Usprawniona izolacja TCR z pojedynczych komórek i generowanie wektorów retrowirusowych do ekspresji TCR u ludzi in vitro i in vivo

Podsumowanie

Obecny protokół łączy sekwencjonowanie łańcucha alfa i beta TCR w parach pojedynczych komórek z usprawnionym generowaniem wektorów retrowirusowych kompatybilnych z ekspresją TCR in vitro i in vivo.

Streszczenie

Chociaż opracowano kilka metod sekwencjonowania sparowanych łańcuchów alfa i beta receptora limfocytów T (TCR) z pojedynczych limfocytów T, żadna z nich jak dotąd nie sprzyjała dalszej analizie funkcjonalnej in vivo heterodimerów TCR. Opracowaliśmy ulepszony protokół oparty na dwuetapowym PCR zagnieżdżonym w multipleksie, w wyniku czego powstaje produkt PCR, który obejmuje całe zmienne regiony ludzkich łańcuchów TCR alfa i beta. Identyfikując unikalne miejsca restrykcyjne i włączając je do starterów PCR, sprawiliśmy, że produkt PCR jest kompatybilny z bezpośrednim subklonowaniem do matrycowego wektora retrowirusowego. Powstały w ten sposób konstrukt retrowirusowy koduje chimeryczny ludzko-mysi TCR z mysią domeną wewnątrzkomórkową, która jest funkcjonalna w komórkach myszy lub w modelach mysich in vivo. Ogólnie rzecz biorąc, opisany tutaj protokół łączy identyfikację łańcucha TCR alfa i beta w parze pojedynczych komórek z usprawnionym generowaniem wektorów retrowirusowych, które można łatwo przystosować do ekspresji TCR in vitro i in vivo. Film i towarzyszący mu materiał mają na celu przedstawienie bardzo szczegółowego opisu PCR jednokomórkowego, tak aby można było postępować zgodnie z krytycznymi krokami i uniknąć potencjalnych pułapek. Dodatkowo udostępniamy szczegółowy opis kroków klonowania niezbędnych do wygenerowania wektora wyrażenia. Po opanowaniu, cała procedura, od sortowania pojedynczych komórek do ekspresji TCR, może być wykonana w krótkim okresie dwóch tygodni.

Wprowadzenie

Receptor limfocytów T (TCR) decyduje o losie limfocytów T podczas rozwoju, stanu stacjonarnego/homeostazy i stymulacji antygenowej na peryferiach^1,2,3. Niedawna ekspansja technologii głębokiego sekwencjonowania ujawniła wcześniej niedocenianą różnorodność TCR w odpowiedziach limfocytów T specyficznych dla antygenu. Różnorodność TCR sugeruje potencjał funkcjonalnie szerokich odpowiedzi limfocytów T. W celu zintegrowania analizy repertuaru sekwencji TCR z testami funkcjonalnymi TCR, podejścia do sekwencjonowania powinny być zaprojektowane tak, aby były kompatybilne z systemami eksperymentalnymi i modelami in vivo wykorzystywanymi do późniejszej analizy funkcjonalnej wybranych TCR. Opracowaliśmy skuteczne podejście do izolacji sekwencji TCR u ludzi i usprawniliśmy subklonowanie do chimerycznego wektora szablonu TCR człowieka / myszy kompatybilnego z ekspresją TCR w myszach humanizowanych przez HLA⁴. Izolacja odpowiednich łańcuchów alfa i beta heterodimerycznych TCR wymaga amplifikacji PCR obu łańcuchów z pojedynczej komórki. Chociaż opracowano i wykorzystano kilka protokołów klonowania pojedynczych komórek TCR, żaden z nich do tej pory nie był łatwo kompatybilny z wysokoprzepustowym, usprawnionym bezpośrednim klonowaniem nieznanych TCR Vα/Vβ do wektorów retrowirusowych niezbędnych do reekspresji in vivo^4,5,6,7. Poprzednie badania wykorzystywały dwa główne podejścia, albo selektywne wzmacnianie ograniczonej części TCR wystarczającej do ekstrapolacji sekwencji, albo amplifikacja całej sekwencji TCR^4,5,6,7. Dalsza analiza funkcjonalna sekwencji TCR uzyskanych za pomocą pierwszego podejścia wymaga kosztownego montażu in silico i budowy TCR de novo. Podczas gdy drugie podejście zapewnia pełną sekwencję TCR, ludzki region stały nie jest zgodny z ekspresją in vivo sklonowanych TCR w modelach mysich. Nasze podejście zostało specjalnie zaprojektowane, aby było kompatybilne z analizą funkcjonalną in vivo TCR w modelach mysich. Opracowaliśmy wydajny i usprawniony protokół PCR z pojedynczą komórką, który pozwala na bezpośrednie subklonowanie fragmentów PCR do wektora wyrażenia matrycy.

