Protokół charakteryzujący zmiany morfologiczne Clostridium difficile w odpowiedzi na leczenie antybiotykami

Summary

Skuteczność antybiotyku jest najczęściej określana poprzez przeprowadzanie badań kinetycznych zabijania i pomiar jednostek tworzących kolonie (CFU). Integrując skaningową mikroskopię elektronową (SEM) z tymi standardowymi metodami, możemy rozróżnić efekty farmakologiczne leczenia między różnymi antybiotykami.

Abstract

Ocena działania antybiotyku przy opracowywaniu nowych leków skierowanych przeciwko bakteriom beztlenowym jest trudna i wymagająca technicznie. Aby uzyskać wgląd w możliwe MOA, zmiany morfologiczne związane z ekspozycją na antybiotyki można uwidocznić za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Integracja obrazowania SEM z tradycyjnymi krzywymi zabijania może poprawić nasz wgląd w działanie leków i przyspieszyć proces ich opracowywania. Aby przetestować tę przesłankę, przeprowadzono krzywe zabijania i badania SEM przy użyciu leków o znanym, ale różnym MOA (wankomycyna i metronidazol). Komórki C. difficile (R20291) hodowano z lub bez obecności antybiotyku przez okres do 48 godzin. W ciągu 48 godzin komórki pobierano w wielu punktach czasowych w celu określenia skuteczności antybiotyku i obrazowania na SEM. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, wankomycyna i metronidazol wykazywały znaczącą aktywność bakteriobójczą po 24 godzinach leczenia, mierzoną za pomocą zliczania jednostek tworzących kolonie (CFU). Korzystając z obrazowania SEM, ustaliliśmy, że metronidazol miał znaczący wpływ na długość komórek (> 50% zmniejszenie długości komórek dla każdego antybiotyku; P< 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną i wankomycyną. Chociaż odpowiedź fenotypowa na leczenie farmakologiczne nie została wcześniej udokumentowana w ten sposób, są one zgodne z MOA leku, co dowodzi wszechstronności i wiarygodności obrazowania i pomiarów oraz zastosowania tej techniki do innych związków eksperymentalnych.

Introduction

Clostridium difficile jest bakterią Gram-dodatnią, tworzącą przetrwalniki, powodującą około 500 000 infekcji rocznie w USA i jest uważana przez Centers for Disease Control and Prevention (CDC) za pilny patogen na poziomie zagrożenia, najwyższy poziom ryzyka. ¹ W ciągu ostatniej dekady nastąpił znaczny rozwój leków przeciwdrobnoustrojowych o działaniu przeciwko C. difficile. ^2,3 Badania in vitro są niezbędnym elementem procesu opracowywania leków. ⁴ Tradycyjnie, badania in vitro nad podatnością i zabijaniem czasu są wykorzystywane do walidacji przyszłych badań na zwierzętach i innych badaniach in vivo.

Chociaż te metody pełnią ważną rolę w ocenie działania zabijającego, nie rejestrują fenotypowej odpowiedzi komórek na leczenie farmakologiczne. Dzięki połączeniu skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) ze standardowymi badaniami kinetycznymi zabijania, możliwa jest dokładniejsza charakterystyka bezpośrednich skutków działania antybiotyku. ^5,6,7 Tutaj przedstawiamy metodę, w której SEM jest używany jako środek do profilowania skuteczności leczenia antybiotykami.

Protocol

1. Izolowanie C. difficile z różnych źródeł środowiskowych lub klinicznych

1. Izolaty środowiskowe: Za pomocą wstępnie wysterylizowanego bawełnianego miernika (lekko zwilżonego 0,85% NaCl), przetrzyj powierzchnię dowolnego obszaru zainteresowania (podłoga, drzwi, klamka, półka itp.). ⁸ Upewnij się, że nosisz sterylne rękawiczki i umieść wacik w wysterylizowanej probówce po zakończeniu.
2. Izolaty kliniczne (kał): Umieścić 10 do 100 mg klinicznych próbek kału na agarze cefcytyna-cykloseryna-fruktoza (CCFA) za pomocą pętli inokulacyjnej i inkubować w ścisłych warunkach beztlenowych przez 48 - 72 godzin. Przechowywać izolowane kolonie C. difficile w kriowialach w temperaturze -80 °C do dalszych analiz. ^7,9,10
3. Wzbogać próbki wymazów środowiskowych w bulionie do infuzji mózgu i serca (BHI) 0,05% taurocholanu sodu i umieścić w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C na 5 dni. Odwirować 1 ml kultury przy 10 000 x g i ponownie zawiesić osad w 100 μl etanolu.
4. Zawiesinę komórek (50 μl) należy umieścić na płytkach z agatorem fruktozowo-cykloserynowym (CCFA) i inkubować w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 40-48 godzin. Izolowane kolonie C. difficile należy przechowywać w kriowiach w temperaturze -80 °C do dalszych analiz.
5. Zbadać podejrzane kolonie C. difficile za pomocą odczynnika do aglutynacji lateksowej lub PCR.

