Jednoczesna ocena właściwości hemodynamiki mózgu i rozpraszania światła w mózgu szczura in vivo za pomocą wielospektralnego obrazowania odbicia rozproszonego

Summary

Jednoczesna ocena hemodynamiki mózgu mózgu i właściwości rozpraszania światła w tkance mózgowej szczura in vivo jest demonstrowana przy użyciu konwencjonalnego wielospektralnego systemu obrazowania odbicia rozproszonego.

Abstract

Jednoczesna ocena hemodynamiki mózgu i właściwości rozpraszania światła w tkance mózgowej szczura in vivo jest demonstrowana przy użyciu konwencjonalnego wielospektralnego systemu obrazowania odbicia rozproszonego. System ten składa się z szerokopasmowego źródła światła białego, zmotoryzowanego koła filtrów z zestawem wąskopasmowych filtrów interferencyjnych, światłowodu, soczewki zbierającej, obiektywu zmiennoogniskowego wideo i monochromatycznej kamery z ładowanym urządzeniem sprzężonym (CCD). W kości czaszki szczura w znieczuleniu izofluranowym wykonuje się elipsoidalne okno czaszki w celu uchwycenia in vivo wielospektralnych obrazów rozproszonego odbicia powierzchni kory mózgowej. Regulacja frakcji wdychanego tlenu za pomocą urządzenia do mieszania gazów umożliwia indukcję różnych stanów oddechowych, takich jak normoksja, hiperoksja i anoksja. Następnie przeprowadzana jest oparta na symulacji Monte Carlo analiza regresji wielorakiej dla zmierzonych wielospektralnych obrazów odbicia dyfuzyjnego na dziewięciu długościach fal (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 i 760 nm) w celu wizualizacji dwuwymiarowych map hemodynamiki i właściwości rozpraszania światła w mózgu szczura in vivo.

Introduction

Wielospektralne obrazowanie odbicia dyfuzyjnego jest najczęstszą techniką uzyskiwania przestrzennej mapy wewnętrznych sygnałów optycznych (IOS) w tkance korowej. IOS obserwowane w mózgu in vivo przypisuje się głównie trzem zjawiskom: różnicom we właściwościach absorpcji i rozpraszania światła spowodowanym hemodynamiką korową, zmianom absorpcji w zależności od redukcji lub utleniania cytochromów w mitochondriach oraz zmianom właściwości rozpraszania światła wywołanym zmianami morfologicznymi¹.

Światło w zakresie widzialnym (VIS) do bliskiej podczerwieni (NIR) jest skutecznie absorbowane i rozpraszane przez tkankę biologiczną. Rozproszone widmo odbicia mózgu in vivo charakteryzuje się widmami absorpcyjnymi i rozpraszającymi. Zmniejszone współczynniki rozpraszania μ_s' tkanki mózgowej w zakresie długości fal od VIS do NIR skutkują monotonnym widmem rozpraszania wykazującym mniejsze wielkości przy dłuższych falach. Widmo zredukowanego współczynnika rozpraszania μ_s'(λ) można w przybliżeniu przedstawić jako funkcję prawa potęgowego^2,3 jako μ_s'(λ) = a × ^λ-b. Moc rozpraszania b jest związana z wielkością biologicznych rozpraszaczy w żywej tkance^2,3. Zmiany morfologiczne tkanki i zmniejszenie żywotności żywej tkanki korowej mogą wpływać na wielkość biologicznych rozpraszaczy^4,5,6,7,8^,9.

System optyczny do wielospektralnego obrazowania odbicia dyfuzyjnego można łatwo zbudować z żarowego źródła światła, prostych komponentów optycznych i monochromatycznego urządzenia z naładowanym sprzężeniem (CCD). W związku z tym do oceny hemodynamiki kory i/lub morfologii tkanek zastosowano różne algorytmy i systemy optyczne do wielospektralnego obrazowania odbicia rozproszonego i / lub morfologii tkanek^{10,11,12,13,14,15,16,17, 18}.

