Bezwzględna ocena ilościowa Aβ1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym przy użyciu referencyjnej procedury pomiaru spektrometrii mas

Summary

Opisana jest referencyjna procedura pomiarowa do bezwzględnej kwantyfikacji Aβ_1-42 w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym w oparciu o ekstrakcję do fazy stałej i tandemową spektrometrię mas chromatografii cieczowej.

Abstract

Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszą chorobą neurodegeneracyjną wśród osób starszych i stanowi 60-80% wszystkich przypadków demencji. Obecnie diagnoza AD opiera się na testach poznawczych i badaniach stanu psychicznego, ale peptyd amyloid-beta (Aβ) w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) jest coraz częściej stosowany w badaniach klinicznych i warunkach. Podobnie jak w przypadku większości biomarkerów białkowych i peptydowych, kwantyfikacja odbywa się przy użyciu technik opartych na przeciwciałach, takich jak test immunoenzymatyczny (ELISA). Jednak wewnątrz- i międzylaboratoryjna zmienność w tych testach utrudnia jego wykorzystanie jako markera diagnostycznego w rutynie klinicznej.

Niezależna od przeciwciał Procedura Pomiaru Referencyjnego (RMP) została opracowana w oparciu o ekstrakcję do fazy stałej (SPE) i chromatografię cieczową (LC) - tandemową spektrometrię mas (MS/MS), gdzie stabilne, znakowane izotopowo peptydy Aβ zostały użyte jako wewnętrzne wzorce, umożliwiające bezwzględną kwantyfikację. Do pomiarów wykorzystano hybrydowy instrument kwadrupolowo-orbitrapowy o wysokiej rozdzielczości. Metoda pozwala na ilościowe oznaczenie płynu mózgowo-rdzeniowego Aβ_1-42 w zakresie 150-4 000 pg/ml.

Introduction

Choroba Alzheimera (AD) jest najczęstszą formą demencji i dotyka około 35 milionów ludzi na całym świecie¹. Neuropatologicznymi cechami charakterystycznymi choroby, powszechnie uważanymi za leżące u podstaw patogenezy AD, są wewnątrzkomórkowe splątki neurofibrylarne hiperfosforylowanego białka tau² oraz blaszki zewnątrzkomórkowe składające się z zagregowanych peptydów amyloid-beta (Aβ)³. W związku z tym ocena patologii blaszki miażdżycowej in vivo za pomocą biomarkerów została niedawno włączona do badawczych kryteriów diagnostycznych dla AD⁴. Do pomiarów płynu mózgowo-rdzeniowego Aβ_1-42 dostępnych jest kilka testów immunologicznych, które są stosowane w wielu laboratoriach klinicznych⁵. Stężenie Aβ_1-42 w płynie mózgowo-rdzeniowym jest o około 50% niższe u pacjentów z AD niż u osób w podeszłym wieku zdrowym poznawczo, co odzwierciedla odkładanie się peptydu w blaszkach w mózgu6^,7.

Te biomarkery są głównie analizowane za pomocą testów immunologicznych (tj. technik opartych na przeciwciałach), ale na te testy mogą mieć wpływ efekty matrycowe⁸. Stosowanie testów immunologicznych na różnych platformach technologicznych i brak standaryzacji testów^9,10 utrudnia wprowadzenie globalnych stężeń granicznych^11,12. Zweryfikowany analitycznie RMP pozwoliłby na jednolitą kalibrację różnych platform testowych, co w idealnym przypadku doprowadziłoby do lepszej porównywalności między platformami analitycznymi i lepszej kontroli czynników przyczyniających się do ogólnej zmienności pomiaru.

Bezwzględna kwantyfikacja Aβ_1-42 przy użyciu opracowanej metody LC-MS/MS przezwycięża wiele problemów związanych z technikami opartymi na przeciwciałach. Metoda, wymieniona jako RMP przez Wspólny Komitet ds. Identyfikowalności w Medycynie Laboratoryjnej (numer identyfikacyjny bazy danych JCTLM C11RMP9), zostanie wykorzystana do określenia bezwzględnego stężenia Aβ_1-42 w certyfikowanym materiale odniesienia (CRM) w celu harmonizacji pomiarów CSF Aβ_1-42 w różnych technikach i platformach analitycznych. Opisany przebieg pracy powinien mieć znaczenie dla opracowania potencjalnych metod referencyjnych dla peptydów i białek w innych dziedzinach medycyny.

