Artykuł metodologiczny

Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

15.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55355

⸱

2 marca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj metoda opisuje skalowalny i gotowy do stosowania w dobrej praktyce produkcyjnej (GMP) system różnicowania do generowania ludzkich komórek hepatocytowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Służy jako opłacalny i ustandaryzowany system do generowania ludzkich komórek podobnych do hepatocytów do podstawowych i stosowanych badań nad ludzką wątrobą.

Streszczenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wielką wartość dla badań biomedycznych. hPSC mogą być skalowane i różnicowane do wszystkich typów komórek występujących w ludzkim ciele. Różnicowanie hPSC do ludzkich komórek podobnych do hepatocytów (HLC) zostało szeroko zbadane i ustanowiono skuteczne protokoły różnicowania. Połączenie macierzy zewnątrzkomórkowej i bodźców biologicznych, w tym czynników wzrostu, cytokin i małych cząsteczek, umożliwiło wytworzenie HLC, które przypominają pierwotne ludzkie hepatocyty. Jednak większość procedur nadal wykorzystuje niezdefiniowane komponenty, co powoduje różnice między partiami. Stanowi to istotną barierę w stosowaniu tej technologii. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy zdefiniowany system różnicowania hepatocytów przy użyciu ludzkich rekombinowanych laminin jako matryc zewnątrzkomórkowych w połączeniu z procesem różnicowania bez surowicy. Osiągnięto wysoce efektywną specyfikację hepatocytów, wykazując poprawę zarówno funkcji HLC, jak i fenotypu. Co ważne, system ten można łatwo rozbudować przy użyciu badań i linii hPSC klasy GMP, obiecując postępy w modelowaniu i terapiach komórkowych.

Wprowadzenie

Pierwotna tkanka ludzka i pochodne typy komórek są regularnie używane, zarówno do badań przesiewowych opartych na komórkach, jak i w klinice. Jednak dostęp do tych komórek jest poważnie ograniczony z powodu niewystarczającego dawstwa narządów i utraty fenotypów komórek po izolacji1. Komórki hPS stanowią obiecującą alternatywę dla tkanek pierwotnych i ułatwiają wytwarzanie genetycznie zdefiniowanych i odnawialnych ludzkich komórek somatycznych. Komórki podobne do hepatocytów (HLC) pochodzące z hPSC już okazały się obiecujące w tej dziedzinie. HLC przypominają pierwotne ludzkie hepatocyty pod różnymi względami, w tym morfologią komórek, ekspresją genów hepatocytów, funkcją metaboliczną oraz wrażliwością na leki i wirusy2,3,4,5,6,7,8. Ponadto nieograniczona zdolność do proliferacji i samoodnawiania się hPSC zarówno klasy badawczej, jak i GMP ułatwia ich stosowanie9,10.

Ponad dekada badań zaowocowała wieloma skutecznymi procedurami różnicowania hepatocytów2,3,5,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Jednak większość z tych systemów wykorzystuje niezdefiniowane komponenty i/lub transdukcję wirusa do sterowania specyfikacją komórek wątrobowych. Aby zwiększyć niezawodność technologii na dużą skalę, ważne jest opracowanie solidnego systemu różnicowania hepatocytów, który jest naprawdę zdefiniowany, wolny od ksenotypów i zgodny z GMP.

Lamininy (LNs) są ważnymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, które mogą wpływać na adhezję, proliferację, migrację i różnicowanie komórek. Lamininy to heterotrimeryczne glikoproteiny składające się z jednego α, jednego β i jednego łańcucha γ. Ostatnio wyprodukowano i zastosowano rekombinowane ludzkie lamininy w biologii komórki. Wykazano, że LN-511 wspiera utrzymanie hPSCs21, podczas gdy mieszanina LN-521 i E-kadheryny umożliwia klonalne pochodzenie i ekspansję ludzkich embrionalnych komórek macierzystych22. Z drugiej strony LN-111 wspomaga utrzymanie komórek podobnych do hepatoblastów pochodzących z hPSCs23. Jednak przed naszym raportem lamininy 521 i 111 nie były wykorzystywane do generowania HLC o dojrzałych cechach z hPSCs10.

