Artykuł metodologiczny

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

1 maja 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośnie zapotrzebowanie na analizę wielu próbek biologicznych w celu zrozumienia chorób i odkrycia biomarkerów. Ilościowe strategie proteomiczne, które umożliwiają jednoczesny pomiar wielu próbek, stały się powszechne i znacznie skracają koszty i czas eksperymentów. Nasze laboratorium opracowało technikę zwaną połączonym znakowaniem izotopowym prekursorów i znakowaniem izobarycznym (cPILOT), która usprawnia multipleksowanie próbek w porównaniu z tradycyjnymi metodami znakowania izotopowego lub izobarycznego. Global cPILOT może być stosowany do próbek pochodzących z komórek, tkanek, płynów ustrojowych lub całych organizmów i dostarcza informacji na temat względnej obfitości białek w różnych warunkach próbki. cPILOT działa poprzez: 1) wykorzystanie warunków buforowych o niskim pH do selektywnego dimetylowania N-końców peptydu oraz 2) wykorzystanie warunków buforowych o wysokim pH do znakowania pierwszorzędowych amin reszt lizyny dostępnymi na rynku odczynnikami izobarycznymi (patrz Tabela materiałów/odczynników). Dostępny stopień multipleksowania próbki zależy od liczby użytych znaczników prekursora i odczynnika do znakowania izobarycznego. Tutaj przedstawiamy analizę 12-plex przy użyciu lekkiej i ciężkiej dimetylacji w połączeniu z sześcio-pleksowymi odczynnikami izobarycznymi do analizy 12 próbek z tkanek myszy w jednej analizie. Ulepszone multipleksowanie jest pomocne w skracaniu czasu i kosztów eksperymentu, a co ważniejsze, umożliwia porównanie wielu warunków próbki (kontrprób biologicznych, stadium choroby, leczenie farmakologiczne, genotypy lub podłużne punkty czasowe) przy mniejszym odchyleniu i błędzie eksperymentalnym. W niniejszej pracy globalne podejście cPILOT jest wykorzystywane do analizy tkanek mózgu, serca i wątroby w replikacjach biologicznych z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego. Global cPILOT może być stosowany do badania innych procesów biologicznych i przystosowany do zwiększenia multipleksowania próbek do ponad 20 próbek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomika często obejmuje analizę wielu próbek wykorzystywanych do lepszego zrozumienia procesów chorobowych, kinetyki enzymów, modyfikacji potranslacyjnych, reakcji na bodźce środowiskowe, odpowiedzi na leczenie terapeutyczne, odkrywania biomarkerów lub mechanizmów leków. Metody ilościowe mogą być stosowane do pomiaru względnych różnic w poziomach białka w próbkach i mogą być bezznacznikowe lub obejmować znakowanie izotopowe (metaboliczne, chemiczne lub enzymatyczne). Metody znakowania stabilnymi izotopami zyskały na popularności, ponieważ umożliwiają jednoczesną analizę wielu próbek i są odpowiednie dla próbek z różnych komórek, tkanek, płynów ustrojowych lub całych organizmów. Metody oznaczania izotopów1,2,3,4,5,6,7 zwiększają przepustowość eksperymentalną, jednocześnie skracając czas pozyskiwania, koszty i błędy eksperymentalne. Metody te wykorzystują widma masowe prekursorów do pomiaru względnej obfitości białek z pików peptydów. W przeciwieństwie do tego, odczynniki do znakowania izobarycznego8,9,10 generują jony reporterowe, które są wykrywane w widmach MS/MS lub MS3 11, a te piki są używane do raportowania względnej obfitości białek.

Aktualnym stanem techniki w multipleksowaniu proteomicznym jest 10-plex12 lub 12-plex isobaric tag analysis13. Ulepszone metody multipleksowania próbek (tj. >10 próbek) zostały opracowane przez nasze laboratorium dla tissues14,15,16,17, oraz przez inne do analizy komórek18,19,20, tissues 21, lub targeted peptides22. Opracowaliśmy ulepszoną technikę multipleksowania zwaną połączonym znakowaniem izotopowym prekursorów ze znakowaniem izobarycznym (cPILOT). Global cPILOT jest przydatny do uzyskiwania informacji o względnych stężeniach wszystkich białek w różnych warunkach próbki (≥12)14. Rysunek 1 przedstawia ogólny przebieg pracy cPILOT. Peptydy tryptyczne lub Lys-C są selektywnie znakowane na N-końcu za pomocą dimetylacji przy użyciu niskiego pH2 i przy resztach lizyny za pomocą odczynników 6-plex przy użyciu wysokiego pH. Strategia ta podwaja liczbę próbek, które można analizować za pomocą odczynników izobarycznych, co pomaga obniżyć koszty eksperymentu, a dodatkowo skraca etapy i czas eksperymentu.

