Dwa algorytmy wysokoprzepustowej i wieloparametrycznej kwantyfikacji morfologii połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila

Summary

Dwa algorytmy analizy obrazu, "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" zostały stworzone, aby automatycznie określić ilościowo dziewięć cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Abstract

Morfologia synaptyczna jest ściśle związana ze skutecznością synaps, a w wielu przypadkach morfologiczne defekty synaps ostatecznie prowadzą do nieprawidłowego funkcjonowania synaps. Połączenie nerwowo-mięśniowe larw Drosophila (NMJ), dobrze ugruntowany model synaps glutaminergiczne, jest intensywnie badane od dziesięcioleci. Identyfikacja mutacji powodujących defekty morfologiczne NMJ ujawniła repertuar genów, które regulują rozwój i funkcję synaps. Wiele z nich zidentyfikowano w badaniach na dużą skalę, które koncentrowały się na jakościowych podejściach do wykrywania nieprawidłowości morfologicznych Drosophila NMJ. Wadą analiz jakościowych jest to, że wielu subtelnych graczy przyczyniających się do morfologii NMJ prawdopodobnie pozostaje niezauważonych. Podczas gdy analizy ilościowe są wymagane do wykrycia subtelniejszych różnic morfologicznych, takie analizy nie są jeszcze powszechnie wykonywane, ponieważ są pracochłonne. Protokół ten szczegółowo opisuje dwa algorytmy analizy obrazu "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", dostępne jako makra kompatybilne z Fidżi, do ilościowej, dokładnej i obiektywnej analizy morfometrycznej Drosophila NMJ. Metodologia ta została opracowana do analizy końcówek NMJ znakowanych immunologicznie powszechnie stosowanymi markerami Dlg-1 i Brp. Dodatkowo w niniejszym protokole przedstawiono jej szersze zastosowanie do innych markerów, takich jak Hrp, Csp i Syt. Makra są w stanie ocenić dziewięć cech morfologicznych NMJ: obszar NMJ, obwód NMJ, liczbę boutonów, długość NMJ, długość najdłuższej gałęzi NMJ, liczbę wysp, liczbę rozgałęzień, liczbę punktów rozgałęzień oraz liczbę aktywnych stref w terminalu NMJ.

Introduction

Zaburzenia poznawcze, takie jak niepełnosprawność intelektualna, zaburzenia ze spektrum autyzmu i schizofrenia, często charakteryzują się nieprawidłową funkcją synaptyczną^1,2,3. Morfologia i funkcja synaps są ze sobą ściśle powiązane; Defekty morfologiczne mogą powodować nieprawidłowe funkcjonowanie synaps i odwrotnie, nieprawidłowa transmisja synaptyczna wpływa na dojrzewanie i morfologię synapty^4,5,6.

Zastosowano szereg organizmów modelowych w celu lepszego zrozumienia biologii synaps i rzucenia światła na to, jak zmiany synaptyczne wpływają na funkcjonowanie mózgu w zdrowiu i chorobie^7,8^,9. Drosophila NMJ jest szeroko przebadanym i dobrze ugruntowanym modelem in vivo dla biologii synaps glutaminergiczne^10,11. W ostatnich dziesięcioleciach model ten był wykorzystywany do badań fizjologicznych i skoncentrowanych na genach, a także do badań genetycznych na dużą skalę, w celu wykrycia różnic morfologicznych między NMJ. W szczególności badania genetyczne zidentyfikowały wiele kluczowych regulatorów i mechanizmów leżących u podstaw rozwoju i funkcji synaps^{12,13,14,15,16}. Jednak większość z tych badań przesiewowych opierała się na wizualnej ocenie końcowej morfologii NMJ i jakościowym wykrywaniu nieprawidłowości synaptycznych lub półilościowej ocenie kilku cech morfologicznych. W konsekwencji łatwo przeoczyć dość subtelne nieprawidłowości morfologiczne synaptyczne, które nie są oczywiste dla ludzkiego oka. Aby móc kompleksowo wykryć różnice ilościowe, NMJ musi być dokładnie oceniony poprzez systematyczną kwantyfikację parametrów morfologicznych będących przedmiotem zainteresowania. Ręczny pomiar cech NMJ jest pracochłonny, zwłaszcza gdy istnieje kilka interesujących cech NMJ i/lub podczas wykonywania badań genetycznych na dużą skalę. W celu wsparcia wieloparametrycznej, wysokoprzepustowej analizy morfologicznej i osiągnięcia obiektywnej kwantyfikacji opracowano dwa makra "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" ¹⁷. Oba makra działają w oprogramowaniu do analizy obrazów typu open source Fiji¹⁸ i umożliwiają kwantyfikację zarówno obrazów konfokalnych, jak i niekonfokalnych.

"Drosophila NMJ Morphometrics" mierzy końcówki NMJ wybarwione immunologicznie postsynaptycznym krążkiem markerowym large-1 (Dlg-1) lub presynaptyczną peroksydazą chrzanową (Hrp), znakowaną markerem strefy aktywnej bruchpilot (Brp). Określa ilościowo dziewięć parametrów morfologicznych (opisanych poniżej): obszar NMJ, obwód NMJ, liczba boutonów, długość NMJ, najdłuższa długość gałęzi NMJ, liczba wysp, liczba gałęzi, liczba punktów rozgałęzień i liczba aktywnych stref w końcu synaptycznym (ryc. 1). Chociaż w tym makrze obecny jest algorytm określający liczbę boutonów, nie spełniał on kryteriów dokładności¹⁷. Aby prawidłowo ocenić liczbę zakłuć, konieczne jest użycie makra "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", który jest specjalnie zaprojektowany do ilościowego oznaczania boutonów przy użyciu preparatów NMJ wybarwionych immunologicznie anty-synaptotagminą (Syt) lub białkiem strunowym anty-cysteiny (Csp) i znakowanych immunologicznie z Brp. Makro "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" określa ilościowo następujące parametry: liczba boutonów, obszar bouton NMJ, długość NMJ, najdłuższa długość gałęzi NMJ, liczba wysp, liczba gałęzi, liczba punktów rozgałęzień i liczba aktywnych stref (ryc. 2).

