Artykuł metodologiczny

Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa

DOI:

10.3791/55358

⸱

18 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do użycia metody barwienia Golgiego-Coxa w grubych fragmentach mózgu, w celu wizualizacji neuronów z długimi drzewami dendrytycznymi zawartymi w pojedynczych próbkach tkanek. Przedstawiono również dwa warianty tego protokołu, które obejmują barwienie przeciwstawne fioletem krezylowym i zamrażanie nieprzetworzonych mózgów w celu długotrwałego przechowywania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda barwienia neuronów metodą Golgiego-Coxa jest stosowana od ponad dwustu lat, aby poszerzyć nasze zrozumienie morfologii neuronów w histologicznych próbkach mózgu. Chociaż z praktycznego punktu widzenia preferowane jest przygotowanie skrawków mózgu o jak największej grubości, w celu zwiększenia prawdopodobieństwa identyfikacji barwionych neuronów, które są w pełni zawarte w pojedynczych sekcjach, podejście to jest ograniczone z technicznego punktu widzenia przez odległość roboczą obiektywów mikroskopowych o dużym powiększeniu. Przedstawiamy tutaj protokół barwienia neuronów za pomocą metody Golgiego-Coxa w sekcjach mózgu myszy, które są cięte na grubość 500 μm, oraz wizualizacji neuronów na całej głębokości tych odcinków za pomocą mikroskopu pionowego wyposażonego w obiektyw zanurzeniowy w oleju silikonowym o wysokiej rozdzielczości 30X 1,05 N.A., który ma odległość roboczą 800 μm. Zgłaszamy również dwa użyteczne warianty tego protokołu, które mogą być wykorzystane do przeciwdziałania barwieniu powierzchni zamontowanych skrawków mózgu barwieniem Nissl w kolorze fioletu krezylo-fioletowego lub do zamrażania całych mózgów w celu długotrwałego przechowywania przed sekcją i ostatecznym przetwarzaniem. Główny protokół i jego dwa warianty wytwarzają barwione grube odcinki mózgu, w których pełne drzewa dendrytyczne neuronów i kolce dendrytowe mogą być wiarygodnie wizualizowane i określane ilościowo.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja pojedynczych neuronów w próbkach tkanek pozwala na analizę in situ cech morfologicznych neuronów, co znacznie poszerzyło nasze zrozumienie mózgu i tego, jak mogą na niego wpływać choroby endogenne lub egzogenne czynniki środowiskowe. Metoda barwienia Golgiego-Coxa jest opłacalnym, stosunkowo prostym sposobem barwienia losowej próbki neuronów w mózgu. Po raz pierwszy opracowana przez Golgi1 i zmodyfikowana przez Cox2 w 1800 roku, naukowcy udoskonalili tę technikę na przestrzeni lat, aby uzyskać wyraźne, dobrze wybarwione neurony, które można wykorzystać do wizualizacji i ilościowego określenia zarówno morfologii drzew dendrytycznych, jak i gęstości kręgosłupa3,4,5,6,7,8,9.

Głównym technicznym czynnikiem dla wizualizacji zabarwionych neuronów w sekcjach mózgu jest maksymalna grubość warstwy, która jest ograniczona przez odległość roboczą dostępnych obiektywów mikroskopowych o dużym powiększeniu/wysokiej rozdzielczości. Typowe obiektywy olejowe w zakresie 60 - 100X zapewniają doskonałą rozdzielczość, ale są ograniczone przez odległości robocze, które zwykle nie są większe niż 200 μm. Wycinki mózgu wycięte w zakresie 200 μm mogą być wystarczające do wizualizacji pewnych typów neuronów, które mogą być zawarte w tym wycinku, na przykład neurony piramidowe w płytkich warstwach kory mózgowej10,11,12, neurony piramidowe w regionie CA1 hipokampa13,14 oraz komórki ziarniste w zakręcie zębatym hipokampa15. Neurony ze stosunkowo dłuższymi drzewami dendrytycznymi, takimi jak neurony piramidalne w głębokich warstwach kory mózgowej, które dla myszy mogą rozciągać się na więcej niż 800 μm od ciała komórki16, stanowią większe wyzwanie, ponieważ mózgi musiałyby być podzielone pod idealnym kątem, aby pomieścić całe drzewo dendrytowe w warstwach 200 μm. Może to nie być nawet wykonalne, jeśli dendryt lub którakolwiek z jego gałęzi rozciąga się w kierunku rostralnym lub ogonowym. Chociaż możliwe jest rozwiązanie tego ograniczenia poprzez śledzenie neuronu w wielu sąsiednich sekcjach mózgu, takie podejście wprowadza poważne wyzwanie techniczne w dokładnym dopasowaniu sekcji do śledzenia17. Bardziej praktycznym podejściem byłaby wizualizacja całych neuronów zawartych w sekcjach mózgu, które są cięte na większą grubość.

