Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek in vitro do badania chemioterapeutyków dostarczanych przez nanocząstki na bazie lipidów

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55405

⸱

1 listopada 2017

 , 
1Laboratory Experimental Surgical Oncology, Section Surgical Oncology, Department of Surgery, Erasmus MC

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie żywych komórek to potężne narzędzie do wizualizacji dynamicznych procesów. Badanie nieruchomych komórek dostarcza jedynie statycznych obrazów, co może prowadzić do błędnej interpretacji i zamieszania co do procesu. W pracy przedstawiono metodę badania wychwytu, uwalniania leków i lokalizacji wewnątrzkomórkowej nanocząstek liposomalnych w żywych komórkach.

Streszczenie

Konwencjonalne techniki obrazowania mogą dostarczyć szczegółowych informacji o procesach komórkowych. Informacje te opierają się jednak na statycznych obrazach w dynamicznym systemie, a kolejne fazy są łatwo przeoczone lub błędnie zinterpretowane. Obrazowanie żywych komórek i mikroskopia poklatkowa, w których żywe komórki mogą być obserwowane przez wiele godzin, a nawet dni w sposób mniej lub bardziej ciągły, są zatem bardzo pouczające. Opisany tu protokół pozwala na badanie losów nanocząstek chemoterapeutycznych po dostarczeniu doksorubicyny (doks) do żywych komórek. Dox jest środkiem interkalacyjnym, który musi zostać uwolniony ze swojego nanonośnika, aby stać się biologicznie aktywnym. Pomimo jego rejestracji klinicznej od ponad dwóch dekad, jego wchłanianie, rozkład i uwalnianie leku nadal nie są w pełni poznane. W artykule omówiono hipotezę, że nanocząstki na bazie lipidów są wychwytywane przez komórki nowotworowe i ulegają powolnej degradacji. Uwolniony dox jest następnie translokowany do jądra. Aby zapobiec artefaktom fiksacji, można zastosować obrazowanie żywych komórek i mikroskopię poklatkową, opisane w tej procedurze eksperymentalnej.

Wprowadzenie

Możliwość śledzenia procesu biologicznego, takiego jak interakcje komórka-komórka, transport między- i wewnątrzkomórkowy, wychwyt związków cytotoksycznych i oddziaływanie białko-białko pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach i tkankach, zyskała duże zainteresowanie w ciągu ostatniej dekady, ponieważ zapewnia dodatkowy wymiar "czasu rzeczywistego". W tym manuskrypcie opisana jest metoda śledzenia wewnątrzkomórkowego losu wolnego dox i dox włączonego do nanocząstek (Dox-NP).

Nanocząsteczki są używane od dziesięcioleci do leczenia niektórych nowotworów. Dox-NP został zatwierdzony do leczenia mięsaka Kaposiego związanego z AIDS, zaawansowanego raka jajnika i piersi oraz szpiczaka mnogiego1. Była to jedna z pierwszych liposomalnych nanocząstek opracowanych i wprowadzonych do warunków klinicznych. Wolna forma, dox, jest w znacznym stopniu usuwana z krążenia krwi, co ogranicza jej zdolność do dotarcia do miejsca guza w wystarczających ilościach. Ponadto leczeniu towarzyszą ciężkie i ograniczające dawkę działania niepożądane, takie jak zapalenie jamy ustnej i niewydolność serca. Po zamknięciu w pegylowanych nanocząstkach liposomalnych czas krążenia wydłuża się z minut do dni2. Ten rodzaj liposomu zawierającego cholesterol jest dość stabilny i ta stabilność decyduje o farmakokinetyce kapsułkowanego leku.

Jednak ta sztywność ma wadę. Zdolność cytotoksyczna związku w stosunku do komórek nowotworowych jest najpierw oceniana in vitro i wykazano, że dox jest silniejszy niż Dox-NP w testach cytotoksycznych3,4. Postawiono hipotezę, że stabilność nośnika zapobiega uwalnianiu i wychwytowi komórkowemu leku, i warto dokładniej zbadać to zjawisko. Wewnętrzne właściwości liposomalne, zbudowane tak, aby przetrwać agresywne elementy w krwiobiegu i dotrzeć do miejsca guza w stanie nienaruszonym, spowodowały upośledzenie biodostępności składnika cytotoksycznego (tj. Dox) w miejscu docelowym (tj. Jądrze komórki nowotworowej). Chociaż Dox-NP znacznie poprawił odpowiedź w porównaniu z wolną formą, nadal miał wartość kliniczną, ponieważ enkapsulacja znacznie zmniejszyła działanie kardiotoksyczne5. W kolejnych latach inne związki zostały zamknięte w nano-nośnikach6. Ponadto modyfikacja nośników powodowała wyzwalanie uwalniania leku (tj. w miejscu guza), ale utrzymywała stabilność krążenia krwi7,8. Pomimo wieloletnich badań i stosowania klinicznego, losy wewnątrznowotworowe nanonośników, takich jak Dox-NP, nadal nie są do końca jasne. W niedawnej publikacji wykazano, że nanocząstka jest pobierana jako całość, podczas gdy doks pozostaje uwięziony w lizosomach9.

