Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

Podsumowanie

Opisana jest prosta, ale skuteczna metoda, która wykorzystuje magnetyczne nanocząstki do wykrywania i wzbogacania komórek B reagujących na antygen do analizy funkcjonalnej i fenotypowej.

Streszczenie

Limfocyty B reagujące ze specyficznym antygenem zwykle występują z częstością <0,05% limfocytów. Przez dziesięciolecia naukowcy poszukiwali metod izolowania i wzbogacania tych rzadkich komórek do badań nad ich fenotypem i biologią. Podejścia te nieuchronnie opierają się na zasadzie, że limfocyty B rozpoznają natywny antygen dzięki receptorom na powierzchni komórki, które są reprezentatywne pod względem specyficzności przeciwciał, które ostatecznie zostaną wydzielane przez ich zróżnicowane córki. Być może najbardziej oczywistym podejściem do problemu jest użycie antygenów sprzężonych z fluorochromem w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS). Jednak użyteczność tych metod jest ograniczona przez częstotliwość komórek oraz osiągalną szybkość analizy i izolacji za pomocą sortowania elektronicznego. Opisano nowatorską metodę wzbogacania rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych, która skutkuje wysokowydajnym wzbogacaniem komórek B reagujących na antygen z dużych początkowych populacji komórek. Metoda ta umożliwia lepsze monitorowanie fenotypu i biologii komórek reagujących na antygen przed i po kontakcie z antygenem in vivo, np. po immunizacji lub w trakcie rozwoju autoimmunizacji.

Wprowadzenie

Analizy ograniczające rozcieńczenie częstotliwości prekursorów komórek wydzielających przeciwciała sugerują, że limfocyty B reagujące na określony antygen zazwyczaj występują z częstotliwością od 0,05 do 0,005% w normalnym repertuarze, w zależności od statusu szczepienia i wielkości/liczby epitopów obecnych na antygenie. Niska częstość występowania tych komórek utrudnia badanie zmian w ich statusie podczas rozwoju odpowiedzi immunologicznej, na przykład po szczepieniu lub ekspozycji na obcy antygen, lub podczas rozwoju autoimmunizacji. Wcześniej naukowcy podjęli się izolacji komórek B reagujących na antygen przy użyciu różnych technik, od płytek pokrytych antygenem lub adsorbentów kolumnowych, przez resetowanie czerwonych krwinek powlekanych antygenem, po sortowanie komórek aktywowane fluorescencją^1,2,3,4,5,6. Chociaż techniki te okazały się skuteczne w identyfikacji i izolacji limfocytów B reagujących na antygen, wyniki różniły się pod względem wydajności, czystości i skalowalności. Niedawno opracowaliśmy nowatorską metodę wykrywania i wzbogacania rzadkich subpopulacji limfocytów B za pomocą nanocząstek magnetycznych. Metoda umożliwia wzbogacenie z relatywnie wysoką wydajnością i czystością z dużych populacji wyjściowych i jest kompatybilna z analizą odpowiedzi na antygen. Wzbogacając populacje komórek w zawiesinie, metoda eliminuje ograniczenia związane z geometrią płytek lub kolumn pokrytych antygenem i ogranicza przepustowość. Wreszcie, ponieważ wzbogacone komórki pozostają związane z antygenem i fluorescencyjnym reporterem, można je dalej oczyszczać przez sortowanie FACS. Jak opisano w niniejszym dokumencie, zastosowaliśmy to podejście do badania limfocytów B reaktywnych na toksoidy tężca we krwi obwodowej przed i po immunizacji ludzi, a także komórek B reagujących na autoantygen od osób z różnymi zaburzeniami autoimmunologicznymi, w tym cukrzycą typu 1, chorobą Gravesa-Basedowa i chorobą Hashimoto⁷. Metoda działa równie dobrze u myszy, jak i u ludzi i jest kompatybilna z analizą komórek B reagujących na antygen z różnych tkanek (manuskrypt w przygotowaniu).