Przedstawiamy tutaj technikę barwienia neuronów w obrębie 400 - 500 μm grubych odcinków mózgu myszy za pomocą metody Golgiego-Coxa oraz wizualizacji ich morfologii za pomocą obiektywu o wysokiej rozdzielczości z olejem silikonowym, który ma odległość roboczą 800 μm. Protokół impregnacji i przetwarzania Golgiego-Coxa, który opisujemy, jest zmodyfikowany w stosunku do jednego z najczęściej cytowanych współczesnych protokołów w literaturze6. Nasze podejście z grubymi sekcjami mózgu ma tę zaletę, że zwiększa prawdopodobieństwo zidentyfikowania neuronów dowolnego typu, które są w pełni zawarte w sekcji. Oprócz głównego protokołu przedstawiamy również dwie odmiany, które zapewniają wyjątkowe korzyści: (1) barwienie Golgiego-Coxa za pomocą fioletu krezylowego na powierzchni zamontowanych sekcji, w celu określenia granic regionów mózgu i identyfikacji warstw kory mózgowej, oraz (2) barwienie Golgiego-Coxa z pośrednim etapem zamrażania w celu długotrwałego przechowywania zaimpregnowanych całych mózgów przed sekcją i ostatecznym przetwarzaniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu wykorzystano dorosłe samice myszy szczepu CD1. Podobne barwienie można osiągnąć przy użyciu obu płci w różnym wieku. Zwierzęta doświadczalne były opiekowane zgodnie z zasadami i wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami, a protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Guelph.

