Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek in vitro do badania chemioterapeutyków dostarczanych przez nanocząstki na bazie lipidów

DOI:

10.3791/55405

⸱

1 listopada 2017

 , 
1Laboratory Experimental Surgical Oncology, Section Surgical Oncology, Department of Surgery, Erasmus MC

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie żywych komórek to potężne narzędzie do wizualizacji dynamicznych procesów. Badanie nieruchomych komórek dostarcza jedynie statycznych obrazów, co może prowadzić do błędnej interpretacji i zamieszania co do procesu. W pracy przedstawiono metodę badania wychwytu, uwalniania leków i lokalizacji wewnątrzkomórkowej nanocząstek liposomalnych w żywych komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne techniki obrazowania mogą dostarczyć szczegółowych informacji o procesach komórkowych. Informacje te opierają się jednak na statycznych obrazach w dynamicznym systemie, a kolejne fazy są łatwo przeoczone lub błędnie zinterpretowane. Obrazowanie żywych komórek i mikroskopia poklatkowa, w których żywe komórki mogą być obserwowane przez wiele godzin, a nawet dni w sposób mniej lub bardziej ciągły, są zatem bardzo pouczające. Opisany tu protokół pozwala na badanie losów nanocząstek chemoterapeutycznych po dostarczeniu doksorubicyny (doks) do żywych komórek. Dox jest środkiem interkalacyjnym, który musi zostać uwolniony ze swojego nanonośnika, aby stać się biologicznie aktywnym. Pomimo jego rejestracji klinicznej od ponad dwóch dekad, jego wchłanianie, rozkład i uwalnianie leku nadal nie są w pełni poznane. W artykule omówiono hipotezę, że nanocząstki na bazie lipidów są wychwytywane przez komórki nowotworowe i ulegają powolnej degradacji. Uwolniony dox jest następnie translokowany do jądra. Aby zapobiec artefaktom fiksacji, można zastosować obrazowanie żywych komórek i mikroskopię poklatkową, opisane w tej procedurze eksperymentalnej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość śledzenia procesu biologicznego, takiego jak interakcje komórka-komórka, transport między- i wewnątrzkomórkowy, wychwyt związków cytotoksycznych i oddziaływanie białko-białko pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach i tkankach, zyskała duże zainteresowanie w ciągu ostatniej dekady, ponieważ zapewnia dodatkowy wymiar "czasu rzeczywistego". W tym manuskrypcie opisana jest metoda śledzenia wewnątrzkomórkowego losu wolnego dox i dox włączonego do nanocząstek (Dox-NP).

Nanocząsteczki są używane od dziesięcioleci do leczenia niektórych nowotworów. Dox-NP został zatwierdzony do leczenia mięsaka Kaposiego związanego z AIDS, zaawansowanego raka jajnika i piersi oraz szpiczaka mnogiego1. Była to jedna z pierwszych liposomalnych nanocząstek opracowanych i wprowadzonych do warunków klinicznych. Wolna forma, dox, jest w znacznym stopniu usuwana z krążenia krwi, co ogranicza jej zdolność do dotarcia do miejsca guza w wystarczających ilościach. Ponadto leczeniu towarzyszą ciężkie i ograniczające dawkę działania niepożądane, takie jak zapalenie jamy ustnej i niewydolność serca. Po zamknięciu w pegylowanych nanocząstkach liposomalnych czas krążenia wydłuża się z minut do dni2. Ten rodzaj liposomu zawierającego cholesterol jest dość stabilny i ta stabilność decyduje o farmakokinetyce kapsułkowanego leku.

Jednak ta sztywność ma wadę. Zdolność cytotoksyczna związku w stosunku do komórek nowotworowych jest najpierw oceniana in vitro i wykazano, że dox jest silniejszy niż Dox-NP w testach cytotoksycznych3,4. Postawiono hipotezę, że stabilność nośnika zapobiega uwalnianiu i wychwytowi komórkowemu leku, i warto dokładniej zbadać to zjawisko. Wewnętrzne właściwości liposomalne, zbudowane tak, aby przetrwać agresywne elementy w krwiobiegu i dotrzeć do miejsca guza w stanie nienaruszonym, spowodowały upośledzenie biodostępności składnika cytotoksycznego (tj. Dox) w miejscu docelowym (tj. Jądrze komórki nowotworowej). Chociaż Dox-NP znacznie poprawił odpowiedź w porównaniu z wolną formą, nadal miał wartość kliniczną, ponieważ enkapsulacja znacznie zmniejszyła działanie kardiotoksyczne5. W kolejnych latach inne związki zostały zamknięte w nano-nośnikach6. Ponadto modyfikacja nośników powodowała wyzwalanie uwalniania leku (tj. w miejscu guza), ale utrzymywała stabilność krążenia krwi7,8. Pomimo wieloletnich badań i stosowania klinicznego, losy wewnątrznowotworowe nanonośników, takich jak Dox-NP, nadal nie są do końca jasne. W niedawnej publikacji wykazano, że nanocząstka jest pobierana jako całość, podczas gdy doks pozostaje uwięziony w lizosomach9.