Nasze podejście wykorzystuje bardzo czułą reakcję PCR zagnieżdżoną w multipleksie, która jest przeprowadzana w dwóch krokach. W pierwszym etapie reakcji multipleksowej do amplifikacji TCR-alfa wykorzystuje się pulę 40 starterów specyficznych dla wszystkich łańcuchów V-beta oraz pulę 44 starterów specyficznych dla wszystkich łańcuchów V-alfa bez wcześniejszej znajomości sekwencji (Tabela 1). Starter do przodu ma sekwencję adaptera, która jest włączona do 5' produktu PCR. Odwrócony starter opiera się na stałym obszarze TCR. Zidentyfikowaliśmy unikalne miejsca restrykcyjne, które są nieobecne w ludzkich zmiennych lub węzłowych regionach TCR, i włączyliśmy je do nowo przeprojektowanych starterów TCRα i TCRβ (Rysunek 1). W drugiej zagnieżdżonej reakcji stosuje się starter specyficzny dla sekwencji adaptora i zagnieżdżony starter odwrotny w stałym obszarze w celu dalszego wzmacniania łańcuchów TCR ze zwiększoną swoistością (Tabela 1, Rysunek 1). Po izolacji pojedynczej komórki, dwie rundy PCR (pierwsza reakcja z pulą zarówno starterów Vα, jak i Vβ, a druga ze starterami adaptorowymi) dają produkt PCR, który można bezpośrednio sklonować do matrycowego wektora retrowirusowego. Ostateczny konstrukt TCR zakoduje, w pojedynczej otwartej ramce odczytu (ORF), ludzkie regiony zmiennych połączone z mysimi stałymi regionami połączonymi "samodzielną" sekwencją białkową, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)⁸. Sekwencja P2A była używana w wielu systemach i została gruntownie przetestowana specjalnie pod kątem wyrażenia TCRs^8,9,10,11. Chociaż po translacji większość sekwencji P2A pozostaje przyłączona do C-końca łańcucha alfa połączonego elastycznym łącznikiem, podczas gdy sekwencja sygnałowa łańcucha beta ma dodatkową prolinę, modyfikacja ta nie ma szkodliwego wpływu na funkcję TCR. Stały region myszy jest używany w konstrukcji zamiast ludzkiego, aby uniknąć potencjalnych zmienionych interakcji z dalszymi komponentami sygnalizacyjnymi po ponownej ekspresji w komórkach myszy. Pojedynczy ORF spowoduje stechiometryczne oddzielne wyrażenie łańcuchów alfa i beta^9,11. Obecny protokół opiera się na odczynnikach i podejściach, które są powszechnie dostępne, i został zaprojektowany tak, aby można go było wykonywać w sposób usprawniony i wydajny. Chociaż specjalnie użyliśmy tej techniki do oznaczania TCR z samoreaktywnych limfocytów T zaangażowanych w cukrzycę autoimmunologiczną, przewidujemy, że protokół ten może mieć szerokie zastosowanie do identyfikacji i oceny funkcjonalnej ludzkich TCR specyficznych dla epitopów autoimmunologicznych, epitopów raka lub odpowiedzi na patogeny i szczepionki.