1. Barwienie metodą Golgiego-Coxa

  1. Impregnacja mózgu metodą Golgiego-Coxa
    1. Przygotować roztwór Golgiego-Coxa składający się z 1% (m/v) dichromianu potasu, 0,8% (w/v) chromianu potasu i 1% (w/v) chlorku rtęci, rozpuszczając oddzielnie dichromian potasu i chromian potasu w wodzie wysokiej jakości. Wymieszaj roztwory, dodaj chlorek rtęci i przefiltruj końcowy roztwór za pomocą bibuły filtracyjnej klasy 1. Roztwór należy przechowywać w ciemności przez okres do jednego miesiąca.
    2. Znieczulij mysz za pomocą 5% izofluranu.
    3. Poddaj mysz eutanazji przez ścięcie głowy i szybko usuń mózg.
    4. Umieścić mózg w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml zawierającej 17 ml roztworu Golgiego-Coxa i inkubować w ciemności w temperaturze RT przez 25 dni.
    5. Krioprotektoratuj mózg, umieszczając go w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml krioprotektantu sacharozy (30% (w/v) sacharozy w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,4) w ciemności w temperaturze 4 °C przez 24 godziny
      UWAGA: Następujące opcjonalne trzy kroki mogą być zastosowane jako alternatywa dla głównego protokołu, w celu zamrożenia mózgu na tym etapie w celu długotrwałego przechowywania.
    6. Zamroź cały mózg, zanurzając go w 200 ml izopentanu, który został wstępnie schłodzony na suchym lodzie.
    7. Umieścić zamrożony mózg w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i przechowywać w ciemności w temperaturze -80 °C.
    8. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, rozmrozić mózg, umieszczając go w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej 40 ml krioprotektantu sacharozy w ciemności w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
  2. Sekcja mózgu
    1. Usuń mózg z sacharozy i zablokuj go do podziału, odcinając móżdżek za pomocą żyletki i pozostawiając płaską krawędź na pozostałym ogonowym końcu mózgu.
    2. Podgrzej agar (3% (w/v) w wodzie), aż się rozpuści i pozostaw do ostygnięcia, aż osiągnie nieco wyższą temperaturę topnienia.
    3. Umieść mózg w małym jednorazowym naczyniu wagowym końcem ogonowym skierowanym do dołu i dodaj wystarczającą ilość stopionego agaru, aby przykryć mózg.
    4. Gdy agar zastygnie, odetnij nadmiar agaru, pozostawiając około 2 - 4 mm otaczając mózg i przyklej mózg do etapu wibratomu końcem ogonowym skierowanym w dół za pomocą niewielkiej ilości kleju cyjanoakrylowego etylu.
    5. Wypełnij obszar wibratomu wystarczającą ilością krioprotektantu sacharozy, aby pokryć mózg, i podziel mózg na plasterki o grubości 400 - 500 μm (w zależności od badanego obszaru mózgu) przy użyciu częstotliwości drgań 86 Hz i prędkości posuwu ostrza 0,125 mm/s.
    6. Za pomocą małego pędzla umieść skrawki mózgu w studzience 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej dostępne w handlu wkładki z siatkowym dnem i wstępnie napełnionej 10 ml 6% (w/v) sacharozy w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4.
    7. Inkubować sekcje w ciemności w temperaturze 4 °C O/N.
  3. Rozwijanie sekcji mózgu
    1. Za pomocą wkładek z siatkowym dnem przenieś skrawki mózgu do nowego dołka zawierającego 5 ml 2% (w/v) paraformaldehydu (PBD) w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4. Wysiaduj na kołysaku poruszającym się z małą prędkością w ciemności przy RT przez 15 minut.
    2. Umyj skrawki dwukrotnie, przenosząc je do nowych studzienek zawierających 5 ml wody. Prać na bujaczku poruszającym się z umiarkowaną prędkością w ciemności przy natężeniu ruchu przez 5 minut.