Makra składają się z 3 pod-makr: (I) "Konwertuj na stos" identyfikuje wszystkie dostępne pliki graficzne i tworzy Z-hyperstacki oraz projekcje maksymalnej intensywności obu kanałów. Jako dane wyjściowe to makro wygeneruje dwa nowe pliki na synapsę o nazwach "stack_image_name" i "flatstack_image_name". II) "Zdefiniuj ROI" otworzy kolejno wszystkie obrazy maksymalnej projekcji "flatstack_image_name" i przedstawi je z żądaniem ręcznego zdefiniowania obszaru zainteresowania (ROI), w którym znajduje się określony terminal synaptyczny będący przedmiotem zainteresowania. Zostało to zaimplementowane, aby umożliwić wykluczenie synaps łączących się z sąsiednimi mięśniami i/lub innymi typami zakończeń synaptycznych (takimi jak 1s), które mogą być obecne na obrazach¹¹. (III) "Analizuj" stosuje w pełni zautomatyzowaną analizę obszaru obrazu w granicach ROI. W wyniku tego kroku użytkownik otrzyma dwa nowe pliki: "results.txt", w którym zostaną opatrzone adnotacjami wszystkie pomiary numeryczne, oraz "res_image_name.tif", w którym zostaną zilustrowane segmentacje obrazu utworzone przez makro. Podczas analizy obrazu z każdego zakończenia synaptycznego wyprowadzane są trzy struktury: kontur NMJ, szkielet NMJ i liczba Brp-dodatnich stref aktywnych. Kontur NMJ służy do wyznaczenia obszaru NMJ i jego obwodu, a późniejsze oddzielenie działu wodnego zapewnia liczbę boutonów. Ze szkieletu wyprowadza się pięć cech NMJ: całkowitą długość NMJ, sumę długości najdłuższej ciągłej ścieżki łączącej dowolne dwa punkty końcowe (najdłuższa długość rozgałęzienia), liczbę niepołączonych przedziałów na NMJ (określanych jako "wyspy"), liczbę rozgałęzień i liczbę punktów rozgałęzień (jeden punkt rozgałęzienia łączy trzy lub więcej gałęzi). Liczba stref aktywnych jest określana w kanale Brp poprzez zliczanie plam Brp-dodatnich. Kontur NMJ z adnotacjami (żółta linia), szkielet NMJ (niebieska linia) oraz liczba Brp-dodatnich stref aktywnych (oznaczona białymi ogniskami) są wyświetlane na obrazie wyników, a pomiary parametrów są przetwarzane do (.txt) pliku wyjściowego (rysunek 3).

Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" zostały po raz pierwszy opisane i obszernie zweryfikowane przez Nijhof et al.¹⁷. Ten manuskrypt skupia się na metodologii analizy morfologii NMJ za pomocą makr "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Przed analizami wspomaganymi makro należy przeprowadzić sekcje NMJ i barwienie immunologiczne. Są to kluczowe etapy, a kombinacja markerów stosowanych w immunohistochemii musi być odpowiednia do analiz makro. Kroki te są pokrótce wymienione w sekcji 1 niniejszego protokołu i kierują użytkownika do odniesień opisujących szczegółowo protokoły do wykonania tych procedur.

Protocol

1. Wymagania przed przetwarzaniem obrazu

1. Wykonaj preparaty Drosophila w otwartej książce larw wędrujących w trzecim stadium rozwojowym (L3), jak wcześniej opisano¹⁹.
2. Koimmunologiczne terminale Drosophila NMJ przy użyciu kombinacji dwóch markerów: Dlg-1 lub Hrp wraz z Brp do analizy za pomocą "Drosophila NMJ Morphometrics" oraz Syt lub Csp razem z Brp do analizy za pomocą "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics"²⁰.
   UWAGA: Przeciwciała tego samego gatunku można łączyć poprzez wstępne znakowanie jednego z nich za pomocą zestawu do koniugacji przeciwciał, takiego jak Zenon Alexa Labeling Kits¹⁷.
3. Obrazuj terminale NMJ za pomocą wybranego mikroskopu, np. fluorescencji (z lub bez ApoTome) lub mikroskopii konfokalnej.
   1. Uzyskaj 2-kanałowy stos obrazów terminala NMJ.
      1. Dostosuj ustawienia mikroskopu w taki sposób, aby kanał 1 uzyskał terminal NMJ znakowany immunologicznie Dlg-1 (lub Hrp, Syt, Csp), a kanał 2 terminal NMJ znakowany immunologicznie Brp.
      2. Opcjonalnie analizuj jednokanałowe obrazy (synaps znakowanych immunologicznie pojedynczym przeciwciałem) za pomocą makr. Obraz NMJ znakowane immunologicznie jednoznacznie za pomocą Dlg-1 lub Hrp do analizy za pomocą "Drosophila NMJ Morphometrics" lub Syt lub Csp dla "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
         UWAGA: Nie jest możliwa analiza synaps wybarwionych immunologicznie tylko anty-Brp.
   2. Eksportuj uzyskane obrazy jako pojedyncze pliki '.tiff. Odwróć kolejność kanałów przed uruchomieniem makr, jeśli nie zostały pobrane zgodnie ze wskazaniami.

2. Wymagania dotyczące oprogramowania i instalacja

1. Pobierz makra: "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" z następującej strony internetowej: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1²¹.
2. Przesuń kursor do folderu "Aktualizacja makr 1" i kliknij pojawiającą się opcję "widok". Pojawi się lista z zawartością tego folderu. Folder zawiera makra "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   UWAGA: Oba makra są zgodne z Fidżi w wersji 1.4, która również znajduje się w tym samym folderze. Makra mogą nie działać w najnowszych wersjach. Skorzystaj z dostarczonej wersji 1.4. Uruchomienie tej wersji jest bezproblemowe, nawet na komputerach z dostępną nowszą wersją Fidżi.
3. Kliknij "Pobierz wszystko". Zawartość folderu zostanie pobrana na komputer jako plik .zip. Rozpakuj pobrany plik.
4. Skopiuj pliki Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm i Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm do Fiji.app/plugins/ katalogu. Po ponownym uruchomieniu programu makra pojawią się na dole menu rozwijanego Wtyczki.

3. Uruchom makro podrzędne "Konwertuj na stos", aby utworzyć projekcje Z i hiperstosy obrazów NMJ

1. Uruchom interfejs graficzny, wybierając Wtyczki na pasku narzędzi i wybierz "Drosophila NMJ Morphometrics" z menu rozwijanego.
2. Zdefiniuj ustawienie "Unikalny ciąg pliku" w interfejsie graficznym makra.
   UWAGA: Oprogramowanie mikroskopu wykorzystuje sygnaturę identyfikacyjną do organizowania płaszczyzn i kanałów podczas przechowywania stosów jako indywidualnych plików ".tiff". Wprowadzone unikalne ustawienie ciągu pliku musi określać sygnaturę przypisaną przez oprogramowanie do pierwszej płaszczyzny pierwszego kanału (ważne: należy wskazać najniższą płaszczyznę i numer kanału).
3. Wybierz tylko makro podrzędne "Konwertuj na stos" i kliknij "ok" i wybierz folder, w którym znajdują się obrazy. Jeśli wybrany jest katalog główny z kilkoma podfolderami, przetwarzane będą wszystkie pojedyncze pliki '.tiff w głównym katalogu i podfolderze spełniające kryteria unikalnego ciągu pliku.
   1. Jeśli stos z zawiera tylko jeden kanał, zaznacz pole "Tylko kanał 1".
4. Zwróć uwagę, że pojawią się dwa nowe pliki na obraz NMJ, domyślnie określane jako stack_image_name i flatstack_image_name. Przechowuj tylko te stosy i płaskie stosy do dalszej analizy. W tym momencie można usunąć .tiff serie plików, minimalizując wymaganą pojemność pamięci masowej i unikając potencjalnych źródeł błędów.

