Artykuł metodologiczny

Organotypowe kultury warstwowe hipokampa jako model do badania neuroprotekcji i inwazyjności komórek nowotworowych

12.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55359

⸱

27 sierpnia 2017

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Martin Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Anatomy, University of Otago

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Organotypowe kultury plastrów hipokampa (OHSC) reprezentują model in vitro, który bardzo dobrze symuluje sytuację in vivo. W tym miejscu opisujemy ulepszony protokół krojenia oparty na wibratomie w celu uzyskania wysokiej jakości plastrów do wykorzystania w ocenie potencjału neuroprotekcyjnego nowych substancji lub biologicznego zachowania komórek nowotworowych.

Streszczenie

W organtypowych kulturach warstwowych hipokampa (OHSC), morfologiczne i funkcjonalne cechy zarówno neuronów, jak i komórek glejowych są dobrze zachowane. Model ten nadaje się do rozwiązywania różnych pytań badawczych, które obejmują badania nad neuroprotekcją, eksperymentami elektrofizjologicznymi na neuronach, sieciach neuronalnych lub inwazji guza. Architektura hipokampa i aktywność neuronalna w obwodach wielosynaptycznych są dobrze zachowane w OHSC, mimo że sama procedura krojenia początkowo powoduje uszkodzenia i prowadzi do powstania blizny glejowej. Powstawanie blizn prawdopodobnie zmienia właściwości mechaniczne i dyfuzyjne zachowanie małych cząsteczek itp. Plastry umożliwiają monitorowanie procesów zależnych od czasu po urazie mózgu bez konieczności przeprowadzania operacji na zwierzętach oraz badania interakcji między różnymi typami komórek pochodzących z mózgu, a mianowicie astrocytami, mikroglejem i neuronami zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Ambiwalentnym aspektem tego modelu jest brak przepływu krwi i komórek odpornościowych. Podczas progresji uszkodzenia neuronów ważną rolę odgrywają migrujące komórki odpornościowe z krwi. Ponieważ brakuje tych komórek w plasterkach, wewnętrzne procesy w kulturze można obserwować bez ingerencji zewnętrznej. Ponadto w OHSC skład środowiska zewnętrznego jest precyzyjnie kontrolowany. Kolejną zaletą tej metody jest mniejsza liczba uśmiercanych zwierząt w porównaniu ze standardowymi preparatami. Od jednego zwierzęcia można uzyskać kilka OHSC, co umożliwia jednoczesne badania z wieloma terapiami na jednym zwierzęciu. Z tych powodów OHSC doskonale nadaje się do analizy efektów nowych terapii ochronnych po uszkodzeniu tkanek lub podczas inwazji guza.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę przygotowania OHSC, która pozwala na generowanie wysoce powtarzalnych, dobrze zachowanych wycinków, które mogą być wykorzystane do różnych badań eksperymentalnych, takich jak badania nad neuroprotekcją lub inwazją nowotworów.

Wprowadzenie

OHSC to dobrze scharakteryzowany model in vitro do badania zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych właściwości neuronów, astrocytów i mikrogleju1. Łatwo jest kontrolować środowisko zewnątrzkomórkowe i monitorować zmiany komórkowe i morfologiczne po różnych bodźcach. Organizacja neuronów hipokampa i ich połączeń jest dobrze zachowana po przygotowaniu2,3. Spośród kilku zalet, OHSC umożliwia monitorowanie uszkodzenia mózgu i inwazji guza bez chirurgii na zwierzętach. Sześć do ośmiu OHSC można uzyskać z jednego mózgu gryzonia. W związku z tym OHSC przyczynia się do znacznego zmniejszenia liczby zwierząt i umożliwia testowanie wielu stężeń leków, manipulacji genetycznych lub różnych modeli zmian u tego samego zwierzęcia. W testach opartych na warstwach warunki eksperymentalne mogą być precyzyjnie kontrolowane. Dodatkowo, zależny od czasu rozwój stanów patologicznych, takich jak uszkodzenia wtórne, można łatwo monitorować za pomocą obrazowania poklatkowego.

