Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Podsumowanie

Przedstawiona tutaj metoda opisuje skalowalny i gotowy do stosowania w dobrej praktyce produkcyjnej (GMP) system różnicowania do generowania ludzkich komórek hepatocytowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Służy jako opłacalny i ustandaryzowany system do generowania ludzkich komórek podobnych do hepatocytów do podstawowych i stosowanych badań nad ludzką wątrobą.

Streszczenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wielką wartość dla badań biomedycznych. hPSC mogą być skalowane i różnicowane do wszystkich typów komórek występujących w ludzkim ciele. Różnicowanie hPSC do ludzkich komórek podobnych do hepatocytów (HLC) zostało szeroko zbadane i ustanowiono skuteczne protokoły różnicowania. Połączenie macierzy zewnątrzkomórkowej i bodźców biologicznych, w tym czynników wzrostu, cytokin i małych cząsteczek, umożliwiło wytworzenie HLC, które przypominają pierwotne ludzkie hepatocyty. Jednak większość procedur nadal wykorzystuje niezdefiniowane komponenty, co powoduje różnice między partiami. Stanowi to istotną barierę w stosowaniu tej technologii. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy zdefiniowany system różnicowania hepatocytów przy użyciu ludzkich rekombinowanych laminin jako matryc zewnątrzkomórkowych w połączeniu z procesem różnicowania bez surowicy. Osiągnięto wysoce efektywną specyfikację hepatocytów, wykazując poprawę zarówno funkcji HLC, jak i fenotypu. Co ważne, system ten można łatwo rozbudować przy użyciu badań i linii hPSC klasy GMP, obiecując postępy w modelowaniu i terapiach komórkowych.

Wprowadzenie

Pierwotna tkanka ludzka i pochodne typy komórek są regularnie używane, zarówno do badań przesiewowych opartych na komórkach, jak i w klinice. Jednak dostęp do tych komórek jest poważnie ograniczony z powodu niewystarczającego dawstwa narządów i utraty fenotypów komórek po izolacji¹. Komórki hPS stanowią obiecującą alternatywę dla tkanek pierwotnych i ułatwiają wytwarzanie genetycznie zdefiniowanych i odnawialnych ludzkich komórek somatycznych. Komórki podobne do hepatocytów (HLC) pochodzące z hPSC już okazały się obiecujące w tej dziedzinie. HLC przypominają pierwotne ludzkie hepatocyty pod różnymi względami, w tym morfologią komórek, ekspresją genów hepatocytów, funkcją metaboliczną oraz wrażliwością na leki i wirusy^2,3,4,5^,6,7,8. Ponadto nieograniczona zdolność do proliferacji i samoodnawiania się hPSC zarówno klasy badawczej, jak i GMP ułatwia ich stosowanie^9,10.

Ponad dekada badań zaowocowała wieloma skutecznymi procedurami różnicowania hepatocytów^2,3,5^{,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20}. Jednak większość z tych systemów wykorzystuje niezdefiniowane komponenty i/lub transdukcję wirusa do sterowania specyfikacją komórek wątrobowych. Aby zwiększyć niezawodność technologii na dużą skalę, ważne jest opracowanie solidnego systemu różnicowania hepatocytów, który jest naprawdę zdefiniowany, wolny od ksenotypów i zgodny z GMP.

Lamininy (LNs) są ważnymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, które mogą wpływać na adhezję, proliferację, migrację i różnicowanie komórek. Lamininy to heterotrimeryczne glikoproteiny składające się z jednego α, jednego β i jednego łańcucha γ. Ostatnio wyprodukowano i zastosowano rekombinowane ludzkie lamininy w biologii komórki. Wykazano, że LN-511 wspiera utrzymanie hPSCs²¹, podczas gdy mieszanina LN-521 i E-kadheryny umożliwia klonalne pochodzenie i ekspansję ludzkich embrionalnych komórek macierzystych²². Z drugiej strony LN-111 wspomaga utrzymanie komórek podobnych do hepatoblastów pochodzących z hPSCs²³. Jednak przed naszym raportem lamininy 521 i 111 nie były wykorzystywane do generowania HLC o dojrzałych cechach z hPSCs¹⁰.

Tutaj szczegółowo opisujemy procedury hodowli hPSC na LN-521 i różnicowania ich na LN-521 lub mieszance LN-521 i LN-111 (LN-521/LN-111). Zoptymalizowaliśmy protokół różnicowania za pomocą rozsiewania pojedynczych komórek, aby wygenerować wysoce powtarzalną i jednorodną monowarstwę HLC w wielu formatach¹⁴. Wierzymy, że nasz zdefiniowany system różnicowania stanowi prostą i opłacalną metodę produkcji aktywnych HLC do zastosowań, stanowiąc znaczący krok naprzód w tej dziedzinie.