4. Uruchom makro podrzędne "Zdefiniuj ROI", aby wyznaczyć terminal NMJ będący przedmiotem zainteresowania

1. Uruchom interfejs graficzny "Drosophila NMJ Morphometrics".
2. Zaznacz tylko pole wyboru "Zdefiniuj ROI" i naciśnij "OK" i wybierz główny katalog, w którym przechowywane są obrazy zatytułowane flatstack_name i naciśnij "Wybierz". Podmakro "Zdefiniuj ROI" automatycznie przeszukuje wszystkie podfoldery w wybranym katalogu głównym.
3. Gdy otworzy się pierwsza projekcja, wybierz narzędzie "Zaznaczanie odręczne" na pasku narzędzi.
4. Za pomocą myszy narysuj zaznaczenie, które zawiera wyłącznie cały terminal NMJ, który Cię interesuje i kliknij "OK" w oknie "Zdefiniuj terminal". Makro przejdzie do następnej projekcji.
5. Nakreśl następny zwrot z inwestycji i powtarzaj tę czynność, aż wszystkie zwroty akcji zostaną zdefiniowane. Plik obrazu ROI o nazwie "roi_image_name" będzie przechowywany w tym samym katalogu, co wcześniej wygenerowane obrazy stosu i projekcji dla każdego z przetworzonych obrazów. Wynikiem tego submakro jest binarny obraz ROI w kolorze białym na czarnym tle.

5. Uruchom makro podrzędne "Analizuj", aby określić ilościowo cechy terminala NMJ

1. Przejdź do paska narzędzi, wybierz "Wtyczki" i użyj:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics" podczas analizy synaps znakowanych immunologicznie anty-Dlg-1 lub anty-Hrp (kanał 1) razem z anty-Brp (kanał 2) lub "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" podczas analizy synaps znakowanych immunologicznie anty-Syt lub anty-Csp (kanał 1) razem z Brp (kanał 2).
   1. Gdy mają być analizowane stosy obrazów jednokanałowych (kanał strukturalny Dlg-1 lub HRP dla "Drosophila_NMJ_Morphometrics" lub Syt lub Csp dla "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics), zaznacz pole "Tylko kanał 1".
2. Dostosuj skalę odpowiadającą obrazom, które mają być analizowane.
   1. Jeśli jeden piksel na obrazie odpowiada 2,5 μm, wskaż Scale-Pixels = 1, Scale-Distance w μm = 2,5. W przypadku, gdy oba ustawienia pozostaną na 0, obszar NMJ, obwód, długość i najdłuższa długość gałęzi zostaną wyrażone w liczbie pikseli.

3. W razie potrzeby dostosuj domyślne ustawienia analizy makra. Regulacje należy wykonywać tylko wtedy, gdy makro podrzędne "Analizuj" zostało wcześniej uruchomione z niezadowalającymi wynikami (patrz koniec tej sekcji i sekcja 6, aby uzyskać instrukcje dotyczące optymalizacji ustawień).
4. Zaznacz pola wyboru "Analizuj" i "Czekaj" i naciśnij "OK".
   1. Zaznacz pole wyboru "Czekaj" podczas uruchamiania makra podrzędnego "Analizuj" na obrazach 2 kanałów. W przeciwnym razie mogą wystąpić błędy w zliczaniu aktywnych stref z powodu ograniczonej pojemności komputera.
5. Gdy otworzy się nowe okno "Wybierz katalog", wybierz katalog, w którym znajdują się obrazy i naciśnij "wybierz". Makro przeanalizuje wszystkie obrazy przechowywane w katalogu głównym oraz, w stosownych przypadkach, w kolejnych folderach (przy użyciu trzech plików z wykonania poprzednich makr podrzędnych: stack_image_name, flatstack_image_name i roi_image_name). Makro przetwarza każdy obraz indywidualnie i po kolei. Może to potrwać kilka minut na stos obrazów (w zależności od pojemności komputera).
6. Po uruchomieniu makra należy pamiętać, że nowy plik obrazu o nazwie res_image_name dla każdej analizowanej synapsy przechowywanej zostanie utworzony w folderze nadrzędnym. Pomiary ilościowe zostaną zapisane jako plik "results.txt".
7. Sprawdź wszystkie obrazy wynikowe, aby wykryć i wykluczyć obrazy z błędami segmentacji. Możliwe błędy segmentacji opisano w tabeli 3 wraz z poradami, jak dostosować ustawienia, aby obejść te błędy. Obrazy wynikowe z takimi błędami segmentacji przedstawiono jako przykłady na rysunku 4.
   UWAGA: Podczas uruchamiania makra z domyślnymi ustawieniami zaobserwowanymi w interfejsie użytkownika, dokładność makra została porównana z oceną ręczną¹⁷.