Protocol

UWAGA: Ten protokół wymaga podwielokrotności co najmniej 50 μL, o stężeniu 50 μg/ml dla każdego peptydu Aβ, jako materiału wyjściowego. Peptydy Aβ należy rozpuścić w 20% acetonitrylu (ACN) i 4% stężonym roztworze amoniaku w wodzie dejonizowanej (v/v) i przechowywać w temperaturze 80 °C.

Uwaga: Zobacz Tabelę 1, aby uzyskać informacje dotyczące bezpieczeństwa.

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj 100 ml 20% ACN i 4% stężonego roztworu amoniaku w wodzie dejonizowanej (v/v), rozcieńczając 20 ml ACN i 4 ml stężonego amoniaku (~25%) w wodzie dejonizowanej. Dostosuj końcową objętość do 100 ml wodą dejonizowaną. Codziennie rób świeże.
2. Przygotować 50 ml 5 M chlorowodorku guanidyny, rozpuszczając 26,08 g chlorowodorku guanidyny w wodzie dejonizowanej do końcowej objętości 50 ml. Przechowywać w temperaturze 20 °C i przygotowywać świeże co miesiąc.
3. Przygotuj 200 ml 4% kwasu fosforowego w wodzie dejonizowanej (v/v), rozcieńczając 9,4 ml stężonego kwasu fosforowego (~85%) w wodzie dejonizowanej. Dostosuj końcową objętość do 200 ml wodą dejonizowaną. Przechowuj w lodówce i co tydzień przygotowuj świeże.
4. Przygotuj 50 ml 75% ACN i 10% stężonego roztworu amoniaku (v/v) w wodzie dejonizowanej, rozcieńczając 37,5 ml ACN i 5 ml stężonego amoniaku (~25%) w wodzie dejonizowanej. Dostosuj końcową objętość do 50 ml wodą dejonizowaną. Codziennie rób świeże.
5. Rozmrozić co najmniej 2,5 ml ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego dla kalibratorów, uzyskanego z zanonimizowanych próbek pozostałych po rutynowej analizie klinicznej.
6. Przygotować sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy zawierający 150 mM Na, 3,0 mM K, 1,4 mM Ca, 0,8 mM Mg, 1,0 mM P i 155 mM Cl w wodzie dejonizowanej i dodać albuminę surowicy bydlęcej do końcowego stężenia 4 mg / ml. Na analizę potrzebny jest tylko 1 ml, ale przygotuj dużą objętość, podziel ją na porcje i przechowuj do wykorzystania w przyszłości.

2. Przygotowanie kalibratorów

1. Przygotuj 0,5 ml peptydu 4 μg/ml ¹⁵N-Aβ_1-42, dodając 40 μl 50 μg/ml ¹⁵NAβ₁₄₂ do 0,46 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce mikrowirówki o pojemności 0,5 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.
2. Przygotuj 2 ml peptydu 100 ng/ml ¹⁵N-Aβ_1-42, dodając 50 μl 4 μg/ml ¹⁵NAβ₁₄₂ do 1,95 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.
3. Przygotować sześć roztworów kalibracyjnych (A-F), mieszając objętości każdego roztworu wskazane w Tabeli 2. Użyj probówek do mikrowirówek o pojemności 0,5, 1,5 i 2 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.
4. Przygotować końcowe kalibratory (w dwóch egzemplarzach) w probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml, dodając odpowiednie roztwory kalibracyjne i płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) zgodnie z tabelą 3. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.

3. Przygotowanie wzorca wewnętrznego

1. Przygotuj 2 ml 0,8 μg/ml ¹³C-Aβ_1-42 peptydu, dodając 32 μl 50 μg/ml ¹³CAβ₁₄₂ do 1,968 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.
2. Przygotuj 5 ml peptydu 16 ng/ml ¹³C-Aβ_1-42, dodając 0,1 ml 0,8 μg/ml do 4,9 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce mikrowirówki o pojemności 5 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.

4. Przygotowanie próbki czynnika odpowiedzi

UWAGA: Określenie współczynnika odpowiedzi (RF) jest wykonywane w celu określenia stężenia znakowanego peptydu użytego do kalibracji (¹⁵N-Aβ_1-42). Wymaga to określenia stężenia natywnego peptydu Aβ_1-42 za pomocą analizy aminokwasów (AAA). Tak więc objętość i stężenie natywnych podwielokrotności peptydu Aβ_1-42 muszą spełniać wymagania AAA.

