Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oznaczanie względnej siły działania przeciwciała monoklonalnego anty-TNF (mAb) przez neutralizację TNF przy użyciu metody bioanalitycznej in vitro

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55376

⸱

16 września 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research and Development, Probiomed, 2Bioprocess Research and Development Unit, Instituto Politecnico Nacional

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół do określania względnej aktywności antyapoptotycznej mAb anty-TNFα przy użyciu mechanizmu neutralizacji z komórkami WEHI 164 jest przedstawiony tutaj. Protokół ten jest przydatny do porównywania siły neutralizacji różnych cząsteczek o tej samej funkcjonalności biologicznej.

Streszczenie

Ten protokół pokazuje pomiar neutralizacji aktywności apoptotycznej TNFα w mysim modelu komórkowym fibroblastów (WEHI 164) przy użyciu mAb anty-TNFα. Ponadto protokół ten może być wykorzystany do oceny innych cząsteczek anty-TNFα, takich jak białka fuzyjne. Zastosowany tutaj model komórkowy jest wrażliwy na apoptozę, w której pośredniczy TNFα, gdy w warunkach hodowli komórkowej indukowany jest dodatkowy czynnik stresowy (np. deprywacja surowicy). Procedura ta ilustruje, w jaki sposób przeprowadzić ten test analityczny, podkreślając kluczowe operacje związane z przygotowaniem próbki, rozcieńczaniem komórek, indukcją apoptozy i pomiarami spektrofotometrycznymi, które mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia pomyślnych wyników. Protokół ten ujawnia najlepsze warunki wydajności związane z indukcją apoptozy i wydajnym rejestrowaniem sygnału, co prowadzi do niskich wartości niepewności.

Wprowadzenie

Siła biologiczna to ilościowa miara aktywności biologicznej oparta na atrybutach badanego produktu, które są powiązane z odpowiednimi właściwościami biologicznymi, podczas gdy ilość (wyrażona w masie) jest fizykochemiczną miarą zawartości białka. Testy siły działania, wraz z innymi metodologiami analitycznymi, są wykonywane w ramach badań zgodności, stabilności i porównywalności produktów. W tym sensie pomiary siły działania są wykorzystywane do wykazania, że partie produktu spełniają krytyczne atrybuty jakości (CQA) lub kryteria akceptacji we wszystkich fazach badań klinicznych i po dopuszczeniu do obrotu.

Apoptoza to zaprogramowana śmierć komórki, naturalnie występująca, gdy komórki są zainfekowane wirusem lub gdy komórki są zestresowane przez czynnik środowiskowy, który zagraża żywotności i funkcji komórki1,2. Między innymi hamowanie apoptozy, czyli neutralizacja biologiczna, jest jednym z zasadniczo znanych mechanizmów terapeutycznych mAb, szczególnie w leczeniu chorób przewlekłych, takich jak choroby zapalne o podłożu immunologicznym. Cząsteczki anty-TNFα wywierają swoje właściwości terapeutyczne poprzez blokowanie interakcji czynnika martwicy nowotworu alfa (TNFα) z receptorami powierzchniowymi komórek p55 i p753, zapobiegając w ten sposób szlakom sygnałowym, które ostatecznie prowadzą do apoptozy komórkowej.

TNFα może powodować stany zapalne w niektórych chorobach przewlekłych4. TNFα jest fałszywie wydzielany do środowiska zewnątrzkomórkowego przez makrofagi, które są strażnikami wrodzonego układu odpornościowego i głównymi aktorami tego rodzaju choroby5. Jako powszechna ścieżka, deregulacja TNFα jest związana z patogenezą tych chorób. Bez kontroli i pod ciągłą indukcją i stresem komórkowym, TNFα indukuje śmierć komórek i degenerację tkanek, ostatecznie prowadząc do reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby Leśniowskiego-Crohna i innych profili patologicznych6.

Antagoniści TNF, którzy blokują interakcję między TNF a jego receptorami, są coraz częściej stosowane jako skuteczna terapia zmniejszająca symptomatologię i hamująca postęp tych chorób. Obecnie leki anty-TNFα są szeroko stosowane do kontrolowania ogólnoustrojowego stężenia tej cytokiny, zapobiegając w ten sposób dalszej degeneracji zaangażowanych tkanek. W tym sensie konieczne jest zapewnienie powtarzalnego i solidnego testu biologicznego w celu opisania specyficznej zdolności leku do osiągnięcia efektu biologicznego.

