przypadku wykrycia włośni w próbce zbiorczej pobranej od pięciu świń, pobiera się 20 g próbek od poszczególnych świń w grupie i każda z nich jest badana oddzielnie aż do momentu wykrycia dodatniej tuszy pochodzenia.
Wyniki
Po trawieniu kształt zakaźnych larw mięśniowych może być zmienny, co utrudnia ich identyfikację. Typowe formy obejmują larwy ściśle zwinięte, lekko zwinięte, w kształcie litery C lub całkowicie rozwinięte (Ryciny 2B - 2C). Liczba larw znaleziona w jednym gramie może znacznie się różnić i wynosić od jednej do kilkuset larw.
Morfologia zakaźnej larwy mięśniowej przedstawiona jest na Rysunku 2A. Larwy Trichinella mają od 0,7 do 1,5 mm długości i około 0,3 mm szerokości. Przełyk jest wąski i ma lekko zaokrąglony koniec. Kutykula jest gładka. W przedniej połowie jamy ciała można zaobserwować stichosom – strukturę składającą się z długiej, cienkiej rurki otoczonej rzędem od 45 do 55 dużych komórek (stichocytów). Odbytnica jest również zaokrąglona, bez jakichkolwiek wypustek lub wyrostków10,11.
Po trawieniu mięśni można znaleźć inne struktury niż larwy Trichinella. Niektóre przykłady przedstawiono na rycinach 3A – 3F. Dzikie zwierzęta są często zainfekowane innymi pasożytami lub próbki mięśni przeznaczone do badań zostają zanieczyszczone podczas procesu wypatroszenia przez ożywione lub nieożywione struktury/organizmy. Długość larw, wygląd końców przedniego i tylnego oraz obecność stichosomu pomagają w rozróżnieniu różnych rodzajów nicieni12.
Rycina 1: Badanie mikroskopowe larw Trichinella po (A) niewystarczających i (B) wystarczających etapach płukania. Paski skali oznaczają 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Morfologia zakaźnych larw Trichinella przedstawiająca odbyt, stichosom i przełyk larwy (A). Możliwe kształty larw mięśniowych po trawieniu przedstawiające (B) larwy poruszające się ciasno i luźno zwinięte oraz (C) larwy rozwinięte. Paski skali wskazują 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 3: Przykłady znalezisk przypadkowych po trawieniu próbek mięśni metodą z mieszadłem magnetycznym. (A) szczecinkowy włos dżdżownicy znaleziony u dzika; (B) Alaria alata z dzika; (C) włókno mięśniowe z dzika; (D) Metastrongylus sp. z dzika; (E) włókno roślinne znalezione u dzika (F): larva Toxocara sp. z dzika. Paski skali oznaczają 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Chociaż metoda mieszadła magnetycznego może być łatwa do wykonania, nieścisłe przestrzeganie szczegółów technicznych prowadzi do niewystarczającej czułości, zagrażając w ten sposób zdrowiu konsumentów. Krytyczne punkty kontrolne zostały wyróżnione w powyższym tekście. Ponadto kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku testu ma użycie odpowiedniego sprzętu. Wszystkie naczynia powinny być wykonane ze szkła, a końcówki pipet pokryte silikonem, aby zmniejszyć przyleganie larw do powierzchni.
Czułość metody trawienia zależy od gęstości larw w mięśniach i ilości badanej próbki mięśniowej. Dla zagęszczenia larw tkanek mięśniowych wynoszącej 3 - 5 lpg stwierdzono czułość na poziomie 100%, ale poniżej 1 lpg czułość spadła do 40%13. W zależności od badanego gatunku zwierzęcia żywiciela, czułość testu można poprawić poprzez zwiększenie ilości używanej próbki. Obciążenie infekcjami u dzikich zwierząt jest zwykle niskie, dlatego stosuje się większe rozmiary próbek14. Miejsca predylekcji różnią się również wśród zwierząt gospodarzy. W tym przypadku należy wziąć pod uwagę niższą strawność niektórych tkanek mięśniowych, takich jak język, co może również skutkować większymi rozmiarami prób15.