6. Dostosuj ustawienia makr do obrazów

1. Jeśli więcej niż 5% obrazów wykazuje błędy segmentacji, zapoznaj się z różnymi algorytmami, aby zdefiniować/wybrać najbardziej odpowiednie ustawienia makr dla obrazów.
2. Dostosuj wartość promienia toczącej się kulki
   UWAGA: Funkcja promienia toczącej się kuli odejmuje tło obrazu. Funkcja ta ma kluczowe znaczenie podczas pracy z obrazami uzyskanymi za pomocą mikroskopów fluorescencyjnych i/lub gdy obrazy mają wysoki poziom szumów tła. Odjęcie tła pomoże krokom automatycznego progowania makra w uzyskaniu odpowiedniej segmentacji terminali NMJ.
   1. Wybierz trzy obrazy NMJ stack_image_name wygenerowane przez makro podrzędne "Konwertuj na stos". Wybierz obrazy, które są reprezentatywne dla zestawu danych obrazu.
   2. Na pasku narzędzi wybierz opcję Obraz | Kolor | Podziel kanały. Zostaną utworzone dwa stosy obrazów, jeden reprezentujący odpowiednio kanał 1, a drugi kanał 2, i zostaną one zapisane.
   3. Otwórz stos obrazów należący do otwartego kanału 1, odpowiadający immunoznakowaniu Dlg-1, Hrp, Syt lub Csp.
   4. Uruchom filtr "Odejmij tło", wybierając "Proces" na pasku narzędzi, a następnie "Odejmij tło..." z menu rozwijanego.
   5. Kliknij pole wyboru podglądu w wyskakującym oknie i dostosuj promień toczącej się kuli do wartości najbardziej odpowiedniej dla obrazów. Ustawienie "Promień toczącej się kuli" powinno być dostosowane do wartości zwiększających kontrast między synapsą a tłem (patrz Rysunek 5A').
      1. Zobacz przykład Rysunek 5. W panelu A części synapsy wykazują te same poziomy szarości co tło, podczas gdy w Rysunek 5 panel A' "Promień toczącej się kuli" wynoszący 500 powoduje silny kontrast między synapsą a tłem.
   6. Utwórz projekcję z, wybierając na pasku narzędzi Obraz | Stos| Projekcja Z, wybierz Typ projekcji = Maksymalna intensywność i zapisz wynikowy obraz. Po zdefiniowaniu odpowiedniej wartości promienia toczącej się kuli uruchom algorytm "Odejmij tło" na pozostałych reprezentatywnych obrazach o tej samej wartości promienia toczącej się kuli. Utwórz projekcje Z i zapisz je (w dowolnym katalogu).
      UWAGA: Wartość promienia toczącej się kuli dla obrazów 8-bitowych lub RGB powinna być co najmniej tak duża, jak promień największego obiektu na obrazie, który nie jest częścią tła. W przypadku obrazów 16-bitowych i 32-bitowych promień powinien być odwrotnie proporcjonalny do zakresu wartości pikseli²².
3. Określ różne progi automatyczne, które będą używane
   1. Otwórz projekcje Z zapisane w poprzednim kroku (6.2.6) i wybierz Obraz | Dostosuj | Funkcja AutoThreshold | Wypróbuj wszystkie.
   2. Ponieważ binarny obraz wynikowy z progiem pojawi się z różnymi algorytmami automatycznego progu, określ najbardziej odpowiedni algorytm dla obrazów.
      1. Podczas późniejszego uruchamiania makra należy odpowiednio zmienić próg w ustawieniach makra.
      2. Użyj bardziej restrykcyjnych progów, takich jak "RenyiEntrophy" lub "Moments" jako progu konspektu NMJ i bardziej liberalnych progów, takich jak "Li" do określenia szkieletu NMJ i "Huang" do określenia stref aktywnych. Gdy obrazy są bardzo ostre z niewielką ilością tła lub bez niego, użyj "Huang" jako "progu konturu NMJ". W przeciwnym razie po segmentacji obrazu może brakować części synapsy.
      3. Zobacz rysunek 5B, aby zapoznać się z przykładem. Odpowiednią segmentację synapsy uzyskuje się za pomocą autoprogów podświetlonych zielonymi polami. Niektóre przykłady nieodpowiednich progów są wyróżnione czerwonymi ramkami (sprawdź synapsy przy dużym powiększeniu). W tym drugim przypadku albo brakuje części synapsy, albo zawarte są części tła. Więcej informacji można znaleźć w odnośniku 23.

4. Określ maksymalny rozmiar małych cząstek
   UWAGA: Ta funkcja wykluczy z analizy wszystkie cząstki wykryte przez próg konturu NMJ i próg szkieletu, które są mniejsze niż zdefiniowana wartość w "ustawieniu małych cząstek". Wartość ta jest definiowana w pikselach. Ta funkcja służy jako filtr szumów i jest bardzo przydatna, gdy w uzyskanych obrazach występują duże ilości niejednorodnego tła (takiego jak kryształy/kurz).
   1. Otwórz projekcje Z zapisane w kroku 6.2.6. i ustaw skalę tak, aby wykrywała liczbę pikseli za pomocą opcji Analizuj | Ustaw skalę. Zastosuj następujące ustawienia: odległość w pikselach = 1, znana odległość = 1, proporcje pikseli = 1, jednostka długości = piksel i naciśnij "OK". Kliknij narzędzie "Owalne zaznaczenie" na pasku narzędzi.
   2. Za pomocą myszy narysuj zaznaczenie ściśle otaczające pojedyncze cząstki, które są obecne w barwieniu immunologicznym, ale nie należą do NMJ. Naciśnij Ctrl+m dla użytkownika systemu Windows lub cmd+m dla użytkowników komputerów Mac. Otworzy się okno wyników, wskazujące obszar cząstek wybranych w liczbie pikseli.
   3. Powtórz poprzedni krok kilka razy z kilkoma artefaktami obecnymi na obrazach, aby określić największy obszar zanieczyszczającej cząstki/artefaktu. Będzie to wartość, którą należy ustawić w ustawieniu podczas późniejszego uruchamiania makra. Podczas uruchamiania makra ustaw "Rozmiar małych cząstek" jako najmniejszy rozmiar cząstek, obserwowany ropa margines 25%.
   4. Zobacz rysunek 5D, aby zapoznać się z przykładem. Największy wykryty kryształ ma powierzchnię 112 pikseli. Ustawienie "Rozmiar małych cząstek" podczas przetwarzania tego obrazu za pomocą makra powinno być ustawione na 125 - 150.

5. Określ minimalny rozmiar butonu
   UWAGA: Ta funkcja wykluczy z analizy wszystkie butony wykryte przez próg konturu NMJ, które są mniejsze niż zdefiniowana wartość. Wartość ta jest definiowana w pikselach.
   1. Wykonaj te same kroki, jak opisano w sekcji 6.4, ale w tym przypadku narysuj zaznaczenie otaczające najmniejsze butony obecne w terminalu NMJ. Wybierz najmniejszy obszar odpowiadający najmniejszemu z mierzonych obszarów. Jest to wartość, którą należy ustawić w ustawieniu minimalnego rozmiaru butonu podczas późniejszego uruchamiania makra.