cPILOT jest elastyczny, ponieważ opracowaliśmy inne metody badania oksydacyjnych modyfikacji potranslacyjnych, w tym białka modyfikowane 3-nitrotyrozyną14 i peptydy zawierające cysteinę z S-nitrozylacją (oxcyscPILOT)23. Opracowaliśmy również podejście selektywne dla aminokwasów, cysteina cPILOT (cyscPILOT)17. Akwizycja MS3 za pomocą top-ion11 lub metody selektywnej1-jonowej15 może pomóc w zmniejszeniu interferencji jonów reporterowych i poprawie dokładności ilościowej cPILOT. Zastosowanie MS3 w metodzie akwizycji wymaga instrumentu o wysokiej rozdzielczości z analizatorem masy orbitrap, chociaż instrumenty pułapki jonowej o niskiej rozdzielczości mogą również działać24.

Poprzednio, cPILOT był używany do badania białek wątroby16 z mysiego modelu choroby Alzheimera. W tym miejscu opisujemy, jak przeprowadzić globalną analizę cPILOT przy użyciu homogenatów mózgu, serca i wątroby w celu zbadania roli peryferii w chorobie Alzheimera. Eksperyment ten obejmuje replikację biologiczną. Ze względu na wszechstronność cPILOT, zainteresowani użytkownicy mogą wykorzystać tę technikę do badania innych tkanek pod kątem szeregu problemów i układów biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Myszy zostały zakupione od niezależnej, niekomercyjnej instytucji badań biomedycznych i umieszczone w Wydziale Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie w Pittsburghu. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie w Pittsburghu.

1. Ekstrakcja białek i wytwarzanie peptydów do znakowania chemicznego

  1. Ekstrakcja białka z tkanek, komórek lub płynów ustrojowych.
    1. Homogenizować 60-90 mg tkanki (np. mózgu, serca i wątroby) w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego (1x PBS) z 8 M mocznikiem (500 μL) za pomocą homogenizatora mechanicznego. W razie potrzeby do buforu można dodać inhibitory proteazy lub fosfatazy. W tym projekcie nie zostały one wykorzystane. Dla homogenizatora należy zastosować następujące parametry: kulki A matrycy lizy, 4 m/s, 20 s. Tkanka serca może wymagać do 9 cykli homogenizacji.
      UWAGA: W razie potrzeby do buforu można dodać inhibitory proteazy lub fosfatazy. Nie zostały one wykorzystane w tym badaniu.
      1. Usunąć homogenat tkankowy z probówki do lizy i przenieść do probówki do mikrowirówki. Przepłukać probówki lizujące 100-500 μl PBS z 8 M mocznikiem i połączyć roztwór płuczący z homogenatem tkankowym.
    2. Odwirować homogenizowane tkanki (9,447 x g, 4 °C, 15 min) i zebrać supernatant.
  2. Oznaczyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Dalsze rozcieńczanie buforem może być konieczne, jeśli stężenie białka jest zbyt wysokie. Uzyskane stężenia dla próbek z tych tkanek mieściły się w przedziale 6-13 μg/μL.
    1. Opcjonalnie: Dodać wzorzec wewnętrznej kontroli jakości (np. alfakazeina bydlęca lub inne białko egzogenne) o stosunku 1 μg wzorzec:100 μg próbki białka.

