Opisana jest referencyjna procedura pomiarowa do bezwzględnej kwantyfikacji Aβ1-42 w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym w oparciu o ekstrakcję do fazy stałej i tandemową spektrometrię mas chromatografii cieczowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezwzględna ocena ilościowa Aβ1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym przy użyciu referencyjnej procedury pomiaru spektrometrii mas
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszą chorobą neurodegeneracyjną wśród osób starszych i stanowi 60-80% wszystkich przypadków demencji. Obecnie diagnoza AD opiera się na testach poznawczych i badaniach stanu psychicznego, ale peptyd amyloid-beta (Aβ) w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) jest coraz częściej stosowany w badaniach klinicznych i warunkach. Podobnie jak w przypadku większości biomarkerów białkowych i peptydowych, kwantyfikacja odbywa się przy użyciu technik opartych na przeciwciałach, takich jak test immunoenzymatyczny (ELISA). Jednak wewnątrz- i międzylaboratoryjna zmienność w tych testach utrudnia jego wykorzystanie jako markera diagnostycznego w rutynie klinicznej.
Niezależna od przeciwciał Procedura Pomiaru Referencyjnego (RMP) została opracowana w oparciu o ekstrakcję do fazy stałej (SPE) i chromatografię cieczową (LC) - tandemową spektrometrię mas (MS/MS), gdzie stabilne, znakowane izotopowo peptydy Aβ zostały użyte jako wewnętrzne wzorce, umożliwiające bezwzględną kwantyfikację. Do pomiarów wykorzystano hybrydowy instrument kwadrupolowo-orbitrapowy o wysokiej rozdzielczości. Metoda pozwala na ilościowe oznaczenie płynu mózgowo-rdzeniowego Aβ1-42 w zakresie 150-4 000 pg/ml.
Wprowadzenie
Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszą formą demencji i dotyka około 35 milionów ludzi na całym świecie1. Neuropatologicznymi cechami charakterystycznymi choroby, powszechnie uważanymi za leżące u podstaw patogenezy AD, są wewnątrzkomórkowe splątki neurofibrylarne hiperfosforylowanego białka tau2 oraz blaszki zewnątrzkomórkowe składające się z zagregowanych peptydów amyloid-beta (Aβ)3. W związku z tym ocena patologii blaszki miażdżycowej in vivo za pomocą biomarkerów została niedawno włączona do badawczych kryteriów diagnostycznych dla AD4. Do pomiarów płynu mózg....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Ten protokół wymaga podwielokrotności co najmniej 50 μL, o stężeniu 50 μg/ml dla każdego peptydu Aβ, jako materiału wyjściowego. Peptydy Aβ należy rozpuścić w 20% acetonitrylu (ACN) i 4% stężonym roztworze amoniaku w wodzie dejonizowanej (v/v) i przechowywać w temperaturze 80 °C.
Uwaga: Zobacz Tabelę 1, aby uzyskać informacje dotyczące bezpieczeństwa.
1. Przygotowanie roztworów
- Przygotuj 100 ml 20% ACN i 4% stężonego roztworu amoniaku w wodzie dejonizowanej (v/v), rozcieńczając 20 ml ACN i 4 ml stężonego amoniaku (~25%) w wodzie dejonizowanej. Dostosuj końcową objętość do 100 m....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Układ płytki przedstawiony na Rysunku 1 jest przeznaczony dla pełnej płytki próbek. W przypadku analizy mniejszej liczby próbek nieznanych, drugi kalibrator, RF oraz zestawy QC należy umieścić po pierwszej połowie próbek nieznanych.
