Artykuł metodologiczny

Rekombinowane α-β- i γ-synukleiny stymulują aktywność podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A w testach bezkomórkowych

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55361

⸱

13 sierpnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Center of Emphasis in Neurosciences, Graduate School of Biomedical Sciences, Paul L. Foster School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Ta publikacja przedstawia protokół pokazujący, jak mierzyć aktywność rekombinowanej podjednostki katalitycznej fosfatazy białkowej 2A (PP2Ac) w odpowiedzi na rekombinowane białka α-synukleiny, β-synukleiny lub γ-synukleiny za pomocą prostego testu kolorymetrycznego. Pokazujemy wyniki dotyczące swoistości α-synukleiny wobec PP2Ac w mózgu myszy.

Streszczenie

α-synukleina (aSyn), β-synukleina (bSyn) i γ-synukleina (gSyn) są członkami konserwatywnej rodziny białek opiekuńczo-podobnych, które są wysoce eksprymowane w tkankach neuronalnych kręgowców. Spośród trzech synuklein tylko aSyn jest silnie związany z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Parkinsona, demencja z ciałami Lewy'ego i zanik wieloukładowy. Badając normalną funkcję aSyn, dane wskazują, że aSyn stymuluje aktywność podjednostki katalitycznej enzymu defosforylującego o obfitej ekspresji, PP2Ac in vitro i in vivo. Wcześniejsze dane pokazują, że agregacja aSyn w ludzkim mózgu zmniejsza aktywność PP2Ac w regionach z patologią ciał Lewy'ego, w których rozpuszczalny aSyn stał się nierozpuszczalny. Ponieważ jednak wszystkie trzy synukleiny mają znaczną homologię w sekwencjach aminokwasów, eksperymenty zaprojektowano w celu sprawdzenia, czy wszystkie mogą modulować aktywność PP2Ac. Stosując rekombinowane synukleiny i rekombinowane białko PP2Ac, aktywność oceniano za pomocą testu kolorymetrycznego zieleni malachitowej. Dane ujawniły, że wszystkie trzy rekombinowane synukleiny stymulowały aktywność PP2Ac w testach bezkomórkowych, zwiększając prawdopodobieństwo, że zachowana homologia między synukleinami może obdarzyć wszystkie trzy homologi zdolnością wiązania się i aktywacji PP2Ac. Dane dotyczące koimmunoprecypitacji sugerują jednak, że modulacja PP2Ac prawdopodobnie zachodzi poprzez endogenne interakcje między aSyn i PP2Ac in vivo.

Wprowadzenie

Badania definiujące rozkład synuklein w mózgu i rdzeniu kręgowym pokazują, że wszystkie trzy synukleiny są wzbogacone w tkankach nerwowych, chociaż odnotowano różne wzorce lokalizacji1. Na przykład aSyn występuje najliczniej w miejscach presynaptycznych w korze mózgowej i zwojach podstawy2,3, bSyn ma bardziej równomierny rozkład w mózgu i rdzeniu kręgowym4,5, a gSyn jest bardziej obfity w rdzeniu kręgowym i zwojach obwodowych6. Chociaż może wystąpić pewna embrionalna ekspresja wszystkich synuklein, trzy homologi stają się bardziej obfite w okresie noworodkowym4,5,6,7,8. Co ciekawe, dane z myszy z potrójnym nokautem synukleiny wskazują, że utrata wszystkich trzech synuklein powoduje dysfunkcję neuronów w wieku 9, wspierając ważne funkcje synukleiny w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)10,11. Nie wiadomo jeszcze, czy myszy z potrójnym nokautem synukleiny wykazują zmiany w dystrybucji lub aktywności PP2Ac. Dane z pojedynczych myszy z nokautem synukleiny ujawniają, że utrata samego aSyn jest w stanie znacznie zmniejszyć aktywność PP2Ac w brain12. Oprócz OUN wszystkie synukleiny lokalizują się w innych tkankach w całym ciele13,14,15.

