Artykuł metodologiczny

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/55397

⸱

3 kwietnia 2017

 , 
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo wszystkich osiągnięć technologicznych na poziomie mikroskopii świetlnej, mikroskopia elektronowa pozostaje jedynym narzędziem w neurobiologii do badania i charakteryzowania ultrastrukturalnych i morfologicznych szczegółów neuronów, takich jak kontakty synaptyczne. Dobre zachowanie tkanki mózgowej do mikroskopii elektronowej można uzyskać za pomocą rygorystycznych metod kriofiksacji, ale techniki te są dość kosztowne i ograniczają stosowanie znakowania immunologicznego, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia połączeń zidentyfikowanych systemów neuronalnych. Opracowano metody substytucji przez wymrażanie, aby umożliwić połączenie kriofiksacji z immunoznakowaniem. Jednak powtarzalność tych podejść metodologicznych zwykle opiera się na kosztownych urządzeniach zamrażających. Co więcej, osiąganie wiarygodnych wyników za pomocą tej techniki jest bardzo czasochłonne i wymaga umiejętności. W związku z tym tradycyjny chemicznie utrwalony mózg, szczególnie z utrwalaczem akroleiny, pozostaje efektywną czasowo i tanią metodą łączenia mikroskopii elektronowej z immunohistochemią. W tym miejscu zapewniamy niezawodny protokół eksperymentalny wykorzystujący chemiczne utrwalanie akroleiny, który prowadzi do zachowania tkanki mózgowej naczelnych i jest zgodny z wstępnym badaniem immunohistochemicznym i transmisyjnym mikroskopem elektronowym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia świetlna, w tym mikroskopia konfokalna i dwufotonowa, okazała się skutecznym narzędziem do badania procesów neuronalnych in vivo, między innymi1,2. Chociaż typowa rozdzielczość przestrzenna na poziomie mikroskopu świetlnego (LM) wynosi około 200 nm, ostatnie postępy technologiczne wykorzystujące różne źródła światła, takie jak mikroskopia ekstremalnego ultrafioletu i miękkiego promieniowania rentgenowskiego, znacznie zwiększyły tę rozdzielczość do prawie 10 nm rozdzielczości przestrzennej3,4,5. Inne osiągnięcia technologiczne w obrazowaniu obejmują połączone obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego z histologią i zapewniają nowatorską metodę pomiaru grubości osłonki mielinowej in vivo, parametru, który tradycyjnie można było zmierzyć tylko na poziomie mikroskopu elektronowego (EM)6,7. Chociaż te postępy na poziomie LM stanowią doskonałe narzędzie do badania procesów życiowych, szczegółowy widok i charakterystykę struktur, takich jak kontakty synaptyczne, można osiągnąć tylko za pomocą EM, który oferuje rozdzielczość sięgającą 0,5 nm. Jednak obserwacja na poziomie EM wymaga, aby próbki były martwe i zmienione w pewien sposób, za pomocą chemicznych utrwalaczy i procesów odwadniania, w celu zachowania cytoarchitektury. W związku z tym badanie próbek biologicznych w wysokiej rozdzielczości może być trudne ze względu na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem wiązki elektronów, niski kontrast, odchylenia strukturalne membran, a nawet obecność artefaktów, które mogą wystąpić po odwodnieniu i zatopieniu żywicy epoksydowej8,9,10.

Zachowanie próbek w ich natywnej formie do analizy strukturalnej można osiągnąć za pomocą "Cryo EM of Vitrified Sections" lub CEMOVIS, metody przekroju, która polega na szybkim zamrożeniu i zatopieniu próbki w szklistym lodzie oraz zbadaniu przekrojów pod EM w temperaturze kriogenicznej11,12. Procedura ta pozwala na badanie próbek, gdy są jeszcze stałe i w pełni uwodnione, eliminując w ten sposób artefakty spowodowane procesami dehydracji13. Metoda ta obejmuje jednak dodatkowe urządzenia do krioultramikrotomii, a także dodatkowe urządzenia na standardzie EM, w celu umożliwienia tej obserwacji w bardzo niskich temperaturach, co generuje znaczne dodatkowe koszty. Ponadto podejście opracowane w ramach projektu CEMOVIS wyklucza stosowanie technik znakowania immunologicznego, ponieważ przeciwciała zwykle muszą być inkubowane w temperaturze pokojowej. Alternatywnie możliwe jest połączenie analizy ultrastrukturalnej z procedurami immunohistochemicznymi przy użyciu podejścia zamrażającego i substytucji, podczas którego próbki krioutrwalone są powoli rozmrażane, gdy są zanurzone w krioochronnych chemikaliach, a następnie są zatapiane w specjalistycznych żywicach, takich jak Lowicryls. Znakowanie immunologiczne po osadzeniu można następnie przeprowadzić na takim materiale12. Jednak techniki zamrażania i krioutrwalania są czasochłonne. Wymagają one instalacji dodatkowego sprzętu i nadal wymagają wystawienia próbek na działanie rozpuszczalnika organicznego i chemicznego utrwalacza, które mogą zmienić cytoarchitekturę, pomimo użycia niskiej temperatury14,15. W związku z tym, pomimo całego postępu technologicznego zarówno na poziomie LM, jak i EM, chemiczne utrwalanie tkanki mózgowej, szczególnie za pomocą akroleiny, pozostaje tanią i efektywną czasowo metodą łączenia immunohistochemii z EM16.