Metoda opisana w tym artykule jest używana do wizualizacji zarówno właściwości hemodynamicznych, jak i rozpraszania światła w tkance mózgowej szczura in vivo przy użyciu konwencjonalnego wielospektralnego systemu obrazowania rozproszonego odbicia. Przewagą tej metody nad technikami alternatywnymi jest możliwość oceny zmian czasoprzestrzennych zarówno w hemodynamice mózgu, jak i morfologii tkanki korowej, a także jej zastosowanie do różnych modeli zwierzęcych dysfunkcji mózgu. Dlatego metoda będzie odpowiednia do badań nad urazowym uszkodzeniem mózgu, napadami padaczkowymi, udarem mózgu i niedokrwieniem.

Protocol

Protokoły opieki nad zwierzętami, przygotowania i eksperymentów zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Rolnictwa i Technologii w Tokio. W przypadku tej metodyki szczur jest trzymany w kontrolowanym środowisku (24 °C, 12 godzin cyklu światła/ciemności), z jedzeniem i wodą dostępnymi ad libitum.

1. Budowa konwencjonalnego wielospektralnego systemu obrazowania z rozproszonym odbiciem

1. Zamontuj dziewięć wąskopasmowych filtrów interferencyjnych optycznych o środkowych długościach fal 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 i 760 nm w otworach filtrowych zmotoryzowanego koła filtrów.
2. Zbuduj system obrazowania wielospektralnego przy użyciu szerokopasmowego źródła światła białego, zmotoryzowanego koła filtrów z powyższym zestawem wąskopasmowych filtrów interferencyjnych, światłowodu, soczewki zbierającej, obiektywu zmiennoogniskowego i monochromatycznej kamery CCD. Układ elementów optycznych, pokazany na rysunku 2, może być odwołany do tej procedury konstrukcyjnej.
   UWAGA: Kąt oświetlenia wynosi około 45° w stosunku do powierzchni próbki.
3. Włącz źródło światła lampy halogenowej, aby oświetlić powierzchnię próbki za pomocą filtra interferencyjnego, światłowodu i soczewki zbierającej.
4. Otwórz oprogramowanie operacyjne kamery CCD.

2. Przygotowanie zwierząt

UWAGA: W tym protokole szczur nie był wykorzystywany do przyszłych eksperymentów i został złożony w ofierze natychmiast po pomiarach obrazów wielospektralnych.

1. Podłącz port wlotowy komory indukcyjnej do portu wylotowego aparatu do znieczulenia za pomocą rurki. Podłącz port wylotowy komory indukcyjnej do portu wlotowego aparatu do znieczulenia za pomocą drugiej rurki.
2. Umieścić szczura w komorze indukcyjnej i wywołać znieczulenie 5,0% izofluranem. Utrzymuj znieczulenie na takiej głębokości, aby szczur nie reagował na szczypanie palców u stóp. Obniż do 2,0% izofluranu za pomocą pokrętła na aparacie anestezjologicznym.
3. Zamocuj głowę szczura w stereotaktycznej ramce. Przymocuj ustnik do znieczulenia do ramy stereotaktycznej.
4. Podłącz port wlotowy ustnika do portu wylotowego aparatu do znieczulenia za pomocą rurki. Podłącz otwór wylotowy ustnika do portu wlotowego aparatu do znieczulenia za pomocą rurki.
5. Ogol obszar głowy poza potencjalne miejsce nacięcia za pomocą maszynki do strzyżenia włosów, aż pojawi się powierzchnia skóry.
6. Wykonać podłużne nacięcie o długości około 20 mm wzdłuż linii środkowej głowy za pomocą skalpela chirurgicznego (ryc. 1 lit. a)) i odsłonić podskórne tkanki łączne (ryc. 1 lit. b)).
7. Usuń podskórne tkanki łączne za pomocą ostrej łyżeczki lub szczypiec i pociągnij ją po obu stronach głowy, aby odsłonić kość czaszki (ryc. 1(c)).
8. Wykop elipsoidalny rów na kości czaszki wewnątrz szwów czaszkowych (szew koronalny, szew strzałkowy i szew lambdoidalny) za pomocą wiertła o dużej prędkości (ryc. 1 (d)).
9. Powoli i równomiernie wykop kość czaszki do rowu za pomocą wiertła szybkoobrotowego.
10. Lekko dociśnij powierzchnię przerzedzonej czaszki czubkiem szczypiec, aby oszacować grubość i siłę kości po pojawieniu się naczynia krwionośnego mózgu. Jeśli przerzedzony obszar czaszki łatwo się wciska, zakończ redukcję kości czaszki za pomocą wiertła o dużej prędkości.
11. Przetnij elipsoidalną linię graniczną przerzedzonej czaszki na kawałki za pomocą końcówki szczypiec lub małych nożyczek chirurgicznych.
12. Powoli i delikatnie usuń przerzedzoną czaszkę z powierzchni mózgu za pomocą szczypiec.
13. Delikatnie wykąpać okienko czaszki solą fizjologiczną i przykryć je przezroczystą szklaną płytką o grubości około 0,1 mm.