W podanym protokole, pierwotnie ustalonym przez Stoppini et al.4, opisano etapy przygotowania i podkreślono ważne punkty orientacyjne dla wyboru odpowiednich przekrojów. Zalecamy przygotowanie szczurów w 7-9 dniu po urodzeniu lub 4-5 myszy w dniu poporodowym. W tych okresach OHSC wykazują dużą odporność na urazy mechaniczne i wysoki potencjał reorganizacji obwodów neuronalnych. Natomiast preparaty z zarodków lub dorosłych szczurów szybko zmieniają swoją strukturę i tracą swoją organotypową morfologię podczas hodowli, a zatem są mniej odpowiednie do badania długoterminowych procesów w badaniach podstawowych5,6,7,8,9,10,11. Innym krytycznym punktem dla wskaźnika przeżywalności OHSC jest grubość samego wycinka, ponieważ dyfuzja, a tym samym dopływ składników odżywczych są ograniczone12,13,14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Polityką Etyki i Polityką Wykorzystania Zwierząt w Badaniach Neurologicznych, zatwierdzonymi przez Dyrektywę Rady Wspólnot Europejskich 2010/63/UE Parlamentu Europejskiego i Rady Unii Europejskiej w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.

1. Przygotowanie instrumentów i pożywek hodowlanych

  1. Do przygotowania OHSC należy użyć następującego zestawu narzędzi: dwóch małych nożyczek, dwóch zakrzywionych pęset, jednej pęsety z cienką końcówką, trzech ostrzy (dwa o rozmiarze 11, jedno o rozmiarze 15), trzy uchwyty na skalpele, okrągłe bibuły filtracyjne (średnica: 35 mm), agar, jedna żyletka, jedna niemodyfikowana pipeta Pasteura i jedna zmodyfikowana pipeta Pasteura bez końcówki. Wysterylizuj wszystkie materiały w autoklawie przed użyciem (Rysunek 1).
  2. Odważyć 5 g agaru i rozpuścić go w 100 ml wody destylowanej. Sterylizować roztwór przez 20 minut w temperaturze 121,7 °C i 210,8 kPa w autoklawie. Rozprowadzić 3 ml płynnego roztworu agaru na 60-milimetrowych szalkach Petriego za pomocą sterylnej szklanej pipety, pozostawić do zestalenia przez 5 godzin, przykryć folią parafinową z tworzywa sztucznego, aby uniknąć zanieczyszczenia i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia. Bloki agaru są potrzebne do ustabilizowania mózgów podczas procedury krojenia.
  3. media
    1. Przygotować 200 ml pożywki (pH 7,35) składającej się ze 198 ml minimalnej pożywki egzogennej (MEM) i 2 ml roztworu L-glutaminy (stężenie końcowe 2 mM). Przygotować roztwór w dniu przygotowania pożywki i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj 100 ml pożywki hodowlanej składającej się z 49 ml MEM, 25 ml zrównoważonych roztworów soli Hanksa (HBSS), 25 ml (v/v) normalnej surowicy końskiej (NHS), 1 ml roztworu L-glutaminy (końcowe stężenie 2 mM), 100 μg insuliny, 120 mg glukozy, 10 mg streptomycyny, 10 000 U penicyliny i 800 μg witaminy C, jak opisano wcześniej. Ogrzać pożywkę (37 °C), dostosować wartość pH do pH 7,4 i sterylnie przefiltrować (wielkość porów 0,2 μm). Powtarzaj procedurę (rozgrzewka, regulacja pH itp.) co drugi dzień przed zmianą podłoża. Pożywkę należy stosować maksymalnie przez tydzień, jeśli jest przechowywana w temperaturze 4 °C.
  4. Napełnij jedną 35-milimetrową szalkę Petriego pożywką do przechowywania mózgu. Umieść dwie puste szalki Petriego do zebrania tkanki na opakowaniu chłodzącym w obszarze roboczym.