Protokół

UWAGA: Informacje o dostawcach wszystkich odczynników używanych w tym protokole zostały wymienione w Tabeli 1. Wszystkie podłoża/płytki powinny być sterylne i mieć co najmniej temperaturę pokojową, gdy komórki mają mieć z nimi bezpośredni kontakt.

1. Przenikanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) na Lamininę 521

UWAGA: Opisana poniżej procedura pasażowania komórek opiera się na pojedynczych komórkach i jest idealna do uzyskania jednorodnej populacji komórek podobnych do hepatocytów z hPSC. Możliwe jest również posiewanie kolonii, które zostało opisane wcześniej²⁴.

1. W razie potrzeby przygotuj talerze pokryte lamininą.
   1. Rozmrozić zapas 100 μg/ml rekombinowanej lamininy 521 (LN-521) w temperaturze 4 °C.
   2. Rozcieńczyć rozmrożony LN-521 w lodowato zimnym 1x DPBS (z Ca^{2 +} / Mg^{2 +}), aby uzyskać roztwór o stężeniu 5 μg / ml.
   3. Dodaj 1 ml 5 μg/ml roztworu LN-521, aby pokryć jedną studzienkę 6-dołkowej płytki i rozdrobnić, aby równomiernie rozprowadzić ją w dołku.
   4. Inkubować płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 2 godziny w przypadku pilnego użycia lub w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc.
   W
   5. razie potrzeby przechowuj talerze pokryte lamininą w lodówce o temperaturze 4 °C. Trzymaj płytki na płaskiej powierzchni i uszczelnij je, aby uniknąć parowania i zanieczyszczenia.
      UWAGA: Nigdy nie pozwól, aby pokryte studzienki wyschły; W razie potrzeby uzupełnij je dodatkowym 1x DPBS (z Ca²⁺/Mg²⁺). Płytki zużyć w ciągu 2 tygodni.
2. Przed użyciem należy pozwolić, aby wymagana liczba wstępnie pokrytych płytek osiągnęła temperaturę pokojową lub inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 0,5 - 1 godzinę.
3. Ostrożnie zassać roztwór powłoki LN-521, nie uszkadzając powlekanej powierzchni. Uwaga: Bardzo ważne jest, aby nie uszkodzić powlekanej powierzchni przed wysianiem na niej komórek.
4. Natychmiast dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki mTeSR1 uzupełnionej 10 μM inhibitorem kinazy związanej z Rho (ROCK) Y27632 do jednego dołka 6-dołkowej płytki. Pozostawić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w celu pobrania komórek.
   UWAGA: Nigdy nie pozwól, aby studzienki pokryte lamininą wyschły.
5. Odessać pożywkę z dobrze utrzymanych hPSC przy zbieganiu około 75% do 85%. Umyj komórki z jednego dołka płytki 6-dołkowej raz 1 ml 1x DPBS o temperaturze pokojowej (bez Ca²⁺ / Mg^{2 +}).
6. Dodać 0,5 ml 1x Accutazy do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 - 8 minut w celu dysocjacji komórek.
   UWAGA: Aby sprawdzić, czy trawienie jest wystarczająco długie, czy nie, delikatnie postukaj w płytkę i sprawdź, czy komórki mogą się łatwo oderwać. Jeśli tak, nadszedł czas, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną; Jeśli nie, przedłuż trawienie o dodatkowe 1 - 2 minuty.
7. Zakończ dysocjację, dodając do komórek 2 ml świeżej pożywki mTeSR1 uzupełnionej 10 μM Y27632. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół za pomocą końcówki P1000, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
8. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru. Użyj błękitu trypanowego do barwienia i wykluczania martwych komórek¹⁴
9. Oblicz całkowitą liczbę potrzebnych komórek. W przypadku rutynowego pasażowania hPSC, wysiewaj 4 x 10⁵ do 5 x 10⁵ komórek na dołek płytki 6-dołkowej (tj. 4,21 x 10⁴ do 5,26 x 10⁴ na cm²). Do pasażowania hPSC w celu różnicowania hepatocytów, nasiona 6,5 x 10⁵ do 7,5 x 10⁵ (tj. 6,84 x 10⁴ do 7,89 x 10⁴ na cm²) komórek na dołek płytki 6-dołkowej.
   UWAGA: Gęstość wysiewu dla każdej linii komórkowej może wymagać niewielkiej optymalizacji w oparciu o podaną tutaj gęstość empiryczną dla różnicowania wątroby.
10. Przenieść potrzebną zawiesinę komórkową do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml lub 50 ml i wirować przy 115 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
11. Powoli odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżym, ciepłym podłożu mTeSR1 uzupełnionym inhibitorem 10 μM kinazy związanej z Rho (ROCK) Y27632, używając odpowiedniej pożywki, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek.
    UWAGA: Stosowanie inhibitora ROCK jest wysoce zalecane w celu zwiększenia przyczepiania komórek i przeżywalności.
12. Zasiej komórki na przygotowanych płytkach i kołysz nimi w przód iw tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzienkach, niezależnie od tego, czy płytka jest przeznaczona do rutynowej hodowli komórek, czy do eksperymentów z różnicowaniem hepatocytów.
13. Umieścić płytki w inkubatorze do komórek i utrzymywać je w temperaturze 37 °C/5% CO₂ przez 24 godziny, aby umożliwić im przyczepienie się i odzyskanie.
14. Zbadaj komórki następnego dnia i odstaw inhibitor ROCK, jeśli kontakt komórka-komórka został nawiązany. Utrzymuj komórki w pożywce mTeSR1 do rutynowej hodowli lub w razie potrzeby zmień na pożywkę różnicującą.
    UWAGA: Jeśli komórki zostały zasiane o wspomnianej gęstości, zbieg powinien być idealny do rutynowej konserwacji lub różnicowania hepatocytów.