1. Przygotuj 0,5 ml 4 μg/ml natywnego (nieznakowanego) ^Aβ_1-42, dodając 40 μl 50 μg/ml natywnego Aβ_1-42 do 0,46 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce mikrowirówki o pojemności 0,5 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.
2. Przygotuj 2-mililitrową mieszaninę 40 ng/ml natywnego i ¹⁵N-Aβ_1-42, dodając 20 μl 4 μg/ml natywnego Aβ_1-42 i 20 μl 4 μg/ml ¹⁵N-Aβ_1-42 do 1,96 ml 20% ACN i 4% stężonego amoniaku w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Mieszaj na mikserze wirowym przez 1 min.
3. Dodać 20 μl mieszaniny 40 ng/ml do 0,38 ml sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego w probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml. Przygotuj duplikaty i mieszaj na mikserze wirowym przez 1 minutę.

5. Przygotowanie próbki

UWAGA: Rozmrozić próbki do pomiaru w temperaturze pokojowej na walcu.

1. Dodać 0,18 ml każdego kalibratora, współczynnika odpowiedzi i nieznanej próbki (w tym próbek kontroli jakości [QC], jeśli są używane) do 1 ml białkowej płytki 96-dołkowej, zgodnie z rysunkiem 1 (zakładając, że używana jest pełna płytka). Upewnij się, że dodałeś próbki do dna studzienek lub w ich pobliżu.
2. Dodać 20 μl wzorca wewnętrznego do każdego dołka (tj. kalibratorów, współczynników odpowiedzi, kontroli jakości i niewiadomych); bardzo ważne jest, aby uwolnić kroplę po stronie studzienki blisko powierzchni próbki bez zanurzania końcówki pipety.
3. Dodać 0,2 ml 5 M chlorowodorku guanidyny do każdej studzienki.
4. Umieścić płytkę z próbką na wytrząsarce do mikropłytek i mieszać próbki przez 45 minut z prędkością 1 100 obr./min. Optymalna częstotliwość może się różnić w zależności od oprzyrządowania. Ustaw częstotliwość i amplitudę mieszalnika tak, aby roztwory były dokładnie wymieszane i żadne krople wzorca wewnętrznego lub CSF nie pozostały niezmieszane z boku studzienek.
5. Dodaj 0,2 ml 4% kwasu fosforowego do każdej studzienki. Krótko wymieszaj wirowo.

6. Ekstrakcja do fazy stałej

UWAGA: We wszystkich etapach mycia, ładowania i elucji, zastosuj najniższą możliwą próżnię po dodaniu roztworu i stopniowo zwiększaj w razie potrzeby, aby załadować lub wymyć roztwór. Wyłącz podciśnienie między każdym etapem ładowania i elucji.

1. Umieść tacę zbiornika na odpady pod 96-dołkową płytką do ekstrakcji fazy stałej (SPE) w trybie mieszanym, z wymianą kationową, w komorze kolektora z płytą ekstrakcyjną
.
2. Kondycjonować sorbent SPE, dodając 0,2 ml metanolu do każdej studzienki.
3. Zrównoważyć sorbent, dodając 0,2 ml 4% kwasu fosforowego do każdej studzienki.
4. Przenieść wszystkie próbki (około 0,62 ml w każdym dołku) z płytki głębokiej na płytkę SPE. Do przenoszenia próbek z płytki głębinowej na płytkę SPE należy używać pipety ośmiokanałowej; Nie jest konieczne przenoszenie całej lub równej objętości wszystkich próbek, ponieważ próbki zawierają wewnętrzny wzorzec, który kompensuje różnice.
5. Po przejściu próbek przez sorbent należy przepłukać przez dodanie 0,2 ml 4% kwasu fosforowego do każdej studzienki.
6. Po wypłukaniu rozpuszczalnika myjącego z sorbentu zastąp tacę zbiornika płytką lub rurkami zbiorczymi.
7. Eluować próbkę z sorbentu, dodając dwukrotnie 50 μl 75% ACN/10% stężonego amoniaku i należy pamiętać, że roztwór ten wymaga bardzo niskiej próżni, aby przejść przez sorbent. Pamiętaj, aby wyłączyć próżnię między każdym dodawaniem.
   1. OPCJONALNIE: Uszczelnić płytkę lub probówki zbiorcze i zamrozić je w temperaturze -80 °C. Usunąć uszczelkę z płytki lub probówek zbiorczych przed przejściem do kroku 6.8.2.
   2. Wysuszyć eluaty za pomocą wirowania próżniowego (bez stosowania ciepła); może to zająć od jednej do kilku godzin, w zależności od wirówki próżniowej.
   3. Zamknąć pojemniki i zamrozić je w temperaturze -80 °C.