W ostatnich dziesięcioleciach podjęto wiele prób znalezienia mieszaniny aldehydów, które zapewniają najlepszą konserwację tkanek. Przed 1960 rokiem jedynym chemicznym utrwalaczem, który dawał akceptowalne wyniki dla EM, był tetratlenek osmu. Jednak tetratlenek osmu jest wysoce toksyczny i drogi, co wyklucza jego stosowanie przez układ naczyniowy do naprawy narządów, takich jak mózg. Akroleina została wprowadzona pod koniec lat pięćdziesiątych XX wieku jako niezawodna metoda konserwacji tkanek zwierzęcych odpowiednia do obserwacji EM struktur komórkowych17. Wnika głębiej w tkankę i reaguje szybciej niż inne aldehydy, gdy jest używany do utrwalania przez zanurzenie i pozwala na dobre zachowanie składników cytoplazmatycznych, przy minimalnym skurczu tkanki17. Taka cecha daje utrwalaniu akroleiny wyraźną przewagę nad innymi aldehydami, gdy jest stosowane w świeżej tkance, umożliwiając dokładniejszą lokalizację żywych związków molekularnych, takich jak enzymy i inne białka18. Rzeczywiście, przez lata była zatwierdzana jako łatwa, wydajna i tania metoda utrwalania do wizualizacji na poziomie EM u wielu gatunków, w tym i gryzoni, ponieważ skutecznie stabilizuje peptydy i białka, zachowuje antygenowość i zapewnia stosunkowo nienaruszoną ultrastrukturę, gdy jest stosowana w połączeniu z innym utrwalaczem aldehydowym16,18,19,20,21. Od tego czasu protokoły wiązania akroleiny u gryzoni zostały ustandaryzowane i szeroko stosowane, szczególnie przez grupę Pickel, w celu wdrożenia podwójnego immunoznakowania dla EM16,22. Kilka grup stosowało utrwalanie akroleiny w tkance mózgowej naczelnych innych niż ludzie23. Jednakże, zgodnie z naszą wiedzą, istnieje tylko jeden opublikowany protokół skutecznie opisujący chemiczne wiązanie akroleiny u naczelnych innych niż ludzie, który jest zgodny z immunoznakowaniem EM24.

W tym artykule przedstawiamy łatwą i niezawodną metodę skutecznego chemicznego unieruchamiania mózgów naczelnych za pomocą akroleiny, co pozwala na potencjalnie długoterminową konserwację wraz z wstępnym wbudowaniem immunoznakowania i badania EM transmisji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval i zostały sporządzone zgodnie z Przewodnikiem Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt doświadczalnych (Ed. 2). Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany dla dorosłych zwierząt o wadze około 800 g. Objętości utrwalacza należy dostosować do wielkości zwierzęcia.