Tutaj szczegółowo opisujemy procedury hodowli hPSC na LN-521 i różnicowania ich na LN-521 lub mieszance LN-521 i LN-111 (LN-521/LN-111). Zoptymalizowaliśmy protokół różnicowania za pomocą rozsiewania pojedynczych komórek, aby wygenerować wysoce powtarzalną i jednorodną monowarstwę HLC w wielu formatach14. Wierzymy, że nasz zdefiniowany system różnicowania stanowi prostą i opłacalną metodę produkcji aktywnych HLC do zastosowań, stanowiąc znaczący krok naprzód w tej dziedzinie.

Protokół

UWAGA: Informacje o dostawcach wszystkich odczynników używanych w tym protokole zostały wymienione w Tabeli 1. Wszystkie podłoża/płytki powinny być sterylne i mieć co najmniej temperaturę pokojową, gdy komórki mają mieć z nimi bezpośredni kontakt.

1. Przenikanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) na Lamininę 521

UWAGA: Opisana poniżej procedura pasażowania komórek opiera się na pojedynczych komórkach i jest idealna do uzyskania jednorodnej populacji komórek podobnych do hepatocytów z hPSC. Możliwe jest również posiewanie kolonii, które zostało opisane wcześniej24.

  1. W razie potrzeby przygotuj talerze pokryte lamininą.
    1. Rozmrozić zapas 100 μg/ml rekombinowanej lamininy 521 (LN-521) w temperaturze 4 °C.
    2. Rozcieńczyć rozmrożony LN-521 w lodowato zimnym 1x DPBS (z Ca2 + / Mg2 +), aby uzyskać roztwór o stężeniu 5 μg / ml.
    3. Dodaj 1 ml 5 μg/ml roztworu LN-521, aby pokryć jedną studzienkę 6-dołkowej płytki i rozdrobnić, aby równomiernie rozprowadzić ją w dołku.
    4. Inkubować płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 2 godziny w przypadku pilnego użycia lub w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc.
      5. W
    5. razie potrzeby przechowuj talerze pokryte lamininą w lodówce o temperaturze 4 °C. Trzymaj płytki na płaskiej powierzchni i uszczelnij je, aby uniknąć parowania i zanieczyszczenia.
      UWAGA: Nigdy nie pozwól, aby pokryte studzienki wyschły; W razie potrzeby uzupełnij je dodatkowym 1x DPBS (z Ca2+/Mg2+). Płytki zużyć w ciągu 2 tygodni.
  2. Przed użyciem należy pozwolić, aby wymagana liczba wstępnie pokrytych płytek osiągnęła temperaturę pokojową lub inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 0,5 - 1 godzinę.
  3. Ostrożnie zassać roztwór powłoki LN-521, nie uszkadzając powlekanej powierzchni. Uwaga: Bardzo ważne jest, aby nie uszkodzić powlekanej powierzchni przed wysianiem na niej komórek.
  4. Natychmiast dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki mTeSR1 uzupełnionej 10 μM inhibitorem kinazy związanej z Rho (ROCK) Y27632 do jednego dołka 6-dołkowej płytki. Pozostawić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w celu pobrania komórek.
    UWAGA: Nigdy nie pozwól, aby studzienki pokryte lamininą wyschły.
  5. Odessać pożywkę z dobrze utrzymanych hPSC przy zbieganiu około 75% do 85%. Umyj komórki z jednego dołka płytki 6-dołkowej raz 1 ml 1x DPBS o temperaturze pokojowej (bez Ca2+ / Mg2 +).
  6. Dodać 0,5 ml 1x Accutazy do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 - 8 minut w celu dysocjacji komórek.
    UWAGA: Aby sprawdzić, czy trawienie jest wystarczająco długie, czy nie, delikatnie postukaj w płytkę i sprawdź, czy komórki mogą się łatwo oderwać. Jeśli tak, nadszedł czas, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną; Jeśli nie, przedłuż trawienie o dodatkowe 1 - 2 minuty.
  7. Zakończ dysocjację, dodając do komórek 2 ml świeżej pożywki mTeSR1 uzupełnionej 10 μM Y27632. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół za pomocą końcówki P1000, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  8. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru. Użyj błękitu trypanowego do barwienia i wykluczania martwych komórek14
  9. Oblicz całkowitą liczbę potrzebnych komórek. W przypadku rutynowego pasażowania hPSC, wysiewaj 4 x 105 do 5 x 105 komórek na dołek płytki 6-dołkowej (tj. 4,21 x 104 do 5,26 x 104 na cm2). Do pasażowania hPSC w celu różnicowania hepatocytów, nasiona 6,5 x 105 do 7,5 x 105 (tj. 6,84 x 104 do 7,89 x 104 na cm2) komórek na dołek płytki 6-dołkowej.
    UWAGA: Gęstość wysiewu dla każdej linii komórkowej może wymagać niewielkiej optymalizacji w oparciu o podaną tutaj gęstość empiryczną dla różnicowania wątroby.
  10. Przenieść potrzebną zawiesinę komórkową do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml lub 50 ml i wirować przy 115 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  11. Powoli odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym, ciepłym podłożu mTeSR1 uzupełnionym inhibitorem 10 μM kinazy związanej z Rho (ROCK) Y27632, używając odpowiedniej pożywki, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek.
    UWAGA: Stosowanie inhibitora ROCK jest wysoce zalecane w celu zwiększenia przyczepiania komórek i przeżywalności.
  12. Zasiej komórki na przygotowanych płytkach i kołysz nimi w przód iw tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzienkach, niezależnie od tego, czy płytka jest przeznaczona do rutynowej hodowli komórek, czy do eksperymentów z różnicowaniem hepatocytów.
  13. Umieścić płytki w inkubatorze do komórek i utrzymywać je w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 24 godziny, aby umożliwić im przyczepienie się i odzyskanie.
  14. Zbadaj komórki następnego dnia i odstaw inhibitor ROCK, jeśli kontakt komórka-komórka został nawiązany. Utrzymuj komórki w pożywce mTeSR1 do rutynowej hodowli lub w razie potrzeby zmień na pożywkę różnicującą.
    UWAGA: Jeśli komórki zostały zasiane o wspomnianej gęstości, zbieg powinien być idealny do rutynowej konserwacji lub różnicowania hepatocytów.