7. Chromatografia cieczowa

1. Przygotować ruchomą fazę A (5% ACN i 0,3% stężonego amoniaku w wodzie dejonizowanej [v/v]), B (4% wody dejonizowanej i 0,1% stężonego amoniaku w ACN [v/v]) i płukać igłami (50% ACN i 4% stężonego amoniaku w wodzie dejonizowanej [v/v]).
   1. Na 500 ml ruchomej fazy A dodaj 25 ml ACN i 1,5 ml stężonego amoniaku do wody dejonizowanej. Dostosuj końcową objętość do 500 ml wodą dejonizowaną.
   2. Na 500 ml ruchomej fazy B dodaj 500 μl stężonego amoniaku i 25 ml wody dejonizowanej do ACN. Dostosuj końcową objętość do 500 ml za pomocą ACN.
   3. Przygotuj 250 ml płynu do płukania igł, dodając 120 ml ACN i 10 ml stężonego amoniaku do wody dejonizowanej. Dostosuj końcową objętość do 250 ml wodą dejonizowaną.
   4. Umieść ruchome fazy A i B oraz butelki do mycia igł otwarte w kąpieli sonicyjnej na 20 minut przed użyciem z systemem LC
2. Rozpuścić każdą próbkę w 25 μl 20% ACN i 4% stężonego roztworu amoniaku i umieścić je na wytrząsarce na 20 minut. Odwirować próbki i umieścić je w automatycznym podajniku próbek (przechowywać w temperaturze 7 °C).
3. Wstrzyknąć 20 μl próbki na monolityczną kolumnę o wymiarach 1 x 250^mm2 polistyren-diwinylobenzen (z odwróconymi fazami) utrzymywaną w temperaturze 50 °C.
   1. Użyć gradientu LC pokazanego w tabeli 4 przy natężeniu przepływu 0,3 ml/min. Pierwsze dwie i ostatnie pięć minut należy przekierować do odpadów (po kolumnie) za pomocą zaworu przełączającego, aby zmniejszyć zanieczyszczenie spektrometru masowego.

8. Analiza spektrometryczna mas

UWAGA: Te parametry zostały użyte dla hybrydowego spektrometru mas kwadrupolowo-orbitrapowego, wyposażonego w podgrzewane źródło jonizacji elektrorozpylania.

1. Ustaw parametry źródła jonów zgodnie z tabelą 5.
2. Ustaw przyrząd MS tak, aby wyizolował 4+ stanów naładowania natywnego Aβ_1-42 (stosunek masy do ładunku 1 129,48 [m/z]), ¹⁵N-Aβ_1-42 (1 143,00 m/z) i ¹³C-Aβ_1-42 (1 179,50 m/z) w kwadrupolowym analizatorze masy o szerokości izolacji 2,5 m/z.
3. Fragmentuj izolowane peptydy w komórce zderzeniowej ze znormalizowaną energią zderzenia (NCE) wynoszącą 17,0. Może to wymagać dostrojenia dla każdego instrumentu, nawet tego samego typu (a zwłaszcza w przypadku korzystania z innych typów instrumentów, takich jak potrójny kwadrupol MS).
4. Rejestruj widma fragmentów z rozdzielczością 17.500, z celem automatycznej kontroli wzmocnienia 2 x 10⁵ ładunków i maksymalnym czasem wtrysku 250 ms.