2. Trawienie próbki

  1. Dodać 100 μg (100 x 10-6 g) białka z każdej próbki do indywidualnie znakowanych probówek wirówek. Objętość zależy od stężenia białka (patrz krok 1.2).
  2. Dodać ditiotreitol (DTT) (stosunek molowy odczynnika 40:1 do próbki) do każdej próbki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Obliczenie stosunku molowego opiera się na masie białkowej albuminy surowicy bydlęcej (BSA), która wynosi 66,5 x 103 g/mol.
  3. Dodać jodoacetamid (IAM) (stosunek molowy odczynnika 80:1 do próbki) do każdej próbki. Inkubować na lodzie w ciemności przez 2 godziny. Reakcję tę przeprowadza się na lodzie przez 2 godziny, aby zapobiec reakcjom ubocznym.
  4. Dodaj L-cysteinę (stosunek odczynnika 40:1 do mola próbki) do każdej próbki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  5. Dodać 20 mM bufor Tris z 10 mM CaCl2 (pH 8,2) w celu rozcieńczenia mocznika do końcowego stężenia 2 M.
  6. Do każdej próbki dodać trypsynę poddaną działaniu L-1-tozyloamido-2 fenyloetylochlorometylu (TPCK) (stosunek substratu do mola enzymu) (stosunek 50:1 substratu do mola enzymu) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  7. Stłumić trawienie białka przez błyskawiczne zamrożenie próbki w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.

3. Odsalanie próbek

  1. Ponownie zakwasić próbki, dodając kwas mrówkowy (FA). Dodaj tyle FA, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1%. Jeśli próbki są pierwotnie w temperaturze -80 °C, należy je rozmrozić na lodzie przed ponownym zakwaszeniem.
  2. Odsolić peptydy za pomocą wkładów C18 hydrofilic lipophilic balanced (HLB) 10 mg, jak opisano wcześniej16.
  3. Wysuszyć próbki przez odwirowanie próżniowe (5 Torr, 45 °C, 77 x g) do objętości ~10 μL.

4. Etykietowanie dimetylacji (N-termini)

  1. Rozpuścić peptydy w 1% kwasie octowym (0,25 μg/μl) rozpuszczonym w wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) lub w wodzie o czystości nanoczystej. Przenieść porcję 50 μg do nowej probówki do mikrowirówki (1,5 ml) i przechowywać pozostałą część w temperaturze -80 °C.
  2. Dodać 8 μl 60 mM (4%) CH2O (37% wag./v) lub 60 mM (4%) 13CD2O (20% wag./v) do próbek w celu znakowania odpowiednio lekką lub ciężką dimetylocją. Zazwyczaj dodaje się 4 μl odczynnika na 25 μg peptydów (kroki 4.2, 4.3, 4.6).
  3. Dodać 8 μl 24 mM NaBH3CN lub 24 mM NaBD3CN do próbek oznakowanych odpowiednio lekką lub ciężką dimetylowaniem.
  4. Wirować i wstrząsać na wytrząsarce rurowej przez ~10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Reakcje schładzić dodając 16 μL 1% amoniaku (~28-30% v/v) przez 5 min. Zazwyczaj dodaje się 8 μl odczynnika na 25 μg peptydów.
  6. Mieszaniny reakcyjne należy ponownie zakwasić, dodając 8 μl 5% FA (98% v/v).
  7. Połącz lekkie i ciężkie peptydy dimetylowane (rysunek 1), aby uzyskać w sumie sześć próbek. W Tabeli 1 znajduje się opis tagowania i łączenia prób wykorzystanych w tym badaniu.
  8. Przeprowadzić odsalanie próbki zgodnie z krokami 3.2 i 3.3.

5. Znakowanie izobaryczne (pozostałości Lys)

  1. Rozpuść 100 μg dimetylonowych peptydów (1 μg/μL) w 100 mM buforze wodorowęglanu tri-etyloamonu (TEAB) (pH ~ 8,5).
  2. Przygotować odczynniki izobaryczne zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów/odczynników).
  3. Dodać rozpuszczone odczynniki izobaryczne (41 μl) do peptydów i wirować przez ~10 s. Wstrząsać próbkami na wytrząsarce w probówce do mikrowirówek przez ~1 h. Schłodzić reakcje 8 μl hydroksyloaminy (10% w/v) i inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Połączyć sześć oznakowanych próbek w jedną mieszaninę i odsolić (kroki 3.1-3.3) lub przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: W celu poprawy pokrycia i głębokości proteomu sugeruje się wielowymiarową strategię separacji, taką jak silna wymiana kationów (SCX).