2. Różnicowanie hPSC do komórek hepatocytopodobnych na rekombinowanych laminach

  1. Przygotować pożywkę różnicującą.
    1. Przygotuj ludzki roztwór podstawowy Activin A: rozpuść ludzką Activinę A w proszku, aby uzyskać 100 μg / ml roztworu podstawowego w sterylnej 0,2% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) / DPBS. Przygotuj małe porcje i przechowuj je w temperaturze -20 °C. Stosować w stosunku 1:1 000.
    2. Przygotuj mysi roztwór podstawowy Wnt 3a: rozpuść mysi proszek Wnt 3a, aby uzyskać roztwór podstawowy 10 μg/ml w sterylnym 0,2% BSA/DPBS. Przygotować małe porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Stosować w temperaturze 1:200.
    3. Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego czynnika wzrostu hepatocytów (HGF): rozpuść ludzki proszek HGF, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 10 μg/ml w sterylnym 0,2% BSA/DPBS. Przygotuj małe porcje i przechowuj je w temperaturze -20 °C. Stosować w stosunku 1:1 000.
    4. Przygotować roztwór podstawowy onkostatyny M (OSM): rozpuścić proszek onkostatyny M (OSM), aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 20 μg/ml w sterylnym 0,2% BSA/DPBS. Przygotuj małe porcje i przechowuj je w temperaturze -20 °C. Stosować w stosunku 1:1 000.
    5. Przygotować 500 ml podłoża podstawowego gruntującego endodermę: 2% suplementu B27 (50x, minus witamina A) i 1% penicyliny/streptomycyny (końcowe stężenia odpowiednio 100 IU/ml i 100 μg/ml); uzupełnić do 500 ml za pomocą pożywki podstawowej Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640). UWAGA: Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu dwóch tygodni. Podwielokrotną pożywkę z podstawowego materiału i dodać świeżą aktywinę A i Wnt 3a (końcowe stężenia odpowiednio 100 ng/ml i 50 ng/ml) przy każdej zmianie pożywki.
    6. Przygotuj 500 ml pożywki różnicującej KSR/DMSO: 80% nokautujący DMEM (KO-DMEM), 20% zastępczy surowicy nokautującej (KSR), 0,5% GlutaMAX, 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 0,1 mM beta-merkaptoetanolu, 1% DMSO i 1% penicyliny/streptomycyny (końcowe stężenia odpowiednio 100 IU/ml i 100 μg/ml). Filtruj pod próżnią. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu dwóch tygodni.
    7. Przygotować 500 ml pożywki do dojrzewania HepatoZYME: 1% GlutaMAX, 10 μM soli sodowej 21-hemibursztynianu hydrokortyzonu (HCC) i 1% penicyliny/streptomycyny (końcowe stężenia odpowiednio przy 100 j.m./ml i 100 μg/ml); uzupełnić do 500 ml za pomocą podłoża podstawowego HepatoZYME. UWAGA: Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu dwóch tygodni. Podwielokrotną pożywkę z podstawowego materiału i dodać świeże HGF i OSM (końcowe stężenia odpowiednio 10 ng/ml i 20 ng/ml) dla każdej zmiany pożywki.
  2. Nasiona hPSC do różnicowania hepatocytów na LN-521, jak opisano w sekcji 1. Jeżeli jako podłoże ma być użyty LN-521/LN-111, należy pokryć płytki LN-521 i LN-111 (w stosunku 1:3) przy końcowym stężeniu lamininy 5 μg/ml; reszta traktowania powinna być taka sama, jak w przypadku czystych płyt powlekanych LN-521.