    3. Przenieść skrawki do nowej studzienki zawierającej 5 ml 2,7% (v/v) wodorotlenku amonu. Wysiaduj na kołysaku poruszającym się z małą prędkością w ciemności przy RT przez 15 minut.
    4. Umyj skrawki dwukrotnie, przenosząc je do nowych studzienek zawierających 5 ml wody. Prać na bujaczku poruszającym się z umiarkowaną prędkością w ciemności przy natężeniu ruchu przez 5 minut.
    5. Przenieś skrawki do nowej studzienki zawierającej 5 ml utrwalacza A (patrz tabela materiałów), który został rozcieńczony w wodzie 10 razy w stosunku do pierwotnie zakupionego stężenia. Wysiaduj na kołysce poruszającej się z małą prędkością w ciemności przy natężeniu kierunkowym przez 25 minut.
    6. Umyj skrawki dwukrotnie, przenosząc je do nowych studzienek zawierających 5 ml wody. Prać na bujaczku poruszającym się z umiarkowaną prędkością w ciemności przy natężeniu ruchu przez 5 minut.
  4. Montaż sekcji mózgu
    1. Za pomocą małego pędzla zamontuj sekcje na szkiełkach mikroskopowych. Usuń nadmiar wody i agaru za pomocą pęsety i małej chusteczki. Upewnij się, że cały agar został usunięty przed przystąpieniem do odwadniania.
    2. Pozostaw sekcje do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez około 45 minut (sekcje 400 μm) lub 90 minut (sekcje 500 μm).
      UWAGA: Czas i właściwy poziom wysuszenia ma kluczowe znaczenie i może być konieczne określenie w każdym laboratorium w zależności od temperatury otoczenia i poziomu wilgotności. Zbyt krótki czas schnięcia prowadzi do odpadania odcinków od szkiełek podczas kolejnych etapów odwadniania, a zbyt długi czas schnięcia prowadzi do pękania sekcji. Sekcje nadal będą wydawać się błyszczące przy odpowiednim poziomie wysuszenia.
    3. Skrawki zabarwić fioletem krezylowym, umieszczając szkiełka w słoikach do barwienia z kopliny, jak wskazano.
      UWAGA: Ten opcjonalny krok może być zastosowany w przypadku odcinków, które nigdy nie były zamrażane, w celu barwienia jąder neuronalnych fioletem krezylowym. Odkryliśmy, że oczyszczanie i ponowne nawadnianie sekcji przed inkubacją w fiołku krezylowym prowadzi do równomiernego zabarwienia i niskiego tła we wszystkich sekcjach.
      1. Umieścić w środku czyszczącym na 5 minut. Powtórzyć raz.
      2. Umieść w 100% etanolu na 5 minut. Powtórz raz.
      3. Umieścić 95% etanolu w wodzie, następnie 75% etanolu w wodzie, a następnie 50% etanolu w wodzie na 2 minuty każde.
      4. Umieść w wodzie na 5 minut.
      5. Umieścić 0,5% (m/v) fioletu krezylowego w wodzie na 7 min.
      6. Umieść w wodzie na 2 minuty. Powtórz raz.
    4. Odwodnić sekcje, umieszczając szkiełka w słoikach do barwienia Coplin zgodnie ze wskazaniami.
      1. Umieść 50% etanolu w wodzie, następnie 75% etanolu w wodzie, a następnie 95% etanolu w wodzie na 2 minuty każde.
      2. Umieść w 100% etanolu na 5 minut. Powtórz raz.
      3. Umieścić w klarowniku na 5 minut. Powtórzyć raz.
        UWAGA: Te czasy odwodnienia i oczyszczania są wystarczające do przetworzenia mózgów myszy zgodnie z opisem w tym manuskrypcie. Jednak zaobserwowaliśmy w przypadku innych gatunków, w tym szczurów i krów, że ostatni etap oczyszczania może wymagać wydłużenia do 15 minut.
    5. Odcinki szkiełek nakrywkowych za pomocą bezwodnego podłoża montażowego.
    6. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia poziomo w ciemności w temperaturze RT przez co najmniej 5 dni.