Ponadto ważne jest, aby zrozumieć, że metoda mieszadła magnetycznego nie obejmuje kontroli wewnętrznych. W związku z tym zarządzanie zapewnieniem jakości, od pobierania próbek po dokumentację, jest niezbędne do uzyskania dokładnych i precyzyjnych wyników. Jakość wyników badań laboratoryjnych w zakresie wykrywania larw włosienia w próbkach mięśniowych powinna być monitorowana poprzez regularny udział każdego analityka w testach biegłości.
Kolejnym ograniczeniem metody jest to, że końcowy etap identyfikacji larw mięśniowych za pomocą mikroskopii jest wysoce subiektywny i w dużym stopniu zależy od wiedzy badającego analityka na temat morfologii larw.
Interesującą alternatywną metodą obejścia tego problemu jest metoda mieszadła magnetycznego / izolacja filtra, a następnie wykrywanie larw za pomocą testu aglutynacji lateksowej. Jednak zgodnie z prawodawstwem UE metoda ta jest uważana za równoważną jedynie w przypadku badania mięsa świń domowych, ale nie w przypadku zwierząt, które są bardziej narażone na zakażenie, takich jak dziki4. Identyfikacja antygenu larwalnego z przeciwciałami monoklonalnymi czyni test bardziej obiektywnym, ale pozbawia laboratorium możliwości określenia liczby larw na gram mięsa16.
Inne odmiany metody mieszadła magnetycznego obejmują metodę mechanicznie wspomaganej mineralizacji próbki zbiorczej/technikę sedymentacji, metodę mechanicznie wspomaganej mineralizacji próbki zbiorczej/technikę izolacji na filtrze oraz metodę automatycznego trawienia dla próbek zbiorczych o masie do 35 g. Wszystkie te techniki opierają się na sztucznym trawieniu mięsa oraz wizualizacji i liczeniu larw włośni , ale różnią się sprzętem używanym do etapów filtracji i sedymentacji.
Wyizolowane larwy można dodatkowo zidentyfikować na poziomie gatunku za pomocą testu molekularnego (np. multiplex PCR)17. Zgodnie z prawodawstwem UE wszystkie dodatnie próbki muszą zostać przekazane do krajowego laboratorium referencyjnego lub do EURLP w celu określenia gatunku włosienia .
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Uprzejmie dziękujemy Sabine Reckinger za doskonałą pomoc techniczną i wsparcie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nóż, nożyczki, pęseta | Cięcie próbek i usuwanie niestrawnych tkanek | ||
| Blender | Z ostrym ostrzem do siekania | ||
| Mieszadło | Z termostatycznie sterowaną płytą grzewczą | ||
| Mieszadło | Pokryte teflonem, o długości około 5 cm | ||
| Stożkowy szklany rozdzielacz | Pojemność co najmniej 2 l, najlepiej wyposażone w teflonowe korki bezpieczeństwa. Szerokość nie powinna być większa niż 55% długości, aby umożliwić dobrą sedymentację larw. | ||
| Stojaki, pierścienie i zaciski | |||
| Sito | Rozmiar oczek 180 mikronów, średnica zewnętrzna 11 cm, z siatką ze stali nierdzewnej | ||
| Lejek Średnica | wewnętrzna nie mniejsza niż 12 cm, do podparcia sit | ||
| Zlewka | Pojemność 3 L | ||
| Szklany cylinder | Pojemność od 50 do 100 ml lub probówka wirówkowa | ||
| Mikroskop | Z podstopniowym źródłem światła przechodzącego o regulowanym natężeniu lub trychinoskopem ze stołem poziomym | ||
| Szalki | Petriegoo średnicy 9 cm, oznaczone na ich spodniej stronie 10 i razy; Kwadratowe obszary badania 10 mm za pomocą spiczastego narzędzia lub miski do liczenia larw do trykotkopu | ||
| Folia | aluminiowa Alternatywnie pokrywka do przykrycia zlewek | ||
| 25% kwas | |||
| pepsyny | : 1:10 000 NF (Narodowy Receptariusz USA) odpowiadający 1:12 500 BP (Farmakopea Brytyjska) i 2 000 FIP (Fé dé ration internationale de pharmacie) lub stabilizowaną pepsynę płynną o minimalnej zawartości 660 jednostek Farmakopei Europejskiej/ml | ||
| Etanol | 70-90% alkoholu etylowego | ||
| z kranu | Podgrzana do 46-48 ° C przed użyciem | ||
| Waga | Dokładność co najmniej 0,1 g | ||
| Metalowa taca | Pojemność 10 do 15 l, do zebrania pozostałego soku trawiennego | ||
| Pipety i uchwyt | Różne rozmiary (1, 10 i 25 ml) | ||
| Termometr | Dokładność do 0,5 ° C, zakres temperatur co najmniej od 20 & deg; C do 70 ° C | ||
| Syfon | Do wody z kranu |
Bibliografia
- Gottstein, B., Pozio, E., Nöckler, K. Epidemiology, Diagnosis, Treatment, and Control of Trichinellosis. Clin. Microbiol. Rev. 22, 127-145 (2009).
