Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekspresja cytokin egzogennych w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjentów poprzez wstrzyknięcie linii komórek zrębu transdukowanej cytokiną

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55384

⸱

10 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Human Anatomy, Loma Linda University, 2Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 3Department of Medicine, Loma Linda University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana tutaj jest metoda wytwarzania egzogennej cytokiny u myszy z ksenoprzeszczepem pochodzącym od pacjenta (PDX) poprzez cotygodniowe dootrzewnowe wstrzykiwanie linii komórek zrębu transdukowanej cytokinami. Metoda ta rozszerza użyteczność PDX i zapewnia opcję przejściowego lub trwałego dostarczania cytokin egzogennych w wielu modelach PDX.

Streszczenie

Myszy ksenoprzeszczepowe (PDX) pochodzące od pacjentów są produkowane przez przeszczepianie komórek ludzkich myszom z niedoborem odporności. Modele te są ważnym narzędziem do badania mechanizmów prawidłowej i złośliwej hematopoezy i są złotym standardem w identyfikacji skutecznych chemioterapii wielu nowotworów złośliwych. Modele PDX są możliwe, ponieważ wiele cytokin myszy działa również na komórki ludzkie. Nie dotyczy to jednak wszystkich cytokin, w tym wielu, które mają kluczowe znaczenie dla badania prawidłowej i złośliwej hematopoezy w komórkach ludzkich. Techniki, które pozwalają myszom wytwarzać ludzkie cytokiny (modele transgeniczne i knock-in) wymagają znacznych kosztów, zanim zostanie wykazana przydatność modelu. Inne techniki są pracochłonne (wstrzyknięcie rekombinowanej cytokiny lub lentiwirusa), a w niektórych przypadkach wymagają wysokiego poziomu wiedzy technicznej (hydrodynamiczne wstrzykiwanie DNA). W tym raporcie opisano prostą metodę generowania myszy PDX, które mają egzogenną ludzką cytokinę (TSLP, limfopoetynę zrębu grasicy) poprzez cotygodniowe dootrzewnowe wstrzyknięcie zrębu, który został transdukowany w celu nadekspresji tej cytokiny. Zastosowanie tej metody zapewnia źródło in vivo ciągłej produkcji cytokin, która osiąga fizjologiczne poziomy krążącej ludzkiej cytokiny u myszy. Poziomy ludzkiej cytokiny w osoczu mogą być zmieniane w zależności od liczby wstrzykniętych komórek zrębu, a produkcję cytokin można rozpocząć w dowolnym momencie eksperymentu. Metoda ta obejmuje również myszy kontrolne z cytokinami ujemnymi, które są podobnie produkowane, ale poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie zrębu transdukowanego wektorem kontrolnym. Wcześniej wykazaliśmy, że komórki białaczkowe zebrane z PDX eksprymującego TSLP, w porównaniu z kontrolnym PDX, wykazują wzorzec ekspresji genów bardziej podobny do oryginalnej próbki pacjenta. Razem myszy PDX wytwarzające cytokiny i ujemne pod względem cytokin wyprodukowane tą metodą stanowią system modelowy, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do badania roli TSLP w prawidłowej i złośliwej hematopoezie.

Wprowadzenie

Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) stanowią potężny model in vivo do badania produkcji prawidłowych i złośliwych komórek krwiotwórczych w „rodzimym” środowisku ssaków. Najczęściej PDX są tworzone poprzez wstrzykiwanie lub przeszczepianie ludzkich komórek do myszy z niedoborem odporności. Tworzenie PDX z wykorzystaniem prawidłowych ludzkich komórek macierzystych krwiotwórczych umożliwia badania in vivo rozwoju prawidłowych ludzkich komórek krwi i komórek odpornościowych. PDX wytworzone z komórek białaczkowych lub innych komórek nowotworowych pozwalają na badanie mechanizmów onkogennych oraz identyfikację skutecznych terapii w kontekście różnorodności krajobrazów genetycznych i mutacji występujących w populacji ludzkiej.1 W konsekwencji PDX są obecnie złotym standardem w translacyjnych badaniach biomedycznych służących identyfikacji skutecznych terapii oraz ważnym narzędziem do zrozumienia mechanizmów progresji nowotworów. Modele PDX są niezbędnym narzędziem wspomagającym badania nad chorobami wynikającymi z nierówności zdrowotnych spowodowanych specyficznymi uszkodzeniami genetycznymi lub każdą chorobą, w której wariacje krajobrazu genetycznego pacjenta mogą w znacznym stopniu przyczyniać się do onkogenezy i wyniku leczenia.

Modele PDX myszo-ludzkie są możliwe dzięki temu, że wiele cytokin mysich w stopniu wystarczającym naśladuje swoje ludzkie odpowiedniki w aktywacji receptorów cytokinowych ludzkich komórek podczas ich przebywania w organizmie myszy. Na przykład interleukina-7 (IL-7) dostarcza krytycznego sygnału dla rozwoju ludzkich limfocytów B.2 W tym przypadku mysia IL-7 wykazuje wystarczającą homologię z ludzką IL-7, aby cytokina mysia stymulowała szlaki sygnalizacyjne w ludzkich prekursorach limfocytów B.2,3,4 Nie dotyczy to jednak limfopoetyny stroma lneiej grasicy (TSLP),5,6 która wraz z innymi cytokinami (IL-3, czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów (GM-CSF), czynnik wzrostu komórek macierzystych (SCF),7 jest ważna dla produkcji prawidłowych i nowotworowych ludzkich komórek krwiotwórczych. Gdy cytokiny mysie i ludzkie wykazują niską homologię, cytokiny mysie nie aktywują odpowiednich receptorów na ludzkich komórkach. Aby pokonać tę przeszkodę, zastosowano szereg strategii w celu zaprojektowania ekspresji ludzkich cytokin w myszach PDX. Obejmują one wstrzykiwanie rekombinowanych ludzkich cytokin, wstrzykiwanie hydrodynamiczne DNA, ekspresję lentiwirusową, ekspresję transgeniczną oraz zastąpienie genu metodą knockin.7 Niniejszy raport opisuje metodę modyfikacji PDX w celu produkcji ludzkiej cytokiny poprzez stroma-pośrednią dostawę cytokin (Rysunek 1).