Ze względu na swoje dobrze znane genetyczne powiązania z neurodegeneracją16,17, aSyn jest jednym z najlepiej zbadanych z trzech synuklein. Laboratorium Perez od dawna pracuje nad zdefiniowaniem normalnych czynności funkcjonalnych aSyn, szczególnie w klasie CNS11,12,18,19,20,21,22,23, a ostatnio w tkankach obwodowych24, 25. Wśród nich było odkrycie, że aSyn odgrywa kluczową rolę regulacyjną w stymulowaniu aktywności PP2Ac19. Aktywność PP2A w znacznym stopniu przyczynia się do prawidłowego funkcjonowania mózgu, w tym do regulacji produkcji dopaminy26. Holoenzym PP2A składa się z trzech niezależnych podjednostek, katalitycznej podjednostki C, PP2Ac, podjednostki rusztowania A i jednej z kilku różnych podjednostek regulatorowych / ukierunkowanych B, które pomagają zlokalizować PP2A w określonych mikrodomenach subkomórkowych, zapewniając w ten sposób funkcjonalną różnorodność PP2A27. Dowody wskazują, że interakcje aSyn z PP2Ac znacząco przyczyniają się do jego aktywności fosfatazy in vitro i in vivo12,19,21,23,25. Kiedy aSyn gromadzi się w agregatach białkowych, tak jak ma to miejsce, gdy ciała Lewy'ego tworzą się w neuronach choroby Parkinsona i demencji z ciałami Lewy'ego (DLB), tkanki z zagregowanym aSyn mają zmniejszoną aktywność PP2Ac23,25, gdy poziomy rozpuszczalnego aSyn maleją. Biorąc pod uwagę, że wszystkie trzy synukleiny mają znaczącą homologię28 (aSyn dzieli 66% tożsamości z bSyn i 56% z gSyn) i że aSyn przyczynia się do aktywacji PP2Ac, postawiono hipotezę, że wszyscy członkowie rodziny białek synukleiny mogą być w stanie zwiększyć aktywność PP2Ac, przynajmniej in vitro. Aby to ocenić, aktywność PP2Ac mierzono w odpowiedzi na rekombinowany aSyn, bSyn i gSyn za pomocą prostego testu kolorymetrycznego, wzorowanego na metodzie Fathi i wsp.29. Ta metoda i nowe odkrycia są szczegółowo opisane w tym artykule.