2. Przygotowanie i krojenie za pomocą wibratomu

  1. Użyj mózgów 7-9 dniowych szczurów lub 4-5 dniowych myszy do przygotowania OHSC zgodnie z Stoppini i wsp. 4 Po ścięciu głowy zwierząt, usuń skórę z czaszki nożyczkami.
  2. Wprowadź ostrze cienkich nożyczek do otworu wielkiego i otwórz czaszkę, przecinając wzdłuż osi ogonowej (tylnej) rostralnej (przedniej). Wykonaj dwa cięcia prostopadłe do pierwszego, tak aby nożyczki były skierowane odpowiednio w stronę lewego i prawego ucha ("nacięcie w kształcie litery T").
  3. Ostrożnie otwórz czaszkę cienkimi kleszczami, uważając, aby nie uszkodzić mózgu. Użyj skalpela (rozmiar ostrza 11), aby przeciąć najbardziej rostralną część bieguna czołowego i móżdżku.
  4. Za pomocą szpatułki wyjmij mózg i ostrożnie umieść go na szalce Petriego wypełnionej pożywką do przygotowywania (Ryc. 2). Umieść mózg na uchwycie próbki i przymocuj go za pomocą medycznego kleju cyjanoakrylowego. Użyj kawałków agaru, aby zapewnić stabilizację mechaniczną.
  5. Wyciąć tkankę poziomo w OHSC o grubości 350 μm za pomocą wibratomu ślizgowego.
  6. Oceń plastry optycznie za pomocą mikroskopu dwuokularowego. Natychmiast wyrzuć OHSC o niskiej jakości. Ważne jest, aby pobierać tylko te wycinki z nienaruszoną cytoarchitekturą wyizolowane ze środkowej części hipokampa (patrz ryc. 3 i 4) między hipokampem grzbietowym a brzusznym.
  7. Oddziel obszar hipokampa i korę śródwęchową za pomocą skalpela (okrągłe ostrze o rozmiarze 15; Rysunek 3). Szlak perforacyjny i kora śródwęchowa muszą być zachowane.
  8. Z każdego mózgu uzyskuje się od sześciu do ośmiu OHSC. Przenieść 2-3 plastry do jednej wkładki do hodowli komórkowej (wielkość porów 0,4 μm) i umieścić ją w jednym dołku 6-dołkowego naczynia hodowlanego zawierającego 1 ml pożywki hodowlanej na studzienkę.
  9. Inkubować 6-dołkowe szalki w temperaturze 35 °C w całkowicie nawilżonej atmosferze z 5% (v/v) CO2 i zmieniać pożywkę do hodowli komórkowych co drugi dzień.
    UWAGA: Eksperymenty należy przeprowadzać w 6-dniowym okresie in vitro (div). Reakcje zapalne związane z procedurą krojenia ustępują do 6 dnia. Na tym etapie komórki mikrogleju ponownie wykazują rozgałęzioną morfologię, a połączenia synaptyczne dojrzały.