Komórkowy absorpcja nanocząsteczki i uwalnianie leku to dynamiczne procesy, które najlepiej można monitorować za pomocą obrazowania żywych komórek. Co więcej, klasyczna histologia, w której komórki są inkubowane, a następnie utrwalane, może dawać fałszywe wyniki, jeśli fiksacja zniszczy nośnik liposomalny i wprowadzi artefakty. Głównym wymogiem obrazowania żywych komórek jest wizualizacja, najlepiej za pomocą fluorescencji, pożądanego procesu. Niektóre związki, takie jak dox, mają wewnętrzną czerwoną fluorescencję. Do nośnika można również wprowadzić markery fluorescencyjne, a organelle komórkowe można wizualizować za pomocą markerów żywych komórek. W ten sposób można obrazować i analizować szereg parametrów, takich jak wychwyt nośnika, uwalnianie leku oraz lokalizacja komórkowa nośnika i leku. W tym miejscu opisano metodę, w której losy międzykomórkowe dox i Dox-NP w kilku komórkach nowotworowych są śledzone w czasie rzeczywistym. Ponadto metodę tę można łatwo zaadaptować, aby stworzyć idealne warunki do ukierunkowanego (np. naładowane nanocząstki10) i wyzwalanego (np. hipertermia7) uwalniania leku.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Zmontuj komorę obrazowania, która składa się z dwóch części.
    1. Umieść 25-milimetrową szklaną pokrywę (Rysunek 1A-1) w dolnej części komory (Rysunek 1A-2) i przykręć górną część do dolnej części (Rysunek 1A-3). Nie dokręcaj zbyt mocno, ponieważ szkło może pęknąć. Autoklawuj całą komorę (Rysunek 1A-4).
  2. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco bez czerwieni fenolowej 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (FCS) i 1 mM L-glutaminą w sterylnych warunkach. Przed użyciem przechowywać w temperaturze 4 °C i ogrzać do 37 °C.
  3. Utrzymywać komórki z pożywką do hodowli komórkowych w kolbach hodowlanych przy użyciu standardowych technik hodowli komórkowych.
    UWAGA: W tym przypadku użyto dwóch linii komórkowych myszy, czerniaka B16BL611 i raka płuc Lewisa (LLC) oraz dwóch ludzkich czerniaków, BLM i 1F612.
  4. Przygotować 0,1% żelatyny, ważąc i rozpuszczając żelatynę w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 37 °C przez noc. Wysterylizować roztwór, filtrując go przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Komórki płytkowe

  1. Wyjmij komorę obrazowania z worka sterylizacyjnego w komorze z przepływem laminarnym, ostrożnie dokręć komorę i umieść ją na szalce Petriego.
    UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy przechowywać komorę obrazowania na szalce Petriego do czasu, aż komora będzie mogła zostać umieszczona pod mikroskopem.
  2. Pokryć szklankę komory obrazowania 1 ml 0,1% sterylnej żelatyny przez 20 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Umożliwi to lepsze przymocowanie komórki.
  3. Usunąć pożywkę z kolb do hodowli komórkowych (patrz kroki 1.2 i 1.3), przemyć raz 1x PBS i odłączyć komórki za pomocą 0,25% trypsyny. Dezaktywuj trypsynę, dodając pożywkę do hodowli komórkowych, zbierz komórki, odwiruj je w temperaturze 1 100 x g przez 5 minut i ponownie zawieś osad w 5 ml pożywki do hodowli komórkowych.
  4. Rozcieńczyć 20 μl zawiesiny komórkowej 20 μl błękitu trypanowego (który zostanie wchłonięty przez martwe komórki). Policz liczbę żywych i martwych komórek za pomocą hemocytometru; Liczba martwych komórek nie powinna przekraczać 10%.
  5. Odessać żelatynę i umieścić komórki w rozcieńczeniu, które pozwala na maksymalnie 70% pokrycie w ciągu 24 godzin. Na przykład użyj rozcieńczenia 5 x 104 lub 10 x 104 komórek w 1 ml. Pozostawić komórki do przylegania w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

3. Mikroskopia poklatkowa (Rysunek 2)

UWAGA: Tutaj użyto mikroskopu konfokalnego z specjalnie wykonanym uchwytem na stolik, chociaż większość producentów oferuje szereg inkubatorów do obrazowania żywych komórek, które są również odpowiednie do badania dostarczania nanocząstek leku.