W zaprezentowanej tutaj metodzie myszy PDX są modyfikowane tak, aby ekspresować ludzką cytokinę TSLP lub służyć jako kontrole negatywne pod względem cytokin. PDX ekspresujące TSLP uzyskuje się poprzez cotygodniowe iniekcje dootrzewnowe komórek zrębu, które zostały przetransdukowane w celu ekspresji wysokich poziomów ludzkiej TSLP. Myszy „kontrolne” PDX negatywne pod względem cytokin są modyfikowane w podobny sposób, przy czym zrąb kontrolny jest transdukowany wektorem kontrolnym. Metoda ta pozwala na osiągnięcie normalnych fizjologicznych poziomów ludzkiej TSLP w myszach PDX, którym wstrzyknięto zrąb TSLP+. W myszach PDX otrzymujących zrąb negatywny pod względem cytokin nie obserwuje się wykrywalnej TSLP. Do naszych badań wybraliśmy ludzką linię komórek zrębu HS-27A, ponieważ rośnie ona intensywnie w hodowli i wykazuje bardzo niski poziom produkcji cytokin, który nie wspiera proliferacji izolowanych komórek progenitorowych w kokulturach.8 W celu ekspresji ludzkiej TSLP zrąb został przetransdukowany zaawansowanym wektorem lentiwirusowym samoartefakcyjnym, pochodzącym z wcześniej opisanego szkieletu,9 zawierającym element cPPT/cts oraz posttranskrypcyjny element regulacyjny wirusa zapalenia wątroby świstaka (WPRE) w celu zwiększenia ekspresji transgenu. Gen ludzkiej TSLP został wprowadzony do tego wektora pod kontrolą promotora alfa czynnika elongacyjnego-1 (EF-1), aby uzyskać silną, konstytutywną i długotrwałą ekspresję.

Konstrukcja tego modelu PDX z wzmocnioną produkcją ludzkich cytokin składa się z 4 głównych etapów. Po pierwsze, przetransdukowane zręby są namnażane in vitro i oceniane za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) pod kątem stabilnej, wysokiej produkcji cytokin. Po drugie, aktywność ludzkiej cytokiny produkowanej przez przetransdukowane komórki zrębu (oraz brak aktywności cytokin w zrębie kontrolnym) jest weryfikowana za pomocą cytometrii przepływowej z pomiarem fosforylacji (phospho-flow). Linie komórkowe znane z odpowiedzi na badaną cytokinę (w tym przypadku TSLP) są inkubowane z nadsączem komórek zrębu, a następnie poddawane analizie pod kątem indukowanej cytokiną fosforylacji. Po trzecie, myszom wstrzykuje się przetransdukowany ludzki zrąb, a następnie w osoczu myszy co tydzień ocenia się poziom ludzkiej cytokiny za pomocą testu ELISA. Po czwarte, przeszczepia się ludzkie komórki hematopoetyczne i ocenia efekty funkcjonalne ludzkiej cytokiny in vivo na znanym celu (np. populacji komórek).

Schemat ludzko-mysiego modelu białaczki; tworzenie PDX, monitorowanie cytokin, proces pozyskiwania komórek.
Rysunek 1: Model PDX zaprojektowany do produkcji egzogennej ludzkiej cytokiny u myszy. (1A) Zaplanowanie eksperymentu i pozyskanie transdukowanych ludzkich komórek zrębu (1B) Pozyskanie ludzkich komórek (hematopoetycznych komórek macierzystych, komórek białaczkowych, itp.) w celu generowania myszy PDX (ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta). (2A) Iniekcja zmodyfikowanego zrębu i (2B) przeszczepienie ludzkich komórek do myszy z niedoborem odporności zgodnie z harmonogramem eksperymentalnym. (3A-B) Monitorowanie stężeń cytokin w nadsączu zrębu oraz w osoczu myszy za pomocą testu ELISA. (4) Pozyskanie ludzkich komórek i ocena funkcjonalnych efektów in vivo ludzkiej cytokiny obecnej w PDX. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostarczanie ludzkich cytokin via komórki zrębu oferuje zarówno zalety, jak i wady w porównaniu z innymi metodami dostarczania/produkcji ludzkich cytokin w myszach PDX.7 W porównaniu z wstrzykiwaniem rekombinowanej ludzkiej cytokiny, dostarczanie za pośrednictwem zrębu jest zazwyczaj mniej kosztowne (koszt hodowli komórek zrębu jest niższy niż koszt rekombinowanej cytokiny) i mniej pracochłonne (jedno wstrzyknięcie na tydzień w przeciwieństwie do wielu wstrzyknięć na tydzień). Problem krótkiego okresu półtrwania cytokiny jest również ograniczony, ponieważ zrąb stale produkuje egzogenną cytokinę. Dostarczanie cytokiny via hydrodynamiczne wstrzykiwanie DNA może być mniej kosztowne niż dostarczanie via zrąb. Jest ono jednak podobnie przejściowe i może wymagać większych umiejętności technicznych niż proste cotygodniowe wstrzyknięcie doszprytnewe wymagane przy dostarczaniu za pośrednictwem zrębu. Lentiwirusowa ekspresja genów u myszy może zapewnić mniej przejściową metodę dostarczania cytokin; jednak w naszych badaniach nie osiągnięto fizjologicznych poziomów TSLP. Dodatkowo metoda ta jest pracochłonna, gdyż wymaga ciągłej produkcji wektora lentiwirusowego. Myszy transgeniczne lub knock-in oferują stabilną, długoterminową ekspresję cytokiny i mogą być modyfikowane w celu uzyskania ekspresji specyficznej dla tkanki, co może być zaletą. Z drugiej strony, transgeniczna ekspresja ludzkiego genu cytokiny na tle myszy z niedoborem odporności, wymaganym dla myszy PDX, wiąże się z ogromnymi nakładami zasobów, zanim wartość modelu zostanie ustalona. Co więcej, modele transgeniczne zazwyczaj nie pozwalają na możliwość zmiany czasu rozpoczęcia podaży cytokiny lub poziomu produkcji cytokiny in vivo. Można to osiągnąć w przypadku dostarczania za pośrednictwem zrębu, po prostu zmieniając punkt czasowy rozpoczęcia wstrzykiwania komórek zrębu lub dawkę wstrzykiwanych komórek zrębu.