6. Silna wymiana kationów

  1. Wykonaj SCX zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
    1. Przygotuj ~1 ml roztworów mrówczanu amonu (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM i 500 mM) z 10% acetonitrylem (ACN), 0,1% FA (pH 3).
    2. Zdejmij czerwoną nasadkę z górnej części końcówki pipety i postukaj w końcówkę pipety zawiesiną do pakowania, aby upewnić się, że materiał opakowaniowy znajduje się w dolnej części końcówki pipety.
      UWAGA: Krytyczne: Nie wyrzucaj końcówki pipety do końca protokołu.
    3. Umieść adapter wirówki na górze probówki do mikrowirówki (2 ml) i zamocuj końcówkę pipety w środku.
    4. Dodać 150 μl buforu do rozpuszczania SCX na końcówki pipet.
    5. Odwirowywać końcówki pipet przez 6 minut w temperaturze pokojowej (4 000 x g). Powtórz ten krok jeszcze dwa razy i wyrzuć odpady.
    6. Rozpuścić peptydy w 150 μl buforu do rozpuszczania SCX. Upewnij się, że pH wynosi 3.
    7. Dodać peptydy do końcówek pipet, odwirować (patrz ppkt 6.1.5) i zachować eluent.
    8. Przenieść filtr i pipetę do nowej probówki do mikrowirówki (2 ml) i dodać 150 μl 20 mM roztworu mrówczanu amonu. Wirować przez 6 minut w temperaturze pokojowej (4 000 x g) i przechowywać eluent.
    9. Powtórzyć krok 6.1.8 dodatkowo siedem razy, stosując kolejne stężenia (tj. 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM i 500 mM) mrówczanu amonu.
  2. Przenieść osiem frakcji SCX do probówek do mikrowirówek (1,5 ml) i zagęścić je za pomocą odparowania odśrodkowego (patrz krok 3.3).

7. Chromatografia cieczowa – tandemowa spektrometria mas (LC-MS/MS) i MS3

  1. Rozpuść peptydy w wodzie o spektrometrii mas z 0,1% FA, przefiltruj i umieść w fiolce z automatycznym samplerem. Przefiltruj peptydy w następujący sposób:
    1. Dodać rozpuszczone peptydy do probówki mikrowirówki zawierającej filtr 0,65 μm (patrz tabela materiałów).
    2. Wirować peptydy przy 12 000 x g przez 1 minutę. Usuń filtr, wyrzuć i dodaj przefiltrowane peptydy do fiolki z automatycznym samplerem.
  2. Przygotować fazy ruchomej w następujący sposób: 3% (v/v) ACN z 0,1% FA (A) i 100% ACN z 0,1% FA (B).
  3. Wstrzyknąć 6 μl każdej próbki frakcji SCX do kolumny pułapki wypełnionej materiałem C18 o średnicy 2 cm (5 μm, 200 A wielkość porów).
    UWAGA: Czyszczenie próbki na syfon przebiega następująco: 3 min, 0% B; 3 μl/min przy użyciu systemu chromatografii cieczowej 2D (patrz tabela materiałów).
  4. Uruchom metodę separacji analitycznej. Użyj laserowej kolumny kapilarnej z topionej krzemionki o średnicy wewnętrznej 75 μm x 13,2 cm z wyciąganą końcówką, wypełnionej materiałem C18 (5 μm, 100 A). Nachylenie wynosi: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% B; 40-90 min, 15-25% B; 90-115 min, 25-30% B; 115-130 min, 30-60% B; 130-135 min, 60-80% B; 135-145 min, 80% B, 145-150 min, 80-10% B; 150-180 min, 10% B; 300 nL/min, 180 min.
  5. Uruchom akwizycję danych dla spektrometru mas, gdy metoda separacji analitycznej jest uruchomiona.
    UWAGA: Parametry skanowania badania MS są następujące: 400-1 600 m/z, rozdzielczość 60 000, cel automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 1 x 106 jonów, maksymalny czas wtrysku 500 ms. Parametry dla CID–MS/MS są następujące: Akwizycja zależna od danych Top 1-7 lub Top 8-14 (DDA), szerokość izolacji 3 m/z, minimalny sygnał 500, 35% znormalizowana energia zderzenia (NCE), 0,25 q aktywacji, czas aktywacji 10 ms, 3 x 104 AGC, maksymalny czas wtrysku 50 ms. Parametry dla HCD–MS3 są następujące: sygnał minimum 200, szerokość izolacji 4 m/z, 60% NCE, czas aktywacji 0,1, 3 x 105 AGC, 250 ms IT, zakres wyboru 300-1,300 m/z MS/MS, z wyłączeniem niefragmentowanego jonu macierzystego.
  6. Wykonaj każdą analizę w dwóch egzemplarzach zarówno dla pierwszych 1-7, jak i pierwszych 8-14 przebiegów.
    UWAGA: W przypadku próbek uruchamianych na nowszym modelu instrumentu zawierającego orbitrap lub tribrydowy spektrometr masowy, parametry DDA będą się różnić i mogą być zoptymalizowane tak, aby obejmowały więcej skanów MS/MS i MS3. Dodatkowo, w przypadku instrumentów tribrydowych, należy zastosować synchroniczną selekcję prekursorów (SPS)-MS3.