  1. Oceń komórki pod mikroskopem pod kątem zbiegu, morfologii komórkowej i zanieczyszczenia. Umieść komorę z powrotem w inkubatorze CO2 .
    UWAGA: Zbieg nie powinien przekraczać 70%. Jeśli morfologia komórek jest niespójna (tj. komórki nie przylegają) lub wykryte zostanie zanieczyszczenie, należy wyrzucić komorę obrazowania.
  2. Włącz mikroskop konfokalny (Rysunek 1E-1), światło fluorescencyjne (Rysunek 1E-2) i komputer (Rysunek 1E-3).
  3. Podłącz grzałkę obiektywu do obiektywu i ustaw ją na 35 °C (Rysunek 1E-4 + wkładka).
  4. Przygotuj jednostkę inkubacyjną, jak pokazano na Rysunek 1B.
    UWAGA: To urządzenie składa się z podgrzewanego stopnia ( Rysunek 1B-1), stopnia przepływu ze złączem do rur CO2 ( Rysunek 1B-2) i sondy CO2 ( Rysunek 1B-3) oraz czerwonej łatki zamykającej ( Rysunek 1B-4). Ta łatka służy do tymczasowego zamknięcia urządzenia do czasu umieszczenia komory obrazowania.
  5. Umieść jednostkę inkubacyjną na stoliku mikroskopu i podłącz rurki wlotowe i wylotowe CO2 (Rysunek 1E-5). Otwórz główny zawór CO2 ( Rysunek 1E-6) i włącz regulator CO2 ( Rysunek 1E-7). Sprawdź, czy sterownik jest ustawiony na 5% CO2.
    UWAGA: W przypadku wilgotności CO2 przechodzi przez nawilżacz ( Rysunek 1E-8). W przypadku eksperymentów z hipoksją w zestawie znajduje się oddzielny regulator O2 (Rysunek 1E-9).
  6. Ustaw temperaturę stage na 37 °C ( Rysunek 1E-10). W przypadku eksperymentów z hipertermią należy ustawić temperaturę na 42 °C. Pozwolić, aby jednostka inkubacyjna osiągnęła wybraną temperaturę i zawartość CO2 procent.
  7. Wyjąć komorę obrazowania z głównego inkubatoraCO2 i przetransportować ją na szalce Petriego do pomieszczenia mikroskopowego.
  8. Umieść komorę obrazowania (Rysunek 1A-4) w specjalnie wykonanym uchwycie stolika o średnicy 35 mm (Rysunek 1A-5) i zamknij komorę wykonaną na zamówienie pokrywą uszczelniającą (Rysunek 1A-6).
    UWAGA: Pokrywka przepuszcza CO2 i zapobiega parowaniu i zanieczyszczeniu.
    1. Otwórz jednostkę inkubacyjną, zastąp czerwoną plamę komorą obrazowania i zamknij jednostkę (Rysunek 1C). Zrób to tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec wychłodzeniu komórek. Upewnij się, że żadne nie są zablokowane między stage a mikroskopem.
  9. Pozostaw urządzenie do aklimatyzacji na 30 minut.
  10. Otwórz oprogramowanie i włącz lasers.
    UWAGA: Tutaj użyto laserów argonowych o długości fali 488 nm, helowo-neonowych o długości fali 543 nm i laserów helowo-neonowych o długości fali 633 nm.
  11. Utwórz nową bazę danych, klikając "Nowa" w zakładce Plik. Nazwij i zapisz bazę danych.
  12. Ustaw konfigurację, klikając "Konfiguracja" w zakładce Pobierz. Wybierz "Tryb kanału" i "Pojedyncza ścieżka", aby ocenić pojedynczy fluorofor lub "Wiele ścieżek" dla kilku fluoroforów. Wybierz odpowiednie filtry pasmowo-przepustowe pasujące do fluoroforu (np. filtr pasmowo-przepustowy od 560 do 615 nm dla dox i Dox-NP; więcej przykładów można znaleźć w reprezentatywnych wynikach). Wybierz kanał jasnego pola na jednej ze ścieżek.
  13. Ustaw kontrolkę skanowania, klikając "Skanuj" na karcie Pobieranie. Ustaw rozmiar klatki (1,024 x 1,024), prędkość skanowania (optymalna), kierunek skanowania (8-bitowy, pojedynczy) i średnią skanowania (4), klikając "Tryb". Ustaw otwór (200 μm), wzmocnienie i przesunięcie (np. 580, 700 i 835; patrz Rysunek 3) oraz moc lasera (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%), klikając "Kanały".
  14. Zapisz te ustawienia, klikając "Config" w zakładce Konfiguracja i zapisz je w bazie danych konfiguracji.
  15. Ustaw film poklatkowy, klikając "Multi Time X" (Rysunek 1D) w zakładce Makro. Kliknij "Pojedyncza lokalizacja".
  16. Aby zachować ostrość komórek, wybierz automatyczne ustawianie ostrości w makrze, klikając "Autofokus".
    UWAGA: Autofokus uzyskuje się za pomocą lasera 633 nm, wykorzystując odbicie szkła jako punkt odniesienia.
  17. Zastosuj zapisaną konfigurację, klikając "Pojedyncza ścieżka" lub "Wiele ścieżki", przewijając do wymaganej konfiguracji w bazie danych konfiguracji, ustawiając przedział czasowy (np. 15 min), liczbę skanów (np. 97) i klikając "Załaduj konfigurację."
    Uwaga: Korzystając z tych ustawień, zostaną utworzone szeregi czasowe 97 x 15 min = 24 h.
  18. Nazwij film poklatkowy w polu "Podstawowa nazwa pliku" i wybierz bazę danych (utworzoną w kroku 3.11), klikając "Baza danych obrazu", aby zapisać film poklatkowy. Ustaw folder tymczasowy, klikając "Tmp Image Folder"."
    UWAGA: Jeśli system zatrzyma się lub ulegnie awarii z jakiegokolwiek powodu, obrazy znajdują się w tym folderze.
  19. Otwórz jednostkę inkubacyjną, podnieś pierścień obrazowania, dodaj kroplę olejku immersyjnego do obiektywu i zamknij jednostkę tak szybko, jak to możliwe. Ustawić ostrość i wybrać pozycję w komorze obrazowania.
    UWAGA: Ta pozycja zawiera komórki w monowarstwie, z minimalną 70% konfluencją, co pozwala na obrazowanie pojedynczych komórek.
  20. Sprawdź ustawienia konfiguracyjne tła i popraw je w razie potrzeby.
    UWAGA: Tło można skorygować, zmniejszając wzmocnienie lub moc lasera. Każda zmiana konfiguracji musi zostać zapisana (patrz krok 3.17) i ponownie załadowana (patrz krok 3.18) do makra.
  21. W komorze z przepływem laminarnym rozcieńczyć wolny lek lub nanocząstki w stężeniu 5 μg/ml leku lub 0,05 μmol lipidów w pożywce do hodowli komórkowych. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm, jeśli lek/nanocząstki nie są sterylne.
  22. Otwórz komorę inkubacyjną, podnieś pokrywę uszczelniającą, usuń pożywkę z komórek, dodaj 1 ml rozcieńczonego leku/nanocząstek i zamknij urządzenie tak szybko, jak to możliwe.
  23. Skoncentruj się na komórkach i rozpocznij film poklatkowy, klikając "Start Time" w makrze Multi Time X.
  24. Sprawdzaj regularnie, czy komórki są nadal ostre, lub użyj autofokusa (patrz krok 3.16). Program automatycznie zapisuje film poklatkowy w bazie danych; Nie zamykaj bazy danych, gdy program jest uruchomiony.