W tym protokole podkreślone są kluczowe kroki - zidentyfikowane podczas opracowywania testu neutralizacji - dla skutecznego pomiaru siły biologicznej, ze szczególnym naciskiem na umiejętności potrzebne do wykonania metody bioanalitycznej. Ta metoda bioanalityczna dostarcza użytecznych informacji na temat porównywalności między różnymi seriami lub produktami leczniczymi anty-TNFα w porównaniu z klinicznie przebadaną substancją referencyjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek i roztworów

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną: RPMI-1640 z 10% FBS, pH 7.4.
  2. Przygotować pożywkę do testów: RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej, ale z 1% FBS, pH 7.4.
  3. Przygotować roztwór do płukania komórek: roztwór DPBS bez Mg i Ca z 0.02% EDTA, pH 7.4.
  4. Przygotować roztwór do odrywania komórek: 0.125% trypsyny z 1 mM EDTA.
    1. Rozmrozić 10 mL 0.25% roztworu trypsyny-EDTA i przelać do sterylnej kolby o pojemności 50 mL.
    2. Wymieszać z 10 mL roztworu do płukania komórek i rozdzielić w 15 mL aliquotach do sterylnych probówek o pojemności 15 mL. Przechowywać w temperaturze od -70 do -80 °C do momentu użycia.
    3. Przefiltrować te roztwory przez membranę 0.22-µm i ogrzać do 37 °C przez co najmniej 30 min przed użyciem.
  5. Przygotować roztwór zapasowy do indukcji apoptozy: roztwór TNFα o stężeniu 3.3 µg/mL.
    1. Rozpuścić 20 µg TNFα w 50 µL sterylnej wody filtrowanej w pierwotnym opakowaniu i mieszać do całkowitego rozpuszczenia.
    2. Przenieść do sterylnej probówki 15 mL i dodać do niej 5.5 mL roztworu DPBS bez Mg i Ca. Delikatnie wymieszać za pomocą vortexera.
    3. Rozdzielić roztwór na porcje po 70 µL. Rozlać każdą porcję do mikroprobówek 0.5 mL i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. Przygotować roztwór indukujący apoptozę: roztwór TNFα o stężeniu 40 ng/mL.
    1. Rozmrozić aliquot roztworu zapasowego do indukcji apoptozy, inkubując go w kąpieli wodnej w temperaturze 25 ˚C przez 10 min.
    2. Rozcieńczyć roztwór zapasowy do stężenia 40 ng/mL, dodając 61 µL roztworu TNFα (3.3 µg/mL) do 4.939 mL pożywki do testów w sterylnej probówce 15 mL.
    3. Wymieszać vortexerem przez 10 s; roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
    4. Ogrzać roztwór do 37 °C przez co najmniej 30 min przed użyciem w teście neutralizacji.
  7. Przygotować roztwór substratu: roztwór caspase 3/7 Glo7,8.
    1. Rozmrozić bufor do kaspazy (bufor caspase 3/7 Glo) 12 h przed użyciem.
    2. Pozostawić bufor do kaspazy i substrat (substrat caspase 3/7 Glo) oddzielnie w temperaturze 25 ± 5 °C przez 30 min przed zmieszaniem.
    3. Przenieść 10 mL buforu do kaspazy do fiolki z substratem i wymieszać przez odwracanie.
    4. Przechowywać w temperaturze 25 ± 5 °C, chroniąc od światła do momentu użycia.
      UWAGA: Roztwór jest stabilny przez 6 h w temperaturze pokojowej.