3. Ocena jakości tkanek

  1. Fiksacja, etykietowanie i wizualizacja degenerujących się neuronów w OHSC
    1. Po przeprowadzeniu eksperymentów inkubować OHSC z 5 μg/ml jodku propydyny (PI) przez 2 godziny przed utrwaleniem, w celu wybarwienia jąder degenerujących się neuronów.
      UWAGA: PI jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy, zawsze należy nosić środki ochrony osobistej (PPE), takie jak rękawice.
    2. Przemyć OHSC 0,1 M buforem fosforanowym (pH 7,4) i utrwalić je 4% (v/v) roztworem paraformaldehydu (PFA) przez 24 godziny
      UWAGA: PFA jest substancją toksyczną i podejrzewaną o działanie rakotwórcze. Pracuj pod wyciągiem i noś środki ochrony osobistej.
    3. Umyj OHSC we wkładkach za pomocą 1 ml PBS i użyj szczotki rigger, aby oddzielić plastry od membrany.
    4. Oznacz OHSC barwnikiem IB4 w 24-dołkowej płytce (Rysunek 5).
  2. Przeprowadzanie eksperymentów inwazji nowotworów przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych pojedynczych komórek
    1. Na 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu oznaczyć komórki nowotworowe za pomocą barwnika fluorescencyjnego Karboksyfluoresceiny dioctan sukcynimidylu estru (CFDA SE).
    2. Odłącz i policz komórki nowotworowe za pomocą komory Neubauera.
    3. Ponownie zawiesić komórki w pożywce, tak aby 10 μl zawiesiny zawierało pożądaną liczbę komórek (zwykle 50 000 lub 100 000 komórek).
    4. Nałożyć 10 μl zawiesiny komórkowej na kulturę plastrową i pozostawić komórkom na inwazję przez 3 dni.
    5. Pod koniec eksperymentu utrwal kultury warstwowe za pomocą 4% (v/v) PFA przez 24 godziny i oznacz kokultury za pomocą PI przez kolejne 24 godziny, aby uwidocznić cytoarchitekturę.
      UWAGA: PFA jest substancją toksyczną i podejrzewaną o działanie rakotwórcze. Pracuj pod wyciągiem i noś środki ochrony osobistej.
    6. Zamontuj kokultury na szkiełku nakrywkowym w celu dalszej analizy przy użyciu podłoża montażowego.

4. Ocena eksperymentów OHSC

Analizuj OHSC za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (CLSM). Do wykrywania neuronów znakowanych PI, degeneracji lub cytoarchitektury znakowanej PI stosuje się światło monochromatyczne o długości fali λ = 543 nm i filtr pasma emisyjnego dla długości fal λ = 585-615 nm. W przypadku komórek nowotworowych znakowanych CFDA lub mikrogleju IB4 należy użyć długości fali wzbudzenia λ = 488 nm. W przypadku obu typów eksperymentalnych należy nagrać stos z warstwami optycznymi o grubości 2 μm i użyć go do oceny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Badania neuroprotekcyjne: W celu określenia uszkodzeń neuronalnych policzono liczbę jąder dodatnich pod względem PI oraz mikrogleju dodatniego pod względem IB4 w każdym trzecim przekroju optycznym warstwy ziarnistej (GCL) zakrętu zębatego (DG). W eksperymentach dotyczących inwazji guza do obliczenia powierzchni zajmowanej przez komórki nowotworowe, jako miary inwazji oraz do wizualizacji różnych wzorców inwazji, wykorzystano projekcję maksymalnej intensywności ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie OHSC. Model ten pozwala na badanie wewnętrznych możliwości i reakcji tkanki mózgowej po zastosowaniu bodźców fizjologicznych i patologicznych. Oprócz analiz parametrów elektrofizjologicznych, OHSC może być zmieniany chorobowo i można określić wpływ uszkodzenia na wszystkie typy komórek. Możliwe jest leczenie różnymi substancjami i szczegółowy opis procesów zmiany chorobowej lub gojenia przy braku makrofagów i limfocytów.

Najważniejszymi etapami udanego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Christine Auste za jej wsparcie przy nagrywaniu wideo oraz Chalidowi Ghadbanowi za doskonałą pomoc techniczną. Urszulę Grabiec wspierał Roux Programm FKZ 29/18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-dołkowyFalcon35-3046
AgarFluka5040
AutoklawSystecDX-45
CFDA  Thermo FisherV12883
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM) LSM700Carl Zeiss
Eagle´ s Minimalny niezbędny nośnik Invitrogen32360-034
Fluoresceina znakowana Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin IVector LabsFL-1101
GlukozaMerk1083371000
GlutaminaInvitrogen25030-024
Hank´ s Zrównoważony roztwór soli (z Ca2+ i Mg2+)Invitrogen24020-133
Hank´ s Zbilansowany roztwór soli (bez Ca2+  i Mg2+)Invitrogen14170-138
Insulina Sigma AldrichI5500
Kwas L-askorbinowySigmaAldrich A5960
L-GlutaminaInvitrogen25030-024
LN229Linie komórkowe-Service300363
Medyczny klej cyjanoakrylowy (klej Histoacryl)B.Braun1050052
Wkładki do hodowli milikomórkowychMilliporePICMORG50
NMDA Kwas N-metylo-D-asparaginowySigma AldrichM3262
Normal Horse SeumInvitrogen26050-088
Penicylina StreptomycynaInvitrogen15140-122
Szalki Petriego (wszystkie rozmiary)Greiner627160/664160/628160
PFARoth0335.1toksyczny
jod Propidium (PI)Sigma Aldrich81845-25MGtoksyczny
U138ATCCHTB-14
WibratomeLeicaLeica VT 1200