Komórkowy absorpcja nanocząsteczki i uwalnianie leku to dynamiczne procesy, które najlepiej można monitorować za pomocą obrazowania żywych komórek. Co więcej, klasyczna histologia, w której komórki są inkubowane, a następnie utrwalane, może dawać fałszywe wyniki, jeśli fiksacja zniszczy nośnik liposomalny i wprowadzi artefakty. Głównym wymogiem obrazowania żywych komórek jest wizualizacja, najlepiej za pomocą fluorescencji, pożądanego procesu. Niektóre związki, takie jak dox, mają wewnętrzną czerwoną fluorescencję. Do nośnika można również wprowadzić markery fluorescencyjne, a organelle komórkowe można wizualizować za pomocą markerów żywych komórek. W ten sposób można obrazować i analizować szereg parametrów, takich jak wychwyt nośnika, uwalnianie leku oraz lokalizacja komórkowa nośnika i leku. W tym miejscu opisano metodę, w której losy międzykomórkowe dox i Dox-NP w kilku komórkach nowotworowych są śledzone w czasie rzeczywistym. Ponadto metodę tę można łatwo zaadaptować, aby stworzyć idealne warunki do ukierunkowanego (np. naładowane nanocząstki10) i wyzwalanego (np. hipertermia7) uwalniania leku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie

  1. Zmontuj komorę obrazowania, która składa się z dwóch części.
    1. Umieść 25-milimetrową szklaną pokrywę (Rysunek 1A-1) w dolnej części komory (Rysunek 1A-2) i przykręć górną część do dolnej części (Rysunek 1A-3). Nie dokręcaj zbyt mocno, ponieważ szkło może pęknąć. Autoklawuj całą komorę (Rysunek 1A-4).
  2. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco bez czerwieni fenolowej 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (FCS) i 1 mM L-glutaminą w sterylnych warunkach. Przed użyciem przechowywać w temperaturze 4 °C i ogrzać do 37 °C.
  3. Utrzymywać komórki z pożywką do hodowli komórkowych w kolbach hodowlanych przy użyciu standardowych technik hodowli komórkowych.
    UWAGA: W tym przypadku użyto dwóch linii komórkowych myszy, czerniaka B16BL611 i raka płuc Lewisa (LLC) oraz dwóch ludzkich czerniaków, BLM i 1F612.
  4. Przygotować 0,1% żelatyny, ważąc i rozpuszczając żelatynę w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 37 °C przez noc. Wysterylizować roztwór, filtrując go przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Komórki płytkowe

  1. Wyjmij komorę obrazowania z worka sterylizacyjnego w komorze z przepływem laminarnym, ostrożnie dokręć komorę i umieść ją na szalce Petriego.
    UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, należy przechowywać komorę obrazowania na szalce Petriego do czasu, aż komora będzie mogła zostać umieszczona pod mikroskopem.
  2. Pokryć szklankę komory obrazowania 1 ml 0,1% sterylnej żelatyny przez 20 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Umożliwi to lepsze przymocowanie komórki.
  3. Usunąć pożywkę z kolb do hodowli komórkowych (patrz kroki 1.2 i 1.3), przemyć raz 1x PBS i odłączyć komórki za pomocą 0,25% trypsyny. Dezaktywuj trypsynę, dodając pożywkę do hodowli komórkowych, zbierz komórki, odwiruj je w temperaturze 1 100 x g przez 5 minut i ponownie zawieś osad w 5 ml pożywki do hodowli komórkowych.
  4. Rozcieńczyć 20 μl zawiesiny komórkowej 20 μl błękitu trypanowego (który zostanie wchłonięty przez martwe komórki). Policz liczbę żywych i martwych komórek za pomocą hemocytometru; Liczba martwych komórek nie powinna przekraczać 10%.
  5. Odessać żelatynę i umieścić komórki w rozcieńczeniu, które pozwala na maksymalnie 70% pokrycie w ciągu 24 godzin. Na przykład użyj rozcieńczenia 5 x 104 lub 10 x 104 komórek w 1 ml. Pozostawić komórki do przylegania w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

3. Mikroskopia poklatkowa (Rysunek 2)

UWAGA: Tutaj użyto mikroskopu konfokalnego z specjalnie wykonanym uchwytem na stolik, chociaż większość producentów oferuje szereg inkubatorów do obrazowania żywych komórek, które są również odpowiednie do badania dostarczania nanocząstek leku.