2. Hodowla C. difficile i procedury kinetyki zabijania

1. Hodować oczyszczone, środowiskowe lub kliniczne szczepy C. difficile na płytkach z agarem z krwią w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
2. Pobrać jedną izolowaną kolonię z pętlą inokulacyjną, przenieść ją do 5 ml pożywki BHI w probówce o pojemności 15 ml i rosnąć przez 24 godziny w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C.
3. Rozcieńczyć kultury wstępne w stosunku 1:100 do około 10⁶ jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml w świeżym, wstępnie zredukowanym BHIS (BHI plus 5 g/l ekstraktu drożdżowego i 1% L-cysteiny) uzupełnionym 0,1% taurocholanu sodu i odpowiednim stężeniem antybiotyku (T0).
4. Pobrać 1 ml próbki za pomocą pipety w każdym punkcie czasowym (T0, T6, T24, T48) i rozprowadzić małą porcję (100 μl w rozcieńczeniach seryjnych) na płytce z agarem z krwią. Pozwól komórkom rosnąć na płytce z agarem z krwią przez 48 godzin w komorze beztlenowej w temperaturze 37 °C i policz otrzymaną liczbę kolonii w celu określenia CFU.

3. Przygotowanie próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej

1. Zebrać 1 ml komórek z każdego punktu czasowego w probówkach do mikrowirówek i odwirować przy 10 000 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant i przepłukać komórki w PBS.
2. Ponownie odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant. Ponownie rozcieńczyć komórki w 1 ml 4% paraformaldehydu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Ponownie odwirować próbki przez 10 minut przy 10 000 x g i odrzucić supernatant. Umyć komórki dwukrotnie wodą destylowaną i ponownie rozcieńczyć w 100 μl wody destylowanej. Dostosuj objętość w zależności od zmętnienia roztworu.
   UWAGA: Dobrym pomysłem jest wielokrotne seryjne rozcieńczenia.
4. Oznaczyć szkiełka nakrywkowe i dodać na nie 40 μl próbki. Inkubować przez 15 minut w okapie przepływowym, aby odparować ciecz i pozwolić komórkom przylgnąć do szkiełka nakrywkowego. Jeśli płyn jest nadal obecny, użyj dmuchawy, aby usunąć płyn.
5. Umieść oznaczone szkiełka nakrywkowe z komórkami w maszynie do napylania biurkowego i zaklej taśmą. Zabezpiecz czyste złoto w maszynie do napylania. Włącz maszynę i rozpocznij rozpylanie pod niskim ciśnieniem (50 mTorr). Powlekaj ogniwa przez 30 s przy 80 mA, co przekłada się na 20 nm złotej powłoki.
6. Przenieś powlekane komórki do skaningowego mikroskopu elektronowego.

4. Obrazowanie komórek C. difficile w skaningowym mikroskopie elektronowym

1. Prawidłowo odpowietrzyć skaningowy mikroskop elektronowy (SEM), naciskając przycisk odpowietrzania w oprogramowaniu komputerowym.
2. Za pomocą taśmy węglowej przymocuj powlekane szkiełka nakrywkowe do metalowej sceny. Po odpowietrzeniu SEM drzwi powinny się łatwo otworzyć. Zablokuj metalowy stolik w komorze SEM, przykręcając go.
3. Kliknij przycisk POMPA w oprogramowaniu komputerowym. SEM będzie można użyć, gdy system odczyta "Vac OK".
4. Kliknij detektor SE w zakładce detektory. Włącz wiązkę, klikając przycisk wyświetlający napięcie. Rozpocznij obrazowanie przy niższym napięciu (5 kV) przed zwiększeniem napięcia (do 15 kV). Po włączeniu wiązki pojawi się obraz.
5. Korzystając z funkcji śledzenia, znajdź obszar na powlekanych szkiełkach nakrywkowych, aby wykonać zdjęcie. Powiększ region i znajdź struktury w kształcie prętów; Są to Clostridium difficile.
6. Powiększ i ustaw ostrość obrazu, aby skalibrować system. Należy to zrobić w różnych odległościach roboczych: 15, 9 i 5 mm. Obraz w odległości roboczej 5 mm.
7. Włącz tryb obrazowania o ultrawysokiej rozdzielczości i zacznij ustawiać ostrość i optymalizować astygmatyzm.
8. Zacznij ustawiać ostrość przy dużym powiększeniu. Użyj do tego przełączników zgrubnej i precyzyjnej ostrości. Dostosuj również astygmatyzm, aby uzyskać wyraźniejszy obraz.
   1. Dostosuj astygmatyzm przy dużym powiększeniu. Aby to zrobić, wyreguluj przełączniki astygmatyzmu (wyglądają podobnie do przełączników ostrości drobnej/zgrubnej) i sprawdź klarowność obrazu, powiększając cyfrowo oprogramowanie komputerowe.
9. Wybierz funkcję powolnego skanowania, aby uzyskać obraz wysokiej jakości. Zapisz zebrany obraz jako plik . Plik TIFF, który będzie używany do analizy. Upewnij się, że pasek danych jest zaznaczony, jeśli pomiary będą wykonywane podczas analizy.
10. Zbieraj obrazy pod różnymi kątami (do 52°), ręcznie obracając kąt bezpośrednio na SEM. Obrazy ustawione pod kątem zwykle ujawniają więcej informacji o głębi
.
11. Zmień napięcie wiązki w zależności od komórek, które są obrazowane. Utrzymuj go głównie w zakresie 5 - 15 kV dla wszystkich eksperymentów.
12. Po zakończeniu obrazowania wyłącz wiązkę i zwiększ odległość roboczą do 20 mm. Komora może być następnie odpowietrzona, a stolik może zostać usunięty. Skopiuj wszystkie obrazy na dysk w celu dalszej analizy.