Protokół

1. Przygotowanie i odczynników

  1. Przygotowanie buforu fosforanu p-nitrofenylu (pNPP)
    1. Przygotować 50 ml buforu pNPP w następujący sposób.
    2. Odważyć 0,30285 g zasady Tris (patrz tabela materiałów) i rozpuścić w 25 ml ultraczystej wody dejonizowanej.
      1. Dodać 41,6 μl ze 120 mM CaCl2. Dostosuj do pH 7,0 za pomocą 1 M HCl i doprowadź końcową objętość roztworu do 50 ml za pomocą ultraczystej wody dejonizowanej.
      2. Upewnij się, że końcowe stężenie wynosi 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7,0.
      3. Przechowywać bufor pNPP w temperaturze 4 oC.
  2. W przypadku roztworów zieleni malachitowej przygotuj następujące elementy.
    1. Przygotować roztwór A, dodając 32,8 ml stężonego HCl do 67,2 ml ultraczystej wody dejonizowanej, aby utworzyć 4 M roztwór HCl.
      UWAGA: Roztwór malachitu przygotowuje się w dygestorium przy użyciu jednorazowych rękawiczek, maski na twarz i okularów ochronnych.
    2. Przygotować roztwór B, odważając 4,2 g molibdenianu amonu i dodając go do 95,8 ml roztworu A.
    3. Przygotuj roztwór C, ważąc 0,045 g soli malachitowej zielonego szczawianu i dodając ultraczystą wodę dejonizowaną, aby uzyskać końcową całkowitą objętość do 100 ml.
    4. Przygotować roztwór D, mieszając roztwory B i C w stosunku 1:3 (v/v), mieszać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Przefiltruj roztwór D przez jednostkę filtrującą z membraną nitrocelulozową o wielkości porów 0,22 μm za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml.
    6. Przygotowany roztwór malachitu przechowywać w temperaturze 4 oC z dala od światła.
  3. Przygotowanie aktywatora
    1. Aby przygotować 1% roztwór tween 20, odpipetuj 10 μl tween 20 do 990 μl ultraczystej wody dejonizowanej (v/v), a następnie wiruj, aż tween 20 całkowicie się rozpuści.
  4. Przygotowanie roztworu roboczego zieleni malachitowej Tween 20 (MGT).
    1. Zmieszać aktywator (etap 1.3) z roztworem zieleni malachitowej (roztwór D, etap 1.2.5) w stosunku 1:100 (np. 1 μl aktywatora na 99 μl roztworu zieleni malachitowej).
  5. Przygotowanie substratu fosfopeptydu treoniny (KRpTIRR) (pT).
    1. Aby przygotować bulion o wielkości 2 mM, umieść fiolkę z fosfopeptydem o pojemności 1 mg na lodzie, dodaj 550 μl ultraczystej wody dejonizowanej i delikatnie przemieszaj, aby się rozpuścił.
      1. Wykonaj ~10 porcji i przechowuj pT w temperaturze -20oC.
  6. Przygotowanie synukleiny
    1. Przygotuj synukleiny w dygestoriach za pomocą jednorazowych rękawiczek, maski na twarz i okularów ochronnych.
    2. Zawiesić 1 mg rekombinowanej synukleiny w 1 ml ultraczystej wody dejonizowanej do końcowego stężenia 1 mg/ml.
    3. Delikatnie zmieszaj do rozpuszczenia i umieść na lodzie.
    4. Przygotować 50 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 oC.
  7. Przygotowanie wzorców fosforanowych
    1. Przygotować 0,1 mM roztwór podstawowy fosforanu w następujący sposób.
      1. Odważyć 0,1361 g KH2PO4 i umieścić w zlewce z 80 ml ultraczystej wody dejonizowanej. Dodaj mieszadło i wymieszaj do rozpuszczenia. Przenieś cały roztwór do cylindra miarowego i doprowadź końcową całkowitą objętość do 100 ml ultraczystą wodą dejonizowaną.
      2. Przefiltrować cały roztwór przez jednostkę filtrującą z membraną nitrocelulozową o wielkości porów 0,22 μm za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml; końcowe stężenie wynosi 10 mM.
      3. Rozcieńczyć roztwór (10 mM) w stosunku 1:100; końcowe stężenie wyniesie 0,1 mM fosforanu (PO4), który zostanie użyty do wzorców testowych.
      4. Przechowywać podstawowy roztwór fosforanu w temperaturze 4 oC.
    2. Patrz Tabela 1 w celu ograniczenia rozcieńczeń stosowanych do sporządzania wzorców PO4 o końcowej całkowitej objętości 1250 μL każdy. Dodaj odpowiednią ilość fosforanów i ultraczystej wody dejonizowanej do probówek o pojemności 1,5 ml zgodnie z tabelą 1.
      1. Przygotowane wzorce PO4 należy przechowywać w temperaturze -20 oC.
Rozdział szt. szt. szt. szt. szt. osób szt. szt. szt. Rozdział szt. szt. szt. szt. szt.
Standardy fosforanowe
0,1 mM roztwór PO4 (ml)0751503006001 200
Ultraczysta woda dejonizowana (ml)1 2501 1751 10095065050
Stężenie końcowe PO4 [pmol]01503006001 2002 400

Tabela 1: Wzorce fosforanów.

2. Test PP2A w odpowiedzi na rekombinowane synukleiny

UWAGA: Całkowita końcowa objętość dla każdej reakcji wyniesie 60 μL, więc eksperymentator musi odpowiednio dostosować początkową objętość bufora pNPP, aby dostosować się do objętości synuklein używanych dla każdej próbki. W większości przypadków objętość bufora pNPP będzie wynosić od 40 do 44 μL.

  1. Przygotować każdą reakcję PP2Ac w następujący sposób.
    1. Do probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 39 μl buforu pNPP i umieść na lodzie.
    2. Dodać 1 μl (105 ng/μL lub 0,0007 U/μL) ludzkiego rekombinowanego PP2Ac (rPP2Ac).
    3. Dodać 4 μl synukleiny 0, 1,5, 7,5, 15 lub 30 μM do rPP2Ac w buforze pNPP dla końcowych stężeń 0, 0,1, 0,5, 1,0 i 2,0 μM i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut na jednostce obrotowej; końcowa objętość wyniesie 60 μl.
    4. Po 30 minutach przenieść próbki do lodu i dodać 16 μl 2 mM pT substratu.
    5. Każdą mieszaninę do oznaczania PP2A inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C w łaźni wodnej z przerywanym wstrząsaniem.
    6. Do 96-dołkowej płytki z płaskim dnem dodać 25 μl każdego wzorca PO4 (0, 150, 300, 600, 1,200 i 2,400 pmol) w zduplikowanych studzienkach od niskiego do wysokiego.
    7. Następnie dodać 25 μl każdej próbki doświadczalnej (test PP2A ± synukleiny), przygotowanej w krokach 2.1.1 do 2.1.6, w celu zduplikowania studzienek na tej samej 96-dołkowej płytce.
    8. Następnie dodać 75 μl roztworu roboczego MGT do każdej studzienki zawierającej wzorce i próbki.
    9. Pozostaw talerz w temperaturze pokojowej na 10 minut.
    10. Obserwuj zmianę koloru w próbkach mających mierzalne różnice w poziomach fosforanów.