4. Analiza danych

  1. W zależności od pierwotnego pytania badawczego użyj programów, takich jak ImageJ, do analizy danych (przykłady znajdują się w sekcji Wyniki).

Wyniki

Znakowanie nośników liposomalnych różnymi markerami zostało opisane wcześniej9. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono nośniki znakowane daleką czerwienią perchloranem dioctadecylo tetrametylindotricarbocyjaniny (DiD; Ex = 644 nm; Em = 665 nm) lub zielenią 1,2-dioleoil-sn-glycero-3-fosfoetanolaminą-N-(karboksyfluoresceiną) (CF-PE; Ex = 490 nm; Em = 515 nm). Aby wykazać międzykomórkowe podobieństwa i różnice w pobieraniu liposomów, ich uwalnianiu oraz lokalizacji wewnątrzkomórkowej, zbadano kilka typów nowotworów. Obejmowały one dwie linie mysie: czerniaka B16BL611 oraz raka płuc Lewisa (LLC), a także dwa czerniaki ludzkie: silnie przerzutowy (BLM) i nieprzerzutowy (1F6)12,13. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na żywych komórkach. We wszystkich doświadczeniach podawano stężenie 5 µg/mL dox, 5 µg/mL Dox-NP lub 0,05 µmol nanocząsteczek przez 3 lub 24 h. Zmierzony i przeanalizowany dox (w formie wolnej, uwolnionej, enkapsulowanej, sekwestrowanej lub interkalowanej) określano jako DXR. Użyto obiektywu olejowego 40X (apertura numeryczna: 1,3), a obrazowanie wykonano za pomocą lasera argonowego 488 nm (moc 10%/0,2 mW) i filtra pasmowoprzepustowego od 505 do 550 nm dla CF-PE i zielonego markera lizosomalnego (LM). Do detekcji dox, Dox-NP oraz czerwonego markera lizosomalnego użyto lasera helowo-neonowego 543 nm (moc 100%/0,2 mW) i filtra pasmowoprzepustowego od 560 do 615 nm. Dla DiD zastosowano laser helowo-neonowy 633 nm (moc 100%/0,5 mW) i filtr długoprzepustowy 640 nm.

Ze względu na enkapsulację, cytotoksyczność in vitro, biodostępność i farmakokinetyka doksorubicyny (dox) uległy znacznym zmianom3,9,14. Różnica w biodostępności leku podanego w formie wolnej i enkapsulowanej została przedstawiona na Rysunku 3. Dox jest agentem interkalującym i musi wniknąć do jądra komórkowego, aby stać się cytotoksyczny. Rysunek 3 oraz powiązane Filmy 1 i 2 przedstawiają 3-godzinny zapis poklatkowy (time-lapse) komórek BLM traktowanych dox lub Dox-NP w identycznych warunkach. W ciągu kilku minut od ekspozycji na dox można zaobserwować jądrową DXR (Rysunek 3A, Film 1), a przy niższym wzmocnieniu (wkładka) widać jej interkalację w jądrze. W przeciwieństwie do tego, przy ekspozycji na Dox-NP, wewnątrzkomórkowa DXR jest prawie niewidoczna w tym przedziale czasowym (Rysunek 3B, Film 2). Dopiero po zwiększeniu wzmocnienia fotopowmnażacza można zaobserwować DXR w cytoplazmie (wkładka). Za pomocą programu ImageJ przeanalizowano gęstość pikseli DXR w cytoplazmie i jądrze. Ponieważ komórki są w ruchu podczas ewaluacji poklatkowej, ważne jest połączenie obrazów fluorescencyjnych z obrazami w polu jasnym. Umożliwia to śledzenie poszczególnych komórek i stabilizację dryfu XY za pomocą odpowiednich wtyczek w ImageJ. W analizie przedstawionej na Rysunku 3 obraz w polu jasnym posłużył do wyznaczenia obszaru zainteresowania (ROI) wokół cytoplazmy (linia ciągła) i jądra (linia przerywana). Menedżer ROI w ImageJ znajduje się w pozycji menu Analyze > Tools > ROI manager. Te ROI są wykorzystywane w obrazie fluorescencyjnym do analizy gęstości pikseli za pomocą pozycji menu Analyze > Measure. Różnica w gęstości pikseli w jądrze (Rysunek 3C) i cytoplazmie (Rysunek 3D) komórek traktowanych dox lub Dox-NP potwierdza obserwacje z obrazów. Ponadto komórki inkubowano przez 24 h z dox lub Dox-NP, po czym związek zastąpiono pożywką i niezwłocznie wykonano obrazowanie przy zwiększonej czułości wzmocnienia fotopowmnażacza (Rysunek 4). Pozostałe ustawienia, takie jak moc lasera, offset, pinhole i wyświetlanie obrazu, były identyczne. Niski sygnał DXR w komórkach traktowanych Dox-NP w porównaniu z komórkami traktowanymi dox jest uderzający. Przy wzmocnieniu wynoszącym 700 DXR w komórkach traktowanych Dox-NP staje się widoczna, podczas gdy obraz dox jest już prześwietlony. Ten prosty eksperyment in vitro wizualizuje znaczną różnicę w biodostępności leku wolnego w porównaniu z enkapsulowanym.