Protokół

1. Zidentyfikuj interesującą populację limfocytów T.

UWAGA: Proliferacja specyficzna dla antygenu w połączeniu z barwnikiem podziału komórkowego (takim jak ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny, CFSE) może być wykorzystana do izolacji limfocytów T na podstawie ich proliferacji w odpowiedzi na stymulację antygenową. Jeśli zaczynasz od PBMCs, 7-dniowa ekspansja in vitro powinna wystarczyć do zidentyfikowania specyficznego dla antygenu CFSE low population¹².

1. Wymieszaj PBMC 1:1 z komórkami zasilającymi dopasowanymi do MHC i oznacz 5 μM barwnikiem podziału komórek CFSE.
2. Płytka 2-2,5 x 10⁵ komórek na basenie w 96-dołkowej płytce do hodowli okrągłodennej w 200 μl 10% FCS kompletnej pożywce RPMI.
   UWAGA: Complete RPMI zawiera 2 mM l-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 μM aminokwasów endogennych MEM, 5 mM HEPES, 5,5 × 10^{− 5} jednostek 2-merkaptoetanolu, 100 U ml^{− 1} penicyliny i 100 μg mL^{− 1} streptomycyny.
3. Stymuluj komórki antygenem peptydowym 25 μM.
4. W czwartym dniu hodowli ostrożnie usunąć i wymienić 100 μl pożywki.
   UWAGA: Bardziej optymalnym podejściem do identyfikacji limfocytów T specyficznych dla antygenu jest użycie tetramerów peptyd-HLA¹³. Barwienie tetramerami pozwala na jednoczesną ocenę swoistości antygenu, a także restrykcji HLA.

2. Ustaw sortowanie pojedynczych komórek.

1. Wykonuj wszystkie zabiegi w kapturze lub wyznaczonym miejscu wolnym od amplifikowanego szablonu. Podajcie odczynniki, aby uniknąć zanieczyszczenia, oczyść wszystkie powierzchnie robocze i, jeśli to możliwe, sprzęt 10% wybielaczem przed konfiguracją PCR. Używaj końcówek filtrujących, odczynników wolnych od RNAzy i DNAzy oraz tworzyw sztucznych na wszystkich etapach PCR i klonowania wektorów. Kluczowe odczynniki można znaleźć w Tabeli Materiałów.
   UWAGA: Reakcja multiplex PCR jest bardzo wrażliwa, a niski poziom zanieczyszczenia może spowodować amplifikację produktu.
2. Wygeneruj główną mieszaninę odwrotnej transkrypcji, łącząc 10-krotny bufor reakcyjny RT, 25-krotny DNTP, enzym 9 U RT, 0,01% inhibitora Triton-X, 0,7 U inhibitora RNAzy i 383 nM każdego startera RT-TCR (wymienionego w Tabeli 1) w sterylnym zbiorniku do pipetowania. Dla każdej płytki 96-dołkowej należy uzupełnić mieszaninę wzorcową wystarczającą do przeprowadzenia 10 dodatkowych reakcji (łącznie 106), aby skompensować utratę cieczy podczas pipetowania. Patrz Tabela 2 dla składników reakcji i ilości na studzienkę.
3. Przygotować 96-dołkową płytkę do pobierania PCR do sortowania komórek, pipetując 6 μl głównej mieszanki odwrotnej transkrypcji na studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej. Trzymaj talerz na lodzie lub w zimnym bloku.
4. Oznacz komórki przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórki (takim jak CD4 i CD3 lub CD8 i CD3, każdy w ilości 2 μg/ml, w połączeniu z barwnikiem podziału komórkowego lub barwieniem tetramerowym).
5. Sortuj limfocyty T po jednej komórce na studzienkę, pomijając dwunasty rząd, który posłuży jako kontrola ujemna.
   UWAGA: Wydajność sortowania będzie zależeć od precyzyjnego wyrównania płytki zbiorczej w uchwycie płytki, a także od utrzymania komórek i płytek w niskiej temperaturze przed reakcją cDNA. Płytki zbiorcze powinny być przechowywane na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem czasu sortowania, kiedy są zamocowane na płycie chłodzącej. Nie wszystkie sortowniki są wyposażone w uchwyt na talerze z regulacją temperatury; Jednak zdecydowanie zaleca się korzystanie z jednego z nich. Ponieważ sortowanie trwa zwykle około 10 - 15 minut na płytkę, istnieje zwiększony potencjał degradacji RNA, jeśli płytka nie jest utrzymywana w niskiej temperaturze.
6. Jako kontrolę pozytywną należy na tym etapie dodać większą liczbę komórek (100 komórek) ręcznie za pomocą pipety do jednego z dołków. Alternatywnie, wcześniej wyizolowane RNA z połączonych komórek można zastosować jako kontrolę pozytywną przy 10 ng na studzienkę.
   UWAGA: Pipeta oczyszcza kontrolne RNA z precyzją i starannością, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego innych studzienek i wyników fałszywie dodatnich.
7. Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną i wirować w temperaturze 1000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
8. Natychmiast transkrybuj RNA do cDNA, inkubując płytkę w temperaturze 25 °C przez 10 minut, 37 °C przez 45 minut i 85 °C przez 10 minut.
   UWAGA: Aby zapewnić skuteczną reakcję PCR, zaleca się, aby pierwsza reakcja PCR została wykonana tego samego dnia. Alternatywnie, transkrybowane płyty można przechowywać w temperaturze -80°C do 2 miesięcy.