W swoim podstawowym formacie, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są najpierw inkubowane z antygenem biotynylowanym wraz z przeciwciałami przeciwko antygenom powierzchniowym komórek wymaganym do analizy fenotypowej. Po tym etapie znakowania następuje mycie i utrwalanie oraz dodanie streptawidyny sprzężonej z barwnikiem fluorescencyjnym dalekiej czerwieni w celu wykrycia komórek wiążących antygen biotynylowany (ryc. 1). Poprzednie badania zidentyfikowały limfocyty B specyficzne dla antygenu w podobny sposób, ale przy użyciu antygenów bezpośrednio sprzężonych z fluorochromem^8,9,10,11. Chociaż jest to godne uwagi podejście, stosowanie biotynylowanych antygenów w połączeniu ze streptawidyną umożliwia większe wzmocnienie sygnału (a tym samym lepsze różnicowanie komórek wiążących i niewiążących), szczególnie gdy antygeny są małe^12,13,14. Dodatkową kwestią jest stosowanie streptawidyny zamiast awidyny, ponieważ streptawidyna jest deglikozylowana, co zmniejsza niespecyficzne wiązanie. Ponadto używamy barwnika fluorescencyjnego dalekiej czerwieni jako fluorochromu ze względu na jego fotostabilność, wydajność kwantową (jasność) i mały rozmiar (~1,3 kD). Fluorochromy białkowe, takie jak fikoerytryna (~250 kD) i allofikocyjanina (~105 kD)¹⁵ nie są optymalne, ponieważ potencjalnie zawierają wiele epitopów antygenowych. Zastosowanie małego organicznego barwnika fluorescencyjnego składającego się z pojedynczego epitopu, takiego jak barwnik fluorescencyjny dalekiej czerwieni, zmniejsza złożoność izolowanej populacji komórek.

Po zaadsorbowaniu antygenu biotynylowego i barwnika streptawidyny barwnika dalekiej czerwonej fluorescencji, są one wzbogacane za pomocą nanocząsteczek magnetycznych sprzężonych z barwnikiem anty-dalekiej czerwieni. Pojedyncze nanocząstki nie są wykrywane przez większość cytometrów przepływowych i dlatego nie muszą być usuwane przed oczyszczeniem przez sortowanie FACS i dalsze testy¹⁶. Selekcja magnetyczna limfocytów B specyficznych dla antygenu wzbogaca badaną populację, eliminując czas i koszty sortowania rzadkich zdarzeń za pomocą cytometru przepływowego.

Poniżej pokazujemy reprezentatywne wyniki wzbogacenia komórek B specyficznych dla toksoidu tężcowego od osoby badanej przed i siedem dni po szczepieniu przypominającym toksoidem tężcowym. Wybraliśmy to konkretne zastosowanie jako przykład, aby zademonstrować zdolność tej metody do wzbogacania limfocytów B specyficznych dla antygenu po ostrej stymulacji in vivo. W połączeniu z cytometrią przepływową, metoda ta jest w stanie wzbogacić i zróżnicować specyficzne dla antygenu naiwne, pamięciowe i plazmablastowe limfocyty B oraz pozwala badaczowi śledzić zmiany ich częstości w czasie. Ponadto uwzględniamy inny możliwy test dalszy, np. test ELISPOT, który pokazuje, że komórki zachowują zdolność do wydzielania przeciwciał po wzbogaceniu. Innym zastosowaniem tej metody może być adoptywny transfer wzbogaconych komórek do gospodarza. Wcześniej wykazaliśmy, że komórki zachowują zdolność do działania jako komórki prezentujące antygen limfocytom T specyficznym dla antygenu po izolacji i transferze (dane nie pokazane). W związku z tym istnieje szereg możliwych dalszych testów, które można sprzęgnąć z metodą, co razem informuje o zrozumieniu odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla antygenu. Poniżej opisaliśmy metodę, w tym kontrole w celu określenia ogólnej wydajności, czystości, swoistości komórek i wzbogacenia fałdowania.