2. Hodowla i liczenie komórek

  1. Rozmrażanie komórek i pierwsza subkultura.
    1. Wyjąć jedną probówkę z komórkami WEHI 1649 z zamrażarki o temperaturze -80 ˚C i przenieść je do łaźni lodowej.
    2. Wielokrotnie pipetuj próbkę w 1 ml podgrzanej wcześniej pożywki hodowlanej, aż zamrożone komórki całkowicie się rozmrożą.
    3. Do 15 ml sterylnej probówki nalać 9 ml uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej.
    4. Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i delikatnie wymieszaj, odwracając ją pięciokrotnie.
    5. Wiruj zawiesinę komórkową przy 125 x g przez 3 min. Odrzucić nadsącz i rozbić pellet komórkowy.
    6. Do probówki należy dodać 5 ml pożywki hodowlanej. Mieszać do całkowitego resuspensowania komórek.
    7. W celu policzenia komórek przenieś 50 µL zawiesiny komórkowej do 500 µL do probówki typu microtube i wymieszać z 50 µL 0,4% błękitu trypanu. Należy policzyć komórki i dostosować ich stężenie do 0,5 x 106 komórek/ml. Patrz w punkcie 2.2 poniżej.
    8. Do kolby do hodowli komórek o objętości 75 mL dodać 13 mL uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej.
    9. Odmiar odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej z kroku 2.1.6, aby uzyskać 0,5 x 106 komórek/ml w kolbie hodowlanej i inkubować w 37 °C oraz 5% CO22 przez noc.
  2. Liczenie komórek.
    UWAGA: Patrz w bibliografii10.
    1. Wykorzystując roztwór z kroku 2.1.6, przenieś 0,05 ml do hemocytometru i wyznacz gęstość komórek pod mikroskopem, stosując metodę wykluczania błękitu trypanu.
    2. Oznacz całkowitą liczbę komórek oraz liczbę komórek żywych.
    3. Dostosuj zawiesiny komórkowe do stężenia 0,5 x 106 komórek/ml
      Równanie 1
      Vpożywka hodowlana(ml) = Obliczanie stężenia komórek, wzór: (0,5x10^6 komórek/ml * 5 ml)/NVC komórek/ml, schemat.
      Vpożywka hodowlana(ml) = (5 ml - Vzawiesina komórkowa)
      Vpożywka hodowlana(ml) = skorygowana objętość zawiesiny komórek WEHI 164
      NVC = liczba żywych komórek WEHI 164/ml
      Vpożywka hodowlana(ml) = Objętość pożywki hodowlanej dodanej do zawiesiny komórkowej w celu uzyskania stężenia 0,5 x 106 komórek/ml
      0,5 x 106  = Docelowa gęstość komórek
  3. Odrywanie komórek oraz druga i trzecia pasażowanie.
    UWAGA: Do usuwania roztworów z kolb można wykorzystać system próżniowy. Można stosować jednorazowe lub szklane pipety sterylne. Jeśli pipeta posiada bawełniany zatek na górze, należy go usunąć przed użyciem.
    1. Usuń pożywkę hodowlaną z kolby T do hodowli komórek, używając sterylnej pipety 1 ml oraz odkurzacza.
    2. Nalać 5 ml roztworu do płukania komórek do kolby T, delikatnie wymieszać i odlać roztwór. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
      UWAGA: Całkowite usunięcie pożywki hodowlanej jest kluczowe dla efektywnego odszczepienia komórek.
    3. Do kolby T dodaj 15 ml roztworu do odrywania komórek i pozostaw na 3 min w inkubatorze przy 37 °C oraz 5% CO22.
    4. Pod mikroskopem zweryfikuj brak komórek przytwierdzonych do wewnętrznej ścianki kolby. Przenieś komórki z kolby T do sterylnej probówki o pojemności 50 ml, używając sterylnej pipety o pojemności 20 ml.
    5. Wiruj zawiesinę komórkową przy 125 x g przez 3 min. Odrzucić nadsącz i ponownie zawiesić osad w kolejnych 5 ml pożywki hodowlanej.
    6. Należy policzyć komórki i dodać odpowiednią ilość pożywki hodowlanej, aby osiągnąć pożądaną koncentrację komórek zgodnie z Równanie 1.
    7. Dodać tę zawiesinę do 72 cm2 kolbę T i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22.
    8. Przesiej komórki co najmniej dwukrotnie przed użyciem ich w teście neutralizacji. Powtarzaj kroki 2.3.1–2.3.8 przez kolejne dwa dni.
  4. Analiza zawiesiny komórkowej.
    1. Wybrać subkulturę WEHI 164, która przeszła co najmniej trzy pasaże. Patrz krok 2.1.
    2. Oddzielić i policzyć komórki zgodnie z krokami 2.2 i 2.3 niniejszego protokołu.
    3. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową zgodnie z Równanie 1 do 0,5 x 106 komórek/ml
    4. Tę zawiesinę komórkową należy wykorzystać do testu neutralizacji. Przed użyciem wszystkie zawiesiny komórkowe należy wymieszać za pomocą mieszadła wortex.