  1. Oceń komórki pod mikroskopem pod kątem zbiegu, morfologii komórkowej i zanieczyszczenia. Umieść komorę z powrotem w inkubatorze CO2 .
    UWAGA: Zbieg nie powinien przekraczać 70%. Jeśli morfologia komórek jest niespójna (tj. komórki nie przylegają) lub wykryte zostanie zanieczyszczenie, należy wyrzucić komorę obrazowania.
  2. Włącz mikroskop konfokalny (Rysunek 1E-1), światło fluorescencyjne (Rysunek 1E-2) i komputer (Rysunek 1E-3).
  3. Podłącz grzałkę obiektywu do obiektywu i ustaw ją na 35 °C (Rysunek 1E-4 + wkładka).
  4. Przygotuj jednostkę inkubacyjną, jak pokazano na Rysunek 1B.
    UWAGA: To urządzenie składa się z podgrzewanego stopnia ( Rysunek 1B-1), stopnia przepływu ze złączem do rur CO2 ( Rysunek 1B-2) i sondy CO2 ( Rysunek 1B-3) oraz czerwonej łatki zamykającej ( Rysunek 1B-4). Ta łatka służy do tymczasowego zamknięcia urządzenia do czasu umieszczenia komory obrazowania.
  5. Umieść jednostkę inkubacyjną na stoliku mikroskopu i podłącz rurki wlotowe i wylotowe CO2 (Rysunek 1E-5). Otwórz główny zawór CO2 ( Rysunek 1E-6) i włącz regulator CO2 ( Rysunek 1E-7). Sprawdź, czy sterownik jest ustawiony na 5% CO2.
    UWAGA: W przypadku wilgotności CO2 przechodzi przez nawilżacz ( Rysunek 1E-8). W przypadku eksperymentów z hipoksją w zestawie znajduje się oddzielny regulator O2 (Rysunek 1E-9).
  6. Ustaw temperaturę stage na 37 °C ( Rysunek 1E-10). W przypadku eksperymentów z hipertermią należy ustawić temperaturę na 42 °C. Pozwolić, aby jednostka inkubacyjna osiągnęła wybraną temperaturę i zawartość CO2 procent.
  7. Wyjąć komorę obrazowania z głównego inkubatoraCO2 i przetransportować ją na szalce Petriego do pomieszczenia mikroskopowego.
  8. Umieść komorę obrazowania (Rysunek 1A-4) w specjalnie wykonanym uchwycie stolika o średnicy 35 mm (Rysunek 1A-5) i zamknij komorę wykonaną na zamówienie pokrywą uszczelniającą (Rysunek 1A-6).
    UWAGA: Pokrywka przepuszcza CO2 i zapobiega parowaniu i zanieczyszczeniu.
    1. Otwórz jednostkę inkubacyjną, zastąp czerwoną plamę komorą obrazowania i zamknij jednostkę (Rysunek 1C). Zrób to tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec wychłodzeniu komórek. Upewnij się, że żadne nie są zablokowane między stage a mikroskopem.
  9. Pozostaw urządzenie do aklimatyzacji na 30 minut.
  10. Otwórz oprogramowanie i włącz lasers.
    UWAGA: Tutaj użyto laserów argonowych o długości fali 488 nm, helowo-neonowych o długości fali 543 nm i laserów helowo-neonowych o długości fali 633 nm.
  11. Utwórz nową bazę danych, klikając "Nowa" w zakładce Plik. Nazwij i zapisz bazę danych.
  12. Ustaw konfigurację, klikając "Konfiguracja" w zakładce Pobierz. Wybierz "Tryb kanału" i "Pojedyncza ścieżka", aby ocenić pojedynczy fluorofor lub "Wiele ścieżek" dla kilku fluoroforów. Wybierz odpowiednie filtry pasmowo-przepustowe pasujące do fluoroforu (np. filtr pasmowo-przepustowy od 560 do 615 nm dla dox i Dox-NP; więcej przykładów można znaleźć w reprezentatywnych wynikach). Wybierz kanał jasnego pola na jednej ze ścieżek.
  13. Ustaw kontrolkę skanowania, klikając "Skanuj" na karcie Pobieranie. Ustaw rozmiar klatki (1,024 x 1,024), prędkość skanowania (optymalna), kierunek skanowania (8-bitowy, pojedynczy) i średnią skanowania (4), klikając "Tryb". Ustaw otwór (200 μm), wzmocnienie i przesunięcie (np. 580, 700 i 835; patrz Rysunek 3) oraz moc lasera (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%), klikając "Kanały".
  14. Zapisz te ustawienia, klikając "Config" w zakładce Konfiguracja i zapisz je w bazie danych konfiguracji.
  15. Ustaw film poklatkowy, klikając "Multi Time X" (Rysunek 1D) w zakładce Makro. Kliknij "Pojedyncza lokalizacja".
  16. Aby zachować ostrość komórek, wybierz automatyczne ustawianie ostrości w makrze, klikając "Autofokus".
    UWAGA: Autofokus uzyskuje się za pomocą lasera 633 nm, wykorzystując odbicie szkła jako punkt odniesienia.
  17. Zastosuj zapisaną konfigurację, klikając "Pojedyncza ścieżka" lub "Wiele ścieżki", przewijając do wymaganej konfiguracji w bazie danych konfiguracji, ustawiając przedział czasowy (np. 15 min), liczbę skanów (np. 97) i klikając "Załaduj konfigurację."
    Uwaga: Korzystając z tych ustawień, zostaną utworzone szeregi czasowe 97 x 15 min = 24 h.
  18. Nazwij film poklatkowy w polu "Podstawowa nazwa pliku" i wybierz bazę danych (utworzoną w kroku 3.11), klikając "Baza danych obrazu", aby zapisać film poklatkowy. Ustaw folder tymczasowy, klikając "Tmp Image Folder"."
    UWAGA: Jeśli system zatrzyma się lub ulegnie awarii z jakiegokolwiek powodu, obrazy znajdują się w tym folderze.
  19. Otwórz jednostkę inkubacyjną, podnieś pierścień obrazowania, dodaj kroplę olejku immersyjnego do obiektywu i zamknij jednostkę tak szybko, jak to możliwe. Ustawić ostrość i wybrać pozycję w komorze obrazowania.
    UWAGA: Ta pozycja zawiera komórki w monowarstwie, z minimalną 70% konfluencją, co pozwala na obrazowanie pojedynczych komórek.
  20. Sprawdź ustawienia konfiguracyjne tła i popraw je w razie potrzeby.
    UWAGA: Tło można skorygować, zmniejszając wzmocnienie lub moc lasera. Każda zmiana konfiguracji musi zostać zapisana (patrz krok 3.17) i ponownie załadowana (patrz krok 3.18) do makra.
  21. W komorze z przepływem laminarnym rozcieńczyć wolny lek lub nanocząstki w stężeniu 5 μg/ml leku lub 0,05 μmol lipidów w pożywce do hodowli komórkowych. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm, jeśli lek/nanocząstki nie są sterylne.
  22. Otwórz komorę inkubacyjną, podnieś pokrywę uszczelniającą, usuń pożywkę z komórek, dodaj 1 ml rozcieńczonego leku/nanocząstek i zamknij urządzenie tak szybko, jak to możliwe.
  23. Skoncentruj się na komórkach i rozpocznij film poklatkowy, klikając "Start Time" w makrze Multi Time X.
  24. Sprawdzaj regularnie, czy komórki są nadal ostre, lub użyj autofokusa (patrz krok 3.16). Program automatycznie zapisuje film poklatkowy w bazie danych; Nie zamykaj bazy danych, gdy program jest uruchomiony.