Protokół

1. Izolacja ludzkich PBMC

1. Pobrać 30-50 ml krwi za pomocą probówek do pobierania krwi w kolorze heparyny.
   UWAGA: Ilość użytej krwi zależy od konkretnego pytania eksperymentalnego i częstości występowania we krwi limfocytów B specyficznych dla antygenu. Heparynizowana krew może być natychmiast przetworzona lub delikatnie kołysana przez noc w temperaturze pokojowej w celu przetworzenia następnego dnia. Opóźnienie w przetwarzaniu ma bardzo mały wpływ na efektywność wzbogacania i wiąże się z minimalną utratą żywotności.
2. Wymieszaj krew pełną 1:1 ze sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) o temperaturze pokojowej (PBS).
3. Do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać 10 ml roztworu gradientu gęstości o temperaturze pokojowej. Otwarte butelki z gradientem gęstości przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C, ale przed użyciem ogrzać je do temperatury pokojowej.
4. Jeśli to możliwe, ustaw pistolet do pipet na wolne ustawienie i/lub zastosuj bardzo mały, ale stały nacisk na spust, aby powoli nałożyć 30-35 ml rozcieńczonej krwi na gradient gęstości, uważając, aby nie wymieszać tych dwóch.
   UWAGA: Przyłożenie końcówki pipety do krawędzi stożkowej pipety o pojemności 50 ml podczas dodawania rozcieńczonej krwi pomoże zapewnić stały, stały przepływ.
5. Wirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze 20 °C przy wyłączonym hamulcu.
6. Usuń górną warstwę, która zawiera osocze i płytki krwi, uważając, aby nie naruszyć warstwy komórek jednojądrzastych poniżej.
7. Za pomocą sterylnej pipety zebrać warstwę komórek jednojądrzastych (kożuch) i umieścić w oddzielnej sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 ml.
8. Dodać PBS do zawiesiny komórek w objętości 50 ml. Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C z hamulcem.
9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w 10 ml PBS. Policz komórki i określ żywotność za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
10. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu^10-7 komórek/ml i umieścić na lodzie, aż będą gotowe do dalszego przetwarzania.

2. Barwienie komórek

1. Usuń 1-2 x 10⁶ komórek dla każdej potrzebnej kompensacji fluorescencji/kontroli FMO, jeśli ma to zastosowanie. Odwirować pozostałe komórki przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z hamulcem.
2. Ponownie zawiesić komórki w sterylnym, przefiltrowanym, zimnym buforze FACS (PBS + 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 0,01% azydku sodu) w stężeniu 3-6 x 10⁷ komórek/ml (usunąć w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml). Upewnij się, że bufor FACS jest zimny i utrzymuj go na lodzie przez cały czas trwania procedury barwienia.
   1. Podziel populację komórek na ćwiartki (A-D) podczas optymalizacji testu. Użyj frakcji A do wzbogacenia komórek B specyficznych dla antygenu, użyj frakcji B i C, aby określić specyficzność wzbogacenia/barwienia (patrz 2.5 i 2.6 poniżej) i użyj frakcji D, aby określić częstość i liczbę komórek specyficznych dla antygenu w populacji niewzbogaconej, aby umożliwić obliczenie wydajności i wzbogacenia fałdowego.
3. Dodać ludzki odczynnik blokujący FcγR do frakcji A-D na lodzie, aby zapobiec wiązaniu przeciwciał z receptorami Fc.
   UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby uzyskać odpowiednie warunki.