9. Przetwarzanie danych

1. Do obliczenia powierzchni chromatograficznych dla każdego peptydu należy wykorzystać sumę jonów potomnych (z tolerancją masy ± 250 jednostek masy mili [mmu]) podaną w tabeli 6. Należy pamiętać, że typy i liczby jonów są pokazane tylko dla natywnych jonów poprodukcyjnych Aβ_1-42, ponieważ są takie same zarówno dla ¹⁵N-Aβ_1-42, jak i ¹³C-Aβ_1-42.
2. Określić średni współczynnik odpowiedzi dwóch próbek współczynnika odpowiedzi, dzieląc obszar pod krzywą (pik chromatograficzny) ¹⁵N-Aβ_1-42 przez obszar pod krzywą natywnego Aβ_1-42.
3. Dostosuj stężenie ¹⁵N-Aβ_1-42 użyte do kalibracji, mnożąc je przez współczynnik odpowiedzi obliczony w kroku 9.2.
4. Skonstruuj krzywą kalibracyjną, wykreślając stosunki powierzchni ¹⁵N-Aβ_1-42 do ¹³C-Aβ_1-42 z dwóch zestawów kalibratorów w zależności od stężenia.
5. Obliczyć nachylenie i punkt przecięcia krzywej kalibracyjnej za pomocą regresji liniowej.
6. Obliczyć stosunek powierzchni natywnego Aβ_1-42 do wzorca wewnętrznego (¹³C-Aβ_1-42) dla nieznanych próbek.
7. Ekstrapolować stężenie nieznanych próbek z krzywej kalibracyjnej, korzystając z nachylenia i punktu przecięcia uzyskanych w kroku 9.5.

Results

Ustawienie płytki na rysunku 1 jest używane do pełnego talerza próbek. Jeśli ma być analizowanych mniej nieznanych próbek, drugi kalibrator, RF i zestawy kontroli jakości należy umieścić po pierwszej połowie nieznanych próbek.

Jak widać na rysunku 2, kalibratory znajdują się blisko linii regresji, z niskimi odchyleniami standardowymi. Ta metoda ma dolny poziom kwantyfikacji wynoszący 150 pg/ml i...

Discussion

Dla opisanej metody, zamiast stosowania matrycy zastępczej, zastosowaliśmy podejście analitu zastępczego 13,14,15,16, które umożliwia kalibrację w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym. Podejście do analitu zastępczego obejmuje dwa różne wzorce znakowane izotopowo. Jeden (¹⁵NAβ₁₄₂) służy do generowania krzywej kalibracyjnej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym, podczas gdy drug...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 0,5 ml	Eppendorf	022431081
Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 1,5 ml	Eppendorf	022431081
Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 2 ml	Eppendorf	022431102
Probówki do mikrowirówek Eppendorf Protein LoBind, 5 ml	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0,75 ml probówek polipropylenowych, probówki Micronic MPW32071BC3 z dnem w kształcie litery V			używane do zbierania eluatu SPE, ale można stosować inne urządzenia do pobierania, takie jak płytki 96-dołkowe.
Micronic Split TPE Capcluster do 96 ind. probówek	Micronic	MP53026	Caps do mikronicznych probówek.
Micronic Loborack-96 biały z wysoką pokrywą z kodem kreskowym	Micronic	MPW51015BC3 Uchwyt do	probówek Micronic.
Końcówki Biohit Optifit 1,2 ml	Sartorius	791210	Służą do sięgania aż do dna płytek głębinowych LoBind (96-dołkowych). Inne wąskie wskazówki również mogą działać.
Waters Oasis MCX 96-studniowy i mikro; Wody z płyt elucyjnych		186001830BA
Waters Plate kolektor	Waters	WAT058942
Waters Płyta ekstrakcyjna Kolektor płytowy do Oasis 96-Well Plates	Wody	186001831
Roztwór wodorotlenku amonu, Puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 na bazie	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitryl, daleki gradient UV HPLC, 2,5 L	Kwas	Fisher Scientific A/0627/17X
85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Milipore	1005731000
chlorowodorek guanidyny, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive hybrydowy kwadrupolowy spektrometr masowy Orbitrap	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	Z dołączonym Dionex Ultimate 3000 LC i automatycznym samplerem.
Kolumna monolityczna Dionex ProSwift RP-4H (1,0 x 250 mm)	Dionex	066640
Albumina surowicy bydlęcej, liofilizowany proszek, odpowiedni do (do biologii molekularnej), Nieacetylowany	Sigma-Aldrich	B6917
(1-42), ultra czysty, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-amyloid (1-42), Jednolicie znakowany	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Jednolicie znakowane	rPeptide	A-1106-2
Wytrząsarki do mikropłytek, TiMix 2	Edmund Bü HLER	6110 000