Podczas ciągłej ekspozycji komórek na Dox-NP przez 24 h, stężenie DXR wzrasta w czasie, co przedstawiono na Rysunku 5A oraz w filmach 3 i 4. Sygnał nasila się w cytoplazmie, a później DXR zostaje również zidentyfikowany jako przemieszczony do jądra komórkowego. Obserwacje te potwierdzają wykresy gęstości pikseli (Rysunek 5B). Zmierzona gęstość pikseli w cytoplazmie jest niższa w komórkach BLM w porównaniu do komórek 1F6 ze względu na różnice w rozkładzie wewnątrzkomórkowym. Podczas gdy w komórkach 1F6 DXR jest rozłożony w całej komórce, w komórkach BLM DXR jest bardziej skoncentrowany w organelli znajdującej się blisko jądra (Rysunek 5C).

Zbadano zatem lokalizację leku i nośnika w różnych liniach komórkowych (Rysunek 6). Komórki inkubowano przez 24 h z Dox-NP/DiD, a następnie obrazowano. Na podstawie obrazu w jasnym polu, na obrazach fluorescencyjnych trzech różnych linii komórkowych wykreślono obrys błony komórkowej (linia ciągła) oraz jądra komórkowego (linia przerywana). Wykazano tutaj, że nośnik znakowany DiD wykazuje taki sam rozkład cytoplazmatyczny jak DXR: jest skoncentrowany w organelli blisko jądra w komórkach BLM, wokół całego jądra w LLC oraz losowo rozproszony w całej cytoplazmie w komórkach B16BL6. W jądrze widoczny jest tylko DXR, a nie DiD, co wskazuje na uwolnioną doksorubicynę. Poprzez zmniejszenie wzmocnienia fotopowielacza można zaobserwować pojedyncze pęcherzyki komórkowe zawierające DXR oraz nośnik znakowany DiD, a także CF-PE (Rysunki 6B i 6C).

Cytoplazmatyczny DXR gromadzi się w małych pęcherzykach, a komórki zostały znakowane zielonym lub czerwonym markerem lizosomalnym do obrazowania żywych komórek. Ruch tych lizosomów można śledzić w komórkach (Film 5). Cytoplazmatyczny DXR i nanonośnik kolokalizują w tych strukturach, a różnica międzykomórkowa w rozmieszczeniu DXR, widoczna na Rysunku 6, jest tutaj wyjaśniona. Lizosomy są rozmieszczone losowo w całej cytoplazmie w komórkach B16BL6 i znajdują się obok jądra w komórkach BLM (Rysunek 7A). Za pomocą programu ImageJ obliczono kolokalizację DXR i nośnika w lizosomie (Rysunek 7B). Obrazy kolorowe przekształcono w obrazy binarne (Process > Binary > Make Binary), a następnie, przy użyciu wtyczki do kolokalizacji (Analyze > Colocalization), stworzono obraz kolokalizacji DXR z DiD. Pozwala to na uzyskanie obrazu w kolorach zielonym, czerwonym i białym, gdzie białe piksele reprezentują piksele kolokalizujące obu obrazów. Poprzez pozycję menu Process > Binary > Make Binary białe piksele zostaną oddzielone i przekształcone w piksele czarne, z których mierzy się gęstość pikseli (Analyze > Measure). Następnie stworzono obraz kolokalizacji między tym obrazem DXR-DiD a obrazem binarnym markera lizosomalnego (LM) i zmierzono gęstość pikseli. Dane dotyczące kolokalizacji stanowią procent pikseli pozytywnych dla DXR-DiD oraz DXR-DiD/marker lizosomalny (Rysunek 7C). Fakt, że nośnik znakowany CF-PE oraz DiD znajduje się w lizosomie, pokazano również na Rysunku 7D.