2. Różnicowanie hPSC do komórek hepatocytopodobnych na rekombinowanych laminach

1. Przygotować pożywkę różnicującą.
   1. Przygotuj ludzki roztwór podstawowy Activin A: rozpuść ludzką Activinę A w proszku, aby uzyskać 100 μg / ml roztworu podstawowego w sterylnej 0,2% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) / DPBS. Przygotuj małe porcje i przechowuj je w temperaturze -20 °C. Stosować w stosunku 1:1 000.
   2. Przygotuj mysi roztwór podstawowy Wnt 3a: rozpuść mysi proszek Wnt 3a, aby uzyskać roztwór podstawowy 10 μg/ml w sterylnym 0,2% BSA/DPBS. Przygotować małe porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Stosować w temperaturze 1:200.
   3. Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego czynnika wzrostu hepatocytów (HGF): rozpuść ludzki proszek HGF, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 10 μg/ml w sterylnym 0,2% BSA/DPBS. Przygotuj małe porcje i przechowuj je w temperaturze -20 °C. Stosować w stosunku 1:1 000.
   4. Przygotować roztwór podstawowy onkostatyny M (OSM): rozpuścić proszek onkostatyny M (OSM), aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 20 μg/ml w sterylnym 0,2% BSA/DPBS. Przygotuj małe porcje i przechowuj je w temperaturze -20 °C. Stosować w stosunku 1:1 000.
   5. Przygotować 500 ml podłoża podstawowego gruntującego endodermę: 2% suplementu B27 (50x, minus witamina A) i 1% penicyliny/streptomycyny (końcowe stężenia odpowiednio 100 IU/ml i 100 μg/ml); uzupełnić do 500 ml za pomocą pożywki podstawowej Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640). UWAGA: Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu dwóch tygodni. Podwielokrotną pożywkę z podstawowego materiału i dodać świeżą aktywinę A i Wnt 3a (końcowe stężenia odpowiednio 100 ng/ml i 50 ng/ml) przy każdej zmianie pożywki.
   6. Przygotuj 500 ml pożywki różnicującej KSR/DMSO: 80% nokautujący DMEM (KO-DMEM), 20% zastępczy surowicy nokautującej (KSR), 0,5% GlutaMAX, 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 0,1 mM beta-merkaptoetanolu, 1% DMSO i 1% penicyliny/streptomycyny (końcowe stężenia odpowiednio 100 IU/ml i 100 μg/ml). Filtruj pod próżnią. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu dwóch tygodni.
   7. Przygotować 500 ml pożywki do dojrzewania HepatoZYME: 1% GlutaMAX, 10 μM soli sodowej 21-hemibursztynianu hydrokortyzonu (HCC) i 1% penicyliny/streptomycyny (końcowe stężenia odpowiednio przy 100 j.m./ml i 100 μg/ml); uzupełnić do 500 ml za pomocą podłoża podstawowego HepatoZYME. UWAGA: Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu dwóch tygodni. Podwielokrotną pożywkę z podstawowego materiału i dodać świeże HGF i OSM (końcowe stężenia odpowiednio 10 ng/ml i 20 ng/ml) dla każdej zmiany pożywki.
2. Nasiona hPSC do różnicowania hepatocytów na LN-521, jak opisano w sekcji 1. Jeżeli jako podłoże ma być użyty LN-521/LN-111, należy pokryć płytki LN-521 i LN-111 (w stosunku 1:3) przy końcowym stężeniu lamininy 5 μg/ml; reszta traktowania powinna być taka sama, jak w przypadku czystych płyt powlekanych LN-521.