3. Analiza fotometryczna

  1. Przeanalizować 96-dołkową płytkę zawierającą wzorce i próbki za pomocą spektrofotometrycznego czytnika płytek o długości fali ustawionej na 630 nm29.
  2. Wykreślić wytworzoną krzywą absorbancji (próbki odczytane przy 630 nm) i zauważyć, że pozostaje ona liniowa do stężenia PO4 4 pmol.

Wyniki

Funkcja i aktywność białek mogą być modyfikowane poprzez modyfikacje potranslacyjne, takie jak fosforylacja. Wiele białek może zostać ufosforylowanych przez kinazę lub defosforylowanych przez fosfatazę. W przypadku fosfatazy białkowej 2A (PP2A), ta wielopodjednostkowa fosfataza ułatwia defosforylację reszt seryny i treoniny w szerokim spektrum fosfoprotein. Nieprawidłowa aktywność PP2A może prowadzić do rozregulowania funkcji białek, co występuje w wielu chorobach, w tym w chorobie Parkinsona, gdzie aSyn może ulec hiperfosforylacji, oraz w chorobie Alzheimera, gdzie białko tau może ulec hiperfosforylacji. Stanowiło to uzasadnienie dla optymalizacji wewnętrznej procedury w celu szybkiej oceny aktywności PP2Ac i ustalenia, czy nieprawidłowa aktywność PP2Ac może prowadzić do dysfunkcji komórkowych.

Za pomocą tego bezkomórkowego testu kolorymetrycznego zmierzono aktywność PP2Ac poprzez ilościowe oznaczenie poziomu wolnego PO4 odszczepionego z substratu pT (Rycina 1A) i porównano go do znanych pikomolarnych ilości PO4 na krzywej wzorcowej (Rycina 1B). Aktywność PP2Ac zmierzono również w odpowiedzi na stężenia 0,0, 0,1, 0,5, 1,0 i 2,0 µM synuklein (Rycina 1A) w porównaniu do podstawowej aktywności PP2Ac w obecności dodanej synukleiny (przy dużej strzałce na Rycynie 1A).

figure-results-1
Rysunek 1: Aktywacja PP2A przez rekombinowane synukleiny, mierzona w stosunku do znanych poziomów fosforanu w standardach. W (A) oceniono aSyn, bSyn i gSyn w zakresie stężeń białek od 0 do 2 µM w porównaniu do standardów od 0 do 2400 pmol PO4 . (B) Wygenerowano krzywą standardową dla testu malachitową zielenią dla PP2Ac, aby zapewnić znane ilości fosforanu, w odniesieniu do których można obliczyć wartości uzyskane w warunkach eksperymentalnych. W każdym przypadku, gdy aktywność PP2Ac wzrasta, ilość wolnego PO4 odszczepionego od substratu pT zwiększa się, co daje ciemniejszy zielony kolor. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki pokazują, że dodanie synuklein do PP2Ac w początkowym etapie inkubacji może zwiększyć ilość zmierzonego wolnego PO4 , co świadczy o zwiększonej aktywności PP2Ac. Analiza statystyczna po wielu powtórzeniach wykazuje, że wszystkie trzy rekombinowane synukleiny (aSyn, bSyn, gSyn) znacząco zwiększają aktywność PP2Ac (Rycina 2). Wyniki te sugerują, że zmiany w ilości rozpuszczalnych komórkowych synuklein mogą zmieniać aktywność PP2Ac, a tym samym wpływać na homeostazę komórkową. Nie wiadomo jednak, czy wszystkie trzy synukleiny przyczyniają się do aktywacji PP2Ac in vivo, choć dane na Rycynie 3 sugerują, że aSyn prawdopodobnie wpływa na aktywność PP2Ac in vivo.