4. Analiza danych

  1. W zależności od pierwotnego pytania badawczego użyj programów, takich jak ImageJ, do analizy danych (przykłady znajdują się w sekcji Wyniki).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etykietowanie nośników liposomalnych różnymi markerami zostało wcześniej opisane9. Nośniki znakowane dalekiej czerwieni nadchloranem dioktadecylu tetrametylolindotrikarbocyjaniny (DiD; Ex = 644 nm; Em = 665 nm) lub zielona 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(karboksyfluoresceina) (CF-PE; Ex = 490 nm; Em = 515 nm) są przedstawione w niniejszym manuskrypcie. Aby wykazać międzykomórkowe podobieństwa i różnice w wychwytywaniu, uwalnianiu i lokalizacji wewnątrzkomórkowej, zbadano kilka typów nowotworów. Należą do nich dwie linie myszy, B16BL6 melanoma11 i Lewis lung carcinoma (LLC), oraz dwa ludzkie czerniaki, czerniak o wysokim stopniu przerzutów (BLM) i czerniak bez przerzutów (1F6)12,13. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na żywych komórkach. We wszystkich eksperymentach przez 3 lub 24 godziny podawano stężenie 5 μg/ml dox, 5 μg/ml Dox-NP lub 0,05 μmol nanocząstek. Mierzone i analizowane dox (w formie swobodnej, uwolnionej, enkapsulowanej, sekwestrowanej lub interkalowanej) były określane jako DXR. Zastosowano olejową soczewkę obiektywową 40X (apertura numeryczna: 1,3), a obrazowanie wykonano za pomocą lasera argonowego 488 nm (moc 10%/0,2 mW) i filtra pasmowo-przepustowego od 505 do 550 nm dla CF-PE i markera lizosomalnego (LM)-zielony. Laser helowo-neonowy o długości fali 543 nm (moc 100%/ 0,2 mW) i filtr pasmowo-przepustowy od 560 do 615 nm zastosowano do dox, Dox-NP i lizosomalnej czerwieni markera. Do DiD zastosowano laser helowo-neonowy o długości fali 633 nm (moc 100%/0,5 mW) oraz filtr długoprzepustowy o długości fali 640 nm.

Ze względu na jego enkapsulację, cytotoksyczność, biodostępność i farmakokinetyka dox in vitro uległy znaczącym zmianom3,9,14. Różnica między biodostępnością leku podawanego w postaci wolnej i kapsułkowanej jest pokazana na Rysunek 3. Dox jest środkiem interkalacyjnym i musi dostać się do jądra komórkowego, aby stać się cytotoksycznym. Rysunek 3 i powiązane filmy 1 i 2 pokazują 3-godzinny film poklatkowy komórek BLM potraktowanych dox lub Dox-NP w identycznych warunkach. W ciągu kilku minut od ekspozycji na doks, jądrowy DXR może być obserwowany (Rysunek 3A, Film 1) i, przy użyciu niższego wzmocnienia (insert), można zobaczyć, jak interkaluje się w jądrze. W przeciwieństwie do tego, po wystawieniu na działanie Dox-NP, wewnątrzkomórkowy DXR jest ledwo widoczny w tym przedziale czasowym (Rysunek 3B, Film 2). Tylko poprzez zwiększenie wzmocnienia fotopowielacza można zaobserwować DXR w cytoplazmie (insert). Za pomocą ImageJ przeanalizowano gęstości pikseli cytoplazmatycznego i jądrowego DXR. Ponieważ komórki są w ruchu podczas oceny poklatkowej, ważne jest, aby połączyć obrazy fluorescencyjne z obrazami w jasnym polu. Daje to możliwość śledzenia pojedynczych komórek i stabilizacji dryfu XY za pomocą określonych wtyczek w ImageJ. W analizie przedstawionej w Rysunek 3, obraz jasnego pola został wykorzystany do narysowania obszaru zainteresowania (ROI) wokół cytoplazmy (linia ciągła) i jądra (linia przerywana). Menedżer ROI w ImageJ znajduje się w punkcie menu Analizuj narzędzia > > Menedżer ROI. Te ROI są używane w obrazie fluorescencyjnym do analizowania gęstości pikseli za pomocą elementu menu Analizuj > Mierz. Różnica między gęstością pikseli w jądrze (Rysunek 3C) a cytoplazmą (Rysunek 3D) komórek traktowanych dox lub Dox-NP potwierdza to, co widać na obrazach. Ponadto komórki inkubowano przez 24 godziny z dox lub Dox-NP, po czym związek zastąpiono pożywką i natychmiast zobrazowano ze zwiększoną czułością wzmocnienia fotopowielacza (Rysunek 4). Inne ustawienia, takie jak moc lasera, przesunięcie, otworek i wyświetlanie obrazu, były identyczne. Niski sygnał DXR w ogniwach traktowanych Dox-NP w porównaniu z ogniwami traktowanymi Dox jest uderzający. Przy wzmocnieniu 700 DXR w komórkach traktowanych Dox-NP staje się widoczny, podczas gdy obraz dox jest już prześwietlony. Ten prosty eksperyment in vitro obrazuje znaczącą różnicę w biodostępności leku wolnego w porównaniu z lekiem kapsułkowanym.