Opisana tutaj metoda dostarczania cytokin za pośrednictwem komórek zrębu została wykorzystana do opracowania modelu PDX w celu oceny roli TSLP w prawidłowym rozwoju ludzkich limfocytów B4,6 oraz w ostrej białaczkowej białaczce limfoblastycznej z komórek B wysokiego ryzyka.6 Metoda ta stanowi alternatywny sposób dostarczania cytokin do generowania podobnych modeli z wykorzystaniem innych ludzkich cytokin niż TSLP. Model ten może być również przydatny do uzyskania wstępnych danych, które pomogą określić, czy wartość transgenicznego modelu PDX z cytokiną lub modelu PDX z knock-in cytokiny uzasadniałaby znaczne nakłady czasu i pieniędzy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Institutional Review Board (IRB) oraz zgodnie ze wszystkimi wytycznymi federalnymi.

UWAGA: PDX i ludzkie tkanki powinny być traktowane zgodnie z procedurami bezpieczeństwa, aby zapobiec przenoszeniu patogenów przenoszonych przez krew.

1. Hodowla i ekspansja komórek zrębowych transdukowanych cytokinami

UWAGA: Za każdym razem, gdy zrąb jest pasażowany, zbierz supernatant kultury (1 ml podwielokrotności) i przechowuj w temperaturze -80 °C do przyszłej kwantyfikacji poziomu cytokin za pomocą testu ELISA.

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną R10 i pożywkę do zamrażania zgodnie z opisem w tabeli materiałów.
  2. Generate10,11 lub uzyskać zrąb kontrolny (transdukowany pustym wektorem) i zręb wytwarzający cytokiny (TSLP+). 6 Przechowywać w ciekłym azocie (LN2) do momentu użycia. Rozmrozić komórki zrębu zgodnie z opisem12 i umieścić je w 5 ml pożywki R10 w oddzielnych kolbach do hodowli komórek T-25. Hodowla komórek w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . Jest to po-odwilżowe "przejście #1".
  3. Gdy zrąb zlewa się (24-48 godzin), pasażuj komórki przez trypsynizację za pomocą 1× trypsyny EDTA (0,25%) i ponowne posiew w kolbie hodowlanej T-150. Jest to poodwilżowe "przejście #2".
  4. Gdy zrąb osiągnie zbieg w kolbach T-150 (3-4 dni później), przejdźcie komórki przez trypsynizację. Użyj tej zawiesiny komórkowej do celów eksperymentalnych.
    1. Ekspansja komórek do wielu kolb
      1. Podziel zebrane komórki między trzy kolby T-150 i hoduj aż do zlewania się. Powtórz ten krok, jeśli konieczne jest rozszerzenie zrębu. Typowa liczba komórek zrębu ludzkiego (HS-27A) przy zbieganiu w kolbie T-150 wynosi ~5 x 106.
    2. Pamięć komórkowa
      1. Przenieść zawiesinę pobranych komórek do stożkowej probówki i odwirować przy 500 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce zamrażającej. Zamrozić i przechowywać w LN2 ~ 1,5 x 106 komórek w fiolce.
    3. W przypadku wstrzyknięć do zrębu okołookoleniowego u myszy przejdź do kroku 4.1.

2. Testy ELISA do monitorowania produkcji cytokin in vitro z transdukowanego zrębu

  1. Kup dostępny na rynku zestaw testowy ELISA, aby wykryć interesującą Cię cytokinę.
  2. Rozmrozić supernatant komórek zrębu z zrębu kontrolnego i wytwarzającego cytokiny (TSLP+) zebranego we wczesnym, środkowym i późnym pasażu (ryc. 2).
  3. Oznaczyć stężenie TSLP w próbkach sklarowanych nad osadem za pomocą zestawu ELISA zgodnie z instrukcją producenta. 13 Skompiluj te dane szeregowe, aby monitorować stabilność produkcji cytokin podczas hodowli komórkowej (Rysunek 2A-B).
    1. Zidentyfikuj i odrzuć zrąb wytwarzający cytokiny ze zmniejszoną lub nieoptymalną ekspresją cytokin, a także wszelkie odpowiadające im fiolki w magazynie (Figura 2A-B).
    2. Zidentyfikuj i utrzymuj zrąb wytwarzający cytokiny, który wykazuje stabilne, wysokie stężenie cytokin. Użyj tych odwilży do eksperymentów.
  4. Użyj zestawu ELISA do rutynowego monitorowania zrębu przez cały czas trwania hodowli komórkowej (co najmniej 1 raz podczas wczesnego, środkowego i późnego pasażu po rozmrożeniu), aby zapewnić stabilną produkcję cytokin lub, w przypadku zrębu kontrolnego, brak produkcji cytokin
    5. .