figure-results-2
Rysunek 2: Aktywność PP2Ac jest stymulowana przez wszystkie trzy synukleiny. Przedstawiono graficzną reprezentację aktywacji PP2Ac w odpowiedzi na zmienne stężenia rekombinowanych aSyn, bSyn lub gSyn. Wszystkie trzy rekombinowane synukleiny stymulowały aktywność PP2Ac. aSyn w większości eksperymentów wydawała się nieco bardziej aktywna, choć wyniki analiz ANOVA przeprowadzone przy użyciu oprogramowania statystycznego były ogólnie bardzo podobne. Dane przedstawiają średnią ± SEM z 4-9 niezależnych eksperymentów. ns, brak istotności; * p <0.05; ** p <0.01; **** p <0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby ocenić, która z synuklein może wchodzić w interakcje z PP2Ac w mózgu, przeprowadzono testy koimmunoprecypitacji (Co-IP) z wykorzystaniem mózgu myszy typu dzikiego oraz przeciwciała specyficznego dla PP2Ac, 1D6. Następnie białka rozdzielono metodą SDS-PAGE, a na błonach przeprowadzono detekcję PP2Ac, aSyn, bSyn i gSyn przy użyciu uznanych metod19. Kontrole z rekombinowanymi synukleinami potwierdzają specyficzność przeciwciał przeciwko aSyn, bSyn i gSyn (Rysunek 3A). Dane z Co-IP wykazują, że główną synukleiną powiązaną z PP2Ac w mózgu była aSyn, ponieważ w Co-IP wytrąciło się znacznie mniej bSyn (Rysunek 3B), a gSyn nie została wytrącona w Co-IP (dane nie pokazano). Sugeruje to odrębną rolę endogennej aSyn w regulacji PP2Ac w mózgu. Podnosi to również możliwość, że modulacja PP2Ac za pomocą terapii opartych na bSyn mogłaby mieć potencjał do przywrócenia aktywności PP2A u osób z synukleinopatiami, ponieważ wiadomo, że bSyn jest nieamyloidogenna, a jak pokazano tutaj, może stymulować PP2Ac30,31.

figure-results-3
Rysunek 3: Interakcja PP2Ac z endogennymi synukleinami w mózgu myszy. (A) Rekombinowane aSyn, bSyn i gSyn zostały poddane analizie z użyciem przeciwciał specyficznych dla synukleiny, zgodnie z opisem poniżej. (B) Przy użyciu homogenatu mózgu myszy przeprowadzono Co-IP z przeciwciałem 1D6, a następnie próbki przeanalizowano metodą immunoblotingu. Przedstawiono dane dla PP2Ac, aSyn i bSyn, pomijając gSyn, która nie uległa współimmunoprecypitacji z PP2Ac. Próbki startowe pokazują względne poziomy PP2Ac (ścieżka 1), aSyn (ścieżka 4) i bSyn (ścieżka 7) w początkowych homogenatach. Próbki końcowe pokazują pozostałe poziomy PP2Ac (ścieżka 2), aSyn (ścieżka 5) i bSyn (ścieżka 8) w homogenatach po Co-IP PP2Ac z użyciem 1D6. Znaczące poziomy PP2Ac zostały immunoprecypitowane za pomocą przeciwciała 1D6 (ścieżka 3), które wytrąciło również znaczące ilości aSyn (ścieżka 6, przy strzałce), ale bardzo mało bSyn (ścieżka 9, silnie przeeksponowana w celu ukazania słabego sygnału bSyn, przy strzałce). *Gwiazdki i nawiasy oznaczają sygnały nieswoiste na blotach. Szczegóły dotyczące użytych przeciwciał znajdują się w Tabeli Materiałów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ten test zieleni malachitowej z pT został użyty do pomiaru aktywności PP2Ac, ponieważ jest łatwiejszy do wykonania niż klasyczna metoda, która wykorzystuje 32substraty znakowane P. Kolejną zaletą tego testu w porównaniu z testami promieniotwórczymi jest to, że izotopy promieniotwórcze stwarzają pewne ryzyko i mogą być kosztowne, zwłaszcza 32cząsteczki znakowane P, które mają krótki okres półtrwania, co ogranicza liczbę testów, które można wykonać przed wygaśnięciem odczynników. Użycie zieleni malachitowej zamiast radioaktywności eliminuje również konieczność utylizacji odpadów 32P. Testy zieleni malachitowej są również dość czułe przy pomiarze aktywności fosfataz serynowo-treoninowych w porównaniu z innym testem kolorymetrycznym, który wykorzystuje substrat p-nitrofenylofosforan (pNPP), który jest nieselektywny, ponieważ może być defosforylowany przez szeroką liczbę enzymów32.