Gdy komórki są stale wystawione na działanie Dox-NP przez 24 godziny, DXR narasta z czasem, jak pokazano na Rysunek 5A oraz filmy 3 i 4. Sygnał wzrasta w cytoplazmie, a później DXR znajduje się również interkalowany w jądrze. Obserwacje te potwierdzają wykresy gęstości pikseli (Rysunek 5B). Zmierzona gęstość pikseli cytoplazmatycznych jest niższa w BLM w porównaniu z komórkami 1F6 ze względu na różnicę w dystrybucji wewnątrzkomórkowej. Podczas gdy DXR w komórkach 1F6 jest rozprowadzany w całej komórce, DXR w komórkach BLM jest bardziej skoncentrowany w organelli blisko jądra (Rysunek 5C).

Dlatego zbadano lokalizację leku i nośnika w różnych liniach komórkowych (Rysunek 6). Komórki inkubowano przez 24 godziny z Dox-NP/DiD i obrazowano. Korzystając z obrazu w jasnym polu, narysowano nakładkę błony komórkowej (linia ciągła) i jądra (linia przerywana) na obrazie fluorescencyjnym trzech różnych linii komórkowych. Wykazano tutaj, że nośnik, oznaczony DiD, podąża za tym samym wzorcem cytoplazmatycznym co DXR: skoncentrowany w organelli blisko jądra w BLM, wokół całego jądra w LLC i losowo rozproszony w cytoplazmie w komórkach B16BL6. W jądrze można zobaczyć tylko DXR i brak DiD, co wskazuje na uwolniony dox. Zmniejszając zysk fotopowielacza, można zobaczyć pojedyncze pęcherzyki komórkowe zawierające DXR i nośnik, oznaczone DiD, a także CF-PE (Rysunki 6B i 6C).

Cytoplazmatyczne sekwestry DXR w małych pęcherzykach, a komórki zostały oznaczone markerem lizosomalnym żywych komórek na zielono lub czerwono. Ruch tych lizosomów można śledzić w komórkach (film 5). Cytoplazmatyczny DXR i nanonośnik kolokalizują się w tych strukturach, a międzykomórkowa różnica we wzorze DXR, jak widać na Rysunek 6, jest wyjaśniona tutaj. Lizosomy są losowo rozmieszczone w cytoplazmie w B16BL6 i znajdują się obok jądra w komórkach BLM (Figura 7A). Za pomocą ImageJ obliczono kolokalizację między DXR a nośnikiem w lizosomie (Rysunek 7B). Kolorowe obrazy zostały wykonane binarnie (Process > Binary > Make Binary) i za pomocą wtyczki kolokalizacyjnej (Analyze > Colocalization) utworzono obraz kolokalizacyjny DXR z DiD. Spowoduje to utworzenie obrazu w kolorze zielono-czerwono-białym, z białymi pikselami reprezentującymi kolokalizowane piksele obu obrazów. Za pomocą pozycji menu Process > Binary > Make Binary białe piksele zostaną oddzielone i zamienione na czarne piksele, na podstawie których mierzona jest gęstość pikseli (Analizuj > Mierz). Następnie wykonano obraz kolokalizacyjny między tym obrazem DXR-DiD a binarnym obrazem markera lizosomalnego (LM) i zmierzonej gęstości pikseli. Dane kolokalizacyjne to procent pikseli dodatnich dla DXR-DiD i DXR-DiD/markera lizosomalnego (Rysunek 7C). To, że nośnik, oznaczony CF-PE oraz DiD, znajduje się w lizosomie, jest również pokazane w Rysunek 7D.