1. Przygotowanie roztworów do perfuzji przezsercowej

  1. Przygotować 1 l 50 mM roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem sodu (PBS) zgodnie z poniższymi krokami. Przygotować roztwór najpóźniej 24 godziny przed perfuzją i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    1. Odmierz 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 l. Dodać 5,87 g dwuzasadowego bezwodnego fosforanu sodu (Na2HPO4), 1,20 g jednowodnego jednowodnego fosforanu sodu (NaH2PO4·H2O) i 9 g chlorku sodu (NaCl). Mieszaj do rozpuszczenia.
    2. Dostosuj pH do 7,4, stopniowo dodając 5 N NaOH. Dodać wodę destylowaną, aby osiągnąć całkowitą objętość 1 l.
      UWAGA: NaOH jest związkiem chemicznym. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (środki ochrony indywidualnej; fartuch laboratoryjny, rękawice, okulary ochronne itp.).
  2. Przygotuj 2 l 4% paraformaldehydu (PFA) zgodnie z poniższymi krokami. Roztwór ten należy przygotować najpóźniej 24 godziny przed zabiegiem i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    1. Odmierz 1,5 l wody destylowanej w zlewce o pojemności 2 l. Dodać 23,48 g dwuzasadowego bezwodnego fosforanu sodu (Na2HPO4) i 4,80 g jednozasadowego jednowodnego fosforanu sodu (NaH2PO4·H2O). Mieszaj do rozpuszczenia. Dodaj wodę destylowaną, aby osiągnąć całkowitą objętość 2 l.
    2. Podgrzewać roztwór pod okapem wentylacyjnym, aż temperatura osiągnie około 45 - 55 °C. Nie podgrzewać do temperatury powyżej 60 °C.
    3. Stopniowo dodawać 80 g PFA do roztworu i mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia (około 30 - 60 min). Monitoruj temperaturę, aby utrzymać ją poniżej 60 °C.
      UWAGA: PFA jest wysoce lotny w postaci proszku. Jest wysoce toksyczny w kontakcie z oczami lub skórą i jest niebezpieczny w przypadku wdychania lub spożycia. Nosić środki ochrony osobistej i używać ostrożnie pod okapem wentylacyjnym.
    4. Schłodzić roztwór do temperatury 4 °C i przefiltrować. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj 1 l 3% akroleiny w 0,1 M buforze fosforanowym (PB) zgodnie z poniższymi krokami. Roztwór PB należy przygotować najpóźniej 24 godziny przed perfuzją.
    UWAGA: Akroleina jest wysoce toksyczna w przypadku wdychania i może spowodować natychmiastowe uszkodzenia. Jest również i wysoce toksyczny, jeśli jest wchłaniany przez skórę. Jest rakotwórczy i mutagenny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i używać pod okapem wentylacyjnym.
    1. Odmierz 800 ml wody destylowanej. Dodać 8,66 g dwuzasadowego bezwodnego fosforanu sodu (Na2HPO4) i 5,38 g jednozasadowego jednowodnego fosforanu sodu (NaH2PO4·H2O). Mieszaj, aż wszystkie sole się rozpuszczą. Dodać wodę destylowaną do uzyskania całkowitej objętości 1 l. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przed zabiegiem należy przenieść 900 ml roztworu PB do szklanego pojemnika o pojemności 1 litra i dodać 30,94 ml 97% roztworu akroleiny pod okapem wentylacyjnym. Dodaj roztwór PB do uzyskania całkowitej objętości 1 l i wymieszaj. Przefiltrować roztwór i utrzymywać go w temperaturze 4 °C.