    UWAGA: LN-521/LN-111 nie jest idealny do rutynowej hodowli hPSC; Służy tylko do eksperymentów różnicujących.
  3. Sprawdź zbieg komórek 24 godziny po wysiewie. Zainicjuj różnicowanie komórkowe, gdy zbieg komórek osiągnie około 40%. Usuń zużytą pożywkę mTeSR1 i dodaj świeżą pożywkę gruntującą endodermę uzupełnioną 100 ng/ml aktywiny A i 50 ng/ml Wnt 3a. Nazwij ten dzień zróżnicowania 1.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się rozpoczęcie różnicowania następnego dnia po wysianiu komórek.
    4. W
  4. przypadku ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) należy zmieniać pożywkę gruntującą endodermę co 24 godziny przez 3 dni. Jeśli chodzi o ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), przedłuż ten etap o kolejne 2 dni, aby przygotować komórki do ostatecznych komórek podobnych do endodermy, ale użyj pożywki gruntującej endodermę uzupełnionej tylko 100 ng / ml aktywiny A przez te dwa dni12.
    UWAGA: Aby zapewnić pomyślną specyfikację endodermy, można zbadać ekspresję markerów endodermalnych, takich jak FOXA2 i SOX17. Zgodnie z barwieniem immunofluorescencyjnym, ponad 80% pobranych komórek jest dodatnich dla obu markerów w naszym laboratorium.
  5. Przełącz na pożywkę różnicującą KSR/DMSO w 4. dniu (dla hESC)/w 6. dniu (dla hiPSC). Zmieniaj podłoże codziennie przez pierwsze 3 dni, a następnie w piątym dniu tego etapu różnicowania.
    UWAGA: W czwartym dniu tego etapu różnicowania nie jest konieczne karmienie. Użyj niesuplementowanego KO-DMEM, aby umyć komórki raz przed zmianą pożywki, jeśli jest wiele martwych komórek. Aby sprawdzić, czy różnicowanie na tym etapie jest pomyślne, czy nie, można przetestować ekspresję markerów komórek progenitorowych wątroby, takich jak AFP, CK19 i HNF4A. Z naszego doświadczenia wynika, że prawie 90% komórek będzie dodatnich dla tych markerów.
  6. Po 5 dniach etapu różnicowania KSR/DMSO przejdź do etapu dojrzewania HepatoZYME. Przemyj komórki raz zwykłym podłożem podstawowym HepatoZYME po usunięciu pożywki KSR/DMSO. Dodaj pożywkę do dojrzewania HepatoZYME uzupełnioną o 10 ng/ml HGF i 20 ng/ml OSM.
  7. Pożywkę należy zmieniać co 48 godzin przez 7 - 10 dni, po czym komórki są gotowe do standardowej charakterystyki lub dalszego użycia.
    UWAGA: Badania ekspresji markerów hepatocytów, testy funkcji metabolicznej (takie jak aktywność cytochromu P450), testy wydzielania mocznika i albuminy, testy magazynowania glikogenu i testy wychwytu zieleni indocyjaninowej (ICG) są typowymi metodami charakteryzacji.
    UWAGA: Oś czasu protokołu różnicowania pokazano na rysunku 5. W naszym laboratorium rutynowo sprawdzamy poziomy ekspresji markerów specyficznych dla hepatocytów w pochodnych HLC, wydzielanie albuminy oraz aktywność cytochromu P450 (CYP) 3A i 1A2.