figure-results-1
Rysunek 1: Konfiguracja przyrządów i sprzętu. A) Komora obrazowania + potrzeby. Szklana osłona 25 mm #1 (1), dolna część komory (2), górna część komory (umieszczona do góry nogami) i O-ring (3), uchwyt stage (4) i pokrywa uszczelniająca (5). Podziałka: 2 cm. B) Jednostka inkubacyjna. Podgrzewany stolik mikroskopu (1), stopień przepływu z wlotem i odpływem dla CO2 (2), sonda CO2 (3) i łata zamykająca (4). Podziałka: 2 cm. C) Komora obrazowania w inkubatorze, widziana pod mikroskopem. D) Makro szeregów wieloczasowych. E) Sprzęt do obrazowania. Mikroskop odwrócony (1), światło fluorescencyjne (2), komputer (3), grzałka pierścieniowa (4, wkładka) i sterownik (4, rysunek główny), rurka przepływowa CO2 (5), zawór CO2 (6), regulator CO2 (7), nawilżacz CO2 (8), zawór i sterownik O2 (9) oraz regulator temperatury stage (10). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat parametrów mikroskopu szczegółowo opisany w sekcji 3 protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Badanie krótkoterminowego wykorzystania dox i Dox-NP. Komórki BLM były stale wystawione na działanie dox lub Dox-NP przez 3 godziny, a następnie wykonano film poklatkowy. (A) Zdjęcia poklatkowe komórek inkubowanych z dox. (B) Zdjęcia poklatkowe komórek inkubowanych z Dox-NP. Podziałka = 50 μm. (C) Wzrost gęstości pikseli jądrowego DXR w komórkach traktowanych dox i Dox-NP. (D) Wzrost gęstości pikseli cytoplazmatycznego DXR w komórkach traktowanych dox i Dox-NP. Dane reprezentują średnią ± SD wynoszącą 3 komórki na pole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Badanie długoterminowego wychwytu dox i dox-NP w różnych liniach komórkowych. Komórki wystawiono na działanie dox lub Dox-NP i zobrazowano 24 godziny później. Zdjęcia zostały wykonane natychmiast po usunięciu leków, z 3 różnymi wzmocnieniami. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Badanie wychwytu i uwalniania czynników liposomalnych przez komórki. Komórki były stale wystawione na działanie Dox-NP przez 24 godziny i wykonano film poklatkowy. (A) Zdjęcia poklatkowe. Podziałka = 50 μm. (B) Wzrost gęstości pikseli DXR w jądrze i cytoplazmie. Dane reprezentują średnią ± SD wynoszącą 3 komórki na pole. (C) Obrazy pokazujące lokalizację DXR w komórce. Linia ciągła: błona komórkowa, linia przerywana: jądro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Badanie lokalizacji leku i nośnika w różnych liniach komórkowych. (A) Komórki wystawiono na działanie Dox-NP/DiD przez 24 godziny i zobrazowano. Pasek skali = 50 μm. (B) Komórki wystawiono na działanie Dox-NP/DiD/CF-PE przez 24 godziny i zobrazowano z mniejszym przyrostem intensywności w celu rozróżnienia poszczególnych pęcherzyków. (C) Jasne pole i nakładka DXR pokazująca DXR w pęcherzykach cytoplazmatycznych (strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rycina 7: Badanie wewnątrzkomórkowej lokalizacji leku i nośnika. Komórki wystawiono na działanie Dox-NP/DiD lub CF-PE/DiD przez 24 godziny, a lizosomy wizualizowano za pomocą markera lizosomalnego żywej komórki (LM) w kolorze zielonym lub czerwonym. (A) Wewnątrzkomórkowa lokalizacja DXR i nośnika (DiD). Strzałki reprezentują 3 przykłady DXR i DiD zlokalizowanych w lizosomie. Podziałka = 50 μm. (B) Analiza kolokalizacji DXR i nośnika (DiD) w lizosomach (LM) przy użyciu ImageJ. (C) Procent kolokalizacji DXR i nośnika w lizosomach. Dane reprezentują średnią ± SEM z 3 indywidualnych eksperymentów. (D) Lizosomalne sekwestrowanie nośnika uwidocznione za pomocą dwóch różnych markerów. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Film 1: Związany z Rysunek 3: Komórki BLM inkubowano z dox przez 3 godziny. Film poklatkowy: 19 zdjęć, w interwale 10 min. Liczba klatek na sekundę: 3 kl./s. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-9
Film 2: Związany z Rysunek 3: Komórki BLM inkubowano z Dox-NP przez 3 godziny. Film poklatkowy: 19 zdjęć, w interwale 10 min. Liczba klatek na sekundę: 3 kl./s. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-10
Film 3: Związany z Rysunek 5: Komórki BLM inkubowano z Dox-NP przez 24 godziny. Film poklatkowy: 96 zdjęć, w interwale 15 min. Liczba klatek na sekundę: 8 kl./s. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-11
Film 4: Związany z Rysunek 5: Komórki 1F6 inkubowano z Dox-NP przez 24 godziny. Film poklatkowy: 96 zdjęć, w interwale 15 min. Liczba klatek na sekundę: 8 kl./s. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