Komercyjne zestawy zieleni malachitowej do pomiaru aktywności PP2A są dostępne od jakiegoś czasu i były wcześniej używane w laboratorium. Jednak podczas wykonywania wielu testów zieleni malachitowej takie zestawy stały się zbyt drogie. Ponadto komercyjne zestawy do aktywności PP2A są stabilne tylko przez jeden rok, a odczynniki są dostępne w postaci sproszkowanej i przy odpowiednim przechowywaniu, zapewniają łatwo dostępne składniki testowe, które są strukturalnie stabilne przez długi czas.

Przed badaniem bSyn i gSyn, aSyn stosowano jako kontrolę pozytywną w celu stymulacji aktywności PP2Ac i określenia ilości PP2Ac wymaganej do testów, a także w celu potwierdzenia, że uzyskane dane pozostają na skali z krzywą wzorcową (150 - 2400 pmol PO4). Warto zauważyć, że jeśli aSyn zbyt silnie stymuluje PP2Ac, mimo że reakcja jest zazwyczaj liniowa, dane wyjdą poza skalę i substancje chemiczne w roztworze MGT wytrącą się, co uniemożliwi dokładne zmierzenie ilości uwolnionego wolnego PO4 za pomocą czytnika płytek.

Biorąc pod uwagę, że aSyn przyczynia się do aktywności PP2Ac in vivo i in vitro 12,19,21,23,25 oraz że wszystkie synukleiny mają znaczną homologię, postawiono hipotezę, że wszyscy członkowie rodziny synukleiny mogą być w stanie stymulować PP2Ac w testach bezkomórkowych. Korzystając z opisanego tutaj testu kolorymetrycznego, stwierdzono, że rzeczywiście wszystkie trzy rekombinowane synukleiny (aSyn, bSyn, gSyn) stymulują aktywność PP2Ac, co zwiększa prawdopodobieństwo, że wszystkie trzy synukleiny mogą pełnić podobne funkcje w układzie nerwowym. Jednak mózg z chorobą Parkinsona lub demencją z przypadkami ciał Lewy'ego ma mniejszą aktywność PP2Ac w tkankach zawierających wysoce zagregowany aSyn23. Tkanki myszy zawierające patologię podobną do ciał Lewy'ego również wykazują zmniejszoną aktywność PP2Ac25. To, a także nowe dane na rysunku 3, jak również wcześniejsze dane z myszy z nokautem aSyn12, zdecydowanie sugerują, że ani bSyn, ani gSyn nie mogą zazwyczaj zrekompensować utraty rozpuszczalnego aSyn w mózgu, lub alternatywnie, że te homologi synukleiny mogą nie wiązać się z PP2Ac tak silnie jak aSyn, jak pokazano (Figura 3). Atlas mózgu Allena pokazuje kolokalizację wszystkich trzech mRNA synukleiny w wielu obszarach mózgu i chociaż myszy z potrójnym nokautem synukleiny zostały wygenerowane 9,33, aktywność PP2Ac nie została oceniona w tym modelu. Co ciekawe, aSyn, który jest fosforylowany na Ser129 przez kinazę podobną do Polo 2, jest mniej zdolny do aktywacji PP2Ac12, ale dowody pokazane tutaj dla bSyn sugerują, że fosforylacja bSyn prawdopodobnie nie wpłynie na aktywność PP2Ac, ponieważ bardzo mało bSyn zaszło z PP2Ac w mózgu myszy (Figura 3). Podsumowując, dane sugerują, że endogenne modulatory aktywności PP2Ac, takie jak aSyn, prawdopodobnie przyczyniają się do dobrego samopoczucia i choroby.