4. Dodaj przeciwciała sprzężone z fluorochromem do antygenów powierzchniowych komórek interesujących frakcje A-D przez 30 minut na lodzie w ciemności, uważając, aby nie uwzględnić fluorochromów, które mogą reagować krzyżowo z przeciwciałami barwnika anty-dalekiej czerwieni fluorescencyjnej sprzężonymi z nanocząstkami magnetycznymi.
   UWAGA: Należą do nich koniugaty przeciwciał przeciwko barwnikowi fluorescencyjnemu bliskiej podczerwieni, Cy5, Cy5.5 i Cy7. Wszelkie dodane plamy żywotności powinny być zgodne z użyciem utrwalacza. Jeśli ktoś nie zamierza analizować komórek za pomocą FACS, ale określa częstotliwość wydzielania przeciwciał, na przykład za pomocą ELISPOT, barwienie powierzchni przeciwciałami nie jest konieczne.
5. Aby sprawdzić swoistość testu, inkubować frakcję B z wystarczającą ilością nieznakowanego antygenu przez 30 minut na lodzie, tak aby większość receptorów o powinowactwie co najmniej ^10-6 M była zablokowana.
   UWAGA: Zazwyczaj dobre stężenie początkowe to 50-100 krotne przekroczenie ilości antygenu uznanej za wystarczającą w 2,6 poniżej (np. 50-100 μM). Powinno to zablokować wiązanie się wszystkich komórek B o wysokim powinowactwie do nieznakowanego antygenu z antygenem biotynylowanym, który dodaje się w kroku 2.6 poniżej, umożliwiając w ten sposób potwierdzenie specyficzności wzbogaconych komórek. Ten krok można wykonać w połączeniu z krokiem 2.4 powyżej.
6. Dodać biotynylowany antygen do frakcji A, B i D. Inkubować na lodzie przez 30 min.
   UWAGA: Stężenie antygenu biotynylowanego należy miareczkować w celu określenia optymalnej ilości potrzebnej do zapewnienia odpowiedniego wykrywania i oddzielania komórek wiążących od niespecyficznych komórek postronnych. Zazwyczaj dobrym stężeniem początkowym do badania jest 1-5 μM.
   UWAGA: W przypadku ułamków A i D ten krok można wykonać równolegle z krokiem 2.4 powyżej. W przypadku frakcji B ten krok należy wykonać po kroku 2.5 (mycie między krokami nie jest konieczne).
7. Pomiń biotynylowany antygen z frakcji C w celu określenia jakiegokolwiek wiązania limfocytów B z innymi odczynnikami w protokole, takimi jak streptawidyna - barwnik fluorescencyjny dalekiej czerwieni i kulki magnetyczne.
8. Przepłukać komórki dwukrotnie przez zawieszenie komórek w 1 ml zimnego buforu FACS na 5 x 10⁷ komórek i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
9. Po ostatnim płukaniu rozcieńczyć skoncentrowaną zawiesinę komórkową w 1 ml 2% formaldehydu na 5 x 10⁷ komórek i pozostawić w ciemności na lodzie przez 5 min.
   UWAGA: Utrwalenie komórek w tym momencie zapewnia, że biotynylowany antygen pozostaje związany z BCR przez pozostałą część procedury. W przypadku komórek żywotnych – do dalszej analizy, takiej jak w przypadku ELISPOTs lub transferów adoptywnych, należy pominąć etap fiksacji.
10. Przemyć komórki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu FACS na 5 x 10⁷ komórek i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić w 1 ml zimnego buforu FACS na 5 x 10⁷ komórek.
11. Dodać 1-2 μg barwnika fluorescencyjnego streptawidyny dalekiej czerwieni/ml i inkubować na lodzie przez 20 minut w ciemności. Miareczkować ilość streptawidyny dla każdej aplikacji.
12. Umyć komórki dwukrotnie 1 ml zimnego buforu FACS na 5 x 10⁷ komórek i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przygotowanie frakcji D jest zakończone w tym momencie, ponieważ nie będzie ona ulegać wzbogacaniu za pomocą kulek magnetycznych.
    UWAGA: Ta próbka zostanie wykorzystana do określenia częstotliwości i liczby limfocytów B specyficznych dla antygenu w próbce. Zostanie to wykorzystane do określenia plonu i wzbogacenia fałdowego osiągniętego przez wzbogacenie.