3. Testy cytometrii fosfoprzepływowej do oceny aktywności cytokin wytwarzanych przez zrąb

UWAGA: Oceń supernatant z zmodyfikowanego zrębu przed pierwszym eksperymentem, aby zweryfikować odpowiednią bioaktywność cytokiny generowanej przez zrąb dla indywidualnego eksperymentu. 6 Po walidacji zrębu inżynieryjnego, dalsze testy nie są konieczne, chyba że zostaną wprowadzone zręby, które zostały wyprodukowane z nowym wektorem.

  1. Zakup linii komórkowych białaczki MUTZ5 i/lub MHH-CALL4 (reagujących na TSLP), rekombinowaną cytokinę ludzką 14 oraz przeciwciała zatwierdzone do stosowania w testach cytometrii fosfoprzepływowej w celu wykrycia odpowiednich celów fosforylacji w dalszej części strumienia.
  2. Rozmrozić zebrany supernatant z zrębu kontrolnego i eksprymującego cytokiny.
  3. Płytkie linie komórkowe białaczki w pożywce R20 (patrz tabela materiałów) w stężeniu 0,2 x 106 komórek na studzienkę na 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Płytka 3 dołki na warunek, aby umożliwić trzykrotne testy. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Czas ten pozwala na utratę fosforylacji, która wystąpiła w poprzednich warunkach hodowli.
    UWAGA: 12 dołków na linię komórkową zapewnia potrójne testy dla każdego warunku eksperymentalnego pokazanego w kroku 3.4.
  4. Po 2 godzinach spędzonych w hodowli, przenieść komórki z każdej studzienki do oddzielnych probówek o pojemności 4 ml i odwirować przy 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant.
    1. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl dla każdego z następujących warunków doświadczalnych (wykonać testy w trzech powtórzeniach): 1) tylko pożywka kontroli ujemnej, 2) pożywka kontroli dodatniej z rekombinowaną cytokiną w stężeniu (stężeniach) nasycającym (TSLP przy 15 ng/ml itp.), 3) supernatant zrębu kontrolnego ze zrębu kontrolnego i 4) supernatant zrębu cytokiny ze zrębu wytwarzającego cytokiny.
  5. Inkubować komórki przez czas określony w specyficznym komercyjnym teście fosfologicznym (np. 30 minut dla fosfo-STAT5 w MUTZ5 lub MHH-CALL4 w odpowiedzi na TSLP).
  6. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i zdekantować supernatant.
  7. Wykonaj barwienie metodą fosfoprzepływowej cytometrii zgodnie z protokołem producenta i zbierz dane z cytometrii przepływowej. 15
  8. Analizuj dane cytometrii przepływowej.15
    1. Bramka na nienaruszonych komórkach w oparciu o rozproszenie światła do przodu (FSC, wskazuje rozmiar komórki) i z boku (SSC, wskazuje ziarnistość komórki).
    2. Określić medianę intensywności fluorescencji (MFI) nienaruszonych komórek w każdej próbce. Porównaj średnią MFI uzyskaną z potrójnych wartości supernatantu komórek zrębu z wartościami dodatnich i ujemnych pożywek.

4. Wstrzykiwanie myszom zrębu transdukowanego cytokinami

UWAGA: Posiewaj zręb HS-27A przez minimum 3 pasaże po rozmrożeniu przed wstrzyknięciem go myszom, aby zapewnić zdrowe komórki i odpowiednią produkcję cytokin.

  1. Przygotowanie zrębu
    1. Przenieść pobraną zawiesinę komórek zrębu do stożkowej probówki i podać podwielokrotność 10 μl do zliczania hemocytometrów; uzyskać liczbę żywych komórek za pomocą błękitu trypanowego. 16 Odwiruj pozostałą zawiesinę komórkową o stężeniu 500 x g przez 5 minut.
    2. Odessać supernatant z granulowanych komórek i delikatnie zawiesić komórki w niezbędnej objętości sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do wstrzykiwań dla myszy (w zależności od liczby myszy do wstrzyknięcia).
      UWAGA Typowe stężenie komórek zrębu do wstrzykiwań myszy: 0,5 x 106-5 x 106 komórek na mysz w 200 μl PBS.
    3. Zawiesinę komórek zrębu należy przechowywać w temperaturze 4 °C (lub na lodzie) do momentu bezpośrednio przed wstrzyknięciem. Upewnij się, że zawiesina komórek ma co najmniej temperaturę pokojową (RT) (~25 °C) do wstrzykiwania myszom.
  2. Iniekcja komórek zrębu
    1. Zdezynfekuj kaptur bezpieczeństwa biologicznego, zbierz materiały do wstrzykiwań, a następnie umieść w nim klatkę dla myszy.
    2. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową przez odwrócenie przed pobraniem 200 μl do strzykawki tuberkulinowej .
    3. Stosując standardowe techniki iniekcji dootrzewnowej, 17 unieruchamiają mysz i podają zawiesinę komórek o objętości 200 μl do jamy otrzewnej. Szczegóły zostały wcześniej zademonstrowane przez Machholza i wsp.18