2. Obrazowanie barwionych neuronów w grubych sekcjach mózgu

  1. Przechwytywanie stosów obrazów
    1. Włącz żarówkę mikroskopu, kamerę i kontroler sceny.
    2. Otwórz oprogramowanie mikroskopu (np. Neurolucida).
    3. Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu.
    4. Uchwyć szerokokątny obraz 2D sekcji mózgu za pomocą obiektywu o małym powiększeniu, takiego jak 1,25X 0,4 N.A. PlanAPO lub 4X 0,16 N.A.
      1. Ustaw ostrość obrazu i dostosuj ustawienia aparatu, w tym czas ekspozycji i balans bieli.
      2. Utwórz punkt odniesienia, klikając lewym przyciskiem myszy w dowolnym miejscu sekcji
      3. Przechwyć obraz, wybierając opcję "uzyskaj pojedynczy obraz" w oknie akwizycji obrazu.
    5. Uchwyć stosy obrazów o średniej rozdzielczości obszaru zawierającego interesujące neurony za pomocą obiektywu 10X 0,3 N.A. UPlan FL N.
      1. Ustaw ostrość obrazu i dostosuj ustawienia aparatu, w tym ekspozycję i balans bieli.
      2. Ustaw górną i dolną granicę stosu obrazów, skupiając się na górze sekcji i wybierając "ustaw" obok "góry stosu" w oknie akwizycji obrazu, a następnie skupiając się na dole sekcji i wybierając "ustaw" obok "na dole stosu" w oknie akwizycji obrazu.
      3. Ustaw odległość kroku na 5 μm, wpisując "5 μm" obok "odległość między obrazami" w oknie akwizycji obrazu.
      4. Przechwyć stos obrazów, wybierając opcję "uzyskaj stos obrazów" w oknie akwizycji obrazu.
      5. Powtórz powyższe kroki, aby uchwycić cały obszar zainteresowania, upewniając się, że wszystkie stosy obrazów nakładają się na siebie o co najmniej 10% w osiach X i Y.
    6. Uchwyć stosy obrazów o wysokiej rozdzielczości obszaru zawierającego neuron będący przedmiotem zainteresowania, używając obiektywu 30X 1,05 N.A. z olejem silikonowym.
      1. Nałóż 3-4 krople silikonowego olejku immersyjnego na szkiełko i umieść obiektyw nad szkiełkiem, upewniając się, że obiektyw ma kontakt z olejkiem.
      2. Ustaw ostrość obrazu i dostosuj ustawienia aparatu, w tym ekspozycję i balans bieli.
      3. Ustaw górną i dolną granicę stosu obrazów, skupiając się na górze sekcji i wybierając "ustaw" obok "góry stosu" w oknie akwizycji obrazu, a następnie skupiając się na dole sekcji i wybierając "ustaw" obok "na dole stosu" w oknie akwizycji obrazu.
      4. Ustaw odległość kroku na 1 μm, wpisując "1 μm" obok "odległość między obrazami" w oknie akwizycji obrazu.
      5. Przechwyć stos obrazów, wybierając opcję "uzyskaj stos obrazów" w oknie akwizycji obrazu.
      6. Powtórz powyższe kroki, aby uchwycić cały obszar zainteresowania, upewniając się, że wszystkie stosy obrazów nakładają się na siebie o co najmniej 10% w osiach X i Y.
    7. Zapisz plik danych i zapisz wszystkie pliki obrazów w formacie TIFF do przetwarzania zewnętrznego.
  2. Tworzenie obrazów i montaży obrazów z projekcją Z
    1. Tworzenie obrazów z projekcją Z w ImageJ
      1. Otwórz oprogramowanie ImageJ z zainstalowaną wtyczką Bio-Formats.
      2. Wybierz "Wtyczki" -> "Bio-formaty" -> "Importer bio-formatów".
      3. Wybierz plik stosu obrazów, który chcesz otworzyć.
      4. Po otwarciu pliku zmień format na RGB, wybierając "Obraz" -> "Typ" -> "Kolor RGB".
      5. Utwórz projekcję Z, wybierając "Obraz" -> "Stosy" -> "Projekt Z...".
      6. Zapisywanie dwuwymiarowego obrazu w projekcji Z jako pliku TIFF.
    2. Stwórz dwuwymiarowy montaż obrazu całego obszaru zainteresowania.
      1. Otwórz oprogramowanie (np. Adobe Photoshop).
      2. Wybierz "Plik" -> "Automatyzuj" -> "Photomerge".
      3. Wybierz "Przeglądaj", a następnie dodaj wszystkie pliki obrazów do scalenia.
      4. Upewnij się, że wybrano opcję "Łącz obrazy razem", a następnie wybierz "OK".
      5. Zapisz wynikowy obraz montażowy całego obszaru zainteresowania jako plik TIFF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół barwienia Golgiego-Coxa i jego dwa opisane opcjonalne warianty mogą być wykorzystane do wizualizacji pojedynczych neuronów w obrębie 400 - 500 μm grubości mózgu. Reprezentatywne montaże obrazów dwuwymiarowych projekcji Z uchwyconych przy użyciu obiektywu 10X i co 5 μm w osi Z pokazano na rysunku 1: A1 - C1 dla dużego obszaru koronalnych odcinków mózgu, który obejmuje obszar przedniej kory obręczy 1 i wtórną korę ruchową18. Odcinki zost...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj protokół barwienia Golgiego-Coxa wraz z dwoma przydatnymi wariantami do wizualizacji neuronów w grubych sekcjach mózgu. Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, zastosowanie obiektywu o wysokiej rozdzielczości, który ma dużą odległość roboczą 800 μm, pozwala na wiarygodną wizualizację całych neuronów na całej głębokości odcinków mózgu wyciętych na 500 μm. To badanie stosunkowo grubych skrawków mózgu zwiększa prawdopodobieństwo, że barwione neurony dowolnego typu są w pełni zawarte w wycinku, co jest szc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Grant Discovery dla CDCB od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), grant na infrastrukturę badawczą John R. Evans Leaders Fund dla CDCB od Canada Foundation for Innovation (numer projektu CFI 30381) oraz przez Discovery Grant dla NJM od NSERC. ELL był wspierany przez stypendium dla absolwentów Ontario oraz stypendium OVC z Ontario Veterinary College na Uniwersytecie Guelph. CDS był wspierany przez asystenturę naukową dla studentów studiów licencjackich z NSERC. ALM był wspierany przez stypendium Alexandra Grahama Bella z NSERC oraz stypendium OVC z Ontario Veterinary College na Uniwersytecie Guelph.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
dwuchromian potasuFisher ScientificP188-100Niebezpieczny
chromian potasuFisher ScientificP220-100Niebezpieczny
chlorek rtęciFisher ScientificS25423Niebezpieczna
bibuła filtracyjna Whatman klasy 1Fisher Scientific1001-185
izofluranPharmaceutical Partners of Canada
Fiolka scyntylacyjna 20 mlFisher Scientific03-337-4
sacharozaBioshop KanadaSUC700.1
jednozasadowy fosforan soduSigma AldrichS5011-500G
fosforan sodu dwuzasadowySigma AldrichS9390-500G
50 ml rurka stożkowaFisher Scientific12-565-271
izopentanFisher ScientificAC126470010Znany również jako 2-metylobutan; niebezpieczny
agarSigma AldrichA1296-100G
mała waga naczynieFisher Scientific02-202-100
wibratomLeicaVT1000 S
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychFisher Scientific08-772-1b
Wkładki do hodowli tkankowych z siatkowym dnemFisher Scientific07-200-214
paraformadelhyd (PFA), 16%Mikroskop elektronowy Sciences15710-SNiebezpieczny
wodorotlenek amonuFisher ScientificA669S-500Niebezpieczny
Kodak Fixative ASigma AldrichP7542
superfrost plus prowadniceFisher Scientific12-550-15
Środek czyszczący CitroSolvFisher Scientific22-143-975
bezwodny alkohol etylowyAlkohole handloweNie dotyczy
fioletu krezylowegoSigma AldrichC1791
permountFisher ScientificSP15-100
model
Olympus BX53kamera kolorowa, 12-bitowaMBF BiosciencesDV-47dQImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
Mikroskop 3D zmotoryzowany stolik, kontroler i enkoderMBF BiosciencesN/ADostarczony i zintegrowany z mikroskopem przez MBF Biosciences
Obiektyw mikroskopowy 4XOlympus4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X Obiektyw mikroskopowyOlympus10x 0.3 N.A. UPlan FL N 
Obiektyw mikroskopowy 30xOlympus30x 1.05 N.A. UPlanSApo 
Obiektyw mikroskopowy 60XOlympus60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silikonowy olejek immersyjnyOlympusZ-81114
Oprogramowanie NeurolucidaMBF BiosciencesWersja 10
Oprogramowanie ImageJU.S. National Institutes of HealthAktualna wersjaZ zainstalowaną wtyczką OME Bio-Formats
OprogramowaniePhotoshopAdobew wersji CS6
CP0406V2 Mikroskop pionowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
  2. Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
  3. Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38(2016).
  4. Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
  5. Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157(2010).
  6. Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
  7. Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
  8. Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
  9. Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
  10. Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
  11. Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
  12. Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
  13. Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
  14. Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
  15. Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
  16. Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
  17. Lytton, W. W. From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , Springer. (2002).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic. (2001).
  19. Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
  20. Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
  21. Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Golgi Cox MethodNeuron StainingThick Brain SectionsSilicone Oil ImmersionCresyl Violet StainBrain SectioningVibratome SectioningImage Stack AcquisitionDendritic Tree VisualizationSpine Density Analysis

Powiązane artykuły