2. Perfuzja przezsercowa i rozwarstwienie mózgu

  1. Utrzymuj roztwory na lodzie podczas całego zabiegu chirurgicznego. Przygotować pompę, umieszczając rurkę w pierwszym roztworze, który ma być użyty (PBS; 50 mM) i włączając pompę, aż w wężu nie pozostanie powietrze. Do perfuzji przezsercowej makaka należy użyć igły 21 G i ustawić odpływ na około 80 ml/min.
  2. Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem domięśniowym mieszaniny ketaminy (20 mg/kg), ksylazyny (4 mg/kg) i acepromazyny (0,5 mg/kg). Utrzymuj zwierzę w sedacji izofluranem (3%).
  3. Przymocuj kończyny zwierzęcia do stołu wentylacyjnego.
  4. Za pomocą skalpela usuń skórę aż do pach. Przetnij mięśnie brzucha. Użyj wytrzymałych nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć żebra na boki, ostrożnie omijając ważne narządy.
  5. Przetnij przeponę nożyczkami chirurgicznymi i podnieś klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Po przecięciu membrany postępuj szybko, ponieważ serce przestanie bić w ciągu kilku minut.
  6. Usuń osierdzie za pomocą ostrza skalpela i włóż igłę do lewej komory. Za pomocą skalpela ostrożnie wykonaj małe wycięcie w prawym przedsionku. Szybko uruchomić pompę z prędkością 72 ml/min i przytrzymać igłę na miejscu. Jeśli to możliwe, przechyl zwierzę tak, aby jego głowa znajdowała się niżej niż serce.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie przebić przegrody międzykomorowej podczas wprowadzania igły.
    1. Przepłukać krew około 300 ml PBS, aż płuca będą białe i krew nie będzie wypływać z prawego przedsionka.
  7. Zatrzymaj pompę, szybko przenieś wąż/rurkę do 3% roztworu akroleiny i ponownie uruchom pompę. Stopniowo zwiększaj prędkość pompowania do 80 ml/min, gdy serce przestanie bić. Ukrwić około 500 ml roztworu akroleiny.
  8. Zatrzymaj pompę, szybko przenieś wąż do 4% roztworu PFA i ponownie uruchom pompę. Ten etap wymaga około 1 l PFA.
    UWAGA: Stabilizacja jest zakończona, gdy kończyny przednie są sztywne, a szyja sztywna.
  9. Odetnij głowę i ostrożnie wypreparuj mózg z czaszki. Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu narzędziami chirurgicznymi. Perfuzja jest optymalna, gdy mózg jest blady (bez śladu krwi) i sztywny (ryc. 1A).
  10. Zanurz nienaruszony mózg w 4% PFA na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  11. Szeregowo pokrój mózg za pomocą wibratomu chłodzącego (4 °C) w żądanej płaszczyźnie na odcinki o grubości 50 μm i zbierz je w PBS (0,1 M) (Rysunek 1B).
    UWAGA: Ten krok można przeprowadzić na wiele sposobów zgodnie z żądanym protokołem. Półkule można oddzielić przed przecięciem wibratomu lub zachować w całości. Jeśli mózg jest zbyt duży dla platformy wibratomu, można go pociąć na mniejsze bloki. Po tym etapie skrawki mogą być przechowywane przez długi czas w temperaturze -30 °C w roztworze niezamarzającym wykonanym z 40% PB (50 mM), 30% glicerolu i 30% glikolu etylenowego.