3. Wykonaj PCR zagnieżdżony w multipleksie

UWAGA: Przygotuj wszystkie mieszanki wzorcowe w czystym miejscu wolnym od szablonów, aby uniknąć zanieczyszczenia.

1. Rozpuść każdy starter regionu zmiennego do 100 μM za pomocą_H2Owolnych od DNAzy i RNAz. Następnie połącz 20 μl każdego z 44 starterów, aby wygenerować pulę starterów V-alfa. Aby wygenerować pulę starterów V-beta, połącz 20 μl każdego z 40 starterów V-beta oraz 80 μl_H2O, wolnych od DNAzy i RNAzy. Sekwencje starterów są wymienione w tabeli 1. Po zebraniu stężenie każdego startera w mieszance wynosi 2,3 μM.
2. Rozpuść startery o stałym obszarze do 100 μM roztworu podstawowego za pomocą_H2O, wolnego od DNAzy i RNAz. Rozcieńczyć startery o stałym obszarze do 10 μM roztworu roboczego i podwielokrotności do użycia.
3. Przygotuj dwa oddzielne miksy główne do amplifikacji TCR-alpha i TCR-beta. Wygeneruj mieszanki główne, łącząc bufor 5X, 80 μM dNTP, 3% DMSO, pulę starterów 2 μM (końcowe stężenie 46 nM dla każdego startera), 200 nM starter odwrotny regionu TCR, polimerazę DNA 1 U oraz H_2Owolne od DNAzy i RNAzy (Tabela 2). Dla każdej płytki 96-dołkowej należy uzupełnić mieszaninę wzorcową wystarczającą do przeprowadzenia 10 dodatkowych reakcji (łącznie 106 reakcji), aby skompensować utratę cieczy podczas pipetowania.
   UWAGA: Obliczenia opierają się na końcowej objętości PCR wynoszącej 25 μl na studzienkę, gdzie 22,5 μl głównej mieszanki PCR łączy się z 2,5 μl matrycy cDNA.
4. Płytkę z cDNA należy przechowywać na lodzie lub w zimnym bloku. Za pomocą wielokanałowego pipetowania 22,5 μl reakcji TCR-beta do nowej 96-dołkowej płytki PCR. Następnie użyj wielokanałowego, aby przenieść 2,5 μl cDNA na płytkę PCR.
5. Za pomocą wielokanałowego pipetowania 22,5 μl reakcji TCR-alfa bezpośrednio do płytki zawierającej pozostałą część cDNA.
6. Uszczelnij płytki klejem, delikatnie zwiruj i wiruj w temperaturze 1000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
7. Przeprowadzić reakcję multipleksową PCR w następujących cyklach: 5 min w temperaturze 95 °C, a następnie 34 cykle po 20 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 54 °C i 1 min w temperaturze 72 °C, a następnie 7 min w temperaturze 72 °C.
8. Przeprowadzić zagnieżdżoną reakcję PCR w końcowej objętości 25 μl, używając 2,5 μl mieszaniny multiplex PCR jako matrycy.
   1. Rozpuść wewnętrzne i adaptorowe startery do 100 μM za pomocą_H2O, wolnych od DNAzy i RNAzy. Wykonać 10 μM podwielokrotności dla zapasu roboczego.