Jak widać na Rysunku 2, kalibratory znajdują się blisko linii regresji, wykazując niskie odchylenia standardowe. Metoda ta posiada dolną granicę kwantyfikacji na poz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dla opisanej metody, zamiast stosowania matrycy zastępczej, zastosowaliśmy podejście analitu zastępczego 13,14,15,16, które umożliwia kalibrację w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym. Podejście do analitu zastępczego obejmuje dwa różne wzorce znakowane izotopowo. Jeden (15NAβ142) służy do generowania krzywej kalibracyjnej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym, podczas gdy drug.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
JP i EP nie informują o żadnych ujawnieniach. Zasiadał w radach doradczych Roche Diagnostics, Eli Lilly i Pharmasum Therapeutics. KB pełnił funkcję konsultanta lub zasiadał w radach doradczych Fujirebio Europe, IBL International i Roche Diagnostics. HZ i KB są współzałożycielami Brain Biomarker Solutions w Göteborgu AB, firmy platformowej z siedzibą w GU Venture na Uniwersytecie w Göteborgu.
Podziękowania
Ta praca została wykonana w imieniu Grupy Roboczej ds. Białek CSF Międzynarodowej Federacji Chemii Klinicznej, która ma następujący skład: Kaj Blennow (Przewodniczący) i Henrik Zetterberg, Uniwersytet w Göteborgu, Szwecja; Les Shaw i Magdalena Korecka, University of Philadelphia, PA, USA; Ingrid Zegers, Instytut Materiałów Referencyjnych i Pomiarów, Geel, Belgia; Piotr Lewczuk, Universitätsklinikum Erlangen, Niemcy; oraz Rand Jenkins, Laboratorium Bioanalityczne PPD, Richmond, Wirginia, USA; Randall Bateman, Uniwersytet Waszyngtoński, MO, Stany Zjednoczone; oraz H Vanderstichele, Innogenetics NV, Gandawa, Belgia. Prace te były również częścią Grupy Roboczej ds. Metod ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 0,5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 1,5 ml | Eppendorf | 022431081 | |
| Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 2 ml | Eppendorf | 022431102 | |
| Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 5 ml | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0,75 ml probówek polipropylenowych, probówki Micronic MPW32071BC3 z dnem w kształcie litery V | używane do zbierania eluatu SPE, ale można stosować inne urządzenia do pobierania, takie jak płytki 96-dołkowe. | ||
| Micronic Split TPE Capcluster do 96 ind. probówek | Micronic | MP53026 | Caps do mikronicznych probówek. |
| Micronic Loborack-96 biały z wysoką pokrywą z kodem kreskowym | Micronic | MPW51015BC3 Uchwyt do | probówek Micronic. |
| Końcówki Biohit Optifit 1,2 ml | Sartorius | 791210 | Służą do sięgania aż do dna płytek głębinowych LoBind (96-dołkowych). Inne wąskie wskazówki również mogą działać. |
| Waters Oasis MCX 96-studniowy i mikro; Wody z płyt elucyjnych | 186001830BA | ||
| Waters Plate kolektor | Waters | WAT058942 | |
| Waters Płyta ekstrakcyjna Kolektor płytowy do Oasis 96-Well Plates | Wody | 186001831 | |
| Roztwór wodorotlenku amonu, Puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 na bazie | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitryl, daleki gradient UV HPLC, 2,5 L | Kwas | Fisher Scientific A/0627/17X | |
| 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Milipore | 1005731000 | |
| chlorowodorek guanidyny, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive hybrydowy kwadrupolowy spektrometr masowy Orbitrap | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | Z dołączonym Dionex Ultimate 3000 LC i automatycznym samplerem. |
| Kolumna monolityczna Dionex ProSwift RP-4H (1,0 x 250 mm) | Dionex | 066640 | |
| Albumina surowicy bydlęcej, liofilizowany proszek, odpowiedni do (do biologii molekularnej), Nieacetylowany | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| (1-42), ultra czysty, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-amyloid (1-42), Jednolicie znakowany | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Jednolicie znakowane | rPeptide | A-1106-2 | |
| Wytrząsarki do mikropłytek, TiMix 2 | Edmund Bü HLER | 6110 000 |
Bibliografia
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Braak, H., Braak, E. Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease. Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. L....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