3. Wstępne osadzenie immunohistochemii (Rysunek 1C)

  1. Przygotować 4 l roztworu podstawowego soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS, 50 mM, pH 7,6) w następujący sposób.
    1. Odmierzyć 2 l wody destylowanej w zlewce o pojemności 4 l, dodać 24,23 g trihydroksymetyloaminometanu (THAM; C4H11NO3) i mieszać do rozpuszczenia.
    2. Doprowadzić pH do 7,6 za pomocą około 148 ml 1 N HCl. Kwas należy dodawać ostrożnie, aby uniknąć osiągnięcia pH poniżej 7,6. Całkowita objętość powinna wynosić 4 L.
      UWAGA: HCl jest silnie. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
  2. Wybierz sekcje (z kroku 2.11) zawierające obszar zainteresowania, który ma być przetworzony do immunohistochemii EM.
  3. Przemyć swobodnie pływające sekcje 3x w PBS (0,1 M, pH 7,4) przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu wypłukania roztworu płynu niezamarzającego.
  4. Przygotować 0,5% roztwór NaBH4 rozcieńczony w PBS.
    1. Odważyć 0,05 g NaBH4 i rozcieńczyć go w 10 ml PBS. Nie zakrywaj. Przygotuj ten roztwór tuż przed użyciem.
  5. Inkubować skrawki w świeżo przygotowanym roztworze NaBH4 przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie kołysać. Nie zakrywaj.
  6. Myć 3x w PBS przez 10 min w temperaturze pokojowej, energicznie kołysząc, aż nie pozostanie żaden z gazów reakcyjnych.
  7. Przygotować roztwór blokujący dla EM z 2% odpowiedniej normalnej surowicy i 0,5% żelatyny z zimnych ryb rozcieńczonych w PBS.
    UWAGA: Ilość należy obliczyć, aby wystarczyła na następujące trzy kroki. Należy użyć surowicy wykonanej z tego samego gatunku zwierząt, w którym występuje przeciwciało drugorzędowe. Należy unikać stosowania metod pobierania antygenu lub dodawania niewielkich ilości trytonu (w celu zwiększenia penetracji przeciwciał), ponieważ metody te znacznie pogarszają jakość tkanki.
  8. Inkubować skrawki w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Delikatnie kołysać.
  9. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała rozcieńczony w roztworze blokującym.
    UWAGA: Stężenie przeciwciała pierwszorzędowego jest zwykle takie samo jak w immunohistochemii LM, ale należy rozważyć wcześniejsze przeprowadzenie testów z różnymi stężeniami przeciwciał, ponieważ niektóre przeciwciała pierwszorzędowe mogą nie działać z akroleiną. Jeśli tak, możliwe jest użycie mieszaniny aldehydu glutarowego (0,1 - 2%) i 4% PFA do perfuzji przezsercowej i uzyskanie podobnych wyników. Zoptymalizuj również czas inkubacji i temperaturę.
  10. Skrawki należy inkubować w roztworze przeciwciała pierwotnego przez noc w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc. Użyj wcześniej przetestowanego czasu inkubacji i temperatury.
  11. Umyj sekcje 3x w PBS przez 5 min w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.
  12. Przygotować roztwór biotynylowanego przeciwciała drugorzędowego w stosunku 1:1 000 rozcieńczonego w roztworze blokującym.
    UWAGA: Przeciwciało drugorzędowe musi zostać podniesione przeciwko gatunkom gospodarza użytym do wytworzenia przeciwciała pierwszorzędowego.
  13. Inkubować skrawki w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej. Delikatnie rozdrabniać.
  14. Przygotować roztwór peroksydazy awidyno-biotynowej (ABC) co najmniej 60 minut przed zakończeniem inkubacji przeciwciał wtórnych.
    1. Za pomocą skalibrowanej pipety odmierzyć 8,80 μl/ml roztworów A i B i rozcieńczyć je w PBS.
    2. Kołysać delikatnie przez co najmniej 60 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić całkowite związanie cząsteczek awidyny i biotyny.
  15. Po inkubacji w roztworze przeciwciał drugorzędowych przemyć 3x w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  16. Inkubować skrawki w roztworze ABC przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Delikatnie kołysać.
  17. Prać raz w PBS i dwa razy w TBS przez 10 minut w temperaturze RT z delikatnym kołysaniem.
  18. Przygotować świeży roztwór 0,05% 3,3'-diaminozydyny (DAB) z 0,005%H2O2rozcieńczony w TBS.
    1. Odważyć 12,5 mg DAB i rozcieńczyć go w 25 ml zimnego TBS. Chronić przed światłem.
      UWAGA: Proszek DAB jest bardzo lotny i szkodliwy w przypadku wdychania. Jest rakotwórczy i teratogenny. Dlatego kobiety w ciąży lub karmiące piersią nie powinny manipulować tym produktem, nawet po rozcieńczeniu. Podczas manipulacji używaj maski N95 i noś środki ochrony osobistej.
    2. Przefiltrować roztwór i dodać 4,5 μl 30%H2O2 tuż przed użyciem.
  19. Inkubuj sekcje w roztworze DAB przez 3 do 7 minut w temperaturze pokojowej. Kołysz delikatnie.
    UWAGA: Brązowy osad nie powinien być zbyt ciemny, aby uniknąć wysokiego poziomu zabarwienia tła. Czas inkubacji powinien być odpowiednio zoptymalizowany.
  20. Zatrzymaj reakcję, szybko myjąc dwa razy w zimnym TBS, następnie dwa razy przez 10 minut w zimnym TBS w RT, a następnie dwa razy przez 10 minut w PB, z łagodnym kołysaniem.
    UWAGA: Użycie PB (a nie PBS) ma kluczowe znaczenie w celu wyeliminowania wszelkich śladów NaCl, ponieważ reagowałby on z osmem i tworzył kryształy.