8. Analiza danych16

  1. Przeszukaj pliki RAW za pomocą oprogramowania do analizy białek w odpowiedniej bazie danych, takiej jak mysz Uniprot.
    UWAGA: Ważne jest, aby utworzyć dwa przepływy pracy dla każdego pliku RAW w celu wyszukania lekkich i ciężkich peptydów dimetylowanych.
  2. Przeszukaj pliki RAW przy użyciu następujących parametrów: trypsyna z dwoma pominiętymi cięciami, zakres mas peptydów 300-6,000 Da, tolerancja masy macierzystej 15 ppm, tolerancja fragmentacji 1 Da. Modyfikacje statyczne: lekka dimetylacja (+28,031, N-koniec peptydu) lub ciężka dimetylacja (+36,076 Da, N-koniec peptydu), karbamidomtyl (+57,021 Da, C).
    UWAGA: Czasami ciężki dimetylowany pik wynosi ~ 7 Da (+35.069 Da, N-koniec peptydu) pochodzi z lekkiego dimetylowanego piku i dlatego powinien być włączony do przepływu pracy wyszukiwania ciężkich dimetylowanych peptydów. Modyfikacje dynamiczne: utlenianie (+15,995 Da, M), znacznik izobaryczny 6-plex (229,163 Da, K). Uwzględnij wyszukiwanie w bazie danych wabików, aby uzyskać wskaźniki fałszywych odkryć (np. 1 i 5%) oraz węzeł ilościowy, aby wyszukać intensywności jonów reporterowych znaczników izobarycznych.
  3. statystyka
    1. Eksport danych do elektronicznego arkusza kalkulacyjnego w celu normalizacji wartości jonów reporterowych białek. Dla każdego białka należy podzielić albo medianę stosunków jonów reporterowych, albo intensywność surowych jonów reporterowych przez średni stosunek wzorca wewnętrznego lub intensywności surowych jonów reporterowych wzorca wewnętrznego. Użyj odpowiedniego oprogramowania statystycznego, takiego jak elektroniczny arkusz kalkulacyjny, Perseus lub R, aby określić znaczące zmiany w warunkach próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT wykorzystuje chemię opartą na aminie do chemicznego znakowania peptydów na N-końcu i reszt lizyny oraz zwiększa możliwości multipleksowania próbek. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne dane dotyczące stwardnienia rozsianego, które uzyskano z 12-pleksowej analizy cPILOT tkanek mózgu, serca i wątroby z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego. Jak pokazano w Tabeli 1, w tej analizie 12-plex uwzględniono dwie kontrpróby biologiczne d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT pozwala na jednoczesny pomiar więcej niż 12 unikalnych próbek. Aby zapewnić pomyślne znakowanie zarówno na N-końcu, jak i na resztach lizyny peptydów, konieczne jest uzyskanie prawidłowego pH dla każdego zestawu reakcji i przeprowadzenie najpierw reakcji dimetylacji w celu znakowania peptydów. Selektywną dimetylację na N-końcu przeprowadza się przy pH na poziomie ~2,5 (±0,2). Osiąga się to poprzez wykorzystanie różnic w pKA grup aminowych na lizynie i N-końcu. Przy pH 2,5 lizyna jest nieaktywna (pKA ~10,5); jednak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują RASR za grant University of Pittsburgh Start-up Funds oraz NIH, NIGMS R01 (GM 117191-01).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ilość wody - MS GradeFisher ScientificW6-44 L nie jest konieczna
Acetonitryl - MS GradeFisher ScientificA955-4ilość 4 l nie jest konieczna
Kwas octowyJ.T. Baker9508-01
Roztwór wodorotlenku amonu (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Mrówczan amonuAcros Organics208-753-9
Kwas mrówkowyFluka Analytical94318-250ML-F
Zestaw do oznaczania białekBCA Pierce Thermo Fisher Scientific23227
MocznikBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Ditiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Jodoacetamid (IAM)Acros Organics144-48-9
L-cysteinaSigma Aldrich, Chemia168149-25G
L-1-tozyloamido-2 keton fenyloetylo-cholormetylowy (TPCK) traktowany trypsyną z trzustki bydlęcejSigma Aldrich, nauki przyrodniczeT1426-100MG
Roztwór formaldehydu (CH2O); 36,5 - 38% w H2OSigma Aldrich, naukiprzyrodniczeF8775-25ML
Formaldehyd (13CD2O); 20 % wag. w D2O, 98 atomów % D, 99 atomów % 13CSigma Aldrich, Chemia596388-1G
Cyjanoborowodorek sodu; klasa odczynnika, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Cyjanoborodeuterek sodu; 96 atomów % D, 98% CPSigma Aldrich, Chemia190020-1G