   2. Przygotuj dwa oddzielne miksy główne do amplifikacji TCR-alpha i TCR-beta. Wymieszaj 5X bufor, 25X DNTP, 3% DMSO, 200 nM starter adaptera do przodu, 200 nM starter zagnieżdżony do tyłu, polimerazę DNA 1 U oraz polimerazę DNA i H_2Owolną od nukleaz, aby uzyskać końcową objętość 22,5 μL (Tabela 2). Dla każdej płytki 96-dołkowej należy uzupełnić mieszaninę wzorcową wystarczającą do przeprowadzenia 10 dodatkowych reakcji (w sumie 106), aby skompensować utratę cieczy podczas pipetowania.
      UWAGA: W drugiej reakcji PCR należy użyć buforu 5X PCR zawierającego barwnik ładujący, aby ułatwić ładowanie żelu agarozowego.
   3. Za pomocą wielokanałowego pipetowania wzorca miesza się do reakcji TCR-alfa i TCR-beta w ilości 22,5 μl na studzienkę na dwie nowe 96-dołkowe płytki PCR.
   4. Dodać matrycę do reakcji multipleksowej PCR w ilości 2,5 μl na basenik.
      UWAGA: Pozostałą pierwszą reakcję PCR należy zapieczętować i przechowywać w temperaturze -20 °C, aby służyła jako źródło dodatkowej matrycy, jeśli zajdzie taka potrzeba (patrz krok 4.3 Uwaga).
   5. Uszczelnić płytki, delikatnie odwirować i wirować w temperaturze 1000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   6. Uruchomić zagnieżdżoną reakcję PCR w następujących cyklach: 5 min w 95 °C, a następnie 34 cykle po 20 s w 95 °C, 30 s w 56 °C i 1 min w 72 °C, a następnie 7 min w 72 °C.
   7. Przeprowadzić 5 μl końcowej reakcji na 1% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny (łącznie z studzienkami kontroli ujemnej i dodatniej).
      UWAGA: Oczekiwane pasmo powinno przebiegać przy wielkości około 500 pz. Przykładowa reakcja jest pokazana w Rysunek 2.
   8. Oczyścić pozostałą część drugiej reakcji (20 μl) za pomocą zestawu do oczyszczania PCR w formacie 96 dołków, eluować 15 μl 70 °C H₂O na basenik i przeprowadzić sekwencjonowanie Sangera. Do sekwencjonowania należy użyć odpowiedniego startera do przodu z adapterem TCR-alpha lub TCR-beta (Tabela 1).
      UWAGA: Sekwencje można analizować za pomocą dostępnego online oprogramowania immunogenetycznego.

4. Subklonowanie łańcuchów PCR alfa i beta.

UWAGA: Pula starterów do przodu użytych w pierwszej reakcji i starterów odwrotnych w drugiej reakcji PCR są używane do włączenia miejsc restrykcyjnych. W związku z tym uzyskane produkty PCR o łańcuchu alfa i beta są gotowe do sekwencyjnego subklonowania do matrycowego wektora retrowirusowego (Rysunek 1).