Bibliografia

  1. Gähwiler, B. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20 (10), 471-477 (1997).
  2. Bahr, B. A. Long-Term Hippocampal Slices: A Model System for Investigating Synaptic Mechanisms and Pathologic Processes. J Neurosci Res. 42 (3), 294-305 (1995).
  3. Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protoc. 2013 (12), 1142-1148 (2013).
  4. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  5. Kleinberger-Doron, N., Schramm, M. Culture of mature hippocampus slices for 4 days in a newly developed medium: preservation of transmitter release and leucine incorporation into protein. Brain Res. 533 (2), 239-247 (1990).
  6. Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Res Bull. 84 (1), 39-44 (2011).
  7. Gähwiler, B. H. Organotypic Monolayer Cultures of Nervous Tissue. J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).
  8. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends Neurosci. 11 (11), 484-489 (1988).
  9. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Methods. 130 (1), 19-32 (2003).
  10. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocamal slice culture from the adult mouse brain: A versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  11. Xiang, Z., Hrabetova, S., et al. Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro. J Neurosci Methods. 98, 145-154 (2000).
  12. Adamchik, Y., Frantseva, M. V., Weisspapir, M., Carlen, P. L., Perez Velazquez, J. L. Methods to induce primary and secondary traumatic damage in organotypic hippocampal slice cultures. Brain rRes Brain Res Protoc. 5, 153-158 (2000).
  13. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Curr Neuropharmacol. 5 (1), 19-33 (2007).
  14. Noraberg, J., Poulsen, F. R., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 4 (4), 435-452 (2005).
  15. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. a Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550 (Pt 1), 135-147 (2003).
  16. Poindrom, P., Piguet, P., Förster, E. New Methods for Culturing Cells from Nervous Tissues. , BioValley Karger. Basel, Switzerland. (2005).
  17. Berger, T., Frotscher, M. Distribution and morphological characteristics of oligodendrocytes in the rat hippocampus in situ and in vitro: An immunocytochemical study with the monoclonal Rip antibody. J Neurocytol. 23 (1), 61-74 (1994).
  18. Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
  19. Bonde, C., Sarup, A., Schousboe, A., Gegelashvili, G., Zimmer, J., Noraberg, J. Neurotoxic and neuroprotective effects of the glutamate transporter inhibitor DL-threo-beta-benzyloxyaspartate (DL-TBOA) during physiological and ischemia-like conditions. Neurochem Int. 43 (4-5), 371-380 (2003).
  20. Derouiche, A., Heimrich, B., Frotscher, M. Loss of layer-specific astrocytic glutamine synthetase immunoreactivity in slice cultures of hippocampus. Eur J Neurosci. 5 (2), 122-127 (1993).
  21. Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18 (4), 319-331 (1996).
  22. Hailer, N. P., Wirjatijasa, F., Roser, N., Hischebeth, G. T. R., Korf, H. W., Dehghani, F. Astrocytic factors protect neuronal integrity and reduce microglial activation in an in vitro model of N-methyl-D-aspartate-induced excitotoxic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Eur J Neurosci. 14 (2), 315-326 (2001).
  23. Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
  24. Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: A model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochem Res. 30 (12), 1521-1528 (2005).
