Method Article

Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa

DOI:

10.3791/55358

⸱

April 18th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do użycia metody barwienia Golgiego-Coxa w grubych fragmentach mózgu, w celu wizualizacji neuronów z długimi drzewami dendrytycznymi zawartymi w pojedynczych próbkach tkanek. Przedstawiono również dwa warianty tego protokołu, które obejmują barwienie przeciwstawne fioletem krezylowym i zamrażanie nieprzetworzonych mózgów w celu długotrwałego przechowywania.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda barwienia neuronów metodą Golgiego-Coxa jest stosowana od ponad dwustu lat, aby poszerzyć nasze zrozumienie morfologii neuronów w histologicznych próbkach mózgu. Chociaż z praktycznego punktu widzenia preferowane jest przygotowanie skrawków mózgu o jak największej grubości, w celu zwiększenia prawdopodobieństwa identyfikacji barwionych neuronów, które są w pełni zawarte w pojedynczych sekcjach, podejście to jest ograniczone z technicznego punktu widzenia przez odległość roboczą obiektywów mikroskopowych o dużym powiększeniu. Przedstawiamy tutaj protokół barwienia neuronów za pomocą metody Golgiego-Coxa w sekcjach mózgu myszy, które są cięte na grubość 500 μm, oraz wizualizacji neuronów na całej głębokości tych odcinków za pomocą mikroskopu pionowego wyposażonego w obiektyw zanurzeniowy w oleju silikonowym o wysokiej rozdzielczości 30X 1,05 N.A., który ma odległość roboczą 800 μm. Zgłaszamy również dwa użyteczne warianty tego protokołu, które mogą być wykorzystane do przeciwdziałania barwieniu powierzchni zamontowanych skrawków mózgu barwieniem Nissl w kolorze fioletu krezylo-fioletowego lub do zamrażania całych mózgów w celu długotrwałego przechowywania przed sekcją i ostatecznym przetwarzaniem. Główny protokół i jego dwa warianty wytwarzają barwione grube odcinki mózgu, w których pełne drzewa dendrytyczne neuronów i kolce dendrytowe mogą być wiarygodnie wizualizowane i określane ilościowo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja pojedynczych neuronów w próbkach tkanek pozwala na analizę in situ cech morfologicznych neuronów, co znacznie poszerzyło nasze zrozumienie mózgu i tego, jak mogą na niego wpływać choroby endogenne lub egzogenne czynniki środowiskowe. Metoda barwienia Golgiego-Coxa jest opłacalnym, stosunkowo prostym sposobem barwienia losowej próbki neuronów w mózgu. Po raz pierwszy opracowana przez Golgi1 i zmodyfikowana przez Cox2 w 1800 roku, naukowcy udoskonalili tę technikę na przestrzeni lat, aby uzyskać wyraźne, dobrze wybarwione neurony, które można wykorzystać do wizualizacji i ilościowego określenia zarówn....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu wykorzystano dorosłe samice myszy szczepu CD1. Podobne barwienie można osiągnąć przy użyciu obu płci w różnym wieku. Zwierzęta doświadczalne były opiekowane zgodnie z zasadami i wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami, a protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Guelph.