3. Przygotowanie i rozcieńczanie przeciwciał

  1. Ilościowe oznaczenie przeciwciał monoklonalnych (mAbs).
    1. Wyznaczyć stężenie substancji odniesienia, próbki kontrolnej i próbki analitycznej poprzez pomiar absorbancji UV przy 280 nm, korzystając z ich współczynnika ekstynkcji masowej (1,39)1.
      UWAGA: Pierwotne stężenia można przyjąć z etykiet produktu leczniczego. Muszą one jednak zostać zweryfikowane poprzez pomiar absorbancji UV.
  2. Rozcieńczanie przeciwciał monoklonalnych (mAbs).
    1. Rozcieńczyć wszystkie próbki niezależnie w trzech powtórzeniach, używając roztworu DPBS wolnego od Mg i Ca w probówkach typu mikro 2 mL, do stężenia 2 mg/mL. Potwierdzić stężenie to pomiarem absorbancji UV w trzech powtórzeniach, stosując roztwór DPBS wolny od Mg i Ca jako próbę ślepą.
    2. Wymieszać roztwory białek zapasowych przez 5 s za pomocą mieszadła wortexowego.
    3. Rozcieńczyć 10 µL każdego roztworu mAb o stężeniu 2 mg/mL w 0,9 mL pożywki hodowlanej do analizy.
    4. Mieszać przez 5 s za pomocą mieszadła wortexowego.
      UWAGA: Roztwory te mają stężenie 200 µg/mL. Rozcieńczanie musi zostać wykonane dla każdego z trzech powtórzeń.
    5. Rozcieńczyć 10 µL każdego roztworu mAb o stężeniu 200 µg/mL w 0,9 mL pożywki hodowlanej do analizy. Mieszać przez 5 s za pomocą mieszadła wortexowego. Roztwory te mają stężenie 2 µg/mL. Wykonać rozcieńczenia seryjne dla każdego powtórzenia przed użyciem ich w teście neutralizacji.
    6. Przygotować rozcieńczenia przeciwciał mAb anty-TNFα w trzech niezależnych mikropłytkach. Przygotować duplikat z każdego niezależnego powtórzenia i nanieść je na jedną mikropłytkę, zgodnie z treścią Tabeli 1. Substancja odniesienia
      Płytka 1Płytka 2Płytka 3
      StudzienkiPróbkaStudzienkiPróbkaStudzienkiPróbka
      B2:B1Substancja odniesieniaB2:B1Próbka kontrolnaB2:B1Próbka analityczna
      C2:C1C2:C1C2:C11
      D2:D1Próbka analitycznaD2:D1Substancja odniesieniaD2:D1Próbka kontrolna
      E2:E1E2:E1E2:E1
      F2:F1Próbka kontrolnaF2:F1Próbka analitycznaF2:F1Substancja odniesienia
      G2:G1G2:G1G2:G11
      Tabela 1: Układy próbek na mikropłytkach. Pełny test neutralizacji musi zostać przeprowadzony w trzech mikropłytkach w obrębie współrzędnych od B2 do G1. Losowe naniesienie substancji odniesienia, próbek analitycznych i kontrolnych pozwala badaczom zweryfikować ewentualne błędy systematyczne w analizie.
    7. Wyonać rozcieńczenia mAb dla każdej substancji odniesienia, próbki lub kontroli, jak pokazano w Tabeli 2.
      UWAGA: Stężenia mAb anty-TNFα opisane w tej tabeli nie są stężeniami końcowymi w teście neutralizacji.
      Kolumna płytkiObjętość pożywki hodowlanej do analizy (μL)Objętość substancji odniesienia, próbki analitycznej lub próbki kontrolnej (uL)Stężenie w płytce analitycznej (ng/mL)
      20230200
      3150150 z linii 210
      47575 z linii 350
      510050 z linii 333
      67575 z linii 4250
      77575 z linii 516
      87575 z linii 6125
      97575 z linii 783
      107575 z linii 941
      115075 z linii 1013
      Tabela 2: Rozcieńczenia mAb anty-TNFα. W tej tabeli przedstawiono rozcieńczenia seryjne przeciwciał mAb anty-TNFα. Stężenia końcowe opisane w tej tabeli nie są stężeniami w samym teście, w którym mAb anty-TNFα zostały rozcieńczone trzykrotnie (rozcieńczenie mAb + pożywka hodowlana + zawiesina komórek). Linie pogrubione reprezentują rozcieńczenia pochodzące z linii 3, 5, 7, 9 i 10; linie niepogrubione reprezentują rozcieńczenia z linii 3, 4 i 6. Rozcieńczenia seryjne te wykonuje się bezpośrednio przed przeprowadzeniem testu neutralizacji. Należy pamiętać o wymieszaniu poprzez trzykrotne pipetowanie w górę i w dół przed naniesieniem rozcieńczeń.
    8. Przechowywać płytki w temperaturze 25 ± 5 °C do momentu użycia.