  25. Guy, Y., Rupert, A. E., Sandberg, M., Weber, S. G. A simple method for measuring organotypic tissue slice culture thickness. J Neurosci Methods. 199 (1), 78-81 (2011).
  26. Grabiec, U., Koch, M., et al. The endocannabinoid N-arachidonoyldopamine (NADA) exerts neuroprotective effects after excitotoxic neuronal damage via cannabinoid receptor 1 (CB 1). Neuropharmacology. 64 (4), 1797-1807 (2012).
  27. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Exp Neurol. 248, 429-440 (2013).
  28. Ebrahimi, F., Hezel, M., Koch, M., Ghadban, C., Korf, H. W., Dehghani, F. Analyses of neuronal damage in excitotoxically lesioned organotypic hippocampal slice cultures. Ann Anat. 192 (4), 199-204 (2010).
  29. He, S., Shao, L. R., Wang, Y., Bausch, S. B. Synaptic and extrasynaptic plasticity in glutamatergic circuits involving dentate granule cells following chronic N-methyl-D-aspartate receptor inhibition. J Neurophysiol. 109 (6), 1535-1547 (2013).
  30. Kann, O., Taubenberger, N., et al. Muscarinic receptor activation determines the effects of store-operated Ca2+-entry on excitability and energy metabolism in pyramidal neurons. Cell Calcium. 51 (1), 40-50 (2012).
  31. Pérez-Gómez, A., Tasker, R. A. Enhanced neurogenesis in organotypic cultures of rat hippocampus after transient subfield-selective excitotoxic insult induced by domoic acid. Neuroscience. 208, 97-108 (2012).
  32. Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gähwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosc. 26 (2), 241-250 (2004).
  33. Pozzo Miller, L. D., Mahanty, N. K., Connor, J. A., Landist, D. M. D. Pyramidal Cell Death in Slice Cultures From Rat Hippocampus Is Prevented By Glutamate Receptor Antagonists. Neuroscience. 63 (2), (1994).
  34. Koch, M., Kreutz, S., et al. The cannabinoid WIN 55,212-2-mediated protection of dentate gyrus granule cells is driven by CB 1 receptors and modulated by TRPA1 and Ca v2.2 channels. Hippocampus. 21 (5), 554-564 (2011).
  35. Pukrop, T., Dehghani, F., et al. Microglia promote colonization of brain tissue by breast cancer cells in a Wnt-dependent way. Glia. 58 (12), 1477-1489 (2010).
  36. Kohl, A., Dehghani, F., Korf, H. W., Hailer, N. P. The bisphosphonate clodronate depletes microglial cells in excitotoxically injured organotypic hippocampal slice cultures. Exp Neurol. 181 (1), 1-11 (2003).
  37. Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model. Biochem Biophys Res Commun. 269 (2), 513-520 (2000).
  38. Aaberg-Jessen, C., Nørregaard, A., Christensen, K., Pedersen, C. B., Andersen, C., Kristensen, B. W. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures. Int J Clin Exp Pathol. 6 (4), 546-560 (2013).
  39. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686(2015).
  40. Hagemann, C., Fuchs, S., et al. Impact of MACC1 on human malignant glioma progression and patients ' unfavorable prognosis. Neuro Oncol. 15 (12), 1696-1709 (2013).
  41. Hohmann, T., Grabiec, U., Ghadban, C., Feese, K., Dehghani, F. The Influence of Biomechanical Properties and Cannabinoids on Tumor Invasion. Cell Adh Migr. 11 (1), 54-67 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Badania nad neuroprotekcjmodel inwazji nowotworowejprocedura ci cia wibratomemkonfokalna mikroskopia laserowamikroglej pozytywny pod k tem izolektyny B4j dra pozytywne pod k tem jodku propidynyprzygotowanie wk adki do hodowli kom rkowejinwazja kom rek glejaka wielopostaciowegozachowanie architektury hipokampa

Powiązane artykuły