1. Trawić oczyszczone produkty PCR z reakcji zagnieżdżonej beta z BstbI i MfeI (Tabela 3).
   UWAGA: Nie przekraczać wkładki 5 μg.
2. Równolegle przetraw wektor szablonu za pomocą BstbI i MfeI (Tabela 3). Użyj 1-2 μg wektora szablonu na TCR. Uruchom strawiony wektor na żelu agarozowym i wyizoluj większe pasmo (~7500 pz). Oczyść wektor za pomocą zestawu do oczyszczania DNA w żelu.
   UWAGA: Podczas trawienia enzymu restrykcyjnego usuwany jest matrycowy mysi region zmienny TCR-beta, co pozwala na dodanie ludzkiego regionu zmiennej TCR-beta.
3. Oczyść strawione produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR.
   UWAGA: Sprawdź zdolność oczyszczania DNA kolumn wchodzących w skład zestawu; W razie potrzeby użyj kilku kolumn. Minimalna ilość oczyszczonej wkładki niezbędna do pomyślnej reakcji ligacji wynosi 50 ng przy minimalnym stężeniu 10 ng/μl. Jeśli oczyszczona ilość wkładki nie jest wystarczająca do pomyślnego podwiązania, można powtórzyć drugą reakcję PCR.
4. Traktować wektor matrycy enzymem 10 U przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aby zapobiec samoligacji, a następnie inaktywować ciepło przez 10 minut w temperaturze 75 °C. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (Tabela 3).
5. Ligacyjna wstawka i wektor TCR-beta za pomocą ligazy DNA w całkowitej objętości 20 μl przy 6 molowym nadmiarze wstawki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: W sumie reakcja ligacji powinna zawierać około 150 ng DNA (Tabela 3).
6. W celu przemian zmieszać 8 μl reakcji ligacji z 80 μl chemicznie kompetentnych komórek E.coli DH5α (tabela materiałów) i inkubować na lodzie przez 30 minut. Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 45 s. Dodać 500 μl bulionu Super Optimal z supresją katabolitu (S.O.C.) i wstrząsać przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C.
7. Umieść 250 μl kultury bakteryjnej na płytce agarowej zawierającej ampicylinę Lysogeny Bulion (LB). Inkubować płytkę przez noc (~16 h) w temperaturze 37 °C.
8. Następnego dnia zbierz kolonie bakterii i wyhoduj je w 3 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę przez noc. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu DNA.
9. Potwierdź pomyślne wprowadzenie łańcucha beta za pomocą testu na małą skalę z enzymami restrykcyjnymi BstbI i MfeI. W całkowitej objętości reakcyjnej 12 μl połącz 200-500 μg plazmidowego DNA, 0,25 μl każdego enzymu i 10-krotny bufor enzymatyczny (tabela 3). Przeprowadź reakcję na 1% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny, aby potwierdzić rozmiar wstęgi wkładki (~500 pz).
10. Po potwierdzeniu obecności wstawki, należy zsekwencjonować odcinek TCR-beta wektora za pomocą startera odwrotnego IRES (Tabela 1).
11. Po potwierdzeniu sekwencji wstawki TCR-beta wykonaj podobny proces insercji regionu zmiennej alfa. Trawić oczyszczone produkty PCR z reakcji zagnieżdżonej alfa i nowo wygenerowaną wstawkę TCR-beta zawierającą wektor, za pomocą SnaBI i SacII.
    UWAGA: Podczas trawienia enzymu restrykcyjnego usuwany jest matrycowy mysi region zmiennej TCR-alfa, co pozwala na dodanie ludzkiego regionu zmiennej TCR-alfa.
12. Insercje ligatowe alfa do wektorów TCR kodujących odpowiedni region zmiennej beta za pomocą ligazy DNA w całkowitej objętości 20 μl przy 6 molowym nadmiarze insertu przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W sumie reakcja ligacji powinna zawierać około 150 ng DNA (Tabela 3).
13. W przypadku przemian zmieszać 8 μl reakcji ligacji z 80 μl chemicznie kompetentnych komórek E.coli DH5α (tabela materiałów) i inkubować na lodzie przez 30 minut. Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 45 s. Dodać 500 μl pożywki S.O.C. i wstrząsać przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C.
14. Umieść 250 μl kultury bakteryjnej na płytce agarowej zawierającej ampicylinę Lysogeny Bulion (LB). Inkubować płytkę przez noc (~16 h) w temperaturze 37 °C.
15. Następnego dnia zbierz kolonie bakterii i wyhoduj je w 3 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę przez noc. Wyizoluj plazmidowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu DNA.
16. Potwierdź pomyślne wprowadzenie łańcucha alfa za pomocą testu na małą skalę z enzymami restrykcyjnymi SnaBI i SacII. W całkowitej objętości reakcyjnej 12 μl połącz 200-500 μg plazmidowego DNA, 0,25 μl każdego enzymu i 10x bufor enzymatyczny (tabela 3). Przeprowadź reakcję na 1% żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny, aby potwierdzić rozmiar wstęgi wkładki (~500 pz).
17. Po potwierdzeniu obecności wstawki, zsekwencjonuj przekrój TCR-alfa wektora za pomocą startera MSCV2-forward (Tabela 1).
18. Po walidacji sekwencji łańcucha alfa sprawdź pełną wstawkę TCR poprzez sekwencjonowanie za pomocą startera TCR-beta-reverse i IRES-reverse (Tabela 1).