figure-results-12
Film 5: Związany z Rysunek 7: Lizosomy komórek B16BL6 zostały wybarwione markerem żywych komórek. Tryb poklatkowy: 10 zdjęć w odstępie 10 s. Liczba klatek na sekundę: 3 kl./s. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak zaobserwowano w przeszłości, fiksacja może niemal natychmiast zniszczyć liposomalne nanonośniki, a DXR uwolniony z tych zniszczonych liposomów miał jeszcze czas, aby dostać się do jądra, co sprawia, że interpretacja danych jest bardzo trudna, a nawet myląca. Dzięki pewnym mikroskopijnym dostosacjom, los chemioterapeutyku w żywych komórkach i tkankach może być rutynowo badany w celu potwierdzenia lub obalenia obserwacji histologicznych. Niedawny artykuł wykazał wychwyt, uwalnianie i lokalizację DXR w komórkach traktowanych wolnym i otorbionym dox przyużyciu obrazowania poklatkowego na żywo 9. W tej pracy opisano konfigurację eksperymentalną bardziej szczegółowo. Korzystając z tego modelu, można zobrazować natychmiastowy transport dox do jądra, gdzie gromadzi się on w sposób ciągły, aż do ostatecznej śmierci komórki. W przeciwieństwie do tego, gdy stosuje się Dox-NP, w jądrze znajdują się tylko niewielkie ilości uwolnionego dox. Chociaż ciągła ekspozycja powoduje ciągłe gromadzenie się DXR, sygnał fluorescencyjny jest znacznie niższy w komórkach traktowanych Dox-NP- w porównaniu z komórkami traktowanymi dox, co wskazuje na różnicę w stężeniu komórkowym i wynikającej z tego cytotoksyczności. Ponadto, dzięki zastosowaniu markerów żywych komórek, wykazano, że podczas wystawiania komórek na działanie Dox-NP, DXR i nanonośnik znajdują się w lizosomie. Wskazuje to, że cały liposom jest pobierany przez komórkę i wykazuje udział szlaku endocytarnego podczas wychwytu tych nanocząstek. DXR w jądrze wyraźnie pochodzi z uwolnionego dox. Jednak przy użyciu tej metody, ponieważ zarówno DXR, jak i nośnik kolokalizują się i wydają się być uwięzione w lizosomach, nadal nie jest jednoznaczne, czy jest to kapsułkowane, czy uwalniane dox. Możliwe, że wewnętrzna stabilność nanocząstki zapobiega uwalnianiu dox, gdy jest zlokalizowana w lizosomie.

W tym protokole obrazowanie żywych komórek jest demonstrowane przy użyciu specjalnego zestawu mikroskopowego, z niestandardowym uchwytem stolika (specyfikacje mogą być podane na życzenie). Jednak większość producentów mikroskopów konfokalnych oferuje szereg inkubatorów, które wykonują obrazowanie żywych komórek. Zachowanie warunków hodowli komórkowej (tj. temperatury, CO2, pH, wilgotności i sterylności) jest głównym kryterium tych inkubatorów i wymaga pewnych wstępnych testów w celu określenia właściwych warunków, co jest dalej wyjaśniane. Zautomatyzowane programy do akwizycji danych mogą być również dostarczane przez tych samych producentów. Opcja "Multi location" umożliwia obrazowanie kilku pozycji w tej samej komorze, co usprawnia analizę statystyczną. Jednak ta opcja w makrze wspomnianym w tym manuskrypcie wymaga stałych pozycji XYZ, dzięki czemu traci się możliwość skorygowania dryfu Z. Skanowanie wymiaru Z może być uwzględnione w tym makrze i wykorzystuje płaszczyznę ostrości do analizy. Wymaga to jednak dodatkowego skanowania, co zwiększa możliwość fototoksyczności i wybielania.

Podobnie jak w przypadku wszystkich pomiarów fluorescencyjnych, nadmierna ekspozycja stanowi problem, zwłaszcza przy porównywaniu dwóch związków o różnym wychwycie komórkowym. Intensywność fluorescencji zależy nie tylko od wewnętrznego sygnału związku, ale także od szybkości wchłaniania, stężenia i czasu ekspozycji na lek. Jak pokazano na rysunku 3, jądrowa zawartość DXR w komórkach traktowanych dox jest już widoczna, podczas gdy w komórkach traktowanych Dox-NP nie widać żadnego sygnału. Tylko poprzez zwiększenie wzmocnienia można uwidocznić DXR w komórkach traktowanych Dox-NP, co prowadzi do nadmiernej ekspozycji w komórkach traktowanych Dox. Co więcej, nawet wewnątrzkomórkowo Dox-NP jest niejednorodnie rozmieszczony, co może prowadzić do nieuniknionej niedostatecznej lub nadmiernej ekspozycji. Zwłaszcza podczas badania uwięzienia komórkowego DXR, zysk został znacznie zmniejszony w celu rozróżnienia poszczególnych organelli (ryc. 5B i 5C). W związku z tym pomiarom reprezentowanym przez gęstość pikseli muszą towarzyszyć reprezentatywne obrazy w celu prawidłowej interpretacji wyników.