6. Określ wartość "Maksymalna tolerancja hałasu"
   1. Aby zdefiniować wartość "Znajdź maksymalną tolerancję szumu" dla makra, otwórz kanał 2 Z-stack zapisany w sekcji 6.2.2.
   2. Przejdź do zakładki wtyczki w menu podręcznym, wybierz Proces | Maksimum (3D), a gdy pojawi się maximum_image_name (co może potrwać kilka minut), zamknij oryginalny stos obrazów.
   3. Wybierz Maximum..._image_name (nowo uzyskany stos obrazów) i wybierz Wtyczki | Proces | Minimum (3D), gdy pojawi się nowy obraz Minimum Maximum..._image_name zamknij stos Maksimum ... _image_name.
   4. Na pasku narzędzi wybierz pozycję Proces | Znajdź maksima.... Otworzy się nowe okno "Znajdź maksima...". Zaznacz pole wyboru "Podgląd wyboru punktu..." i wypełnij pole "Tolerancja hałasu" domyślnym ustawieniem makra 50. Punkty maksimów zostaną wskazane na obrazie jako małe krzyżyki.
      1. Zwiększ wartość "Tolerancja szumu" w przypadku zaobserwowania nadmiaru stref aktywnych z adnotacjami, tj. krzyżyków, które nie znajdują się nad aktywnymi strefami, które nie są ostre na wybranej płaszczyźnie stosu, lub fałszywych stref aktywnych, które są wykrywane w tle.
         1. Z drugiej strony, w przypadku obserwacji niekompletnie opisanych stref aktywnych, tj. nierozpoznania aktywnych stref w ostrości, należy zmniejszyć wartość "Maksymalna tolerancja szumu". Kontynuuj wypróbowywanie różnych wartości, postępując zgodnie z tą procedurą, aż krzyżyki odpowiednio oznaczą aktywne strefy w ostrości. Wypełnij pole "Znajdź maksymalną tolerancję hałasu" tą wartością.
         2. Zobacz Rysunek 5C dla przykładu. Wykryto zbyt wiele aktywnych stref. W Rysunek 5C' tylko aktywne strefy są wykrywane podczas zwiększania wartości "Maksymalna tolerancja hałasu".
   5. Uruchom makro podrzędne "Analizuj" dla reprezentatywnych obrazów wybranych w kroku 5.1 z ustawieniami zdefiniowanymi we wszystkich poprzednich krokach.
7. Dostosuj dolny i górny próg Brp-puncta
   1. Zwróć uwagę, że po uruchomieniu makra zgodnie z krokiem 6.6 pojawi się nowy plik o nazwie 2_active_zone_stack_image_name. W tym stosie obrazów aktywne strefy wykryte przez funkcję "Znajdź maksima" są oznaczone białymi kropkami w każdej płaszczyźnie.
   2. Otwórz ten plik, przeciągając go i upuszczając na pasek narzędzi i wybierz Obraz | Stos | Projekt Z | Typ projekcji = Suma wycinków. Uzyskany zostanie rzut 2_active_zone_stack_image_name.
   3. Wybierz punkt menu Obraz | Dostosuj | Próg. Otworzy się nowe okno "Próg". Przesuń górny pasek, aby wybrać wartość progową, w której wszystkie pożądane ogniska/Brp-dodatnie punkty są wizualizowane na czerwono.
      UWAGA: Jeśli próg jest ustawiony zbyt nisko, zostanie zliczony nadmiar aktywnych stref. Jeśli zostanie ustawiona zbyt wysoko, część aktywnych stref zostanie pominięta.
      1. Zobacz przykład Rysunek 5E. Gdy próg jest ustawiony na 400, większość aktywnych stref (symbolizowanych jako ogniska 1 piksela) nie jest uwzględniana w segmentacji, ponieważ nie są one podświetlone na czerwono (Rysunek 5E). Gdy próg jest ustawiony na wartość 50, wszystkie aktywne strefy są podświetlone na czerwono (Rysunek 5E').
   4. Zdefiniuj tę wartość jako minimalny próg. Pozostaw "Górny próg punktowy" na wartości maksymalnej.
   5. Uruchom ponownie makro podrzędne "Analizuj" dla reprezentatywnych obrazów z ustawieniami zdefiniowanymi we wszystkich poprzednich krokach tej sekcji. Krytycznie oceń wynikowe pliki graficzne i upewnij się, że segmentacja została wykonana prawidłowo. Jeśli tak nie jest, dostosuj ustawienia zgodnie z naturą błędów segmentacji (Rysunek 4, Tabela 3).

Results

Plik z wynikami tekstowymi pojawi się w głównym katalogu. Podsumowuje wszystkie zmierzone parametry na obrazie. Wyniki są powiązane z nazwą pliku, a parametry są następnie podsumowywane w kolejności wskazanej w tabelach 1 i 2.

Res_image_name to stos trzech obrazów. Pierwszy obraz przedstawia kontur i szkielet terminala NMJ określony przez makro na podstawie kanału 1 (immunoznakowanie Dlg-1, Hrp, Syt lub Csp). Drugi obraz jest kopią pierwszego obrazu i dodatkowo pokazuje zidentyfikowane punkty Brp-dodatnie, które są wykrywane w kanale 2 jako schematyczne ogniska. Trzeci obraz zapewnia maksymalną projekcję drugiego kanału wraz ze zidentyfikowanymi ogniskami Brp-dodatnimi.

Próg konturu NMJ jest reprezentowany na żółto na obrazie wyniku makr. Z tego progu wyprowadza się obszar, obwód i liczbę bulionów NMJ.

Próg szkieletu NMJ jest reprezentowany na niebiesko na obrazie wyniku makr. Z tego progu wyprowadza się długość NMJ, najdłuższą długość gałęzi, liczbę odgałęzień, punktów rozgałęzień i wysp.

Próg aktywnych stref NMJ nie jest reprezentowany na obrazie wyników makro. Próg ten określa obszar, w którym makro może potencjalnie napotkać ogniska Brp-dodatnie. Ma to na celu utworzenie obszaru NMJ, który jest nieco większy niż ten zdefiniowany przez próg konturu NMJ. W przypadku wybrania zbyt restrykcyjnego progu można wykluczyć ogniska Brp-dodatnie zlokalizowane na marginesie synapsy. Gdy próg jest zbyt dopuszczalny, szum tła może być liczony jako punkty Brp-dodatnie (ryc. 1 - 2).

Aby potwierdzić działanie makro "Drosophila NMJ Morphometrics", przetestowano trzy zmutowane warunki, które zostały już opisane jako prezentujące defekty synaptyczne w różnych parametrach NMJ. Każdy defekt został wykryty przez inną procedurę segmentacji obrazu wykonywaną przez makro (odpowiednio kontur NMJ, szkielet lub strefy aktywne¹⁷). Po ukierunkowaniu trzech interesujących genów za pomocą indukowalnego RNAi i przeprowadzeniu sekcji oraz barwienia immunologicznego NMJ larw L3, przeprowadzono makro. Uzyskane pomiary morfologiczne NMJ porównano następnie parami (RNAi w porównaniu z jego kontrolą) za pomocą testu t. We wszystkich trzech przypadkach stwierdzono różnice statystyczne między mutantami a grupą kontrolną wpływające na parametry zgodne z wcześniej zgłaszanymi wadami morfologicznymi. Potwierdza to, że makra są rzeczywiście w stanie odpowiednio zidentyfikować wcześniej opisane defekty u Drosophila NMJ.

Mutanty Ankyrin 2 (Ank2, CG42734) wykazują defekty morfologii synaptycznej, w tym zrośnięte butony i mniejsze NMJ. Defekty te zaobserwowano dla mutantów Ank2^24,25 i Ank2 knockdown flies²⁶. Zakończenia NMJ panneuronalnych muszek knockdown Ank2-RNAi (w; UAS-Dicer-2/UAS-Ank2 RNAi KK107238; elav-Gal4/+) wykazały istotnie mniejszą powierzchnię NMJ (średnia = 339,25^μm2; test t p = 2,18 x ^10-8) i obwód (średnia = 238,24 μm; test t p = 1,82 x ^10-3), w porównaniu ze zbiorem danych kontroli tła genetycznego (w; UAS-Dicer-2/UAS-KK60100; elav-Gal4/+) (średnia = odpowiednio 451,95 μm² i średnia = 288,62 μm) po uruchomieniu "Drosophila NMJ Morphometrics" (ryc. 6A i 4B).

GTPase Rab3 (CG7576) jest wymagany do prawidłowego rozmieszczenia bruchpilota, a mutant rup ma znacznie zmniejszoną liczbę aktywnych stref²⁷. Znaczny spadek liczby stref aktywnych zaobserwowano podczas pomiaru ognisk Brp-dodatnich za pomocą makro "Drosophila NMJ Morphometrics" w zakończeniach NMJ panneuronalnych muszek knockdown Rab3 (w; UAS-Dicer-2/UAS-RNAi KK100787; elav-Gal4) . Średnia liczba aktywnych stref na terminal NMJ w Rab3-RNAi wynosiła 138, w przeciwieństwie do 290 wykrytych w kontrolnym zestawie danych (/+) test t p = 4,43 x ^10-29) (ryc. 6A i 4C).