4. Test neutralizacji z użyciem komórek WEHI 164

  1. Wymieszaj wszystkie zawiesiny komórkowe (0,5 x 106 komórek/ml) przed rozdzieleniem na każdym etapie niniejszego protokołu.
    UWAGA: W tej sekcji należy ogrzać każdy roztwór do 37 °C przez 30 min przed użyciem.
  2. Transfer 50 µL zawiesiny komórkowej do każdego z 60 dołków mikropłytek, przechodząc od kolumny 2 do 1 oraz od rzędu B do G.
  3. Transfer 50 µL rozcieńczeń przeciwciał monoklonalnych (mAb) referencyjnych, próbek i kontroli do mikropłytek. Należy postępować zgodnie ze schematem przedstawionym w Rysunek 1.
  4. Dodaj 50 µL roztworu indukującego apoptozę do każdej studzienki.
  5. Wykorzystanie komórkowych kontroli dla 50 µL komórek WEHI 164, rozdzielonych do trzech studni. Doprowadzić w każdej studni do objętości końcowej wynoszącej 150 µL z pożywką do analizy.
  6. Należy zastosować kontrolę cytotoksyczności w postaci mieszaniny 50 µL komórek WEHI 164 plus 50 µL roztworu indukującego apoptozę. Doprowadzić objętość w każdej studzience do końcowej wartości 150 µL z pożywką do testu.
  7. W przypadku kontroli TNFα należy użyć 50 µL roztworu indukującego apoptozę i doprowadzić go do 150 µL z pożywką hodowlaną do analizy.
  8. W przypadku próby ślepej należy użyć 150 µL samego pożywki do hodowli w analizie.
  9. Wypełnij pozostałe studzienki za pomocą 150 µL pożywki hodowlanej, aby uniknąć efektów odparowania z płytek.
  10. Powtórzyć kroki 4.1.1–4.1.9 dwukrotnie w dwóch kolejnych mikropłytkach.
    UWAGA: Końcowe stężenia przeciwciał mAb na mikropłytce wynoszą: 0,6, 0,3, 0,167, 0,1, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 oraz 0.004 µg/mL.
  11. Nanieś próbki na mikropłytki, zgodnie z instrukcją w Rycina 1.
    schemat płytki 96-dołkowej; test TNF-α, seria rozcieńczeń, próbki kontrolne/referencyjne, układ doświadczalny.
    Rysunek 1: Rozmieszczenie próbek na płytkach analitycznych. B1 do G1 to współrzędne studzienek w mikropłytkach, określające położenie rozcieńczeń próbek. Brakujące współrzędne to studzienki wypełnione kontrolami oraz medium hodowlanym do testu (A1–A12 i H1–H12). Taki losowy rozkład próbek (rozcieńczenia przednie i wsteczne w mikropłytkach) pomaga wyeliminować błędy w wynikach wynikające z odparowania medium lub innych zmiennych. Zaleca się, aby każda mikropłytka była opracowywana przez jednego analityka jednocześnie. R: referencja, S: próbka, CS: próbka kontrolna, Dil: rozcieńczenie. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
  12. Inkubować trzy płytki w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez 16 ± 2 h.
  13. Pozostawić odczynnik caspase 3/7 Glo w temperaturze 25 ± 5 °C przez 30 min przed użyciem.
  14. Dodaj 100 µL tego odczynnika do wszystkich studzienek, w tym do próbek i kontroli.
  15. Wstrząsaj płytki za pomocą mikropłytkowego mieszalnika wiertlowego (vortex) przez 3 min w temperaturze 25 ± 5 °C natychmiast po rozdzieleniu do dołków.
  16. Inkubować płytki przez 2,5 ± 0,5 h w temperaturze 25 ± 5 °Cchroniąc przed światłem.
  17. Włóż mikropłytki do luminometru i przejdź do następnej sekcji.