5. Seryjne pobieranie krwi i monitorowanie osocza pod kątem egzogennych cytokin ludzkich u myszy

  1. Pobieranie krwi za pomocą nożyca ogonowego
    1. Zdezynfekuj kaptur bezpieczeństwa biologicznego i zmontuj ogranicznik dla myszy, nożyczki i inne narzędzia/materiały do zabiegu.
    2. Umieść mysz w ograniczniku i zabezpiecz rurkę, aby zminimalizować ruchy myszy.
    3. Zdezynfekuj ogon i nożyczki chirurgiczne alkoholem izopropylowym. Nałóż miejscowo krem znieczulający na ogon.
    4. Za pomocą bardzo ostrych nożyczek chirurgicznych odetnij około 0,5 - 1 mm czubka ogona myszy. Pobrać około 80 μl krwi obwodowej za pomocą heparynizowanych kapilarnek naczyń włosowatych.
      UWAGA: Jeśli krew będzie pobierana tą metodą więcej niż sześć razy, usunięcie ogona powinno być zachowawcze w odniesieniu do ilości usuniętego ogona. W miarę jak nożyce przesuwają się w górę ogona, średnica wzrasta, krwotok jest szybszy, a gojenie trwa dłużej.
  2. Separacja plazmy
    1. Przenieść krew za pomocą strzykawki z gruszką (w celu wydalenia jej z probówek kapilarnych) do znakowanej probówki mikrotainera K2EDTA; odwrócić 20 razy, aby zapobiec krzepnięciu.
      UWAGA: Zazwyczaj krzepnięcie krwi z uszczypnięcia ogona jest szybkie. Jeśli jednak krwotok utrzymuje się dłużej niż ~ 2 minuty, użyj ołówka/proszku ściągającego, aby wspomóc krzepnięcie.
    2. Odwirować probówki do pobierania krwi zgodnie z instrukcją producenta i poddzielić osocze do przechowywania (-20 °C) do momentu, gdy będzie gotowe do testu ELISA.
    3. Jeśli potrzebne są dane dotyczące chimeryzmu komórek mysich i ludzkich z krwi myszy, należy potraktować pozostałą osadkę zgodnie z opisem w kroku 6.3.1. W przeciwnym razie należy wyrzucić osad z krwinkami.
  3. Zmodyfikowany test ELISA dla mikroobjętości osocza myszy
    UWAGA: Procedura ELISA producenta została zmodyfikowana z zalecanej objętości próbki 100 μl do objętości 40 μl, aby dostosować się do mikroobjętości pobranych od myszy. Nie jest możliwe przeprowadzenie badań in vivo próbek osocza myszy w trzech egzemplarzach przy tych ograniczonych objętościach. Pod koniec eksperymentu pobiera się ~500 μL krwi pośmiertnej poprzez punkcję serca. Stężenia cytokin oceniane w 100 μl osocza poddanego eutanazji wykorzystuje się do walidacji 40 μl danych in vivo dla każdej myszy.
    1. Rozmrozić zamrożone próbki osocza myszy.
    2. Seryjnie rozcieńczyć wzorce ELISA i rozlać je trzykrotnie w ilości 40 μl na dołek.
    3. Dodać 40 μl każdej próbki osocza myszy do płytki ELISA.
      UWAGA: Jeśli próbka myszy jest mniejsza niż 40 μl, zwiększ objętość do 40 μl za pomocą buforu ELISA. Zanotować tę objętość rozcieńczalnika i użyć jej do obliczenia współczynnika rozcieńczenia dla każdej rozcieńczonej próbki. Analizując dane ELISA, pomnóż stężenie rozcieńczonej próbki przez współczynnik rozcieńczenia próbki, aby określić rzeczywiste stężenie cytokin w oryginalnej próbce.
    4. Wypełnij test ELISA zgodnie z instrukcjami producenta.