Fototoksyczność, wybielanie i niski stosunek sygnału do szumu są również ważnymi kwestiami w mikroskopii fluorescencyjnej i należy ustalić kompromis między jakością obrazu a akwizycją obrazu. Jednak nawet jeśli konfiguracja mikroskopu jest optymalna, jakość obrazu jest również w dużej mierze determinowana przez jakość komórek i dodanego związku. DXR daje silny sygnał i przy zachowaniu odpowiednich środków ostrożności nie zaobserwowano wybielania, nawet po dłuższych okresach (do 72 godzin). Jednak zmniejszenie sygnału fluorescencyjnego może być również wynikiem wypływu. Wypływ jest ważnym zjawiskiem w oporności na leki15 i występuje, gdy komórki wypompowują lek z wewnątrzkomórkowego miejsca działania. Spadek sygnału fluorescencyjnego w czasie może być zatem również wynikiem wypływu doks9. Porównanie sygnału fluorescencyjnego z nieskanowanego miejsca pod koniec eksperymentu z ostatnim obrazem z serii poklatkowej wykaże blaknięcie (tj. sygnał będzie wyższy w miejscu, które nie zostało zeskanowane) lub wypływ (tj. oba sygnały będą identyczne). W programach takich jak ImageJ16 dostępnych jest kilka opcji korekcji (np. tło, dryf, wybielanie itp.). Ponadto, wraz ze wzrostem intensywności świetlówki w miarę upływu czasu, ustawienia konfiguracyjne można wstępnie ocenić w eksperymencie pilotażowym, aby zminimalizować prześwietlenie pod koniec filmu poklatkowego (krok 3.21). Alternatywnie, do inicjalizacji ustawień można użyć komory obrazowania z komórkami już wystawionymi na działanie leku przez żądany okres czasu. Wreszcie, w przypadku tego typu analizy, należy unikać stężeń toksycznych leków (krok 3.22) i wstępnie ustalić je za pomocą konwencjonalnych testów biologicznych.

Komórki są w sposób ciągły hodowane i utrzymywane w pożywce bez czerwieni fenolowej. Czerwień fenolowa fluoryzuje w czerwonej części widma i można ją zaobserwować w organellach komórkowych, najprawdopodobniej lizosomach, prezentując informacje fałszywie dodatnie (krok 1.2). Aby umożliwić monitorowanie pojedynczych komórek, konfluencja komórek nie powinna przekraczać 70% (krok 3.1.). Prędkość przepływu CO2 (krok 3.5) musi być regulowana w eksperymencie walidacyjnym w momencie zakupu sprzętu lub po jego konserwacji. Gdy prędkość jest zbyt wysoka, medium wyparuje. Gdy prędkość jest zbyt niska, pH pożywki wzrośnie, co może wpłynąć na wzrost komórek. Ponieważ podłoże jest pozbawione czerwieni fenolowej, nie można zaobserwować zmian w pH, a zatem łatwo je przeoczyć. Po walidacji przepływu CO2 ustawienia te mogą być używane we wszystkich przyszłych eksperymentach.

Korzystając z opisanej tutaj metody, losy nanocząstek można łatwo badać za pomocą obrazowania żywych komórek i mikroskopii poklatkowej. W tej procedurze wykorzystano dostępne na rynku nanocząstki. Jednak los termoczułych17, liposomów kationowych10; liposomy wzbogacone o krótkołańcuchowe shingolipidy18; i nanocząstki kapsułkujące inne leki 8,19 badano również w ten sposób w komórkach nowotworowych i prawidłowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Używane urządzenia mikroskopowe są częścią Centrum Obrazowania Optycznego Erasmus i chcielibyśmy podziękować personelowi OIC za ich usługi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM (bez czerwieni fenolowej)SigmaD1145Uzupełniony 1 mM L-glutaminą i 10% FCS
Trypsyna-versene (EDTA)LonzaBE17-161E
Surowica cielęca płoduSigmaF7524Inaktywacja ciepła przez 30 min w temperaturze 55 º C
L-GlutaminaLonzaBE17-605E
Żelatyna ze skóry bydlęcejSigmaG9391Sporządzić 0,1% roztwór w PBS, sterylny
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaD8537
Stericup 0,22 &mikro; m filtr - 500 ml MilliporeSCGPU05RE
Trypan-blueSigmaT8154
Komórki: Rak płuc LewisaATCCCRL-1642
Komórki: B16BL6Dr. P. Brouckaert, Uniwersytet w GandawieprzekazałRef.10
Komórki: BLM i 1F6Dr. van Muijen, University of NijmegenprzekazałRef.11
Szalka PetriegoGreiner664160
DoksorubicynaActavis wymieniony w rękopisie jako dox
Doxil/CaelyxJanssen-Cilagwymieniony jako Dox-NP w rękopisie
Filtr strzykawkowy 0,2 i mikro; mVWR international10462200
Lysotracker-zielony DND-26InvitrogenL7526wymieniony jako marker liosomalny (LM)-zielony w rękopisie
Lysotracker-czerwony DND-99InvitrogenL7528wymieniony jako marker liosomalny (LM)-czerwony w rękopisie
Pierścień komórkowy AttofluorInvitrogenA7816
Szkło nakrywkowe 25 mm #1Thermo scientific
Uchwyt stolika + pokrywa uszczelniającaWykonany
mikroskop ZEISS LSM 510Oprogramowanie Zeiss
LSM 510 wersja 3.2 SP2Zeiss
Image JNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/index.html
CB00250RA1na zamówienie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
  2. Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
  3. Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
  4. Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
  5. Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
  6. Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
  7. Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
  8. Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
  9. Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
  10. Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
  11. Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
  12. Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
  13. Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
  14. Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
  15. Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
  16. Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
  17. Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
  18. Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
  19. Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia poklatkowaleki chemioterapeutycznepobieranie doksorubicynymikroskopia konfokalnaprocesy kom rkowekom rki nowotworowemarkery fluorescencyjneuwalnianie leku

Powiązane artykuły