Wyniki

Różnicowanie hepatocytów z hPSC

Do różnicowania w hepatocyty wykorzystano jedną linię ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, H9, oraz jedną linię ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, 33D6. Wyniki przedstawione na Rysunkach 1-3 pochodzą z komórek H9, natomiast wyniki na Rysunku 4 pochodzą z komórek 33D6. Pojedyncze komórki wysiane na lamininy ustanowiły kontakt międzykomórkowy po 24 h. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji na poziomie około 40% zainicjowano proces różnicowania (Rysunek 1A oraz Rysunek 4A). Na lamininach (zarówno LN-521, jak i LN-521/LN-111) komórki te przeszły sekwencyjne zmiany morfologiczne, prowadząc do powstania spolaryzowanych HLC (Rysunek 1 oraz Rysunek 4A).

Charakterystyka komórek przypominających hepatocyty

W 18. dniu zebrano HLC i oceniono ekspresję reprezentatywnych markerów hepatocytów, HNF4A oraz ALB (Ryc. 2A). Barwienie immunocytochemiczne HLC w 18. dniu wykazało, że prawie 90% komórek wykazywało ekspresję HNF4α (Ryc. 2B). Komórki te uległy polaryzacji na lamininach i przybrały wieloboczny wygląd, co potwierdziła ekspresja E-kadheryny i F-aktyny (Ryc. 2B).

Oceniono również aktywność cytochromu P450 (CYP). Cytochromy CYP450 pełnią istotną funkcję metaboliczną w hepatocytach. Aktywność CYP3A badano w 18. dniu hodowli HLC pochodzących z mieszanin białek żelujących, takich jak Matrigel, LN-521 lub LN-521/LN-111. HLC wykazały znacznie wyższą aktywność CYP3A na podłożach z lamininy niż na matrigelu (Rysunek 3). Co istotne, w porównaniu z komercyjnymi ludzkimi pierwotnymi hepatocytami (HU1339) przesianymi na te podłoża, HLC wykazują niemal 10-krotnie wyższy poziom aktywności CYP3A10.

Różnicowanie hiPSC przebiegało podobnie jak w przypadku hESC. Komórki wykazywały sekwencyjne zmiany w wyglądzie (Rysunek 4A). Uzyskane HLC wykazywały ekspresję kluczowego czynnika transkrypcyjnego hepatocytów, HNF4α (Rysunek 4B), posiadały aktywność CYP3A oraz wydzielały albuminę (Rysunek 4C i D). Co istotne, HLC pochodzące z linii 33D6 wykazywały obniżony poziom CYP3A w porównaniu do HLC pochodzących z komórek H9 (Rysunek 3), jednak był on nadal porównywalny z poziomem w ludzkich pierwotnych hepatocytach10. Niemniej jednak sekrecja albuminy przez te HLC była znacznie niższa niż w pierwotnych hepatocytach10.