figure-results-1
Rysunek 1: Konfiguracja instrumentów i sprzętu. A) Komora obrazująca i niezbędne elementy. Szkło dekowe #1 o średnicy 25 mm (1), dolna część komory (2), górna część komory (umieszczona do góry dnem) i pierścień uszczelniający (3), uchwyt stolika (4) oraz pokrywa uszczelniająca (5). Pasek skali: 2 cm. B) Jednostka inkubacyjna. Podgrzewany stolik mikroskopowy (1), stolik przepływowy z wlotem i wylotem dla CO2 (2), sonda CO2 (3) oraz łata zamykająca (4). Pasek skali: 2 cm. C) Komora obrazująca w jednostce inkubacyjnej, widok pod mikroskopem. D) Makro wielokrotnych serii czasowych. E) Sprzęt do obrazowania. Mikroskop odwrócony (1), światło fluorescencyjne (2), komputer (3), grzałka pierścieniowa (4, wstawka) i kontroler (4, rysunek główny), przewody doprowadzające CO2 (5), zawór CO2 (6), kontroler CO2 (7), nawilżacz CO2 (8), zawór i kontroler O2 (9) oraz kontroler temperatury stolika (10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat parametrów mikroskopu szczegółowo opisanych w sekcji 3 protokołu.Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Badanie krótkoterminowego poboru dox i Dox-NP.  Komórki BLM były stale eksponowane na dox lub Dox-NP przez 3 h, a następnie wykonano obrazowanie w odstępach czasu (time-lapse). (A) Klatki z filmu time-lapse komórek inkubowanych z dox. (B) Klatki z filmu time-lapse komórek inkubowanych z Dox-NP. Pasek skali = 50 µm. (C) Wzrost gęstości pikseli DXR w jądrach komórek traktowanych dox i Dox-NP. (D) Wzrost gęstości pikseli DXR w cytoplazmie komórek traktowanych dox i Dox-NP. Dane przedstawiają średnią ± SD dla 3 komórek na pole widzenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Badanie długoterminowego poboru dox i Dox-NP w różnych liniach komórkowych. Komórki poddano działaniu dox lub Dox-NP, a obrazowanie wykonano po 24 h. Obrazy wykonano bezpośrednio po usunięciu leków, stosując 3 różne wzmocnienia sygnału. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Badanie poboru komórkowego i uwalniania czynników liposomalnych. Komórki były stale eksponowane na Dox-NP przez 24 h, a następnie wykonano nagranie time-lapse. (A) Pojedyncze klatki z nagrania time-lapse. Pasek skali = 50 µm. (B) Wzrost gęstości pikseli DXR w jądrze i cytoplazmie. Dane przedstawiają średnią ± SD dla 3 komórek na pole widzenia. (C) Obrazy demonstrujące lokalizację DXR wewnątrz komórki. Linia ciągła: błona komórkowa, linia przerywana: jądro. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rysunek 6: Badanie lokalizacji leku i nośnika w różnych liniach komórkowych. (A) Komórki poddano działaniu Dox-NP/DiD przez 24 h, a następnie wykonano obrazowanie. Pasek skali = 50 µm. (B) Komórki poddano działaniu Dox-NP/DiD/CF-PE przez 24 h, a następnie wykonano obrazowanie z niższym wzmocnieniem intensywności w celu rozróżnienia poszczególnych pęcherzyków. (C) Nałożenie obrazu w polu jasnym i DXR wykazujące obecność DXR w pęcherzykach cytoplazmatycznych (strzałka). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Badanie lokalizacji wewnątrzkomórkowej leku i nośnika. Komórki poddano działaniu Dox-NP/DiD lub CF-PE/DiD przez 24 h, a lizosomy zwizualizowano przy użyciu markera lizosomalnego dla żywych komórek (LM) w kolorze zielonym lub czerwonym. (A) Lokalizacja wewnątrzkomórkowa DXR i nośnika (DiD). Strzałki wskazują 3 przykłady DXR i DiD zlokalizowanych w lizosomie. Pasek skali = 50 µm. (B) Analiza kolokalizacji DXR i nośnika (DiD) w lizosomach (LM) z wykorzystaniem programu ImageJ. (C) Procent kolokalizacji DXR i nośnika w lizosomach. Dane przedstawiają średnią ± SEM z 3 niezależnych eksperymentów. (D) Sekwestracja lizosomalna nośnika zwizualizowana przy użyciu dwóch różnych markerów. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-8
Film 1: Powiązany z Rysunkiem 3: Komórki BLM inkubowano z doksorubicyną przez 3 h. Time-lapse: 19 obrazów, odstęp 10 min. Częstotliwość klatek: 3 fps. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

figure-results-9
Film 2: Powiązany z Rysunkiem 3: Komórki BLM inkubowano z Dox-NP przez 3 h. Time-lapse: 19 obrazów, odstęp 10 min. Częstotliwość odświeżania: 3 fps. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).*

figure-results-10
Film 3: Powiązane z Rysunek 5: Komórki BLM inkubowano z Dox-NP przez 24 h. Time-lapse: 96 obrazów, z interwałem 15 min. Częstotliwość klatek: 8 fps. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

figure-results-11
Film 4: Powiązany z Rysunkiem 5: Komórki 1F6 inkubowano z Dox-NP przez 24 h. Time-lapse: 96 obrazów, z odstępem 15 min. Częstotliwość klatek: 8 fps. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-12
Film 5: Powiązany z Rysunkiem 7: Lizosomy komórek B16BL6 zostały zabarwione markerem do żywych komórek. Time-lapse: 10 obrazów, w odstępach 10 s. Częstotliwość klatek: 3fps. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