   UWAGA: LN-521/LN-111 nie jest idealny do rutynowej hodowli hPSC; Służy tylko do eksperymentów różnicujących.
3. Sprawdź zbieg komórek 24 godziny po wysiewie. Zainicjuj różnicowanie komórkowe, gdy zbieg komórek osiągnie około 40%. Usuń zużytą pożywkę mTeSR1 i dodaj świeżą pożywkę gruntującą endodermę uzupełnioną 100 ng/ml aktywiny A i 50 ng/ml Wnt 3a. Nazwij ten dzień zróżnicowania 1.
   UWAGA: Zdecydowanie zaleca się rozpoczęcie różnicowania następnego dnia po wysianiu komórek.
W
4. przypadku ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) należy zmieniać pożywkę gruntującą endodermę co 24 godziny przez 3 dni. Jeśli chodzi o ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), przedłuż ten etap o kolejne 2 dni, aby przygotować komórki do ostatecznych komórek podobnych do endodermy, ale użyj pożywki gruntującej endodermę uzupełnionej tylko 100 ng / ml aktywiny A przez te dwa dni¹².
   UWAGA: Aby zapewnić pomyślną specyfikację endodermy, można zbadać ekspresję markerów endodermalnych, takich jak FOXA2 i SOX17. Zgodnie z barwieniem immunofluorescencyjnym, ponad 80% pobranych komórek jest dodatnich dla obu markerów w naszym laboratorium.
5. Przełącz na pożywkę różnicującą KSR/DMSO w 4. dniu (dla hESC)/w 6. dniu (dla hiPSC). Zmieniaj podłoże codziennie przez pierwsze 3 dni, a następnie w piątym dniu tego etapu różnicowania.
   UWAGA: W czwartym dniu tego etapu różnicowania nie jest konieczne karmienie. Użyj niesuplementowanego KO-DMEM, aby umyć komórki raz przed zmianą pożywki, jeśli jest wiele martwych komórek. Aby sprawdzić, czy różnicowanie na tym etapie jest pomyślne, czy nie, można przetestować ekspresję markerów komórek progenitorowych wątroby, takich jak AFP, CK19 i HNF4A. Z naszego doświadczenia wynika, że prawie 90% komórek będzie dodatnich dla tych markerów.
6. Po 5 dniach etapu różnicowania KSR/DMSO przejdź do etapu dojrzewania HepatoZYME. Przemyj komórki raz zwykłym podłożem podstawowym HepatoZYME po usunięciu pożywki KSR/DMSO. Dodaj pożywkę do dojrzewania HepatoZYME uzupełnioną o 10 ng/ml HGF i 20 ng/ml OSM.
7. Pożywkę należy zmieniać co 48 godzin przez 7 - 10 dni, po czym komórki są gotowe do standardowej charakterystyki lub dalszego użycia.
   UWAGA: Badania ekspresji markerów hepatocytów, testy funkcji metabolicznej (takie jak aktywność cytochromu P450), testy wydzielania mocznika i albuminy, testy magazynowania glikogenu i testy wychwytu zieleni indocyjaninowej (ICG) są typowymi metodami charakteryzacji.
   UWAGA: Oś czasu protokołu różnicowania pokazano na rysunku 5. W naszym laboratorium rutynowo sprawdzamy poziomy ekspresji markerów specyficznych dla hepatocytów w pochodnych HLC, wydzielanie albuminy oraz aktywność cytochromu P450 (CYP) 3A i 1A2.