Obrazy z mikroskopii histologicznej kultur komórkowych A-D w skali 200 µm przedstawiające morfologię komórkową.
Rysunek 1: Sekwencyjne zmiany morfologiczne podczas różnicowania w kierunku wątrobowym. (A) Nieróżnicowane hESC wysiane jako pojedyncze komórki osiągnęły około 40% konfluencji 24 h po wysianiu. (B) Po primingu, w dniu 4., komórki wykazywały typową morfologię endodermalną. (C) Po osiągnięciu stadium przypominającego hepatoblasty, w dniu 9., komórki wykazywały wyraźny kształt wieloboczny. (D) Po etapie dojrzewania, spolaryzowane HLC były gotowe do dalszej charakterystyki, co przedstawiono tutaj dla dnia 18. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza ekspresji genów; wykres słupkowy, obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; porównanie HNF4α i ALB, istotność statystyczna.
Rysunek 2: Charakterystyka HLC. (A) Ekspresja genów markerów swoistych dla hepatocytów, HNF4A (lewo) oraz ALB (prawo). Poziom ekspresji analizowano dla HLC w 18. dniu, pochodzących z hESC hodowanych na LN-521 oraz LN-521/LN-111; wyniki znormalizowano względem genu housekeepingowego GAPDH i wyrażono w stosunku do hESC. Wyniki reprezentują trzy powtórzenia biologiczne, a słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe (SD). * p < 0.05, ** p < 0.01; nieparzysty test t. (B) Ekspresja białkowa kluczowego markera wątrobowego, HNF4α, oraz markerów polaryzacji, E-kadheryny i F-aktyny. HLC w 18. dniu na LN-521 oraz LN-521/LN-111 barwiono na powyższe markery i barwiono kontrastowo Hoechst 33342. Kontrolę negatywną przeprowadzono z użyciem odpowiadającej immunoglobuliny G (IgG). Przedstawiono odsetek komórek dodatnich pod kątem HNF4α oraz SD. Wartość tę obliczono z czterech losowych pól widzenia. Zdjęcia wykonano przy powiększeniu 20X. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy porównujący aktywność enzymu CYP3A; istotność statystyczna *p<0.01* w RLU/ml/mg.
Rycina 3: Charakterystyka funkcji metabolicznej HLC. Przebadano aktywność cytochromu P450 CYP3A w komórkach hodowanych na Matrigelu (MG), LN-521 lub LN-521/LN-111. Dane reprezentują trzy powtórzenia biologiczne, a słupki błędu reprezentują SD. ** p < 0.01; jednoczynnikowa analiza ANOVA z post-hoc testem Tukeya. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia histologiczna kultur komórkowych, wyniki analizy immunofluorescencyjnej, wykresy słupkowe ekspresji genów.
Rysunek 4: Standardowa charakterystyka HLC. hiPSC hodowane na LN-521 zróżnicowano do HLC. Standardowe testy charakterystyki przeprowadzono w 17. dniu różnicowania HLC. (A) Sekwencyjna morfologia komórek podczas różnicowania wątrobianego; przedstawione punkty czasowe odpowiadają komórkom w dniach 1, 4, 9 i 17. (B) Immunobarwienie ekspresji HNF4α. Procent komórek pozytywnych oraz SD przedstawiono na podstawie czterech losowych pól widzenia. Zdjęcia wykonano przy powiększeniu 20X. Pasek skali = 100 µm. (C) Aktywność CYP3A w HLC w 17. dniu. Dane reprezentują sześć powtórzeń biologicznych, a słupek błędu reprezentuje SD. (D) Sekrecja albuminy przez pochodne HLC w ciągu 24 h hodowli. Dane reprezentują cztery powtórzenia biologiczne, a słupek błędu reprezentuje SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat różnicowania hepatocytów, oś czasu dla hESC i hiPSC; etapy od endodermy do hepatocytów.
Rycina 5: Schematyczny harmonogram protokołu różnicowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
 

Dyskusja

Aby posunąć naprzód badania nad ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i medycynę translacyjną, potrzebne są systemy wolne od ksenoterapii, które są zgodne z aktualnymi wytycznymi dobrej praktyki produkcyjnej. Kluczem do każdego procesu różnicowania jest macierz zewnątrzkomórkowa (ECM). ECM nie tylko wspiera przyłączanie komórek, ale także zapewnia dostęp do kluczowych czynników sygnalizacyjnych, wpływających na determinację komórek i fenotyp25,26.

Lamininy są wielofunkcyjnymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej in vivo. W wątrobie wydzielanie lamininy ma kluczowe znaczenie dla regeneracji wątroby po częściowej hepatektomii27 i jest niezbędne do utrzymania komórek progenitorowych wątroby28. Znaczenie laminin w utrzymaniu i regeneracji wątroby było podstawą do przetestowania dostępnych na rynku rekombinowanych ludzkich laminin w naszym układzie różnicowania hepatocytów.

Lepsze różnicowanie hepatocytów uzyskano na substratach LN-521 i LN-521/LN-111 w porównaniu z Matrigelem. Pochodne KLC były wyraźnie spolaryzowane i zorganizowane w naczyniu, a ich funkcja komórkowa uległa znacznej poprawie w porównaniu z ich galaretowatymi odpowiednikami z mieszanki białek. U podstaw tych ulepszeń leżała regulacja w dół zanieczyszczających genów związanych z okrężnicą, fibroblastami i komórkami macierzystymi na lamininach, a także zmniejszenie proliferacji komórek i ekspresji genów związanych z migracją10.