Highwire (hiw, CG32592) jest ważnym regulatorem wzrostu NMJ; mutacje w genie hiw prowadzą do przerostu i wydłużenia rozgałęzień końców NMJ²⁸. Pomiar zakończeń NMJ panneuronalnej linii knockdown Hiw-RNAi (w; UAS-Dicer-2/UAS-RNAi-GD36085; elav-Gal4/+) z "Drosophila NMJ Morphometrics", zaobserwowano istotne różnice w parametrach pochodzących ze szkieletu: długość (średnia = 147,36 μm; średnia kontrolna = 122,07 μm; test t p = 7,31 x ^10-7), najdłuższa długość gałęzi (średnia = 122,19 μm; średnia kontrolna = 105,65 μm; test t p=4,62 x ^10-4) liczba gałęzi (średnia = 7,69; średnia kontrolna = 5,74; test t p = 2,52 x ^10-2) i liczba punktów rozgałęzień (średnia = 2,73; średnia kontrolna = 1,79; test t p = 3,31 x ^10-2). Wszystkie te parametry były istotnie podwyższone (120 - 180%) w porównaniu z kontrolnymi tłami genetycznymi (w; UAS-Dicer-2/UAS-GD60000; elav-Gal4/+) (rysunki 6A i 4D).

Rycina 1: Drosophila_NMJ_Morphometrics mierzy 9 parametrów Drosophila NMJ. Po lewej stronie znajdują się terminale NMJ znakowane immunologicznie Dlg-1 i Brp, zobrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą ApoTome. Po prawej stronie znajdują się obrazy wyników po uruchomieniu "Drosophila NMJ Morphometrics". Parametry powierzchnia, obwód i bulony są reprezentowane przez wskazany żółty kontur z adnotacjami makro. Parametry długość, najdłuższa długość gałęzi (LBL), rozgałęzienia, punkty rozgałęzień i wyspy są prezentowane przez niebieski kontur z adnotacjami makro. Ogniska (strefy aktywne) znakowane immunologicznie Brp są reprezentowane przez makro jako białe plamy na obrazach wynikowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Drosophila NMJ Bouton Morphometrics mierzy 8 parametrów Drosophila NMJ. Po lewej stronie znajduje się końcówka NMJ znakowana immunologicznie Syt-1 i Brp, zobrazowana pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą ApoTome. Po prawej stronie znajdują się obrazy wyników po uruchomieniu "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Parametry butonów i obszaru bouton są reprezentowane przez żółty kontur z adnotacjami makro. Parametry długość, najdłuższa długość gałęzi (LBL), rozgałęzienia, punkty rozgałęzień i wyspy są prezentowane przez niebieski kontur z adnotacjami makro. Ogniska (strefy aktywne) znakowane immunologicznie Brp są reprezentowane przez makro jako białe plamy na obrazach wynikowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat blokowy przedstawiający makra morfometrii Drosophila NMJ i morfometrii Drosophila NMJ Bouton. Pierwsze makro podrzędne "Konwertuj na stos" tworzy projekcje i hiperstosy obrazowanych NMJ. Drugie makro podrzędne "Zdefiniuj ROI" wymaga ręcznego wprowadzenia danych określających lokalizację terminala NMJ, który Cię interesuje. Submakro trzecie, "Analizuj", mierzy wszystkie parametry NMJ. Plik tekstowy zawierający wartości ilościowe oraz plik obrazu wynikowego przedstawiający rozgraniczenie parametrów są tworzone, aby pomóc użytkownikowi w ocenie wydajności makr. Gdy obrazy są rejestrowane w różnych warunkach, ustawienia makr muszą zostać przetestowane i dostosowane, aby zapewnić dokładną analizę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przykłady niewłaściwych wyników segmentacji makro. Obrazy wynikowe po uruchomieniu "Drosophila NMJ Morphometrics" lub "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Części zakończenia synaptycznego nie są uwzględnione w żółtym konturze (A). Części tła są zawarte w końcu synaptycznym przez żółty kontur (B). Niebieska linia szkieletu rozciąga się poza zakończenie synaptyczne (C - D). Wykryto zbyt wiele aktywnych stref (E - E'). Niektóre strefy aktywne pozostają niewykryte przez analizę (G - G'). Strefy aktywne są wykrywane poza synapsą (F). Nieprawidłowa segmentacja Boutonów (dotyczy tylko korzystania z morfometrii Drosophila NMJ Bouton), brak boutonów (H) lub wykrycie zbyt wielu butonów przez segmentację (I). Cząstki, takie jak kryształy lub pył, które są częścią tła, są objęte segmentacją (J). Informacje o tym, jak zmienić ustawienia, aby uniknąć tych błędów, znajdują się w Tabeli 3. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykłady korekt ustawień makro i ich konsekwencje dla segmentacji obrazu. (A) Odejmij podgląd tła synapsy znakowanej immunologicznie Dlg-1, zobrazowanej pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą ApoTome, gdy "Promień toczącej się kuli" jest ustawiony na 20 (A) lub 500 (A'). (B) Obrazy wyjściowe uzyskane po uruchomieniu Image | Dostosuj | Automatyczny próg | Wypróbuj wszystko, co ilustruje segmentacje obrazu uzyskane przez 16 różnych algorytmów automatycznego progu. (C) Podgląd "Znajdź maksima" podczas ustawiania "Tolerancja hałasu" na 50 (C) i 500 (C'); Aktywne strefy, które są wykrywane przez segmentację, są oznaczone małym krzyżykiem. (D) Pomiar "małych cząstek" pojawiających się w tle obrazu synapsy znakowanej immunologicznie anty-Hrp, zobrazowanych pod mikroskopem konfokalnym. (E) Rzut "sumy wycinków" otrzymany z 2_active_zone_stack_ima-ge_name. Próg ustala się na 400 (E) i na 50 (E'). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Ocena makro i kwantyfikacja NMJ na mięśniach 4. (A) Obrazy wyników po uruchomieniu makra "Drosophila NMJ Morphometrics" na terminalach NMJ znakowanych immunologicznie Dlg-1 i Brp. Parametry powierzchnia, obwód i bulony są reprezentowane przez żółty kontur z adnotacjami makro. Parametry długość, najdłuższa długość gałęzi (LBL), rozgałęzienia, punkty rozgałęzień i wyspy są prezentowane przez niebieski kontur z adnotacjami makro. Ogniska (strefy aktywne) znakowane immunologicznie Brp są reprezentowane przez makro jako białe plamy na obrazach wynikowych. Pasek skali wskazuje 20 μm. (B) knockdown Ankyrin2 RNAi wykazuje mniejszy obszar i obwód NMJ w porównaniu z kontrolami tła genetycznego. (C) knockdown Rab3 spowodował NMJ z mniejszą liczbą aktywnych stref Brp-dodatnich w porównaniu z kontrolami tła genetycznego. (D) Knockdown highwire skutkował dłuższymi, dłuższymi gałęziami, bardziej rozgałęzionymi i z większą liczbą punktów rozgałęzień na zaciski NMJ w porównaniu z NMJ kontrolnymi w tle genetycznym. Słupki błędów wskazują SEM, ** p < 0,01, dwustronny test T. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