Wyniki

Różnicowanie wątrobowokomórkowe od hPSC

Jedna linia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, H9, i jedna linia ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, 33D6, zostały użyte do różnicowania hepatocytów. Wyniki na rysunkach 1-3 pochodzą z komórek H9, podczas gdy te na rysunku 4 pochodzą z komórek 33D6. Pojedyncze komórki wysiane na lamininy nawiązały kontakt komórka-komórka po 24 godzinach. Po osiągnięciu przez komórki około 40% konfluencji rozpoczął się proces różnicowania (ryc. 1A i ryc. 4A). Na lamininach (zarówno LN-521, jak i LN-521 / LN-111) komórki te przeszły sekwencyjne zmiany morfologiczne i dały początek spolaryzowanym HLC (ryc. 1 i ryc. 4A).

Charakterystyka komórek hepatocytów

Dzień 18 HLC zostały zebrane i ocenione pod kątem ekspresji reprezentatywnych markerów hepatocytów, HNF4A i ALB (Rysunek 2A). Barwienie immunologiczne HLC dnia 18 wykazało, że prawie 90% komórek wyrażało HNF4α (Figura 2B). Komórki te były spolaryzowane na lamininy i wykazywały wielokątny wygląd, oznaczony ekspresją E-kadheryny i F-aktyny (Figura 2B).

Aktywność cytochromu P450 (CYP) również została oceniona. Enzymy CYP450 pełnią ważną funkcję metaboliczną hepatocytów. Dzień 18 HLC uzyskane na galaretowatej mieszaninie białek, takich jak Matrigel, LN-521 lub LN-521/LN-111, badano pod kątem aktywności CYP3A. HLC wykazywały istotnie wyższą aktywność CYP3A na substratach lamininy niż na matriżelu (ryc. 3). Co ważne, w porównaniu z komercyjnymi ludzkimi hepatocytami pierwotnymi (HU1339) ponownie posianymi na tych substratach, HLC mają prawie 10-krotnie wyższy poziom aktywności CYP3A¹⁰.

Zróżnicowanie hiPSC było podobne do zróżnicowania hESC. Komórki wykazywały sekwencyjne zmiany w wyglądzie (ryc. 4A). Uzyskane HLC wyrażały kluczowy czynnik transkrypcyjny hepatocytów, HNF4α (Figura 4B) i posiadały aktywność CYP3A oraz wydzielały albuminę (Figura 4C i D). Warto zauważyć, że HLC pochodzące z 33D6 wykazywały zmniejszony CYP3A w porównaniu z HLC pochodzącymi z komórek H9 (Figura 3), ale nadal były porównywalne z ludzkimi pierwotnymi hepatocytami¹⁰. Jednak wydzielanie albuminy przez te HLC było znacznie niższe niż w pierwotnych hepatocytach¹⁰.

Rycina 1: Sekwencyjne zmiany morfologiczne podczas różnicowania wątroby. (A) Niezróżnicowane hESC wysiane jako pojedyncze komórki osiągnęły około 40% konfluencji 24 godziny po wysiewie. (B) Po przygotowaniu komórki wykazywały typową morfologię endodermy w 4 dniu. (C) Po osiągnięciu stadium podobnego do hepatoblastu, w dniu 9 wykazali wyraźny wielokątny kształt. (D) Po fazie dojrzewania, spolaryzowane HLC były gotowe do dalszej charakterystyki pokazanej tutaj w dniu 18. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Charakterystyka HLC. (A) Ekspresja genów markerów specyficznych dla hepatocytów, HNF4A (po lewej) i ALB (po prawej). Poziom ekspresji analizowano przy użyciu HLC dnia 18 pochodzących z hESC zarówno na LN-521, jak i LN-521/LN-111, i został znormalizowany do genu porządkowego GAPDH i wyrażony w stosunku do hESC. Wyniki reprezentują trzy kontrpróby biologiczne, a słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe (SD). * p < 0,05, ** p < 0,01; Niesparowany test t. (B) Ekspresja białka kluczowego markera wątrobowego, HNF4α, oraz markerów polaryzacji, E-kadheryny i F-aktyny. Dzień 18 HLC na LN-521 i LN-521/LN-111 wybarwiono dla powyższych markerów i wybarwiono przeciwstawnie Hoechst 33342. Przeprowadzono kontrolę ujemną z odpowiednią immunoglobuliną G (IgG). Pokazano procent komórek HNF4α-dodatnich i SD. Zostało to obliczone na podstawie czterech losowych pól widzenia. Zdjęcia zostały wykonane w 20-krotnym powiększeniu. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Charakterystyka funkcji metabolicznych HLC. Badano aktywność cytochromu P450 CYP3A komórek hodowanych na Matrigel (MG), LN-521 lub LN-521/LN-111. Dane reprezentują trzy powtórzenia biologiczne, a słupki błędu reprezentują SD. ** p < 0,01; jednoczynnikowa ANOVA z testem post-hoc Tukeya. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Standardowa charakterystyka HLC. hiPSC hodowane na LN-521 różnicowano w HLC. Standardowe testy charakterystyki przeprowadzono w dniu 17 HLC. (A) Sekwencyjna morfologia komórek podczas różnicowania wątroby; Pokazane punkty czasu reprezentują komórki w dniach 1, 4, 9 i 17. (B) Barwienie immunologiczne ekspresji HNF4α. Procent komórek dodatnich i SD jest pokazany na podstawie czterech losowych pól widzenia. Zdjęcia zostały wykonane w 20-krotnym powiększeniu. Podziałka = 100 μm. (C) Aktywność CYP3A w dniu 17 HLC. Dane reprezentują sześć kontrprób biologicznych, a słupek błędu reprezentuje SD. (D) Wydzielanie albuminy z pochodnych HLC w ciągu 24 godzin w hodowli. Dane reprezentują cztery powtórzenia biologiczne, a słupek błędu reprezentuje SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Schematyczny oś czasu protokołu różnicowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
 