3. Regulacja frakcji wdychanego tlenu

UWAGA: Stan oddechowy można zmienić, regulując frakcję wdychanego tlenu (FiO₂).

1. Za pomocą rurki podłącz pierwszy port łącznika rurowego w kształcie litery Y (złącze 1) do pierwszego portu innego łącznika rurki w kształcie litery Y (łącznik 2).
2. Podłącz port wlotowy ustnika do drugiego portu złącza rurki 1.
3. Za pomocą rurki podłącz trzeci port złącza rurki 1 do urządzenia monitorującego stężenie tlenu.
4. Za pomocą rurki podłącz drugi port złącza rurki 2 do portu wylotowego aparatu do znieczulenia.
5. Za pomocą rurki podłącz trzeci port złącza rurki 2 do portu wylotowego urządzenia do mieszania gazów.
6. Podłącz jeden port wlotowy urządzenia do mieszania gazów do butli z gazem pod wysokim ciśnieniem 95% O₂ - 5% CO₂ za pomocą rurki.
7. Podłącz drugi port wlotowy urządzenia do mieszania gazów do butli z gazem pod wysokim ciśnieniem 95% N₂ - 5% CO₂ za pomocą rurki.
8. Zmień natężenia przepływu gazu_O2 i_N2 za pomocą pokręteł na urządzeniu do mieszania gazów.
9. Sprawdź i wyreguluj FiO₂ za pomocą urządzenia monitorującego stężenie tlenu.