4. Osmyfikacja i osadzanie do obserwacji mikroskopowej elektronów

  1. Przygotować roztwór 1% tetratlenku osmu (OsO4) rozcieńczony w PB. Chronić przed światłem.
    UWAGA: Osm jest wysoce toksyczny i nie powinien mieć kontaktu ze skórą, oczami ani ustami i nie powinien być wdychany. Może spowodować śmierć w przypadku połknięcia. Powinien być używany wyłącznie pod okapem wentylacyjnym i z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
  2. Skrawki należy inkubować w roztworze OsO4 przez 30 minut w temperaturze pokojowej pod pokrywą wentylacyjną (bez mieszania) i przykryć folią aluminiową w celu ochrony przed światłem. Całkowicie spłaszcz sekcje przed dodaniem roztworu OsO4.
    UWAGA: Sekcje stają się bardzo ciemne i sztywne i należy z nimi obchodzić się ostrożnie po wykonaniu tego kroku.
  3. Przygotuj wodoodporną żywicę epoksydową podczas osmityfikacji.
    1. Dodaj odpowiednie ilości każdego składnika mieszanki żywic epoksydowych (20 g żywicy epoksydowej, 20 g utwardzacza, 0,6 g akceleratora i 0,4 g plastyfikatora) do dużego plastikowego kubka. Mieszać drewnianym patyczkiem lub plastikową pipetą, aż do uzyskania jednorodnego brązowego koloru.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby użyć dokładnej proporcji każdego składnika.
    2. Przenieś równe ilości do aluminiowych kubków o odpowiednich rozmiarach, w zależności od liczby sekcji do obróbki. Pozwól mu odpocząć.
  4. Umyj sekcje osmifikowane 3x w PB przez 10 min w temperaturze mokrej z kołysaniem na niskich obrotach.
  5. Odwodnić sekcje w następujących seriach sortowanego etanolu przez 2 minuty każda: 2 razy w 35% etanolu; 1 raz każdy w 50, 70, 80, 90 i 95% etanolu i 3 razy w 100%
    6. etanolu.
  6. Przenieś skrawki do szklanych fiolek, aby zakończyć proces odwadniania, inkubując skrawki 3 razy przez 2 minuty w tlenku propylenu.
    UWAGA: Tlenek propylenu jest wysoce lotnym i toksycznym rozpuszczalnikiem organicznym. Może spowodować poważne uszkodzenie oczu lub skóry w przypadku kontaktu, wdychania lub połknięcia. Został sklasyfikowany jako substancja rakotwórcza stopnia 2. Powinien być używany wyłącznie pod okapem wentylacyjnym i ze środkami ochrony osobistej. Jest również wysoce łatwopalny i należy go trzymać z dala od wszelkich źródeł ciepła.
    UWAGA: Przed tym etapem skrawki należy ostrożnie przenieść w szklanych fiolkach, ponieważ tlenek propylenu jest rozpuszczalnikiem organicznym i jest niekompatybilny z plastikiem. W tym momencie sekcje są bardzo delikatne i należy z nimi obchodzić się ostrożnie. Skrawki można alternatywnie przenieść do szklanych fiolek przed wykonaniem kroku 4.5.
  7. Ostrożnie przenoś sekcje, jedna po drugiej, w aluminiowych kubkach i w miarę możliwości unikaj kontaktu z powietrzem. Zanurz sekcje na płasko we wcześniej zmieszanej wodoodpornej żywicy epoksydowej i inkubuj je przez noc pod okapem wentylacyjnym w RT.
    UWAGA: Na tym etapie skrawki są całkowicie odwodnione i bardzo delikatne i należy z nimi obchodzić się ostrożnie.
  8. Używając oleju mineralnego, przygotuj szkiełka pokryte tłuszczem wraz z natłuszczonymi plastikowymi szkiełkami nakrywkowymi.
  9. Zmiękcz żywicę, inkubując aluminiowe kubki w temperaturze 60 °C przez maksymalnie 12-15 minut. Ostrożnie spłaszcz sekcje po natłuszczonej stronie szkiełka podstawowego. Umieść natłuszczone szkiełko nakrywkowe i ostrożnie wypchnij pozostałe powietrze.
  10. Inkubować szkiełka w temperaturze 60 °C przez 48 h.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie przekraczać 48 godzin czasu inkubacji, ponieważ żywica stanie się zbyt twarda.
  11. Usuń plastikowe szkiełko nakrywkowe.

5. Przygotowanie próbki do ultracienkiego przekroju i obserwacji za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego

  1. Użyj lornetki, aby znaleźć obszar zainteresowania i wytnij skalpelem mały czworokątny kawałek o boku około 1mm2.
  2. Spiłuj końcówkę bloku żywicy i przyklej do niego czworokątny kawałek (Rysunek 1C). Pozostaw klej do wyschnięcia na co najmniej 1 godzinę lub na noc przed cięciem.
  3. Za pomocą ultramikrotomu pokrój czworokątny kawałek na odcinki o grubości 80 μm (rysunek 1D).
    1. Umieść blok żywicy w talii ultramikrotomowej w pozycji pionowej i za pomocą ostrej żyletki stopniowo odetnij każdą stronę bloku żywicy, aby utworzyć trapez o gładkich bokach.
    2. Ustaw pokład w pozycji poziomej i obracaj blok, aż najdłuższy bok trapezu będzie skierowany w dół.
    3. Użyj diamentowego narzędzia do przycinania lub noża do szkła, aby przyciąć powierzchnię czworokątnego elementu. Ustaw ultramikrotom tak, aby tnął odcinki o grubości 300 μm z prędkością 1 mm/s. Ustaw nóż tak, aby był pionowo równoległy do czworokątnego elementu i wyświetlał bardzo mały kąt poziomy około 1°.
      UWAGA: Ten kąt pozwoli użytkownikowi zbliżyć się do tkanki prawie równolegle do powierzchni bloku, gdzie istnieje większe prawdopodobieństwo znalezienia elementów znakowanych immunologicznie. Podczas używania tych parametrów z narzędziem do przycinania diamentów, żywica ma błyszczący biały kolor. Kiedy tkanka jest cięta, zmienia kolor na fioletowy lub zielonkawy.
    4. Użyj noża diamentowego o ultra 45° wyposażonego w łódkę wypełnioną wodą destylowaną, aby wyciąć odcinki o grubości 80 μm, wygładzić sekcje, przechodząc po nich kawałkiem papieru chłonnego zakończonego ksylenem i zebrać odcinki szeregowe na siatkach niklowych pokrytych formvarem lub gołych siatkach miedzianych o oczkach 150 (rysunek 1E).
  4. Umieść kratki w skrzynce do przechowywania siatki.
  5. Zabarwić siatki cytrynianem ołowiu.
    1. Za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i filtra strzykawkowego 0,2 μm przygotować roztwór podstawowy cytrynianu ołowiu w stosunku 1:1 i przefiltrowaną wodę destylowaną. Chroń go przed światłem.
      UWAGA: Roztwór podstawowy cytrynianu ołowiu powinien być świeży co miesiąc, aby uniknąć tworzenia się stałych osadów. Recepturę zapasów można znaleźć w karcie danych materiałowych. Ponadto, jeśli konieczne jest zabarwienie wielu serii siatek, zmień rozcieńczony roztwór, gdy stanie się mleczny.
    2. Umieść każdą siatkę na kropli rozcieńczonego roztworu, tak aby sekcja stykała się z roztworem. Inkubować przez 3 minuty.
    3. Użyj małej pęsety, aby przytrzymać siatkę i dokładnie opłucz ją w dwóch zlewkach zawierających wodę destylowaną.
    4. Usuń nadmiar wody, delikatnie używając papieru do wchłaniania. Przechowuj siatki w pudełku z siatką. Odczekaj 30 minut przed zbadaniem skrawków za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM; Rysunek 1F).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej sekcji prezentujemy reprezentatywne wyniki, które uzyskano po obserwacji, na poziomie transmisji EM, immunologicznie wybarwionej tkanki mózgowej naczelnych chemicznie utrwalonej mieszaniną 3% akroleiny i 4% PFA. Udało nam się dobrze zachować ultrastrukturę, na co wskazuje stosunkowo nienaruszona osłonka mielinowa i schludna wizualizacja podwójnych błon (ryc. 2A). Kontakty synaptyczne, wraz z elementami neuronalnymi z mikrośrodowiska, można łatwo zidentyfikować (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiamy niezawodny protokół perfuzji przezsercowej naczelnych innych niż człowiek oraz wstępne zagłębienie immunohistochemiczne odpowiednie do badania próbki EM. Chociaż typowy cryo-EM, taki jak CEMOVIS, zapewnia dobre zachowanie ultrastruktury mózgu, ogranicza również zastosowanie immunohistochemii12. Inne techniki, w tym kriosubstytucja i technika Tokuyaso, pozwalają na immunohistochemię po osadzeniu, ale techniki te są drogie ze względu na dodatkowe urządzenia potrzebne pod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Kanadyjską Radę ds. Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią (NSERC, 401848-2011 do M.P.). M.P otrzymał nagrodę za całokształt kariery od Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). L.E. był stypendystą FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Dziękujemy Marie-Josée Wallman za pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dwuzasadowy bezwodny fosforan sodu (Na2HPO4)Fisher scientificS374-500
Monozasadowy monohydrat fosforanu sodu (NaH2PO4· H2O)EM ScienceSX0710-1
Chlorek sodu (NaCl)Fisher scientificS271-3