5. Sprawdź ekspresję i specyficzność powierzchni komórki TCR.

Uwaga: HEK293T komórki są używane do testowania udanego parowania łańcucha TCR i ekspresji powierzchni komórki (Rysunek 3A)⁸. Barwienie tetramerem peptydowo-MHC można również przeprowadzić na transfekowanych komórkach HEK293T w celu zbadania zachowania swoistości antygenowej po izolacji genu TCR (Figura 3B).

1. Umieścić HEK293T komórek na 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych w proporcjach 1 x 10⁵ komórek na studzienkę w 1 ml kompletnej pożywce DMEM zawierającej 5% FCS i hodować przez noc w temperaturze 37 °C. Umieścić na płytkach wystarczającą liczbę komórek, aby mieć wyznaczone oddzielne studzienki dla każdego nowego TCR, szablon kontrolny wektor TCR, tylko wektor CD3, tylko kontrolny wektor TCR, i studnia nietransfekowana.
   UWAGA: Transfekcja z całkowicie mysim wektorem TCR szablonu (mTCR-pMIA) w połączeniu z wektorem mCD3εγδζ-pMIG, samym wektorem mTCR-pMIA i samym wektorem mCD3εγδζ-pMIG są używane jako kontrole dodatnie i negatywne.
   UWAGA: Complete DMEM zawiera 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 μM aminokwasów endogennych, 5 mM buforu HEPES, 5,5 x ^10-5 jednostek 2-merkaptoetanolu, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny.
2. Następnego dnia należy przetransfekować komórki 1 μg chimerycznym wektorem h/mTCR-pMIA, 1 μg mysim wektorem CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) i odczynnikiem do transfekcji na bazie liposomów zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Dla każdego TCR dodać 6 μl odczynnika do transfekcji do 100 μl DMEM o temperaturze pokojowej, bez surowicy. Krótko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
4. W oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml połącz 1 μg wektora TCR-pMIA z 1 μg mysim wektorem CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) lub 1 μg każdego wektora oddzielnie dla kontroli.
5. Kroplami dodawać odczynnik do transfekcji/roztwór DMEM do probówek zawierających wektor DNA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
6. Kroplami dodaj odczynnik do transfekcji/roztwór DMEM/DNA do komórek HEK293T. Delikatnie postukaj w płytkę, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
7. Po 24 godzinach wymień pożywkę i trzymaj komórki w hodowli przez dodatkowe 24 godziny.
8. Usunąć komórki z płytki przez energiczne pipetowanie i wybarwić komórki przeciwciałem anty-mysim CD3 (2,5 μg/ml) w celu sprawdzenia ekspresji powierzchniowej chimerycznego TCR za pomocą cytometrii przepływowej.
9. Aby porównać ekspresję CD3 między komórkami, które zostały transfekowane do podobnego poziomu, należy przeprowadzić analizę na komórkach wyrażających podobny wysoki poziom fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych (GFP dla kompleksu CD3 i ametryna dla wektora ekspresyjnego TCR). Optymalnie, analiza powinna być bramkowana na komórkach GFP+Ametrine+ o intensywności fluorescencji 10⁴ do 10⁵ (Rysunek 3A).
   UWAGA: Poziom ekspresji CD3 w komórkach transfekowanych konstruktem chimerycznym powinien być porównywalny z wektorem myszy kontrolnej (oryginalny szablon) (Rysunek 3A). Wygenerowane wektory retrowirusowe TCR są kompatybilne z systemami ekspresji in vivo, jak opisano wcześniej⁴.