4. Akwizycja wielospektralnych obrazów o rozproszonym współczynniku odbicia

1. Akwizycja obrazów referencyjnych
   UWAGA: Elementy optyczne użyte w tym eksperymencie, takie jak źródło światła, światłowód i detektory, mają swoje własne charakterystyki widmowe. W związku z tym natężenie światła przechodzącego przez te składowe powinno być rejestrowane jako obraz referencyjny. Obraz referencyjny to obraz wykonany za pomocą standardowego białego dyfuzora oświetlonego światłem ze źródła światła.
   1. Umieść standardowy biały dyfuzor na scenie poziomo.
   2. Ustaw ostrość obiektywu aparatu na powierzchni białego dyfuzora, obracając pierścień zmiany ogniskowej na tubule.
   3. Dostosuj czas integracji kamery, wybierając odpowiednią wartość z rozwijanej listy czasów integracji w oprogramowaniu operacyjnym kamery tak, aby największa ilość światła wytwarzała sygnał wynoszący około 75% maksymalnych zliczeń. Obserwując histogram wartości pikseli, dostosuj czas całkowania, aż poziom intensywności sygnału osiągnie około 75% maksymalnych zliczeń.
   4. Wybierz polecenie "zapisz" z menu plików, aby zapisać obraz do pliku.
   5. Zmień położenie filtra, obracając pokrętło filtra.
   6. Zapisz obraz na innych długościach fal zgodnie z procesem opisanym powyżej. Nazwa pliku powinna identyfikować próbkę i użytą długość fali (np. W500, W520, W540 ... W760).
2. Akwizycja przykładowych obrazów
   Uwaga: Obrazy natężenia rozproszonego światła odbitego od mózgu szczura na dziewięciu długościach fal są rejestrowane i zapisywane na dysku twardym komputera osobistego przy użyciu tych samych warunków akwizycji.
   1. Delikatnie umieść szczura na scenie i powoli dostosuj poziom sceny, aby kamera mogła ustawić ostrość na powierzchni mózgu szczura.
   2. Wybierz polecenie "zapisz" z menu plików, aby zapisać obraz do pliku.
   3. Zmień położenie filtra, obracając pokrętło filtra.
   4. Zapisz obraz na innych długościach fal zgodnie z procesem opisanym powyżej. Nazwa pliku powinna identyfikować próbkę i długość fali (np. R500, R520, R540 ... R760).
3. Akwizycja ciemnych obrazów
   UWAGA: Kamera CCD może generować natężenie światła w odpowiedzi na sygnał elektryczny. Jednak występuje niewielka moc wyjściowa spowodowana szumami w obwodach elektrycznych i detektorach, nawet jeśli światło nie dostaje się do detektora; Nazywa się to szumem ciemnego prądu. Aby dokładnie zmierzyć natężenie widmowe światła, składową prądu ciemnego należy zarejestrować jako ciemny obraz, a następnie odjąć od mierzonego sygnału. Ciemny obraz to obraz zrobiony z zablokowaną ścieżką światła.
   1. Wyłącz halogen lamp źródło światła.
   2. Zablokuj drogę światła do systemu kamer CCD za pomocą płytki ekranującej.
   3. Wybierz polecenie "zapisz" z menu plików, aby zapisać obraz do pliku. Nazwa pliku powinna identyfikować próbkę (np. Dark).

5. Wizualizacja zawartości hemoglobiny i parametru rozpraszania światła

UWAGA: Zestaw wielospektralnych obrazów odbicia dyfuzyjnego jest zapisywany na dysku twardym komputera osobistego i analizowany w trybie offline. Następnie przeprowadzana jest analiza regresji wielorakiej wspomagana symulacją Monte Carlo¹⁹ wielospektralnych obrazów odbicia rozproszonego na dziewięciu długościach fal (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 i 760 nm) w celu wizualizacji dwuwymiarowych map stężenia hemoglobiny natlenionej, stężenia hemoglobiny odtlenionej, całkowitego stężenia hemoglobiny, regionalnego nasycenia mózgu tlenem i mocy rozpraszania. Szczegółowy algorytm został opublikowany w literaturzes^17,18.