5. Przetwarzanie i analiza obrazu

1. Pobierz i zainstaluj na komputerze bezpłatnie dostępne oprogramowanie FIJI (http://fiji.sc).
2. Otwórz plik obrazu na FIDŻI.
3. Korzystając z funkcji linii, precyzyjnie prześledź podziałkę liniową.
4. Kliknij zakładkę Analizuj w programie FIJI i na koniec wybierz funkcję Select Scale. Pojawi się okno, które będzie wymagało ustawienia znanej odległości na podstawie podziałki. Zmień również jednostkę długości i kliknij przycisk OK.
5. Teraz, gdy program jest skalibrowany pod kątem odległości, użyj funkcji linii, aby zmierzyć długość komórki. Aby uzyskać długość, użyj funkcji linii, aby prześledzić komórkę w całości. Wybierz ponownie kartę Analizuj, a następnie kliknij pozycję Zmierz. Długość powinna pojawić się w jednostkach oznaczonych wcześniej.

Results

Clostridium difficile jest bakterią tworzącą przetrwalniki, dlatego ważne jest, aby określić różnice morfologiczne między komórkami wegetatywnymi i zarodnikowymi przed jakąkolwiek analizą funkcjonalną. Rycina 1 przedstawia reprezentatywne obrazy komórek wegetatywnych, które zostały przechwycone podczas wykładniczej fazy krzywej wzrostu i komórek przetrwalnikowych. Jak pokazano, komórki wegetatywne są długimi, gładkimi strukturami w kształcie pręcików, podczas gdy...

Discussion

Celem obecnego badania było stworzenie wysokoprzepustowej metody izolowania C. difficile i badanie wrażliwości na antybiotyki przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) jako środka do dokładniejszej charakterystyki działania farmakologicznego antybiotyku. Korzystając z przedstawionych tutaj protokołów, wykazaliśmy, że obrazowanie fenotypowej odpowiedzi komórki na antybiotykoterapię może ujawnić wgląd w farmakologiczne działanie leku. W sumie obrazowanie w tym protokole trwa około 2 godzin po pobraniu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
gaza bawełniana	Opiekuńczy	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
Probówki 50 ml	Falcon	352098
Napar z serca do mózgu (BHI)	Criterion	C5141
L-cysteina	Alfa Aesar	A10389
ekstrakt drożdżowy	Criterion	C741
taurocholan sodu	Alfa	Aesar A18346
komora beztlenowa	Coy		winylowa komora beztlenowa
agarowe fruktozowe (CCFA) Systemy	beztlenowe	AS-213
płytki agarowe z krwią Diagnostyka	Hardy	A-10
	Oxoid	DR1107A	C. zestaw testowy diff
probówki mikrowirówkowe	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% paraformaldehyd	Szkiełka	50-259-98
	J. Melvin uwolniony od marki	7525M	75 x 25mm
okap przepływowy	Labconco	klasa II typ A2	Szafa bezpieczeństwa biologicznego
maszyna do napylania biurka	Taśma Denton Vacuum	Desk II
	Plastikowy rdzeń	05072-AB	SPI Dwustronna taśma samoprzylepna
węglowa złota	Denton Vacuum	TAR001-0158	2.375" Średnica x .002"
Skaningowy mikroskop elektronowy	grubą złotą folią FEI	XL-30