6. Przeszczepianie komórek krwiotwórczych myszom

  1. Napromienianie subletalne w celu przygotowania szpiku kostnego do przeszczepu
    UWAGA: Uniwersytet Loma Linda (LLU) wykorzystuje źródło promieniowania kobalt-60. Zwierzęta umieszcza się w uchwycie do krępowania, który jest umieszczony w odległości 80 cm od źródła promieniowania w polu o wymiarach 20 x 20 cm, a na wierzchu uwięzia znajduje się 0,5 cm warstwa Lexanu. Czas ekspozycji jest obliczany w celu osiągnięcia dawki 225 cGy w oparciu o najnowszą kalibrację źródła (obecnie 2-3 minuty dla tego źródła).
    1. Myszy napromieniane subletalnie (maksymalna dawka promieniowania całego ciała 225 cGy dla myszy z niedoborem odporności).
    2. Przeszczep komórek krwiotwórczych ~ 24 h później poprzez dożylne wstrzyknięcie do żyły ogonowej.
  2. Dożylny przeszczep komórek krwiotwórczych
    1. Przygotować zawiesiny komórek ludzkich do przeszczepu w objętości 200 μl sterylnego PBS na mysz: CD34+ hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC): 1 x 105 do 5 x 105 komórek na myszy i linie komórkowe białaczki / próbki pacjenta: 1 x 10 6 do 5 x 106 komórek na mysz.
    2. Komórki należy utrzymywać w temperaturze 4 °C (transport na lodzie) do momentu bezpośrednio przed przeszczepieniem. Upewnij się, że komórki są co najmniej w RT przed przeszczepem.
    3. Zdezynfekuj kaptur bezpieczeństwa biologicznego i przygotuj obszar kaptura do wstrzyknięć do przeszczepu.
    4. Umieść mysz w klatce rozgrzewającej na co najmniej 5 minut, aby umożliwić rozszerzenie żył ogonowych.
    5. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórek i pobrać 200 μl do strzykawki tuberkulinowej . Bezpiecznie odłożyć igłę na bok, gdzie pozostanie sterylna.
    6. Umieść mysz w unieruchomieniu i zdezynfekuj ogon alkoholem izopropylowym.
    7. Korzystając ze standardowych technik iniekcji dożylnych, 17 wstrzyknąć zawiesinę komórek ludzkich do żyły ogonowej myszy.
      UWAGA: Wstrzyknięcia do żyły ogonowej mogą wymagać kilku prób, szczególnie dla początkującego tresera zwierząt. Kovacscics and Raper's JoVE video19 dostarcza szczegółowej demonstracji tej zwierzęcej techniki.
    8. Monitoruj powrót myszy do zdrowia przez ~5 minut. Rejestruj wszelkie zdarzenia niepożądane podczas wstrzyknięcia (np. rozlane komórki, duży krwotok, nadmierny uraz ogona).
  3. Analiza chimeryzmu komórek ludzkich we krwi obwodowej myszy
    1. Pobrać osad z krwinkami pozostający w probówce z mikrotainerem po rozdzieleniu osocza (etap 5.2.3).
    2. W przypadku lizy krwinek czerwonych (RBC) należy ponownie zawiesić pozostały osad krwi w objętości PBS równej usuniętemu osocza (w celu zastąpienia objętości osocza) i dobrze wymieszać (wir/pipeta).
    3. Przenieść każdą ponownie zawieszoną próbkę krwi do znakowanej probówki o pojemności 4 ml, a następnie dodać bufor do lizy RBC do każdej probówki w stosunku 1:9 (900 μl buforu do lizy RBC na 100 μl ponownie zawieszonej krwi). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować (5 min, 500 x g) i zdekantować.
    4. Przeprowadzić drugą inkubację buforu do lizy RBC (5 min w suchej temperaturze względnej). Odwirować i zdekantować jak poprzednio.
    5. Umyj pozostałe komórki w ~ 1 ml PBS. Odwirować i zdekantować jak poprzednio.
    6. Zawiesić osad w objętości PBS odpowiedniej do standardowego barwienia cytometrią przepływową (różni się to w zależności od producenta i indywidualnych protokołów laboratoryjnych). 20 Użyj przeciwciał immunofenotypowych zatwierdzonych dla cyotmetrii przepływowej do identyfikacji komórek myszy (mysich CD45+) i ludzkich komórek (ludzkich CD45+)6,21 oraz dodatkowych ludzkich markerów leukocytów specyficznych dla interesującej nas linii komórkowej.
      UWAGA: Zaleca się pobranie niewielkiej objętości (5 μL-20 μL) z każdej próbki myszy w celu utworzenia "próbek zbiorczych" do wykorzystania w próbkach niebarwionych, żywotności i kontrolnych izotypach. Najlepszą praktyką jest posiadanie niebarwionych i izotypowych kontroli dla każdego warunku eksperymentalnego.