Jak zaobserwowano w przeszłości, fiksacja może niemal natychmiast zniszczyć liposomalne nanonośniki, a DXR uwolniony z tych zniszczonych liposomów miał jeszcze czas, aby dostać się do jądra, co sprawia, że interpretacja danych jest bardzo trudna, a nawet myląca. Dzięki pewnym mikroskopijnym dostosacjom, los chemioterapeutyku w żywych komórkach i tkankach może być rutynowo badany w celu potwierdzenia lub obalenia obserwacji histologicznych. Niedawny artykuł wykazał wychwyt, uwalnianie i lokalizację DXR w komórkach traktowanych wolnym i otorbionym dox przyużyciu obrazowania poklatkowego na żywo 9. W tej pracy opisano konfigurację eksperymentalną bardziej szczegółowo. Korzystając z tego modelu, można zobrazować natychmiastowy transport dox do jądra, gdzie gromadzi się on w sposób ciągły, aż do ostatecznej śmierci komórki. W przeciwieństwie do tego, gdy stosuje się Dox-NP, w jądrze znajdują się tylko niewielkie ilości uwolnionego dox. Chociaż ciągła ekspozycja powoduje ciągłe gromadzenie się DXR, sygnał fluorescencyjny jest znacznie niższy w komórkach traktowanych Dox-NP- w porównaniu z komórkami traktowanymi dox, co wskazuje na różnicę w stężeniu komórkowym i wynikającej z tego cytotoksyczności. Ponadto, dzięki zastosowaniu markerów żywych komórek, wykazano, że podczas wystawiania komórek na działanie Dox-NP, DXR i nanonośnik znajdują się w lizosomie. Wskazuje to, że cały liposom jest pobierany przez komórkę i wykazuje udział szlaku endocytarnego podczas wychwytu tych nanocząstek. DXR w jądrze wyraźnie pochodzi z uwolnionego dox. Jednak przy użyciu tej metody, ponieważ zarówno DXR, jak i nośnik kolokalizują się i wydają się być uwięzione w lizosomach, nadal nie jest jednoznaczne, czy jest to kapsułkowane, czy uwalniane dox. Możliwe, że wewnętrzna stabilność nanocząstki zapobiega uwalnianiu dox, gdy jest zlokalizowana w lizosomie.

W tym protokole obrazowanie żywych komórek jest demonstrowane przy użyciu specjalnego zestawu mikroskopowego, z niestandardowym uchwytem stolika (specyfikacje mogą być podane na życzenie). Jednak większość producentów mikroskopów konfokalnych oferuje szereg inkubatorów, które wykonują obrazowanie żywych komórek. Zachowanie warunków hodowli komórkowej (tj. temperatury, CO2, pH, wilgotności i sterylności) jest głównym kryterium tych inkubatorów i wymaga pewnych wstępnych testów w celu określenia właściwych warunków, co jest dalej wyjaśniane. Zautomatyzowane programy do akwizycji danych mogą być również dostarczane przez tych samych producentów. Opcja "Multi location" umożliwia obrazowanie kilku pozycji w tej samej komorze, co usprawnia analizę statystyczną. Jednak ta opcja w makrze wspomnianym w tym manuskrypcie wymaga stałych pozycji XYZ, dzięki czemu traci się możliwość skorygowania dryfu Z. Skanowanie wymiaru Z może być uwzględnione w tym makrze i wykorzystuje płaszczyznę ostrości do analizy. Wymaga to jednak dodatkowego skanowania, co zwiększa możliwość fototoksyczności i wybielania.

Podobnie jak w przypadku wszystkich pomiarów fluorescencyjnych, nadmierna ekspozycja stanowi problem, zwłaszcza przy porównywaniu dwóch związków o różnym wychwycie komórkowym. Intensywność fluorescencji zależy nie tylko od wewnętrznego sygnału związku, ale także od szybkości wchłaniania, stężenia i czasu ekspozycji na lek. Jak pokazano na rysunku 3, jądrowa zawartość DXR w komórkach traktowanych dox jest już widoczna, podczas gdy w komórkach traktowanych Dox-NP nie widać żadnego sygnału. Tylko poprzez zwiększenie wzmocnienia można uwidocznić DXR w komórkach traktowanych Dox-NP, co prowadzi do nadmiernej ekspozycji w komórkach traktowanych Dox. Co więcej, nawet wewnątrzkomórkowo Dox-NP jest niejednorodnie rozmieszczony, co może prowadzić do nieuniknionej niedostatecznej lub nadmiernej ekspozycji. Zwłaszcza podczas badania uwięzienia komórkowego DXR, zysk został znacznie zmniejszony w celu rozróżnienia poszczególnych organelli (ryc. 5B i 5C). W związku z tym pomiarom reprezentowanym przez gęstość pikseli muszą towarzyszyć reprezentatywne obrazy w celu prawidłowej interpretacji wyników.