Końcówki spinowe z silną wymianą kationową (SCX) zestaw do przygotowania próbkiProtea BioSciencesSP-155-24kit
Bufor wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB)Sigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Zestaw do znakowania izobarycznego (TMT 6 plex) - 6 reakcji (1 x 0,8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
Chlorowodorek hydroksyloaminySigma Aldrich, Chemia255580-100G
Standardowy mieszalnik wirowyFisher Scientific2215365można użyć dowolnego miksera
Wkłady ekstrakcyjne Oasis HLB 1 cc (10 mg)Wody186000383Są to wkłady C18
Kolektor próżniowy Visiprep SPE, DL (jednorazowa wkładka), model 24-portowySigma Aldrich57265Wystarczający jest również model z 12 portami
Speed-vacThermo ScientificSPD1010wystarczy dowolna marka speed vac
Komora do kąpieli wodnejThermo Scientific2825/2826Wystarczy dowolna marka  komory do kąpieli wodnej z kontrolowaną temperaturą.
Homogenizator mechaniczny (i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D z automatycznym podajnikiem próbek Nano LC AS-2Sciex-Tenmodel nie jest już dostępny. Wystarczy dowolny nano LC z automatycznym samplerem.
Spektrometr masowy LTQ Orbitrap VelosThermoScientific-Tenmodel nie jest już dostępny. Można używać innych instrumentów o wysokiej rozdzielczości (np. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion lub Orbitrap Fusion Lumos).
Oprogramowanie białkowe (np. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Waga analitycznaMettler ToledoAL54
Płytka mieszającaVWR12365-382Wystarczy każda marka płytek mieszających
pH-metr (kompatybilny z Tris)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Wystarczy pH-metr dowolnej marki
Bufor pH 10Fisher Scientific06-664-261Wystarczy dowolnej marki buforu pH 10
pH 7 buforFisher Scientific06-664-260Dowolny markowy bufor pH 7 jest wystarczający
1,5 ml probówek eppendorf, 500 pkFisher Scientific05-408-129Wystarczy dowolnej marki probówek eppendorf 1,5
ml 0,6 ml probówek eppendorf, 500 pkFisher Scientific04-408-120Wystarczy dowolnej marki probówek eppendorf 0,6 ml
0,65 µ m Ultrafree MC DV filtry odśrodkoweEMD MilliporeUFC30DV00
2 mL probówki do mikrowirówek, 72 jednostkiThermo Scientific69720
Materiał opakowaniowy C18 (5  &mikro; m, 100 & Aring ;)BrukerPM5/61100/000Ten produkt nie jest już dostępny w firmie Bruker. Alternatywny materiał opakowaniowy o podanych specyfikacjach będzie wystarczającym
materiałem opakowaniowym C18 (5  &mikro; m, 200 & Aring ;)BrukerPM5/61200/000Ten produkt nie jest już dostępny w firmie Bruker. Wystarczający będzie alternatywny materiał opakowaniowy o podanych specyfikacjach

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
  3. Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
  4. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
  5. Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
  8. Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  9. Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  10. Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
  11. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
  12. McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  13. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  14. Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  15. Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  16. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  17. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
  18. Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2(2012).
  19. Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
  20. Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
  21. Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
  22. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  23. Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  24. Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
  25. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  26. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dimethylation LabelingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

Powiązane artykuły