Method Article

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

May 1st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośnie zapotrzebowanie na analizę wielu próbek biologicznych w celu zrozumienia chorób i odkrycia biomarkerów. Ilościowe strategie proteomiczne, które umożliwiają jednoczesny pomiar wielu próbek, stały się powszechne i znacznie skracają koszty i czas eksperymentów. Nasze laboratorium opracowało technikę zwaną połączonym znakowaniem izotopowym prekursorów i znakowaniem izobarycznym (cPILOT), która usprawnia multipleksowanie próbek w porównaniu z tradycyjnymi metodami znakowania izotopowego lub izobarycznego. Global cPILOT może być stosowany do próbek pochodzących z komórek, tkanek, płynów ustrojowych lub całych organizmów i dostarcza informacji na temat względnej obfitości białek w różnych warunkach próbki. cPILOT działa poprzez: 1) wykorzystanie warunków buforowych o niskim pH do selektywnego dimetylowania N-końców peptydu oraz 2) wykorzystanie warunków buforowych o wysokim pH do znakowania pierwszorzędowych amin reszt lizyny dostępnymi na rynku odczynnikami izobarycznymi (patrz Tabela materiałów/odczynników). Dostępny stopień multipleksowania próbki zależy od liczby użytych znaczników prekursora i odczynnika do znakowania izobarycznego. Tutaj przedstawiamy analizę 12-plex przy użyciu lekkiej i ciężkiej dimetylacji w połączeniu z sześcio-pleksowymi odczynnikami izobarycznymi do analizy 12 próbek z tkanek myszy w jednej analizie. Ulepszone multipleksowanie jest pomocne w skracaniu czasu i kosztów eksperymentu, a co ważniejsze, umożliwia porównanie wielu warunków próbki (kontrprób biologicznych, stadium choroby, leczenie farmakologiczne, genotypy lub podłużne punkty czasowe) przy mniejszym odchyleniu i błędzie eksperymentalnym. W niniejszej pracy globalne podejście cPILOT jest wykorzystywane do analizy tkanek mózgu, serca i wątroby w replikacjach biologicznych z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego. Global cPILOT może być stosowany do badania innych procesów biologicznych i przystosowany do zwiększenia multipleksowania próbek do ponad 20 próbek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomika często obejmuje analizę wielu próbek wykorzystywanych do lepszego zrozumienia procesów chorobowych, kinetyki enzymów, modyfikacji potranslacyjnych, reakcji na bodźce środowiskowe, odpowiedzi na leczenie terapeutyczne, odkrywania biomarkerów lub mechanizmów leków. Metody ilościowe mogą być stosowane do pomiaru względnych różnic w poziomach białka w próbkach i mogą być bezznacznikowe lub obejmować znakowanie izotopowe (metaboliczne, chemiczne lub enzymatyczne). Metody znakowania stabilnymi izotopami zyskały na popularności, ponieważ umożliwiają jednoczesną analizę wielu próbek i są odpowiednie dla próbek z różnych komórek, tkanek, płynów ustrojowych lub całyc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Myszy zostały zakupione od niezależnej, niekomercyjnej instytucji badań biomedycznych i umieszczone w Wydziale Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie w Pittsburghu. Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie w Pittsburghu.