5. Analiza wyników

  1. Korzystając z oprogramowania do detekcji luminescencji, należy wybrać tryb luminescencji oraz funkcję pomiaru końcowego (endpoint).
  2. Wybierz płytkę 96-dołkową z przezroczystym dnem oraz jej 80 dołków wewnętrznych, z wyłączeniem kolumn 1 i 12.
  3. Wybierz czas integracji wynoszący 1 250 ms oraz 10 s na wymieszanie mikropłytki przed odczytem.
  4. Wybierz dołki, w których zostaną umieszczone substancja referencyjna, substancja analityczna oraz próbka kontrolna, i oznacz je zgodnie z odpowiadającymi im stężeniami.
  5. Odczytaj próbki umieszczone w mikropłytkach za pomocą luminometru.
  6. Do analizy wyników należy zastosować równanie czteroparametrowe. Należy wykreślić krzywą zależność dawka-odpowiedź, zgodnie z przedstawionym w Rysunek 2.
    Test neutralizacji, wykres zależności RLU od stężenia; Próbki referencyjne, analityczne i kontrolne, słupki błędów.
    Rysunek 2: Krzywa zależności efektu od dawki. Przedstawiono zależność stężenia przeciwciał monoklonalnych (mAb) anty-TNFα od luminescencji (żywotności komórek). Jako model zastosowano równanie parametru czwartego opisujące ochronną aktywność przeciw-TNFα przeciwciał mAb. EC50 to stężenie mAb zdolne do zneutralizowania ilości TNFα wywołującej śmierć 50% komórek w każdym teście, co na wykresie zostało zobrazowane jako zmiana nachylenia krzywej. Słupki przedstawiają odchylenie standardowe luminescencji dla każdego stężenia mAb. Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. reprezentuje stężenie przeciwciał anty-TNFα i jest przedstawione jako funkcja logarytmiczna w ng/mL, podczas gdy y reprezentuje odpowiedź luminescencyjna w dowolnych jednostkach luminescencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
    UWAGA: W równaniu czwartego parametru C oznacza efektywne stężenie 50 (EC50). Wartość ta zostanie wykorzystana do porównania substancji referencyjnej, próbki analitycznej i próbki kontrolnej za pomocą funkcji efektora.
  7. W celu obliczenia potencji względnych, należy przyjąć wartość 10% dla substancji odniesienia, a następnie odpowiednio obliczyć potencje próbek i kontroli.
    UWAGA: Wartości te przedstawiono w Rycina 3.
    Wyniki dopasowania krzywej 4-parametrycznej; symbole na wykresie: referencyjny (czerwony), analityczny (niebieski), kontrolny (zielony).
    Rycina 3: Równanie matematyczne wykorzystane do obliczenia wartości EC50 oraz uzyskane wartości. Wartości EC50, lub parametry C, mają przedstawioną niepewność w postaci błędu standardowego. Przedstawiono również porównanie wartości EC50 między próbką a wzorcem, co pozwala określić względną aktywność. Przedział ufności obliczono dla α = 0,05. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykres dawka-odpowiedź (z kontrolami)
Rysunek 1 przedstawia odpowiedź luminescencyjną w porównaniu ze stężeniem mAb. Ta sigmoidalna funkcja jest przykładem uwalniania kaspazy 3 i 7 w pożywce do hodowli testowej w wyniku lizy komórek. Śmierć komórki jest zwiększona przez głód surowicy oraz indukcję sygnalizacji TNFα. Dlatego cząsteczka anty-TNFα (mAb) oddziałuje z cytokiną, hamując (poprzez przeszkodę steryczną) jej interakcję z receptore...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Charakterystyka ta pomaga określić a priori biologiczne zachowanie opracowywanej cząsteczki przed przeprowadzeniem kosztownych i czasochłonnych badań klinicznych. Jest również przydatny do zwalniania partii po partii zatwierdzonego produktu leczniczego. Warto wspomnieć, że testy te są przydatne do określenia, czy cząsteczka ma odpowiedni efekt biologiczny w odniesieniu do jej mechanizmu działania. Metoda bioanalityczna przedstawiona w tym samouczku ma kluczowe znaczenie dla porównania różnych cząsteczek anty-TNF...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Radę Nauki i Technologii (CONACYT), Meksyk grant PEI CONACYT 2015 220333, bez udziału w projektowaniu badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