Podsumowując, opisany tutaj protokół generuje komórki podobne do hepatocytów, które są bliższe w naturze hepatocytom dorosłego człowieka. Proces jest powtarzalny, podatny na automatyzację i może być ekonomicznie skalowany do zastosowań. Co ważne, zmienność między partiami została znacznie zmniejszona w porównaniu z technikami wykorzystującymi Matrigel, co zaowocowało lepszym systemem różnicowania dla badaczy w tej dziedzinie.

Oświadczenia

Dr David C. Hay jest współzałożycielem i dyrektorem Stemnovate Limited.

Podziękowania

Ta praca została wsparta nagrodami od Brytyjskiej Platformy Medycyny Regeneracyjnej (MRC MR/L022974/1 i MR/K026666/1) oraz chińskim stypendium.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ludzka rekombinowana Laminina 521BioLaminaLN521-02
Ludzka rekombinowana Laminina 111BioLaminaLN111-02
Rekombinowana mysz Wnt3aR& D Systems1324-WN-500/CF
Ludzka aktywina APeprotech120-14E
Ludzki czynnik wzrostu hepatocytówPeprotech100-39
Ludzka onkostatyna MPeprotech300-10
Inhibitor kinazy związanej z Rho (ROCK) Y27632 Sigma-AldrichY0503-1MG
Hydrokortyzon 21-hemibursztynian sól sodowaSigma-AldrichH4881
DMSOSigma-AldrichD5879
mTeSR1 mediumSTEMCELL Technologies05850
RPMI 1640Life Technologies21875
Nokaut DMEMLife Technologies10829
HepatoZYMELife Technologies17705
Suplement B27Life Technologies12587-010
Zamiennik surowicy do nokautuLife Technologies10828
GlutaMaxLife Technologies35050
Aminokwasy endogenneLife Technologies11140
2-merkaptoetanolLife Technologies31350
AccutaseMilliporeSCR005
DPBS z wapniem i magnezemThermoFisher14040133

Bibliografia

  1. Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62 (1 Suppl), S157-S169 (2015).
  2. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12301-12306 (2008).
  3. Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
  4. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (7), 505-509 (2013).
  5. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).
  6. Zhou, X., et al. Modulating innate immunity improves hepatitis C virus infection and replication in stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
  7. Rashidi, H., Alhaque, S., Szkolnicka, D., Flint, O., Hay, D. C. Fluid shear stress modulation of hepatocyte-like cell function. Arch Toxicol. 90 (7), 1757-1761 (2016).
  8. Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).
  9. Wang, Y., Hay, D. C. Mass production of stem cell derived human hepatocytes for experimental medicine. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 769-771 (2016).
  10. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
  11. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  12. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
  13. Duan, Y., et al. Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).
  14. Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 30, 1-12 (2014).
  15. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  16. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  17. Touboul, T., et al. Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology. 51 (5), 1754-1765 (2010).
  18. Touboul, T., et al. Stage-specific regulation of the WNT/beta-catenin pathway enhances differentiation of hESCs into hepatocytes. J Hepatol. 64 (6), 1315-1326 (2016).
  19. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 38, 1-1 (2016).
  20. Takayama, K., et al. Efficient generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells by HNF4alpha transduction. Mol Ther. 20 (1), 127-137 (2012).
  21. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28 (6), 611-615 (2010).
  22. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195(2014).
  23. Takayama, K., et al. Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes. Stem Cell Reports. 1 (4), 322-335 (2013).
  24. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations. J Vis Exp. (56), e2969(2011).
  25. Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114 (1 Suppl), I193-I199 (2006).
  26. Taylor-Weiner, H., Schwarzbauer, J. E., Engler, A. J. Defined extracellular matrix components are necessary for definitive endoderm induction. Stem Cells. 31 (10), 2084-2094 (2013).
  27. Martinez-Hernandez, A., Delgado, F. M., Amenta, P. S. The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin. Lab Invest. 64 (2), 157-166 (1991).
  28. Lorenzini, S., et al. Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver. Gut. 59 (5), 645-654 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rekombinowana lamininazdefiniowana różnicowanieproces bezsurowiczymacierz zewnątrzkomórkowainkubator do hodowli komórkowychfunkcjonalne hepatocytyskalowalna produkcjapowtarzalność eksperymentalna
Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.