Przedstawiony tutaj protokół jest prostą, ale potężną techniką określania zdolności PP2Ac do defosforylacji substratu fosfopeptydowego w odpowiedzi na różne zabiegi. Na przykład ta sama metodologia może być wykorzystana do testowania innych aktywatorów PP2Ac, takich jak ceramidy, a także potencjalnych nowych środków terapeutycznych34, lub do oceny wpływu inhibitorów PP2Ac in vitro. Ważne jest również, aby podkreślić, że podobne testy mogą mierzyć aktywność PP2Ac, który został wyizolowany przez immunoprecypitację 1D6 z ekstraktów komórkowych lub tkanek ciała, jak wcześniej opisali autorzy 12,19,25. Przyszłe zastosowania testu zieleni malachitowej wykraczają poza pomiar aktywności PP2Ac, ponieważ za pomocą takiego testu można również określić aktywność ATP.

Należy pamiętać, że krzywa wzorcowa musi być generowana za każdym razem dla każdego niezależnego testu PP2Ac. Obowiązkowe jest upewnienie się, że wszystkie używane odczynniki są wolne od fosforanów, ponieważ wolne fosforany sztucznie zwiększają sygnał tła i dają błędne wyniki. W dniu badania konieczne jest przygotowanie wystarczającej ilości świeżego roztworu MGT dla wszystkich próbek, które mają być oznaczone. Ponadto MGT jest dobry tylko w dniu, w którym jest wytwarzany i ma tendencję do wytrącania się po kilku godzinach. PP2Ac zakupiony od dostawcy musi być podzielony na porcje i przechowywany w stanie zamrożonym wkrótce po otrzymaniu, aby zapobiec cyklom zamrażania i rozmrażania, które zmniejszają jego aktywność. Ponieważ inne fosfatazy mogą defosforylować substrat pT (np. PP1 i PP535), podczas analizy ekstraktów komórkowych lub tkankowych, w których PP2Ac nie został wyizolowany przez immunoprecypitację, próbki muszą zostać przepuszczone przez kolumny w celu usunięcia wolnych fosforanów, a w celu potwierdzenia swoistości fosfatazy należy zastosować specyficzne inhibitory fosfatazy, jak opisano wcześniej18.

Oświadczenia

W latach 1999 – 2011 dr Perez był członkiem wydziału na Wydziale Neurologii Uniwersytetu w Pittsburghu School of Medicine.

Podziękowania

Autorzy doceniają wysiłki poprzednich członków laboratorium, Kendry Mackett, Sandry Slusher i Jie Chen, którzy pracowali nad optymalizacją metody. Autorzy dziękują również National Institutes of Health, Fundacji Michaela J. Foxa, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso Scholarly Activity Research Project (SARP), Fundacji Lizanell and Colbert Coldwell, Multiple System Atrophy Coalition, Hoy Family Research i Anna Mae Doyle Gift Funds za wsparcie finansowe tych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik
1 M Trizma BaseSigma-AldrichT15003
CaCl2 (chlorek wapnia)Fisher ScientificC70-500
Skoncentrowany HCl   JT Baker9535-33
Molibdenian amonuSigma-AldrichA1343
Sól zielonego szczawianu malachituSigma-AldrichM6880
Tween 20Sigma-AldrichP9416
Fosfopeptyd treoniny (KRpTIRR)Peptyd Nowej Anglii LLCBP12-011
KH2PO4 ( fosforan potasu)Sigma-Aldrich795488
Rekombinowana ludzka podjednostka PP2A CCayman Chemical 
Rekombinowany ludzki &alfa;-synukleinarPeptydS-1001-2
Rekombinowany ludzki β-synukleinarPeptydS-1003-2
Rekombinowany ludzki γ-synukleinarPeptydS-1007-2
PP2Ac 1D6Przeciwciało Millipore05-421
PP2AcNovus BiologicalsNB100-92217
Przeciwciało aSyn C-20Santa Cruz Biotechnologysc-7011-R
Przeciwciało bSyn EP1537YNovus BiologicalsNB100-79903
Przeciwciało gSyn E-20Santa Cruz Biotechnologysc-10698
Kolumny odsalające Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 mlThermo-Fisher Scientific89882
NameFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment/Software
Multiskan Czytnik płytek SpectrumThermo Fisher Scientific 
51118650 pH-metr Fisher Naukowy 13-636-AB15P
10011237