parametr	Struktura NMJ	wyjaśnienie
Powierzchnia (μm2)	Zarys NMJ	Obszar kompletnego oznakowanego NMJ
Obwód (μm)	Zarys NMJ	Obwód należący do obszaru
#Boutons	Zarys NMJ	Liczba boutonów synaptycznych ("pereł na sznurku") NMJ
Długość (μm)	szkielet	Całkowita długość całego terminala NMJ
Najdłuższa długość gałęzi (μm)	szkielet	Suma długości najdłuższej ciągłej ścieżki łączącej dowolne dwa punkty końcowe NMJ
#Branches	szkielet	Łączna liczba oddziałów
#Branching punktów	szkielet	Liczba punktów rozgałęzienia (kilka rozgałęzień może wywodzić się z jednego punktu rozgałęzienia)
#Islands	szkielet	Liczba niepołączonych Dlg1-dodatnich przedziałów synaptycznych (lub dowolnego innego barwienia)
#Active stref	Plamy Brp-dodatnie	Liczba aktywnych stref na podstawie barwienia Brp

Tabela 1: Parametry NMJ mierzone przez "Drosophila NMJ Morphometrics". Parametry NMJ zmierzone za pomocą makra "Drosophila NMJ Morphometrics" pojawią się jako lista w otrzymanym pliku tekstowym, zgodnie z kolejnością opisaną w tej tabeli. Ta tabela jest przedrukiem z Nijhof et al.¹⁷

parametr	Struktura NMJ	wyjaśnienie
Butony	Zarys NMJ	Liczba boutonów synaptycznych ("pereł na sznurku") NMJ
okolice Bouton	Zarys NMJ	Łączna powierzchnia wszystkich bulionów
Długość (μm)	szkielet	Całkowita długość całego terminala NMJ
Najdłuższa długość gałęzi (μm)	szkielet	Suma długości najdłuższej ciągłej drogi łączącej dowolne dwa punkty końcowe NMJ
#Branches	szkielet	Łączna liczba oddziałów
#Branching punktów	szkielet	Liczba punktów rozgałęzienia (kilka rozgałęzień może wywodzić się z jednego punktu rozgałęzienia)
#Islands	szkielet	Liczba niepołączonych Dlg1-dodatnich przedziałów synaptycznych (lub dowolnego innego barwienia)
#Active stref	Plamy Brp-dodatnie	Liczba aktywnych stref na podstawie barwienia Brp

Tabela 2: Parametry NMJ mierzone przez "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Parametry NMJ zmierzone przez makro "Drosophila_Bouton_NMJ_Morphometrics" pojawią się w postaci listy w otrzymanym pliku tekstowym, zgodnie z kolejnością opisaną w tej tabeli. Ta tabela jest przedrukiem z Nijhof et al.¹⁷

segmentacja	Zaobserwowane błędy	przykład	Wymagane korekty
Obszar i obwód NMJ (reprezentowane przez żółty kontur na obrazie wynikowym)	Części zakończenia synaptycznego albo nie są uwzględnione w żółtym konturze, albo części tła są zawarte w końcu synaptycznym zaznaczonym na żółto.	Rysunek 5A-B	Dostosuj wartość "Promień toczącej się piłki". Patrz punkt 6.1.	Dostosuj "Próg konturu NMJ". Patrz punkt 6.2.
Parametry związane z długością NMJ (reprezentowane przez niebieską linię szkieletu na obrazie wyników)	Niebieska linia szkieletu albo rozciąga się poza cały koniec synaptyczny, albo nie występuje wzdłuż niego.	Rysunek 5C-D	Dostosuj wartość "Promień toczącej się piłki". Patrz punkt 6.1.	Dostosuj "Próg konturu NMJ". Patrz punkt 6.2.
Brp-dodatnia punktacja (reprezentowana przez kropki na obrazie wyników)	Wykryto zbyt wiele aktywnych stref.	Rysunek 5E-E'	Zmniejsz wartość "Znajdź maksymalną tolerancję hałasu". Patrz punkt 6.5.
Brp-dodatnia punktacja (reprezentowana przez kropki na obrazie wyników)	Aktywne strefy są pomijane w analizie.	Rysunek 5G-G'	Zwiększ wartość "Znajdź maksymalną tolerancję hałasu". Patrz punkt 6.5.	Zmniejszyć 'Brp-puncta dolny próg'. Patrz punkt 6.6.
Brp-dodatnia punktacja (reprezentowana przez kropki na obrazie wyników)	Artefakty strefy aktywnej są wykrywane poza terminalem synaptycznym.	Rysunek 5F	Dostosuj "Próg aktywnej strefy" w sekcji 6.2.	Zwiększ "Brp-puncta dolny próg". Patrz punkt 6.6.
Małe cząstki	Cząstki, takie jak kryształy lub pył, które są częścią tła, wydają się być uwzględnione w segmentacji.	Rysunek 5J	Zaznacz pole "Usuń małe cząstki". Patrz punkt 6.3.	Określ maksymalny rozmiar małych cząstek. Patrz punkt 6.3.
Segmentacja Boutona	Nieprawidłowa segmentacja Boutonu (dotyczy tylko Drosophila NMJ Bouton Morphometrics; nie należy używać Drosophila NMJ Morphometrics do segmentacji Bouton).	Rysunek 5H-I	Dostosuj "Próg konturu NMJ". Patrz punkt 6.1.	Określ "minimalny rozmiar batutonu". Patrz punkt 6.4.

Tabela 3: Przewodnik rozwiązywania problemów z różnymi rodzajami błędów w segmentacji obrazów, które mogą być generowane przez makra. W tej tabeli opisano różne rodzaje błędów segmentacji obrazów generowanych przez makra. Można je łatwo wykryć na obrazach wyników. Przykłady każdego typu błędu przedstawiono na rysunku 4. W "sekcji regulacji" tabeli wyróżnione są ustawienia, które należy dostosować, a użytkownik jest odsyłany do krytycznego kroku podrzędnego w sekcji 6, który opisuje, jak dostosować te ustawienia.