Dyskusja

Aby posunąć naprzód badania nad ludzkimi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i medycynę translacyjną, potrzebne są systemy wolne od ksenoterapii, które są zgodne z aktualnymi wytycznymi dobrej praktyki produkcyjnej. Kluczem do każdego procesu różnicowania jest macierz zewnątrzkomórkowa (ECM). ECM nie tylko wspiera przyłączanie komórek, ale także zapewnia dostęp do kluczowych czynników sygnalizacyjnych, wpływających na determinację komórek i fenotyp^25,26.

Lamininy są wielofunkcyjnymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej in vivo. W wątrobie wydzielanie lamininy ma kluczowe znaczenie dla regeneracji wątroby po częściowej hepatektomii²⁷ i jest niezbędne do utrzymania komórek progenitorowych wątroby²⁸. Znaczenie laminin w utrzymaniu i regeneracji wątroby było podstawą do przetestowania dostępnych na rynku rekombinowanych ludzkich laminin w naszym układzie różnicowania hepatocytów.

Lepsze różnicowanie hepatocytów uzyskano na substratach LN-521 i LN-521/LN-111 w porównaniu z Matrigelem. Pochodne KLC były wyraźnie spolaryzowane i zorganizowane w naczyniu, a ich funkcja komórkowa uległa znacznej poprawie w porównaniu z ich galaretowatymi odpowiednikami z mieszanki białek. U podstaw tych ulepszeń leżała regulacja w dół zanieczyszczających genów związanych z okrężnicą, fibroblastami i komórkami macierzystymi na lamininach, a także zmniejszenie proliferacji komórek i ekspresji genów związanych z migracją¹⁰.

Podsumowując, opisany tutaj protokół generuje komórki podobne do hepatocytów, które są bliższe w naturze hepatocytom dorosłego człowieka. Proces jest powtarzalny, podatny na automatyzację i może być ekonomicznie skalowany do zastosowań. Co ważne, zmienność między partiami została znacznie zmniejszona w porównaniu z technikami wykorzystującymi Matrigel, co zaowocowało lepszym systemem różnicowania dla badaczy w tej dziedzinie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ludzka rekombinowana Laminina 521	BioLamina	LN521-02
Ludzka rekombinowana Laminina 111	BioLamina	LN111-02
Rekombinowana mysz Wnt3a	R& D Systems	1324-WN-500/CF
Ludzka aktywina A	Peprotech	120-14E
Ludzki czynnik wzrostu hepatocytów	Peprotech	100-39
Ludzka onkostatyna M	Peprotech	300-10
Inhibitor kinazy związanej z Rho (ROCK) Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503-1MG
Hydrokortyzon 21-hemibursztynian sól sodowa	Sigma-Aldrich	H4881
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
mTeSR1 medium	STEMCELL Technologies	05850
RPMI 1640	Life Technologies	21875
Nokaut DMEM	Life Technologies	10829
HepatoZYME	Life Technologies	17705
Suplement B27	Life Technologies	12587-010
Zamiennik surowicy do nokautu	Life Technologies	10828
GlutaMax	Life Technologies	35050
Aminokwasy endogenne	Life Technologies	11140
2-merkaptoetanol	Life Technologies	31350
Accutase	Millipore	SCR005
DPBS z wapniem i magnezem	ThermoFisher	14040133