WEHI 164ATCCCRL-1751Komórki włókniakomięsaka z Mus musculus
RPMI-1640 MediumATCC30-2001Przechowywać podłoże w temperaturze 2 & stopni; C do 8 & stopni; C
RPMI 1640 Medium, bez czerwieni fenolowejGIBCO11835-030Przechowywać podłoże w temperaturze 2 & deg; C do 8 & stopni; C
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGIBCO25200-056Przechowywać podłoże w temperaturze -10 &; C do -20 ° C
DPBS, bez wapnia, bez magnezuGIBCO14190-136Przechowywać podłoże w temperaturze 2 & st; C do 8 & stopni; C
Rekombinowane ludzkie białko TNF-alfa R& D Systems210-TA-020Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C do -70 & C
Płodowa surowica bydlęca (USA), hyklon o bardzo niskiej IgGSH3089803Przechowywać w temperaturze -10 stopni; C do -20 ° C
Płodowa surowica bydlęca (USA), scharakteryzowanaHyklonSH3007103Przechowywać w temperaturze -10 stopni; C do -20 ° C
Zestaw do oznaczania kaspazy-glo 3/7PromegaG8093Przechowuj substrat Caspase-Glo. 3/7 i bufor Caspase-Glo. 3/7 w – 20 º C chroniony odŚwiatło
EDTA, sól disodowa, dihydrat, kryształ, A.C.S. OdczynnikJ.T.Baker8993-01--
Próbka mAb AdalimumabProbiomedNAKońcowe stężenia w mikropłytce wynoszą:  0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 i 0,004 μ g/ml
Referencyjne i kontrolne mAb AdalimumabAbbvieNAStężenia końcowe w mikropłytce wynoszą:  0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 i 0,004 μ Czytnik mikropłytek g / ml
Urządzenia molekularne89429-536SpectraMax M3
Oprogramowanie Urządzenia molekularne--Inkubator SoftMax Pro 6.3 GxP
 Revco 30482Revco RNW3000TABB Okap z wymuszonym przepływem CO2
przepływem laminarnym Firma Baker   200256Baker SG603A-HE | Wysoka sprawność, klasa II typ A2                   
Wielomodowy czytnik mikropłytek z

Bibliografia

  1. Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
  2. Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
  3. Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
  4. Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
  5. Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
  6. Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
  7. Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
  8. Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
  9. Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
  10. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3(2001).
  11. Ramasubramanyan, N., et al. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, ABBVIE INC. North Waukegan Road, North Chicago, IL, 60064, US. (2014).
  12. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
  13. Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
  14. Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
  15. Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
  16. Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
  17. Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
  18. Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
  19. Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neutralizacja TNF-alfamodel komórkowy WEHI 164test indukcji apoptozywyznaczanie względnej potencjiprotokół rozcieńczeń seryjnychanaliza spektrofotometrycznapomiar EC50pasażowanie kultur komórkowych
Oznaczanie względnej siły działania przeciwciała monoklonalnego anty-TNF (mAb) przez neutralizację TNF przy użyciu metody bioanalitycznej in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.