1. Barwienie metodą Golgiego-Coxa

  1. Impregnacja mózgu metodą Golgiego-Coxa
    1. Przygotować roztwór Golgiego-Coxa składający się z 1% (m/v) dichromianu potasu, 0,8% (w/v) chromianu potasu i 1% (w/v) chlorku rtęci, rozpuszczając oddzielnie dichromian potasu i c....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół barwienia Golgiego-Coxa i jego dwa opisane opcjonalne warianty mogą być wykorzystane do wizualizacji pojedynczych neuronów w obrębie 400 - 500 μm grubości mózgu. Reprezentatywne montaże obrazów dwuwymiarowych projekcji Z uchwyconych przy użyciu obiektywu 10X i co 5 μm w osi Z pokazano na rysunku 1: A1 - C1 dla dużego obszaru koronalnych odcinków mózgu, który obejmuje obszar przedniej kory obręczy 1 i wtórną korę ruchową18. Odcinki zost.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj protokół barwienia Golgiego-Coxa wraz z dwoma przydatnymi wariantami do wizualizacji neuronów w grubych sekcjach mózgu. Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, zastosowanie obiektywu o wysokiej rozdzielczości, który ma dużą odległość roboczą 800 μm, pozwala na wiarygodną wizualizację całych neuronów na całej głębokości odcinków mózgu wyciętych na 500 μm. To badanie stosunkowo grubych skrawków mózgu zwiększa prawdopodobieństwo, że barwione neurony dowolnego typu są w pełni zawarte w wycinku, co jest szc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Grant Discovery dla CDCB od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), grant na infrastrukturę badawczą John R. Evans Leaders Fund dla CDCB od Canada Foundation for Innovation (numer projektu CFI 30381) oraz przez Discovery Grant dla NJM od NSERC. ELL był wspierany przez stypendium dla absolwentów Ontario oraz stypendium OVC z Ontario Veterinary College na Uniwersytecie Guelph. CDS był wspierany przez asystenturę naukową dla studentów studiów licencjackich z NSERC. ALM był wspierany przez stypendium Alexandra Grahama Bella z NSERC oraz stypendium OVC z Ontario Veterinary College na Uniwersytecie Guelph.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
dwuchromian potasuFisher ScientificP188-100Niebezpieczny
chromian potasuFisher ScientificP220-100Niebezpieczny
chlorek rtęciFisher ScientificS25423Niebezpieczna
bibuła filtracyjna Whatman klasy 1Fisher Scientific1001-185
izofluranPharmaceutical Partners of Canada
Fiolka scyntylacyjna 20 mlFisher Scientific03-337-4
sacharozaBioshop KanadaSUC700.1
jednozasadowy fosforan soduSigma AldrichS5011-500G
fosforan sodu dwuzasadowySigma AldrichS9390-500G
50 ml rurka stożkowaFisher Scientific12-565-271
izopentanFisher ScientificAC126470010Znany również jako 2-metylobutan; niebezpieczny
agarSigma AldrichA1296-100G
mała waga naczynieFisher Scientific02-202-100
wibratomLeicaVT1000 S
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychFisher Scientific08-772-1b
Wkładki do hodowli tkankowych z siatkowym dnemFisher Scientific07-200-214
paraformadelhyd (PFA), 16%Mikroskop elektronowy Sciences15710-SNiebezpieczny
wodorotlenek amonuFisher ScientificA669S-500Niebezpieczny
Kodak Fixative ASigma AldrichP7542
superfrost plus prowadniceFisher Scientific12-550-15
Środek czyszczący CitroSolvFisher Scientific22-143-975
bezwodny alkohol etylowyAlkohole handloweNie dotyczy
fioletu krezylowegoSigma AldrichC1791
permountFisher ScientificSP15-100
model
Olympus BX53kamera kolorowa, 12-bitowaMBF BiosciencesDV-47dQImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
Mikroskop 3D zmotoryzowany stolik, kontroler i enkoderMBF BiosciencesN/ADostarczony i zintegrowany z mikroskopem przez MBF Biosciences
Obiektyw mikroskopowy 4XOlympus4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X Obiektyw mikroskopowyOlympus10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
Obiektyw mikroskopowy 30xOlympus30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
Obiektyw mikroskopowy 60XOlympus60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silikonowy olejek immersyjnyOlympusZ-81114
Oprogramowanie NeurolucidaMBF BiosciencesWersja 10
Oprogramowanie ImageJU.S. National Institutes of HealthAktualna wersjaZ zainstalowaną wtyczką OME Bio-Formats
OprogramowaniePhotoshopAdobew wersji CS6
CP0406V2 Mikroskop pionowy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
  2. Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
  3. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Golgi Cox MethodNeuron StainingThick Brain SectionsSilicone Oil ImmersionCresyl Violet StainBrain SectioningVibratome SectioningImage Stack AcquisitionDendritic Tree VisualizationSpine Density Analysis

Related Articles