Hydroksymetyloaminometan (THAM)Fisher scientificT370-500
HCl EMDHX0603-3Rozcieńczenie 1 N. Produkt jest. Stosować z zachowaniem odpowiedniej ochrony.
NaOHEMDSX0590-1Rozcieńczenie 5 N. Produkt jest. Stosować z zachowaniem odpowiedniej ochrony.
Paraformaldehyd (PFA)SigmaP61484% rozcieńczenie. Produkt jest wysoce lotny w postaci proszku i wysoce toksyczny. Używaj ostrożnie pod okapem wentylacyjnym z odpowiednią ochroną.
Akroleina (90%)Sigma1102213% rozcieńczeniu. Produkt jest wysoce toksyczny. Stosować pod okapem wentylacyjnym z odpowiednią ochroną.
Stół do wentylacji autopsjiMopecCE400
Elektroniczna pompa perfuzyjnacole parmermasterflex L/S 7523-90
Igła (perfuzja)terumo NN-1838R18 G 11/2
Igłaterumo NN-2713R21 G 1/2
Ketamina20 mg/kg
Ksylazyna4 mg/kg
Acepromazyna0,5 mg/kg
Skalpel
Ostrza skalpela Pióro                    lanca201011                    J9913nr 22 do chirurgii i nr 11 do
nożyczek
Rongeurs
VibratomeLeicaVT 1200SKalibruj ostrze przed każdym użyciem, gdy urządzenie na to pozwala
Żyletka VibratomeGilletteGIN 642107
GlycerolFisher scientificG33-430% rozcieńczenie
Glikol etylenowyFisher scientificE178-430% rozcieńczenie
Borowodorek sodu (NaBH4)SigmaS-9125
Normalna surowica konia (NHS)Jackson immunoResearch Laboratories008-000-121% rozcieńczenie
Żelatyna rybna na zimnoAurion900.0330,5% rozcieńczenie. Oryginalny produkt jest skoncentrowany w 40%
Przeciwciało pierwszorzędowe, SERTSanta Cruz biotechnologySC-1458/500 rozcieńczenie
Przeciwciało pierwszorzędowe, ChATChemicon (Millipore)AB144P1/25 rozcieńczenie
Przeciwciało pierwszorzędowe, THImmunoStar229411/1,000 rozcieńczenie
Biotynylowane przeciwciało drugorzędowe, kozaLaboratoria wektoroweBA-95001/1,000 Rozcieńczenie
Biotynylowane przeciwciało drugorzędowe, mysieLaboratoria wektoroweBA-20001/1,000 rozcieńczenie
Vectastain elite ABC zestaw VectorlaboratoriesPK61008,8 i mikro; L / ml A i B po
3,3'-diaminobenzydynie (DAB)SigmaD56370,05% rozcieńczenie. Produkt jest wysoce lotny w postaci proszku i toksyczny. Nie wyrzucaj odpadów do zlewu.
Nadtlenek (H2O2) 30%Fisher scientificH-3230,005% rozcieńczenie
Tetratlenek osmu (OsO4)Mikroskopia elektronowa2% 19152
4% 19150
Oryginalny roztwór może wynosić 2 lub 4%. Zwróć uwagę na to, który z nich jest używany do obliczania końcowego 1% rozcieńczenia. Produkt jest bardzo wrażliwy na światło. Osm jest wysoce toksyczny. Używać tylko pod okapem wentylacyjnym z odpowiednią ochroną.
Wodoodporna żywica epoksydowa DurcupanSigmaA: M żywica epoksydowa (44611)
B: utwardzacz 964 (44612)
C: akcelerator 960 (DY 060) (44613)
D: plastyfikator (44614) 		Polimeryzować 48 h w temperaturze 58 & stopni; C przed wyrzuceniem odpadów.
Kubki aluminioweMikroskopia elektronowa70048-01
Alkohole etylowekomercyjne 1019CRozcieńczyć w wodzie destylowanej o odpowiednim stężeniu
Tlenek propylenuMikroskopia elektronowa20401Rozpuszczalnik organiczny. Wysoce lotny i toksyczny. Stosować pod okapem wentylacyjnym.
Niepowlekane średnie szkiełka szkiełkowelaboratoria badań mózgu3875-FRPowierzchnia smarowana olejem mineralnym
Folia z tworzywa sztucznego (folia do zatapiania Aclar)Mikroskopia elektronowa50425-25Powierzchnia smarowana olejem mineralnym
UltramikrotomLeica UC7EM UC7
Diamentowe narzędzie do przycinania (ultratrim)Diatome UT 1081Można używać noża do szkła alternatywnie
Ultra 45° Nóż diamentowy DiatomeDiatome MC13437wyposażony w łódź:
KsylenyFisher scientificX5SK-4
Siatki miedziane o oczkach 150Mikroskopia elektronowaG150-cu
grid-boxMikroskopia elektronowa71138Może przechowywać do 100 siatek
Cytrynian soduAnachemia81983
Azotan ołowiuSigmaL-6258Przygotuj roztwór podstawowy cytrynianu ołowiu o zawartości 1,33  g azotanu ołowiu i 1,76  g cytrynianu sodu rozcieńczonego w 42  ml przegotowanej i schłodzonej wody destylowanej, do której należy dodać 8  ml 1  N NaOH dodaje się po zakończeniu konwersji z azotanu ołowiu na cytrynian ołowiu. pH powinno wynosić około 12. Przechowuj roztwór w hermetycznej plastikowej butelce i chroń przed światłem.
Strzykawkaterumo SS-05L5 ml
Filtr strzykawkowyCorning4312220,2 i mikro; m
Papier absorpcyjny (bibulous paper)Mikroskopia elektronowa70086-1
ParafilmFolia laboratoryjnaPM-999
Olej mineralnySigmaM5904
chirurgicznych EM 2 1

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008(2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Acrolein FixationTissue SectioningAntibody IncubationDAB StainingOsmium TetroxideEpoxy Resin EmbeddingUltramicrotomy

Powiązane artykuły