7. Funkcjonalna ocena aktywności cytokin in vivo

  1. Eutanazja myszy i pobieranie tkanek
    1. Eutanazja myszy przez uduszenie CO2 w wyznaczonym eksperymentalnym punkcie czasowym.
    2. Pobrać krew przez punkcję serca i pobrać osocze jak w krokach 5.2.1-5.2.2.
      UWAGA: Krew należy pobrać przed innymi tkankami, ponieważ zaczyna ona krzepnąć natychmiast po śmierci.
    3. Przetwarzać krew myszy, podwielokrotność i przechowywać osocze jak w kroku 5.2.2.
      1. W późniejszym czasie oceń stężenie cytokin egzogennych w osoczu uzyskanym podczas eutanazji za pomocą testu ELISA zgodnie z protokołem producenta. Ocenić i porównać stężenia cytokin egzogennych w osoczu myszy z seryjnego pobrania krwi in vivo i próbek osocza poddanych eutanazji (opisanych w punkcie 5.3).
    4. Dodać PBS do pozostałej próbki krwi w celu zastąpienia objętości osocza i przeprowadzić proces zgodnie z opisem w krokach 6.3.1 i 6.3.2. Natychmiast wykonać testy cytometrii przepływowej lub ponownie zawiesić komórki w pożywce zamrażającej w celu przechowywania LN2.
  2. Zbierz szpik kostny (BM) i śledzionę od myszy PDX i przygotuj zawiesiny jednokomórkowe, jak opisano wcześniej. 22
  3. Uzyskaj liczbę komórek dla każdej próbki tkanki myszy PDX przy użyciu 3% kwasu octowego z błękitem metylenowym (lizuje błony komórkowe i erytrocyty, pozostawiając nienaruszone jądra żywych komórek) w rozcieńczeniu 1:1 i policz komórki za pomocą hemocytometru. Tabelaryczne zestawienie całkowitej liczby komórek w próbkach szpiku kostnego i śledziony dla każdego zwierzęcia.
  4. Odwirować (500 x g, 15 min) zawiesiny komórek i zdekantować supernatant. Natychmiast wykonać testy cytometryczne szpiku kostnego i/lub śledziony lub ponownie zawiesić w pożywce zamrażającej w celu przechowywania LN2.
    UWAGA: Zamroź 10 podwielokrotności BM (do przyszłych testów biochemicznych) i ~5 podwielokrotności śledziony (do przyszłych przeszczepów PDX) na mysz.
  5. Immunofenotypowanie w celu identyfikacji efektów funkcjonalnych in vivo
    1. Przygotować jedną mieszaninę główną (MM) przeciwciał cytometrii przepływowej dla immunofenotypu populacji hematopoetycznej reagującej na cytokinę będącą przedmiotem zainteresowania i drugą MM przeciwciał kontrolnych izotypu (ryc. 5 i tabela materiałów).
    2. Rozmrozić porcje tkankowe PDX (kąpiel perełkowa w temperaturze 37 °C) przygotowane w kroku 7.4.
    3. Umyj rozmrożone komórki, przenosząc je do stożkowej rurki i dodając co najmniej 3 razy objętość PBS. Odwirować (500 x g, 5 min) i zdekantować supernatant.
    4. Powtórzyć etap prania (7.5.3).
    5. Utwórz zbiorcze podwielokrotności, pobierając ~10 μL-20 μL komórek z każdej próbki PDX dla niebarwionej kontroli, kontroli żywotności i kontroli izotypu (patrz uwaga dotycząca kroku 6.4.6). Wszystkie próbki, z wyjątkiem niebarwionej kontroli, zabarwić barwnikiem żywotności (marker martwych komórek), inkubować i przemywać zgodnie z protokołem producenta.
    6. Wybarwić każdą próbkę komórek PDX fenotypowaniem-MM zgodnie ze standardowym protokołem barwienia cytometrii przepływowej; podobnie zabarwić zbiorczą próbkę (próbki) kontrolne izotypu izotypem MM. Inkubować wszystkie próbki, przemyć PBS i utrwalić próbki poprzez ponowne zawieszenie w 1% paraformaldehydzie.
    7. Zbierz dane cytometrii przepływowej i przeanalizuj dane przy użyciu strategii bramkowania odpowiedniej dla populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania (ryc. 5). Typowe bramkowanie wygląda następująco:
      1. Zdefiniuj nienaruszone komórki, rysując bramkę FSC i SSC, która wyklucza zanieczyszczenia.
      2. Zidentyfikuj populację żywych komórek poprzez bramkowanie na komórkach, które są ujemne dla markera martwej komórki (jest to "całkowita liczba żywych komórek").
      3. Użyj podbramek w "całkowitej liczbie żywych komórek", aby zdefiniować populacje komórek o pożądanym immunofenotypie (patrz ryc. 5).
      4. Uzyskaj częstość występowania podzbiorów komórek w całkowitej liczbie żywych komórek z analizy cytometrii przepływowej. 6,21
    8. Obliczyć liczbę komórek docelowych w każdej tkance, mnożąc częstość występowania podzbioru komórek B w obrębie całkowitej liczby żywych komórek (uzyskanej w kroku 7.5.6.4) przez całkowitą liczbę żywych komórek w tkance uzyskaną w kroku 7.3 (% podzbioru komórek B x "liczba komórek hemocytometru"; patrz tabela 1)
    9. Porównaj liczbę komórek w populacjach komórek docelowych między myszami kontrolnymi PDX i myszami PDX z ekspresją cytokin (TSLP+), aby określić in vivo funkcjonalne efekty egzogennej cytokiny ludzkiej (Tabela 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przegląd modelu przedstawiono na Rysunku 1. Po uzyskaniu stromy produkującej cytokiny (stroma TSLP+) oraz stromy kontrolnej, są one namnażane w hodowli. Przed wstrzyknięciem stromy myszom, supernatant komórek stromalnych jest analizowany metodą ELISA w celu weryfikacji produkcji cytokin (Rysunek 2), a aktywność cytokiny produkowanej przez stromę jest weryfikowana za pomocą cytometrii przepływowej z detekcją fosforylacji (Protokół #3). Supernatant jest zbi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten manuskrypt opisuje prostą, szybką i stosunkowo opłacalną metodę inżynierii PDX w celu ekspresji egzogennej ludzkiej cytokiny. Opisana tutaj strategia opiera się na cotygodniowych iniekcjach dootrzewnowych linii komórek zrębu transdukowanej w celu ekspresji ludzkiej cytokiny, TSLP. Przed wykonaniem opisanych tutaj metod wygenerowano zrąb zaprojektowany do wyrażania wysokich poziomów cytokiny będącej przedmiotem zainteresowania (TSLP) i podobnie zmodyfikowany zrąb kontrolny. W przedstawionych tutaj protokołach zrąb jes...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, Hyundai Hope Hope Scholar Grant, Department of Pathology and Human Anatomy, Department of Basic Sciences oraz Center for Health Disparities and Molecular Medicine at Loma Linda University School of Medicine oraz przez Grant na Promowanie Wspólnych i Translacyjnych Badań z Uniwersytetu Loma Linda (KJP). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mokre odczynniki laboratoryjne 