1. Odejmij ciemny obraz zarówno od obrazu referencyjnego, jak i od przykładowego obrazu na każdej długości fali.
2. Znormalizuj obraz próbki za pomocą obrazu referencyjnego dla każdej długości fali λ. Traktuj znormalizowany obraz jako obraz odbicia rozproszonego R.
3. Obliczyć obraz absorbancji (lub gęstości optycznej) A, biorąc logarytm odwrotności obrazu odbicia rozproszonego R dla każdej długości fali λ:
   (1)
4. Wygeneruj trójwymiarową matrycę, układając obrazy absorbancji w kolejności ich długości fal, gdzie płaszczyzna x-y pokazuje informacje strukturalne uzyskane dla powierzchni mózgu, a oś z pokazuje informacje spektralne.
5. Przeprowadzić analizę regresji wielokrotnej dla widma absorbancji A(λ) dla każdej współrzędnej x-y.
6. Jako zmienne niezależne dla kroku 5.5 należy zastosować widmo absorbancji A(λ) jako zmienną zależną oraz widma współczynnika ekstynkcji molowej hemoglobiny utlenionej ε_HbO (λ) i hemoglobiny odtlenionej ε_HbR (λ) (wartości opublikowane dla ε_HbO (λ) i ε_HbR (λ) przedstawiono w tabeli 1).
7. Sprawdź dwuwymiarowe mapy (obrazy) trzech współczynników regresji wielokrotnej _HbO, _HbR i ₀.
8. Wygeneruj trójwymiarową matrycę, układając obrazy wielu współczynników regresji w kolejności _HbO, _HbR i ₀, gdzie płaszczyzna x-y pokazuje informacje strukturalne uzyskane dla powierzchni mózgu, a oś z pokazuje wielokrotne współczynniki regresji.
9. Obliczyć stężenie hemoglobiny utlenionej C_HbO, stężenie hemoglobiny odtlenionej C_HbR i moc rozpraszania b ze zbioru współczynników regresji wielokrotnej_{a HbO, HbR} i ₀ na każdej współrzędnej x-y, korzystając z następujących wzorów empirycznych (wartości he β_HbO,i, β_{HbR, i} oraz β_0,i (i = 0,1,2,3) przedstawiono w tabeli 2):
   (2)
   (3)
   (4)
10. Sprawdź dwuwymiarowe mapy (obrazy) stężenia hemoglobiny utlenionej C_HbO, stężenia hemoglobiny odtlenionej C_HbR i mocy rozpraszania b.
11. Oblicz dwuwymiarową mapę całkowitego stężenia hemoglobiny C_HbT, sumując C_HbO i C_HbR na każdej współrzędnej x-y.
12. Obliczyć dwuwymiarową mapę regionalnego nasycenia mózgu tlenem rSO₂, dzieląc stężenie hemoglobiny natlenionej C_HbO przez całkowite stężenie hemoglobiny C_HbT na każdej współrzędnej x-y.

Results

Reprezentatywne obrazy spektralne rozproszonego odbicia uzyskane z mózgów szczurów in vivo są pokazane na rysunku 3. Obrazy przy długości fali 500, 520, 540, 560, 570 i 580 nm wyraźnie uwidaczniają gęstą sieć naczyń krwionośnych w korze mózgowej. Pogorszenie kontrastu między naczyniami krwionośnymi a otaczającymi tkankami obserwowane na obrazach przy 600, 730 i 760 nm odzwierciedla mniejszą absorpcję światła przez hemoglobinę na dłuższych falach i NIR.

Discussion

Najważniejszym krokiem w tym protokole jest usunięcie przerzedzonego obszaru czaszki w celu wykonania okna czaszki; Należy to zrobić ostrożnie, aby uniknąć nieoczekiwanego krwawienia. Ten krok jest ważny dla uzyskania wysokiej jakości wielospektralnych obrazów odbicia rozproszonego z dużą dokładnością. Jeśli to możliwe, do zabiegu chirurgicznego zaleca się użycie mikroskopu stereoskopowego. Małe kawałki gąbki żelatynowej są przydatne do hemostazy.

Układ optyczny opisany w tym artykule przepusz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Źródło światła lampy halogenowej 150 W	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokio, Japonia	LA-150SAE
Światłowód	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokio, Japonia	LGC1-5L1000
Soczewka kolekcjonerska	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokio, Japonia	SH-F16
Filtry interferencyjne l@ 500 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japonia	65088
Filtry interferencyjne l@ 520 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japonia	#65093
Filtry interferencyjne l@ 540 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japonia	#65096
Filtry interferencyjne l@ 560 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japonia	#67766
Filtry interferencyjne l@ 570 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japonia	#67767
Filtry interferencyjne l@ 580 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japonia	#65646
Filtry interferencyjne l@ 600 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japonia	#65102
Filtry interferencyjne l@ 730 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japonia	#65115
Filtry interferencyjne l@ 760 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japonia	#67777
Zmotoryzowane koło filtrów	Andover Corporation, NH, USA	FW-MOT-12.5
8-bitowa monochromatyczna kamera CCD	THE IMAGINGSOURCE, Niemcy	DMK21BU618. H
Obiektyw zmiennoogniskowy	Edmund Optics Japan Ltd, Tokio, Japonia	VZMTM300i
Biały standard Spectralon z 99% rozproszonym współczynnikiem odbicia	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, USA	SRS-99-020