1. Ekstrakcja białek i wytwarzanie peptydów do znakowania chemicznego

  1. Ekstrakcja białka z tkanek, komórek lub płynów ustrojowych.
    1. Homogenizować 60-90 mg tkanki (np. mózgu, serca i wątroby) w roztworze soli fizjologicznej buforu fosforanowego ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT wykorzystuje chemię opartą na aminie do chemicznego znakowania peptydów na N-końcu i reszt lizyny oraz zwiększa możliwości multipleksowania próbek. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne dane dotyczące stwardnienia rozsianego, które uzyskano z 12-pleksowej analizy cPILOT tkanek mózgu, serca i wątroby z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego. Jak pokazano w Tabeli 1, w tej analizie 12-plex uwzględniono dwie kontrpróby biologiczne d.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT pozwala na jednoczesny pomiar więcej niż 12 unikalnych próbek. Aby zapewnić pomyślne znakowanie zarówno na N-końcu, jak i na resztach lizyny peptydów, konieczne jest uzyskanie prawidłowego pH dla każdego zestawu reakcji i przeprowadzenie najpierw reakcji dimetylacji w celu znakowania peptydów. Selektywną dimetylację na N-końcu przeprowadza się przy pH na poziomie ~2,5 (±0,2). Osiąga się to poprzez wykorzystanie różnic w pKA grup aminowych na lizynie i N-końcu. Przy pH 2,5 lizyna jest nieaktywna (pKA ~10,5); jednak.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują RASR za grant University of Pittsburgh Start-up Funds oraz NIH, NIGMS R01 (GM 117191-01).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ilość wody - MS GradeFisher ScientificW6-44 L nie jest konieczna
Acetonitryl - MS GradeFisher ScientificA955-4ilość 4 l nie jest konieczna
Kwas octowyJ.T. Baker9508-01
Roztwór wodorotlenku amonu (28 - 30%)Sigma Aldrich320145-500ML
Mrówczan amonuAcros Organics208-753-9
Kwas mrówkowyFluka Analytical94318-250ML-F
Zestaw do oznaczania białekBCA Pierce Thermo Fisher Scientific23227
MocznikBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Ditiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
Jodoacetamid (IAM)Acros Organics144-48-9
L-cysteinaSigma Aldrich, Chemia168149-25G
L-1-tozyloamido-2 keton fenyloetylo-cholormetylowy (TPCK) traktowany trypsyną z trzustki bydlęcejSigma Aldrich, nauki przyrodniczeT1426-100MG
Roztwór formaldehydu (CH2O); 36,5 - 38% w H2OSigma Aldrich, naukiprzyrodniczeF8775-25ML
Formaldehyd (13CD2O); 20 % wag. w D2O, 98 atomów % D, 99 atomów % 13CSigma Aldrich, Chemia596388-1G
Cyjanoborowodorek sodu; klasa odczynnika, 95%Sigma Aldrich156159-10G
Cyjanoborodeuterek sodu; 96 atomów % D, 98% CPSigma Aldrich, Chemia190020-1G
Końcówki spinowe z silną wymianą kationową (SCX) zestaw do przygotowania próbkiProtea BioSciencesSP-155-24kit
Bufor wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB)Sigma Aldrich, Life ScienceT7408-100ML
Zestaw do znakowania izobarycznego (TMT 6 plex) - 6 reakcji (1 x 0,8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
Chlorowodorek hydroksyloaminySigma Aldrich, Chemia255580-100G
Standardowy mieszalnik wirowyFisher Scientific2215365można użyć dowolnego miksera
Wkłady ekstrakcyjne Oasis HLB 1 cc (10 mg)Wody186000383Są to wkłady C18
Kolektor próżniowy Visiprep SPE, DL (jednorazowa wkładka), model 24-portowySigma Aldrich57265Wystarczający jest również model z 12 portami
Speed-vacThermo ScientificSPD1010wystarczy dowolna marka speed vac
Komora do kąpieli wodnejThermo Scientific2825/2826Wystarczy dowolna marka  komory do kąpieli wodnej z kontrolowaną temperaturą.
Homogenizator mechaniczny (i.e. FastPrep-24 5G)MP Biomedicals116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D z automatycznym podajnikiem próbek Nano LC AS-2Sciex-Tenmodel nie jest już dostępny. Wystarczy dowolny nano LC z automatycznym samplerem.
Spektrometr masowy LTQ Orbitrap VelosThermoScientific-Tenmodel nie jest już dostępny. Można używać innych instrumentów o wysokiej rozdzielczości (np. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion lub Orbitrap Fusion Lumos).
Oprogramowanie białkowe (np. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Waga analitycznaMettler ToledoAL54
Płytka mieszającaVWR12365-382Wystarczy każda marka płytek mieszających
pH-metr (kompatybilny z Tris)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Wystarczy pH-metr dowolnej marki
Bufor pH 10Fisher Scientific06-664-261Wystarczy dowolnej marki buforu pH 10
pH 7 buforFisher Scientific06-664-260Dowolny markowy bufor pH 7 jest wystarczający
1,5 ml probówek eppendorf, 500 pkFisher Scientific05-408-129Wystarczy dowolnej marki probówek eppendorf 1,5
ml 0,6 ml probówek eppendorf, 500 pkFisher Scientific04-408-120Wystarczy dowolnej marki probówek eppendorf 0,6 ml
0,65 µ m Ultrafree MC DV filtry odśrodkoweEMD MilliporeUFC30DV00
2 mL probówki do mikrowirówek, 72 jednostkiThermo Scientific69720
Materiał opakowaniowy C18 (5  &mikro; m, 100 & Aring ;)BrukerPM5/61100/000Ten produkt nie jest już dostępny w firmie Bruker. Alternatywny materiał opakowaniowy o podanych specyfikacjach będzie wystarczającym
materiałem opakowaniowym C18 (5  &mikro; m, 200 & Aring ;)BrukerPM5/61200/000Ten produkt nie jest już dostępny w firmie Bruker. Wystarczający będzie alternatywny materiał opakowaniowy o podanych specyfikacjach

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

cPILOTIsobaric TaggingDimethylation LabelingSample MultiplexingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

Related Articles