T-25 EasYFlasks do hodowli komórek Nunc, pojemność 7 ml,   25cm² obszar hodowliThermo Scientific / Fisher156367
T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask o pojemności 250 ml, obszar hodowli 75 cm² i wentylowana nasadkaCorning Inc. / Fisher353136
Kolba poddana działaniu kultur tkankowych T-150 Falcon, pojemność 600 ml, 150 cm2; Obszar kultury & nasadka wentylowanaCorning Inc. / Fisher355001
Pipety serologiczne 10 mlFalcon357551
15 mL  polipropylenowe probówki stożkoweFisher05-539-12
Probówki z polistyrenu okrągłodennego 5 mlFalcon352054
50 ml polipropylenowe rurki stożkoweFalcon352098
2,0 ml fiolki kriogeniczne, z gwintem zewnętrznymCorning Inc. / Fisher4230659
1 mL końcówki do pipetFisher2707509
200 μ Końcówki do pipet L Denville ScientificP3020-CPS
10 μ L końcówki do pipetDenville ScientificP-1096-CP
Sterylne jednorazowe jednostki filtrujące z membraną SFCA, Nalgene Rapid-FlowFisher09-740-28D
2 NH2SO4  BioLegend423001
Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez kaliku i magnezu, 1 razy;Corning cellgro/ Mediatech21-031-CV
Human TSLP ELISA Max Deluxe SetBioLegend434204
3% Kwas octowy z błękitem metylenowymStemcell Technologies7060
Trypan Blue Corning25-900-CL
"Trypsin" 1x 0,25% Trypsyna 2,21 mM EDTA w HBSSThermoFisher25-053
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP-7949
" Czynnik R10" pożywka do hodowli komórkowych, % całkowitej objętości (składniki 565 ml)--Lab Recipe
RPMI, 88,5% (500 ml) Mediatech10-040-CV   
FBS, 9,9% (56 ml) Mediatech35-011-CV
L-glutamina, 0,99% (5,6 ml) Mediatech25-005-Cl
Penicylina-Streptomycyna, 0,50% (2,8 ml) Mediatech30-002-Cl
2-merkaptoetanol, 0,10% (560 &mikro; L) MP190242
" Czynnik chłodniczy R20" pożywka do hodowli komórkowych, % całkowitej objętości (składniki na 195 ml)--Lab Receptura
        RPMI, 76,84% (150  ml)patrz wyżejpatrz wyżej
        FBS, 20,49% (40 ml)patrz wyżejpatrz wyżej
        2mM L-glutamina, 1,02% (2 mL)patrz wyżej
        1 mM Na pirogronian, 1,02% (2 ml )patrz wyżejpatrz wyżej
        Penicylina-Streptomycyna,  0,51% (1 ml)patrz wyżej
        2-merkaptoetanol, 0,10% (0,1 M),  0,10% (200 &mikro; L)patrz wyżejpatrz wyżej
" Podłoże do zamrażania", % objętości całkowitej--Receptura laboratoryjna
" Czynnik R10" średni, 45%patrz przepis "R10"-
FBS, 20%patrz wyżej35-011-CV
DMSO, 10%Corning25-950-CQC
D(-)(+)-Trehaloza dwuwodna, 5%Fisher ScientificBP2687-100
NazwaFirmaNumer katologa Komentarze
Biologics  < / silna>
"HS-27" HS-27A ludzka linia zrębuATCCCRL-2496
"CALL-4" Linia komórkowa MHH-CALL-4, białaczka prekursorowa ludzkich komórek BDSMZACC 337
" Myszy NSG" SKINIENIE. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, mężczyzna lub kobieta, wiek 6 – 8 tygodnimyszy JAX # 005557
Linia komórkowa MUTZ-5, białaczka prekursorowa ludzkich komórek BDSMZACC 490
Rekombinowane ludzkie białko TSLPR& D Systems1398-TS-010
NazwaFirmaNumer katologaKomentarze
Flow cytomery przeciwciała (klon)*
Anti-mouse CD45 FITC (30F11)Miltenyi Biotec130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (alternatywna nazwa to IL-7Rα)Miltenyi Biotec130-098-094
CD34 APC (8G12)BD Biosciences340667
CD45 PE-CY7  (HI30)eBioscience25-0459
"FVD" Barwnik do utrwalenia żywotności  eFluor 780 eBioscience65-0865
Ig κ łańcuch lekki FITC  (G20-193)BD Pharmingen555791
Ig λ łańcuch lekki FITC (JDC-12)BD Pharmingen561379
IgD PE (IA6-2)BioLegend348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)BD Biosciences551079
pSTAT5 PE,  mysi anty-STAT5 (pY694)BD PhosphoFlow612567
Nazwa Firma<silny>Numer KatologaKomentarze
Inne materiały i sprzęt 
Zwierzęcy wszczepialny nanotransponder z CanulaTrovan ID-100B(1.25)EMLA
znieczulający z lidokainą (uzyskany przez receptę w placówce opieki nad zwierzętami)receptareceptę
BD ½ cc LO-DOSE U-100 Strzykawka insulinowa 28G½  BD#329461
Rurki mikrotainera BD z K2EDTABD #365974
WirówkaBeckman CoulterAlegra X-15R 
Rurki kapilarne FisherBrand (heparynizowane)Fisher Scientific22-260-950
HemocytometrFisher02-671-6
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
Klatka dla myszyBraintree Scientific, Inc.MPC-1
Ogranicznik iluminatora ogona myszyBraintree Scientific, Inc.MTI STD
Implantator Uchwytu PistoletowegoTrovan IM-300(1.25)
&mikro; Ilość Bio-Tek Instruments Inc.MQX200
FlowJoFlowJo, LLCWersja 10
*Wszystkie przeciwciała są przeciwciała przeciwko ludziom, chyba że zaznaczono inaczej.
, krem na Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej

Bibliografia

  1. Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
  2. Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
  3. Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
  4. Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
  5. Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
  6. Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
  7. Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
  8. Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
  9. Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
  10. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
  11. Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
  12. Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
  14. Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
  15. Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
  17. JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
  19. Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
  20. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  21. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
  22. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
  23. Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
  24. Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ekspresja cytokinwstrzyknięcie komórek stroma lnychtransdukcja TSLPwstrzyknięcie do jamy otrzewnejcytometria przepływowaanaliza ELISAtransplantacja komórek krwiotwórczychpoziomy cytokin w osoczuhodowla komórek stroma lnych
Ekspresja cytokin egzogennych w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjentów poprzez wstrzyknięcie linii komórek zrębu transdukowanej cytokiną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.