Przedstawiamy protokół do użycia metody barwienia Golgiego-Coxa w grubych fragmentach mózgu, w celu wizualizacji neuronów z długimi drzewami dendrytycznymi zawartymi w pojedynczych próbkach tkanek. Przedstawiono również dwa warianty tego protokołu, które obejmują barwienie przeciwstawne fioletem krezylowym i zamrażanie nieprzetworzonych mózgów w celu długotrwałego przechowywania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metoda barwienia neuronów metodą Golgiego-Coxa jest stosowana od ponad dwustu lat, aby poszerzyć nasze zrozumienie morfologii neuronów w histologicznych próbkach mózgu. Chociaż z praktycznego punktu widzenia preferowane jest przygotowanie skrawków mózgu o jak największej grubości, w celu zwiększenia prawdopodobieństwa identyfikacji barwionych neuronów, które są w pełni zawarte w pojedynczych sekcjach, podejście to jest ograniczone z technicznego punktu widzenia przez odległość roboczą obiektywów mikroskopowych o dużym powiększeniu. Przedstawiamy tutaj protokół barwienia neuronów za pomocą metody Golgiego-Coxa w sekcjach mózgu myszy, które są cięte na grubość 500 μm, oraz wizualizacji neuronów na całej głębokości tych odcinków za pomocą mikroskopu pionowego wyposażonego w obiektyw zanurzeniowy w oleju silikonowym o wysokiej rozdzielczości 30X 1,05 N.A., który ma odległość roboczą 800 μm. Zgłaszamy również dwa użyteczne warianty tego protokołu, które mogą być wykorzystane do przeciwdziałania barwieniu powierzchni zamontowanych skrawków mózgu barwieniem Nissl w kolorze fioletu krezylo-fioletowego lub do zamrażania całych mózgów w celu długotrwałego przechowywania przed sekcją i ostatecznym przetwarzaniem. Główny protokół i jego dwa warianty wytwarzają barwione grube odcinki mózgu, w których pełne drzewa dendrytyczne neuronów i kolce dendrytowe mogą być wiarygodnie wizualizowane i określane ilościowo.
Wprowadzenie
Wizualizacja pojedynczych neuronów w próbkach tkanek pozwala na analizę in situ cech morfologicznych neuronów, co znacznie poszerzyło nasze zrozumienie mózgu i tego, jak mogą na niego wpływać choroby endogenne lub egzogenne czynniki środowiskowe. Metoda barwienia Golgiego-Coxa jest opłacalnym, stosunkowo prostym sposobem barwienia losowej próbki neuronów w mózgu. Po raz pierwszy opracowana przez Golgi1 i zmodyfikowana przez Cox2 w 1800 roku, naukowcy udoskonalili tę technikę na przestrzeni lat, aby uzyskać wyraźne, dobrze wybarwione neurony, które można wykorzystać do wizualizacji i ilościowego określenia zarówn....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
W tym badaniu wykorzystano dorosłe samice myszy szczepu CD1. Podobne barwienie można osiągnąć przy użyciu obu płci w różnym wieku. Zwierzęta doświadczalne były opiekowane zgodnie z zasadami i wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami, a protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Guelph.
1. Barwienie metodą Golgiego-Coxa
- Impregnacja mózgu metodą Golgiego-Coxa
- Przygotować roztwór Golgiego-Coxa składający się z 1% (m/v) dichromianu potasu, 0,8% (w/v) chromianu potasu i 1% (w/v) chlorku rtęci, rozpuszczając oddzielnie dichromian potasu i c....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół barwienia metodą Golgiego-Coxa oraz jego dwa opisane warianty opcjonalne mogą być stosowane do wizualizacji pojedynczych neuronów w przekrojach mózgu o grubości 400 - 500 μm. Reprezentatywne montaże obrazów z dwuwymiarowych projekcji Z, wykonane przy użyciu obiektywu 10X i kroków 5 μm w osi Z, przedstawiono na Rysunku 1: A1 - C1 dla dużego obszaru koronalnych przekrojów mózgu, obejmującego obszar 1 przedniej kory zakrętu obręczy oraz wtórną ko.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisujemy tutaj protokół barwienia Golgiego-Coxa wraz z dwoma przydatnymi wariantami do wizualizacji neuronów w grubych sekcjach mózgu. Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, zastosowanie obiektywu o wysokiej rozdzielczości, który ma dużą odległość roboczą 800 μm, pozwala na wiarygodną wizualizację całych neuronów na całej głębokości odcinków mózgu wyciętych na 500 μm. To badanie stosunkowo grubych skrawków mózgu zwiększa prawdopodobieństwo, że barwione neurony dowolnego typu są w pełni zawarte w wycinku, co jest szc.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Grant Discovery dla CDCB od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), grant na infrastrukturę badawczą John R. Evans Leaders Fund dla CDCB od Canada Foundation for Innovation (numer projektu CFI 30381) oraz przez Discovery Grant dla NJM od NSERC. ELL był wspierany przez stypendium dla absolwentów Ontario oraz stypendium OVC z Ontario Veterinary College na Uniwersytecie Guelph. CDS był wspierany przez asystenturę naukową dla studentów studiów licencjackich z NSERC. ALM był wspierany przez stypendium Alexandra Grahama Bella z NSERC oraz stypendium OVC z Ontario Veterinary College na Uniwersytecie Guelph.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| dwuchromian potasu | Fisher Scientific | P188-100 | Niebezpieczny |
| chromian potasu | Fisher Scientific | P220-100 | Niebezpieczny |
| chlorek rtęci | Fisher Scientific | S25423 | Niebezpieczna |
| bibuła filtracyjna Whatman klasy 1 | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| izofluran | Pharmaceutical Partners of Canada | ||
| Fiolka scyntylacyjna 20 ml | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sacharoza | Bioshop Kanada | SUC700.1 | |
| jednozasadowy fosforan sodu | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| fosforan sodu dwuzasadowy | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 ml rurka stożkowa | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| izopentan | Fisher Scientific | AC126470010 | Znany również jako 2-metylobutan; niebezpieczny |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| mała waga naczynie | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| wibratom | Leica | VT1000 S | |
| 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| Wkładki do hodowli tkankowych z siatkowym dnem | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyd (PFA), 16% | Mikroskop elektronowy Sciences | 15710-S | Niebezpieczny |
| wodorotlenek amonu | Fisher Scientific | A669S-500 | Niebezpieczny |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus prowadnice | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Środek czyszczący CitroSolv | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| bezwodny alkohol etylowy | Alkohole handlowe | Nie dotyczy | |
| fioletu krezylowego | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| model | |||
| Olympus BX53kamera kolorowa, 12-bitowa | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| Mikroskop 3D zmotoryzowany stolik, kontroler i enkoder | MBF Biosciences | N/A | Dostarczony i zintegrowany z mikroskopem przez MBF Biosciences |
| Obiektyw mikroskopowy 4X | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10X Obiektyw mikroskopowy | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| Obiektyw mikroskopowy 30x | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| Obiektyw mikroskopowy 60X | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silikonowy olejek immersyjny | Olympus | Z-81114 | |
| Oprogramowanie Neurolucida | MBF Biosciences | Wersja 10 | |
| Oprogramowanie ImageJ | U.S. National Institutes of Health | Aktualna wersja | Z zainstalowaną wtyczką OME Bio-Formats |
| Oprogramowanie | PhotoshopAdobe | w wersji CS6 |
Bibliografia
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