Bibliografia

  1. Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS. Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).
  2. Iwai, A., et al. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system. Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).
  3. Irizarry, M. C., et al. Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).
  4. Shibayama-Imazu, T., et al. Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14). Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).
  5. Nakajo, S., Shioda, S., Nakai, Y., Nakaya, K. Localization of phosphoneuroprotein 14 (PNP 14) and its mRNA expression in rat brain determined by immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Mol Brain Res. 27 (1), 81-86 (1994).
  6. Buchman, V. L., et al. Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system. J Neurosci. 18 (22), 9335-9341 (1998).
  7. George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch. Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).
  8. Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons. Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).
  9. Greten-Harrison, B., et al. alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).
  10. Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease. J Neurochem. , (2016).
  11. Perez, R. G., Hastings, T. G. Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk? J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).
  12. Lou, H., et al. Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo. J Biol Chem. 285 (23), 17648-17661 (2010).
  13. Akil, O., et al. Localization of Synucleins in the Mammalian Cochlea. JARO. 9 (4), 452-463 (2008).
  14. Guardia-Laguarta, C., et al. alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes. J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).
  15. Shibayama-Imazu, T., et al. Distribution of PNP 14 (beta-synuclein) in neuroendocrine tissues: localization in Sertoli cells. Mol Reprod Dev. 50 (2), 163-169 (1998).
  16. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).
  17. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).
  18. Alerte, T. N., et al. Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice. Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).
  19. Peng, X., Tehranian, R., Dietrich, P., Stefanis, L., Perez, R. G. Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3523-3530 (2005).
  20. Perez, R. G., et al. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis. J Neurosci. 22 (8), 3090-3099 (2002).
  21. Porras, J. L., Perez, R. G. Ch. III. Nova Publishers - Alpha-Synuclein. Kanowitz, H. C., Polizzi, M. , NOVA Science Publishers. 51-70 (2014).
  22. Tehranian, R., Montoya, S. E., Van Laar, A. D., Hastings, T. G., Perez, R. G. Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylase activity in dopaminergic cells. J Neurochem. 99 (4), 1188-1196 (2006).
  23. Wu, J., et al. Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo. Neuroscience. 207, 288-297 (2012).
  24. Geng, X., et al. alpha-Synuclein binds the K(ATP) channel at insulin-secretory granules and inhibits insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 300 (2), E276-E286 (2011).
  25. Farrell, K. F., et al. Non-motor parkinsonian pathology in aging A53T alpha-synuclein mice is associated with progressive synucleinopathy and altered enzymatic function. J Neurochem. 128 (4), 536-546 (2014).
  26. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochem J. 353 (Pt 3), 417-439 (2001).
  27. Wlodarchak, N., Xing, Y. PP2A as a master regulator of the cell cycle. Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 51 (3), 162-184 (2016).
  28. George, J. M. The synucleins. Genome Biol. 3 (1), (2002).
  29. Fathi, A. R., Krautheim, A., Lucke, S., Becker, K., Juergen Steinfelder, H. Nonradioactive technique to measure protein phosphatase 2A-like activity and its inhibition by drugs in cell extracts. Anal Biochem. 310 (2), 208-214 (2002).
  30. Hashimoto, M., et al. An antiaggregation gene therapy strategy for Lewy body disease utilizing beta-synuclein lentivirus in a transgenic model. Gene Ther. 11 (23), 1713-1723 (2004).
  31. Hashimoto, M., Rockenstein, E., Mante, M., Mallory, M., Masliah, E. beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an anti-parkinsonian factor. Neuron. 32 (2), 213-223 (2001).
  32. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 18, (2010).
  33. Anwar, S., et al. Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family. J Neurosci. 31 (20), 7264-7274 (2011).
  34. Vargas-Medrano, J., et al. Novel FTY720-based compounds stimulate neurotrophin expression and phosphatase activity in dopaminergic cells. ACS Med Chem Lett. 5 (7), 782-786 (2014).
  35. Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. Methods in Molecular Biology. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

One of the authors' names was corrected from:

Brian Marcus

to:

Brian S. Marcus

Tagi

Analiza aktywno ci synukleinytest z zieleni malachitowrekombinowane synukleinypodjednostka katalityczna PP2Ackoimmunoprecypitacjaprzygotowanie wzorc w fosforanowychprzygotowanie buforu pNPPanaliza spektrofotometryczna

Powiązane artykuły