- Pozio, E., Murrell, D. K. Systematics and epidemiology of Trichinella. Adv. Parasitol. 63, 367-439 (2006).
- OIE World Organisation for Animal Health. Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. OIE Terrestrial Manual. , Available from: http://wahis2-devt.oie.int/fileadmin/Home/fr/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf 1-16 (2013).
- European Commission. Commission Implementing Regulation (EU) 2015/1375 of 10 August 2015 laying down specific rules on official controls for Trichinella in meat. Off. J. EU. 212, Available from: http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=celex%3A32015R1375 7-34 (2015).
- United States Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service. 9 CFR Part 318.10 - Prescribed treatment of pork and products containing pork to destroy trichinae. U.S. Government Publishing Office. , Available from: https://www.gpo.gov/fdsys/pkg/CFR-2016-title9-vol2/pdf/CFR-2016-title9-vol2-sec318-10.pdf (2012).
- Gamble, H. R., et al. International Commission on Trichinellosis: recommendations on methods for the control of Trichinella in domestic and wild animals intended for human consumption. Vet. Parasitol. 93 (3-4), 393-408 (2000).
- Gajadhar, A. A., Forbes, L. B. An internationally recognized quality assurance system for diagnostic parasitology in animal health and food safety, with example data on trichinellosis. Vet. Parasitol. 103, 133-140 (2002).
- ISO. Microbiology of the food chain -- Detection of Trichinella larvae in meat by artificial digestion method 18743. ISO. , Available from: http://www.iso.org/ (2015).
- Nöckler, K., Kapel, C. M. O. Chapter 3, Detection and surveillance for Trichinella: meat inspection and hygiene, and legislation. FAO/WHO/OIE Guidelines for the surveillance, management, prevention and control of trichinellosis. , World Organization for Animal Health (OIE). Paris. 69-98 (2007).
- Boch, J., Schnieder, T., Supperer, R. Veterinärmedizinische Parasitologie. , Parey Verlag. Stuttgart. 6. Aufl (2006).
- Despommier, D. D., Müller, M. The stichosome and its secretion granules in the mature muscle larva of Trichinella spiralis. J. Parasitol. 62 (5), 775-785 (1976).
- Marucci, G., Interisano, M., La Rosa, G., Pozio, E. Molecular identification of nematode larvae different from those of the Trichinella genus detected by muscle digestion. Vet Parasitol. 194, 117-120 (2013).
- Forbes, L. B., Gajadhar, A. A. A validated Trichinella digestion assay and an associated sampling and quality assurance system for use in testing pork and horse meat. J. Food Prot. 62, 1308-1313 (1999).
- Malakauskas, A., et al. Molecular epidemiology of Trichinella spp. in three Baltic countries: Lithuania, Latvia, and Estonia. Parasitol. Res. 100 (4), 687-693 (2007).
- Kapel, C. M., Webster, P., Gamble, H. R. Muscle distribution of sylvatic and domestic Trichinella larvae in production animals and wildlife. Vet. Parasitol. 132 (1-2), 101-105 (2005).
- Interisano, M., et al. Validation of a latex agglutination test for the detection of Trichinella infections in pigs. Vet. Parasitol. 194, 121-124 (2013).
- Pozio, E., La Rosa,, G, PCR-derived methods for the identification of Trichinella parasites from animal and human samples. Methods Mol. Biol. 216, 299-309 (2003).
Przedruki i uprawnienia
