Method Article

Protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne Clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami

DOI:

10.3791/55383

⸱

May 25th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy Practice and Translational Research, University of Houston College of Pharmacy, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Houston

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczność antybiotyku jest najczęściej określana poprzez przeprowadzanie badań kinetycznych zabijania i pomiar jednostek tworzących kolonie (CFU). Integrując skaningową mikroskopię elektronową (SEM) z tymi standardowymi metodami, możemy rozróżnić efekty farmakologiczne leczenia między różnymi antybiotykami.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena działania antybiotyku przy opracowywaniu nowych leków skierowanych przeciwko bakteriom beztlenowym jest trudna i wymagająca technicznie. Aby uzyskać wgląd w możliwe MOA, zmiany morfologiczne związane z ekspozycją na antybiotyki można uwidocznić za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Integracja obrazowania SEM z tradycyjnymi krzywymi zabijania może poprawić nasz wgląd w działanie leków i przyspieszyć proces ich opracowywania. Aby przetestować tę przesłankę, przeprowadzono krzywe zabijania i badania SEM przy użyciu leków o znanym, ale różnym MOA (wankomycyna i metronidazol). Komórki C. difficile (R20291) hodowano z lub bez obecności antybiotyku przez okres do 48 godzin. W ciągu 48 godzin komórki pobierano w wielu punktach czasowych w celu określenia skuteczności antybiotyku i obrazowania na SEM. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, wankomycyna i metronidazol wykazywały znaczącą aktywność bakteriobójczą po 24 godzinach leczenia, mierzoną za pomocą zliczania jednostek tworzących kolonie (CFU). Korzystając z obrazowania SEM, ustaliliśmy, że metronidazol miał znaczący wpływ na długość komórek (> 50% zmniejszenie długości komórek dla każdego antybiotyku; P< 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną i wankomycyną. Chociaż odpowiedź fenotypowa na leczenie farmakologiczne nie została wcześniej udokumentowana w ten sposób, są one zgodne z MOA leku, co dowodzi wszechstronności i wiarygodności obrazowania i pomiarów oraz zastosowania tej techniki do innych związków eksperymentalnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile jest bakterią Gram-dodatnią, tworzącą przetrwalniki, powodującą około 500 000 infekcji rocznie w USA i jest uważana przez Centers for Disease Control and Prevention (CDC) za pilny patogen na poziomie zagrożenia, najwyższy poziom ryzyka. 1 W ciągu ostatniej dekady nastąpił znaczny rozwój leków przeciwdrobnoustrojowych o działaniu przeciwko C. difficile. 2,3 Badania in vitro są niezbędnym elementem procesu opracowywania leków. 4 Tradycyjnie, badania in vitro nad podatnością i zabijaniem czasu są wykorzystywa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolowanie C. difficile z różnych źródeł środowiskowych lub klinicznych

  1. Izolaty środowiskowe: Za pomocą wstępnie wysterylizowanego bawełnianego miernika (lekko zwilżonego 0,85% NaCl), przetrzyj powierzchnię dowolnego obszaru zainteresowania (podłoga, drzwi, klamka, półka itp.). 8 Upewnij się, że nosisz sterylne rękawiczki i umieść wacik w wysterylizowanej probówce po zakończeniu.
  2. Izolaty kliniczne (kał): Umieścić 10 do 100 mg klinicznych próbek kału na agarze cefcytyna-cykloseryna-fruktoza (CCFA) za pomocą pętli inokulacyjnej i inkubować w ścisłych warunkach beztlenowych przez 48 - 72 godzin. Przechowy....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile jest bakterią tworzącą przetrwalniki, dlatego ważne jest, aby określić różnice morfologiczne między komórkami wegetatywnymi i zarodnikowymi przed jakąkolwiek analizą funkcjonalną. Rycina 1 przedstawia reprezentatywne obrazy komórek wegetatywnych, które zostały przechwycone podczas wykładniczej fazy krzywej wzrostu i komórek przetrwalnikowych. Jak pokazano, komórki wegetatywne są długimi, gładkimi strukturami w kształcie pręcików, podczas gdy.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem obecnego badania było stworzenie wysokoprzepustowej metody izolowania C. difficile i badanie wrażliwości na antybiotyki przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) jako środka do dokładniejszej charakterystyki działania farmakologicznego antybiotyku. Korzystając z przedstawionych tutaj protokołów, wykazaliśmy, że obrazowanie fenotypowej odpowiedzi komórki na antybiotykoterapię może ujawnić wgląd w farmakologiczne działanie leku. W sumie obrazowanie w tym protokole trwa około 2 godzin po pobraniu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Firma KWG otrzymała wcześniejsze i obecne wsparcie badawcze od firm Merck & Co. i Summit, PLC.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te eksperymenty były wspierane przez granty badawcze od Merck and Co. i Summit, PLC.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
gaza bawełniana OpiekuńczyPRM21408C
NaClMacron7532
Probówki 50 mlFalcon352098
Napar z serca do mózgu (BHI) CriterionC5141
L-cysteinaAlfa AesarA10389
ekstrakt drożdżowyCriterionC741
taurocholan soduAlfaAesar A18346
komora beztlenowaCoywinylowa komora beztlenowa
agarowe fruktozowe (CCFA) SystemybeztlenoweAS-213
płytki agarowe z krwią DiagnostykaHardyA-10
OxoidDR1107AC. zestaw testowy diff
probówki mikrowirówkoweEppendorf222363204
PBSGibco10010-031
4% paraformaldehydSzkiełka50-259-98
J. Melvin uwolniony od marki7525M75 x 25mm
okap przepływowyLabconcoklasa II typ A2 Szafa bezpieczeństwa biologicznego
maszyna do napylania biurkaTaśma Denton VacuumDesk II
Plastikowy rdzeń05072-ABSPI Dwustronna taśma samoprzylepna
węglowa złotaDenton VacuumTAR001-01582.375" Średnica x .002"
Skaningowy mikroskop elektronowygrubą złotą folią FEIXL-30
płytki Odczynnik do aglutynacji lateksowej mikroskopowe Fisher Scientific z

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  2. Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Clostridium difficileScanning Electron MicroscopyAntibiotic TreatmentMorphological ChangesKill CurvesCell Length AnalysisCFU CountingAnaerobic CultureGold CoatingFiji Software

Related Articles