Fototoksyczność, wybielanie i niski stosunek sygnału do szumu są również ważnymi kwestiami w mikroskopii fluorescencyjnej i należy ustalić kompromis między jakością obrazu a akwizycją obrazu. Jednak nawet jeśli konfiguracja mikroskopu jest optymalna, jakość obrazu jest również w dużej mierze determinowana przez jakość komórek i dodanego związku. DXR daje silny sygnał i przy zachowaniu odpowiednich środków ostrożności nie zaobserwowano wybielania, nawet po dłuższych okresach (do 72 godzin). Jednak zmniejszenie sygnału fluorescencyjnego może być również wynikiem wypływu. Wypływ jest ważnym zjawiskiem w oporności na leki15 i występuje, gdy komórki wypompowują lek z wewnątrzkomórkowego miejsca działania. Spadek sygnału fluorescencyjnego w czasie może być zatem również wynikiem wypływu doks9. Porównanie sygnału fluorescencyjnego z nieskanowanego miejsca pod koniec eksperymentu z ostatnim obrazem z serii poklatkowej wykaże blaknięcie (tj. sygnał będzie wyższy w miejscu, które nie zostało zeskanowane) lub wypływ (tj. oba sygnały będą identyczne). W programach takich jak ImageJ16 dostępnych jest kilka opcji korekcji (np. tło, dryf, wybielanie itp.). Ponadto, wraz ze wzrostem intensywności świetlówki w miarę upływu czasu, ustawienia konfiguracyjne można wstępnie ocenić w eksperymencie pilotażowym, aby zminimalizować prześwietlenie pod koniec filmu poklatkowego (krok 3.21). Alternatywnie, do inicjalizacji ustawień można użyć komory obrazowania z komórkami już wystawionymi na działanie leku przez żądany okres czasu. Wreszcie, w przypadku tego typu analizy, należy unikać stężeń toksycznych leków (krok 3.22) i wstępnie ustalić je za pomocą konwencjonalnych testów biologicznych.

Komórki są w sposób ciągły hodowane i utrzymywane w pożywce bez czerwieni fenolowej. Czerwień fenolowa fluoryzuje w czerwonej części widma i można ją zaobserwować w organellach komórkowych, najprawdopodobniej lizosomach, prezentując informacje fałszywie dodatnie (krok 1.2). Aby umożliwić monitorowanie pojedynczych komórek, konfluencja komórek nie powinna przekraczać 70% (krok 3.1.). Prędkość przepływu CO2 (krok 3.5) musi być regulowana w eksperymencie walidacyjnym w momencie zakupu sprzętu lub po jego konserwacji. Gdy prędkość jest zbyt wysoka, medium wyparuje. Gdy prędkość jest zbyt niska, pH pożywki wzrośnie, co może wpłynąć na wzrost komórek. Ponieważ podłoże jest pozbawione czerwieni fenolowej, nie można zaobserwować zmian w pH, a zatem łatwo je przeoczyć. Po walidacji przepływu CO2 ustawienia te mogą być używane we wszystkich przyszłych eksperymentach.

Korzystając z opisanej tutaj metody, losy nanocząstek można łatwo badać za pomocą obrazowania żywych komórek i mikroskopii poklatkowej. W tej procedurze wykorzystano dostępne na rynku nanocząstki. Jednak los termoczułych17, liposomów kationowych10; liposomy wzbogacone o krótkołańcuchowe shingolipidy18; i nanocząstki kapsułkujące inne leki 8,19 badano również w ten sposób w komórkach nowotworowych i prawidłowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Używane urządzenia mikroskopowe są częścią Centrum Obrazowania Optycznego Erasmus i chcielibyśmy podziękować personelowi OIC za ich usługi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM (bez czerwieni fenolowej)SigmaD1145Uzupełniony 1 mM L-glutaminą i 10% FCS
Trypsyna-versene (EDTA)LonzaBE17-161E
Surowica cielęca płoduSigmaF7524Inaktywacja ciepła przez 30 min w temperaturze 55 º C
L-GlutaminaLonzaBE17-605E
Żelatyna ze skóry bydlęcejSigmaG9391Sporządzić 0,1% roztwór w PBS, sterylny
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaD8537
Stericup 0,22 &mikro; m filtr - 500 ml MilliporeSCGPU05RE
Trypan-blueSigmaT8154
Komórki: Rak płuc LewisaATCCCRL-1642
Komórki: B16BL6Dr. P. Brouckaert, Uniwersytet w GandawieprzekazałRef.10
Komórki: BLM i 1F6Dr. van Muijen, University of NijmegenprzekazałRef.11
Szalka PetriegoGreiner664160
DoksorubicynaActavis wymieniony w rękopisie jako dox
Doxil/CaelyxJanssen-Cilagwymieniony jako Dox-NP w rękopisie
Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; mVWR international10462200
Lysotracker-zielony DND-26InvitrogenL7526wymieniony jako marker liosomalny (LM)-zielony w rękopisie
Lysotracker-czerwony DND-99InvitrogenL7528wymieniony jako marker liosomalny (LM)-czerwony w rękopisie
Pierścień komórkowy AttofluorInvitrogenA7816
Szkło nakrywkowe 25 mm #1Thermo scientific
Uchwyt stolika + pokrywa uszczelniającaWykonany
mikroskop ZEISS LSM 510Oprogramowanie Zeiss
LSM 510 wersja 3.2 SP2Zeiss
Image JNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/index.html
CB00250RA1na zamówienie

Bibliografia

  1. Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
  2. Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
  3. Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
  4. Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
  5. Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
  6. Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
  7. Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
  8. Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
  9. Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
  10. Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
  11. Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
  12. Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
  13. Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
  14. Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
  15. Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
  16. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  17. Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
  18. Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
  19. Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia poklatkowaleki chemioterapeutycznepobieranie doksorubicynymikroskopia konfokalnaprocesy kom rkowekom rki nowotworowemarkery fluorescencyjneuwalnianie leku

Powiązane artykuły