Discussion

"Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ bouton Morphometrics" to potężne narzędzia dla badaczy zainteresowanych oceną morfologii synaps. Ręczna ocena parametrów NMJ jest pracochłonna; szacuje się, że makra zaoszczędziłyby doświadczonemu badaczowi do 15 minut/NMJ poświęconych na ręczną segmentację obrazu. Przy jednym do dwóch tuzinów synaps ocenianych pod kątem stanu lub genotypu, szybko sumuje się to do znacznej ilości zaoszczędzonego czasu, nawet w badaniach na małą skalę. W przypadku wykonywania dużych ekranów korzyści wynikające z zastosowania analizy o wysokiej przepustowości w porównaniu z ręczną oceną i kwantyfikacją mogą być ogromne. Oprócz zwiększonej przepustowości makra z łatwością zapewniają obiektywną analizę; Wykluczają one osobiste uprzedzenia, które w przeciwnym razie wymagałyby zaślepionych eksperymentów, a także różnice interpersonalne, które występują, gdy w analizę zaangażowanych jest wielu badaczy. Wreszcie, makra zapewniają czułą i dokładną analizę cech NMJ, umożliwiając identyfikację regulatorów synaptycznych, które powodują raczej subtelne niż dramatyczne defekty NMJ i do tej pory pozostawały niedocenione przez oko badacza. Szczegółowe informacje na temat procedur walidacji i algorytmów wykorzystywanych w makrach znajdują się w publikacji Nijhof et al.^{Rozdział 17}.

Funkcjonalność makr została zwalidowana w celu odpowiedniego pomiaru cech morfologicznych NMJ Drosophila melanogaster w mięśniu 4. Następnie wykazano, że makra były również odpowiednie do analizy synaps w innych mięśniach tego organizmu. Jest prawdopodobne, że makra mogą być również wykorzystywane do pomiaru parametrów morfologicznych NMJ o podobnej budowie u innych gatunków, w tym innych gatunków Drosophila i innych owadów. Nawet NMJ bardzo odległe w ewolucji, np. NMJ myszy, wykazują dość podobną konformację strukturalną²⁹. Makra nie były testowane na preparatach NMJ innych gatunków, ale zachęca się potencjalnych użytkowników do testowania makr w takich celach.

Bardzo ważne jest, aby użytkownik zapoznał się z różnymi automatycznymi progami i algorytmami, aby zdefiniować/wybrać najbardziej odpowiednie ustawienia makr dla obrazów. Dzięki tym ustawieniom dokładność wynosi około 95%, gdy ocena makro została porównana z oceną ręczną. Dostosowanie ustawień makr do prawidłowej segmentacji 100% obrazów może być bardzo pracochłonną lub nawet niemożliwą procedurą. Dlatego zaleca się wykluczenie obrazów, które nie są odpowiednio podzielone na segmenty, jeśli ich liczba jest mniejsza niż 5%. Oczywiście, jeśli jakość obrazów jest niska, makra będą generować wyższe proporcje niezadowalających segmentacji obrazu. Obrazy o niskiej jakości będą w podobny sposób wpływać na ocenę ręczną i dlatego nie mogą być powiązane z wydajnością makr. Niemniej jednak makra są dość solidne, ponieważ zostały zaprojektowane z myślą o obrazach generowanych za pomocą mikroskopu o wysokiej zawartości (zautomatyzowanego mikroskopu fluorescencyjnego, który umożliwia obrazowanie dużej liczby próbek)¹⁷.

Krytycznym punktem jest to, że użytkownik wizualnie sprawdza wszystkie obrazy wynikowe generowane przez makra. Pozwoli to na wykrycie i wykluczenie zdjęć z niesatysfakcjonującą segmentacją. W sekcji 6 tego protokołu użytkownik jest instruowany, jak dostosować ustawienia w celu prawidłowej segmentacji obrazu podczas uruchamiania podmakra "Analizuj". Aby szybko zapoznać się z wymaganiami makr i sposobem dostosowywania ustawień makr, w repozytorium makr znajduje się folder o nazwie "Examples_adjusting ustawienia makr" https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1. Dostępnych jest trzynaście podfolderów, z których każdy zawiera przykładowe obrazy uzyskane na różnych platformach mikroskopowych (mikroskopy o wysokiej zawartości/konfokalne/fluorescencyjne) i różne barwienia immunologiczne. W tym samym folderze, w którym znajdują się ustawienia wymagane dla każdego przykładu, znajduje się plik PDF zatytułowany "Przewodnik po przykładach", a także dokument tekstowy zawierający oczekiwane wyniki i obrazy wyników.

Makra zostały zaprojektowane do przetwarzania obrazów zapisanych jako .tiff oddzielnych plików, niemniej jednak niektórzy użytkownicy mogli zapisać swoje obrazy w innym formacie. Poniższa strona internetowa https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1²¹ zawiera folder o nazwie "Drosophila NMJ", w którym znajdują się trzy przykładowe pliki (Przykład 1 - 3) oraz dokument "Przewodnik po przykładach" ze szczegółowymi instrukcjami, jak importować obrazy do makra, jeśli nie są przechowywane jako .tiff oddzielone pliki, można również znaleźć w tym samym folderze.

Razem, makra "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ bouton Morphometrics" określają ilościowo dziesięć różnych cech NMJ: obszar NMJ, obwód NMJ, liczba boutonów, obszar NMJ bouton, długość NMJ, najdłuższa długość gałęzi NMJ, liczba wysp, liczba gałęzi, liczba punktów rozgałęzień i liczba aktywnych stref. Daje to ogromną przewagę nad dotychczas dostępnymi narzędziami, które mogą ocenić tylko jedną lub kilka cech synaptycznych^30,31. Wieloparametryczna analiza ilościowa niesie ze sobą ogromny potencjał dla nowych odkryć, np. w celu zidentyfikowania nowych regulatorów, które kontrolują jeden z wielu aspektów biologii synaps. Zapewnia również wymaganą rozdzielczość do określenia genów, które współregulują dokładnie te same lub nakładające się na siebie cechy NMJ, a zatem prawdopodobnie działają we wspólnych szlakach molekularnych. Wreszcie, otwiera to możliwość zbadania, w jaki sposób różne parametry synaptyczne korelują ze sobą w niezakłóconych warunkach¹⁷ i które geny zapewniają takie skoordynowane korelacje morfometryczne.

Podsumowując, protokół ten ilustruje, w jaki sposób można korzystać z dwóch makr "Drosophila NMJ Morphometrics" i "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", które przeprowadzają obiektywną i czułą kwantyfikację dziesięciu cech morfologicznych NMJ w sposób wysokoprzepustowy.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Barwienie immunologiczne			Rozcieńczenie
Mysie anty-dyski duże 1	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (sprzęgnięty przy użyciu zestawu do znakowania Zenon Alexa Fluor 528)
Królicza peroksydaza antychrzanowa	Jackson IR	323-005-021	1/500
Królik anty-Synaptotagmin	Prezent od Hugo Bellen		Jan-00
Mysie białko strunowe anty-cysteinowe	Badania rozwojowe Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (sjungowane przy użyciu zestawu do znakowania Zenon Alexa Fluor 528)
myszy anty-Bruchpilot	Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Kozioł anty-mysz Alexa Fluor 488	Technologie życia	A11029	1/200
Koza anty-królik Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Zestaw do etykietowania myszy IgG1	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Materiał	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Sprzęt
Mikroskop konfokalny lub mikroskop fluorescencyjny	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Komputer	Mac lub PC
Materiał<	silny>Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Software
FIJI