3. Wzbogacanie oparte na nanocząstkach magnetycznych

1. Ponownie zawiesić komórki z próbek A-C w 1 ml zimnego buforu do separacji (PBS + 0,5% BSA + 2mM EDTA) na 5 x 10⁷ komórek i przepuścić przez filtr 40 μm w celu wyeliminowania wszelkich grudek, które mogłyby zatkać kolumnę.
2. Dodaj nanocząsteczki barwnika anty-cy5/anty-dalekiej czerwonej fluorescencji. Aby uzyskać optymalne wyniki, stężenie nanocząstek należy miareczkować dla każdego użycia, ale dobrym punktem wyjścia jest 50 μl zawiesiny na 5 x 10⁷ komórek/ml. Obracać w ciemności w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
3. Przemyć dwukrotnie 1 ml zimnego buforu rozdzielającego o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml zimnego buforu rozdzielającego na 5 x 10⁷ komórek.

4. Wzbogacanie magnetyczne za pomocą kolumn LS lub LD

1. Umieścić trzy kolumny LS lub LD w polu magnetycznym separatora magnetycznego i dodać 3 ml buforu separacyjnego w celu zwilżenia kolumn (patrz opis produktu, aby określić, który typ kolumny jest najbardziej odpowiedni). Pozwolić, aby wszystkie 3 ml przeszły przez kolumnę i wyrzucić po zebraniu.
   UWAGA: Chociaż separację komórek znakowanych nanocząstkami magnetycznymi można przeprowadzić za pomocą dowolnego z dostępnych na rynku urządzeń do separacji magnetycznej, laboratorium odniosło największy sukces przy użyciu kolumn LS pod względem wydajności, czystości i efektywności wzbogacania.
2. Umieścić pod kolumną trzy stożkowe probówki o pojemności 15 ml oznaczone jako "Frakcja A/(B)/(C) ujemna" dla ujemnie wybranych komórek. Dodaj komórki oznaczone cząstkami magnetycznymi do odpowiedniej kolumny i pozwól, aby cała objętość przeszła.
3. Na wierzch dodać 3 ml zimnego buforu do rozdzielania i pozostawić do przejścia przez kolumnę, a następnie powtórzyć z 2 ml. Zebrać ujemnie wybrane komórki i odłożyć na lód.
4. Usuń kolumnę z pola magnetycznego i umieść ją na stożkowej probówce o pojemności 15 ml oznaczonej jako "Frakcja A/(B)/(C) dodatnia", dla pozytywnie wybranych komórek.
5. Napełnić kolumnę do góry około 6 ml buforu separacyjnego i natychmiast zanurzyć tę objętość w kolumnie, aby zebrać komórki, które związały się z polem magnetycznym za pomocą dostarczonego tłoka.
6. Aby zwiększyć czystość, pozytywnie wybrane komórki można dodatkowo wzbogacić za pomocą drugiej czystej kolumny, powtarzając procedurę.
7. Wirować zarówno ujemo, jak i dodatnio wybrane frakcje w temperaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zawiesić w żądanej objętości końcowej. Kontynuuj dalszą analizę, taką jak FACS, ELISPOT lub transfer adopcyjny.

Wyniki

Analiza czystości, wydajności i stopnia wzbogacenia z wykorzystaniem cytometrii przepływowej

Populacje wzbogacone w opisany wyżej sposób nieuchronnie zawierają zanieczyszczone komórki, które nie związały streptawidyny z barwnikiem fluorescencyjnym w dalekiej czerwieni, lecz zostały uwięzione w matrycy. Zanieczyszczenia te można usunąć z wzbogaconych populacji za pomocą sortowania FACS. Aby oszacować czystość wzbogaconych populacji,...

Dyskusja

Tutaj opisujemy nowatorską metodę izolacji i wzbogacania limfocytów B wiążących antygen z ludzkiej krwi obwodowej. Metoda ta jest łatwo stosowana u myszy i innych tkanek, takich jak śledziona i węzły chłonne, i jest zgodna z analizą fenotypu i funkcji komórek po wzbogaceniu (manuskrypt w przygotowaniu).

Użytkownik powinien być świadomy wielu zmiennych, które mogą mieć wpływ na powodzenie tej procedury. Z doświadczenia wynika, że martwe komórki mają tendencję do przyklejania się do kulek magnet...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Antygen o zmiennej zmiennej co			najmniej 100 μ g do łatwego biotynylowania; jeśli używasz białka, spróbuj użyć białka, które zostało zatwierdzone przez ELISA. Musi to być przewoźnik  Nie zawiera białka.
Biotyna do etykietowania; np. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotyna	Thermo Scientific	21335	Biotyna jest dostępna w różnych preparatach, takich jak te zawierające  przekładki o różnej długości, więc rodzaj zastosowany powinien zostać określony przez badacza
Streptawidyna-Alexa Fluor 647	Invitrogen	S21374	Można uzyskać od innych dostawców.
Mikrogranulki Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647	Miltenyi Biotech	130-091-395
LS Kolumny	Miltenyi Biotech	130-042-401
Separatory ręczne MACS	Miltenyi Biotech	Zmienna
formaldehyd			Rozcieńczony do 2% z PBS; opcjonalnie, jeśli dalszy test wymaga żywych komórek
PBS bez wapnia i magnezu
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
Krew pełna w heparynizowanych probówkach
Bufor FACS (PBS + 1% BSA + 0,01% azydek sodu)
Bufor separacyjny (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA)
Probówki stożkowe 50 ml Probówki
	stożkowe 15 ml
1,5 ml probówki Eppendorfa
Marker powierzchniowy przeciwciała reaktywne, Fc Block, żywe/martwe barwienie dyskryminujące, w razie potrzeby
Zapasy ELISPOT, jeśli to konieczne