Wyniki

Skuteczność reakcji PCR zagnieżdżonej w multipleksie jest sprawdzana w kroku 3.2.7 (Rysunek 2) poprzez wyczerpanie 5μL drugiej reakcji na żelu agarozowym. Średnio oczekuje się, że wydajność amplifikacji TCR-beta wyniesie około 80%, podczas gdy wydajność reakcji TCR-alfa jest zwykle niższa i wynosi około 50%⁴. Tylko sparowane łańcuchy TCR-alfa i TCR-beta mogą być używane do ekspresji TCR; jednak wszystkie produkty PCR można sekwencjonow...

Dyskusja

W obecnym protokole opisujemy skuteczną metodę amplifikacji TCR pojedynczej komórki, a następnie subklonowania sparowanych łańcuchów alfa i beta TCR do matrycowego wektora ekspresji retrowirusowej. Chociaż opracowano kilka protokołów PCR z pojedynczymi komórkami, żaden z nich do tej pory nie był kompatybilny z natychmiastowym subklonowaniem do wektora ekspresji. W większości przypadków amplifikowana jest częściowa sekwencja obejmująca wysoce zmienne regiony CDR3, z wystarczającą sekwencją, aby ekstrapolować region zmienn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Międzynarodowa Organizacja Inwestycyjna	eBionauka	65-0850-84	5 mM
anty-ludzki CD4 (OKT4) BV421	Biolegend	317433	2 mg/ml
anty-ludzkiego CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5	Biolegend	317336	2 mg/ml
anty-mysi CD3 AF647	Biolegend	100322	2,5 mg/ml
Rekombinowany inhibitor RNAzy biotech grd 2,5KU	VWR	97068-158	0,7 U
Zestaw RT cDNA o wysokiej pojemności	Invirtogen	4368814	9 U (enzym RT)
NF-H2O: Woda wolna od nukleaz 1000mL	Invirtogen	AM9932
Gotaq DNA polimeraza 2500U	VWR	PAM3008	1 U
96 Well Half Skirt PCR Plate	Phenix	MPX-96M2
MicroAmp Przezroczysta folia samoprzylepna	ThermoFisher
UltraPure Agaroza	Invirtogen	15510-027
SnaBI	Nowa Anglia Biolabs	R0130	15 U (wkładka) 30 U (wektor)
SacII	New England Biolabs	R0157	40 U (wkładka) 80 U (wektor)
MfeI	New England Biolabs	R3589S	40 U (wkładka) 80 U (wektor)
BstBI	New England Biolabs	R0519	40 U (wkładka) 80 U (wektor)
Fosfataza jelitowa cieląt ()	New England Biolabs	M0290S	10 U
Szybka ligaza	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	M2200S
Wizard Plus miniprzygotowuje systemy oczyszczania DNA	Promega	A1460
Wizard Plus midipreps systemy oczyszczania DNA	Promega	A7640-25
	Genesee Scientific	11-304C
ZR-96 Zestaw do czyszczenia i koncentratora DNA-5	Genesee Scientific	11-306A Zestaw do ekstrakcji
żelu QIAquick	Qiagen	28704
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	28104
Skuteczność subklonowania Kompetentne komórki DH5a	ThermoFisher
Odczynnik Transit LT-1 1mL (odczynnik do transfekcji)	Mirus
BD FACS Aria II (sorter)	BD
BD Fortessa (cytometr przepływowy)	BD