Artykuł metodologiczny

Analiza morfologii dendrytycznej w kolumnach i warstwach

DOI:

10.3791/55410

⸱

23 marca 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Neuronal Connectivity, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (NIH), 2Mathematical and Statistical Computing Laboratory, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH), 3Biomedical Imaging Research Services Section, Center for Information Technology, National Institutes of Health (NIH)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy, jak analizować dendrytyczne kierowanie neuronów rdzenia Drosophila w kolumnach i warstwach. Przepływ pracy obejmuje technikę obrazowania w podwójnym widoku w celu poprawy jakości obrazu oraz narzędzia obliczeniowe do śledzenia, rejestrowania trzpieni dendrytycznych do układu kolumn referencyjnych oraz do analizy struktur dendrytycznych w przestrzeni 3D.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W wielu obszarach ośrodkowego układu nerwowego, takich jak płaty wzrokowe muchy i kora kręgowców, obwody synaptyczne są zorganizowane w warstwy i kolumny, aby ułatwić okablowanie mózgu podczas rozwoju i przetwarzania informacji u rozwiniętych zwierząt. Neurony postsynaptyczne tworzą dendryty we specyficznych dla typu wzorcach w określonych warstwach do synapsy z odpowiednimi zakończeniami presynaptycznymi. Rdzeń muchy neuropil składa się z 10 warstw i około 750 kolumn; Każda kolumna jest unerwiona przez dendryty ponad 38 typów neuronów rdzenia, które pasują do zakończeń aksonalnych około 7 typów aferentów w sposób specyficzny dla typu. Ten raport szczegółowo opisuje procedury obrazowania i analizy dendrytów neuronów rdzenia. Przepływ pracy obejmuje trzy sekcje: (i) sekcja obrazowania w podwójnym widoku łączy dwa konfokalne stosy obrazów zebrane w orientacji ortogonalnej w obraz 3D dendrytów o wysokiej rozdzielczości; (ii) sekcja śledzenia i rejestracji dendrytów śledzi altany dendrytyczne w 3D i rejestruje ślady dendrytyczne w układzie kolumn referencyjnych; (iii) Sekcja Analiza dendrytyczna analizuje wzorce dendrytyczne w odniesieniu do kolumn i warstw, w tym zakończenia specyficzne dla warstwy i kierunek projekcji płaskiej trzpieni dendrytycznych, a także uzyskuje szacunki częstotliwości rozgałęzień dendrytycznych i zakończeń. Protokoły wykorzystują niestandardowe wtyczki zbudowane na platformie open source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) oraz niestandardowe zestawy narzędzi w języku laboratorium matrycowego. Razem protokoły te zapewniają kompletny przepływ pracy w celu analizy dendrytycznego routingu neuronów rdzenia Drosophila w warstwach i kolumnach, w celu identyfikacji typów komórek i określenia defektów mutantów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas rozwoju, neurony tworzą dendryty w złożone, ale stereotypowe rozgałęzione wzory, tworząc synapsy ze swoimi presynaptycznymi partnerami. Wzorce rozgałęzień dendrytycznych korelują z tożsamością i funkcjami neuronów. Lokalizacje altan dendrytycznych określają rodzaj otrzymywanych przez nie presynaptycznych danych wejściowych, podczas gdy złożoność rozgałęzień dendrytycznych i rozmiary pól regulują liczbę wejść. Tak więc dendrytyczne właściwości morfologiczne są krytycznymi determinantami łączności synaptycznej i obliczeń neuronalnych. W wielu obszarach złożonych mózgów, takich jak płaty wzrokowe muchy i siatkówka kręgowców, obwody synaptyczne są zorganizowane w kolumny i warstwy, aby ułatwić przetwarzanie informacji1,2. W takiej organizacji kolumn i warstw neurony presynaptyczne o odrębnej modalności projektują aksony, aby kończyły się na określonej warstwie (tzw. celowanie specyficzne dla warstwy) i tworzyły uporządkowaną dwuwymiarową tablicę (tak zwana mapa topograficzna), podczas gdy neurony postsynaptyczne wydłużają dendryty o odpowiednich rozmiarach w określonych warstwach, aby odbierać presynaptyczne dane wejściowe o odpowiednich typach i liczbach. Podczas gdy celowanie aksonalne do warstw i kolumn zostało dobrze zbadane3,4, znacznie mniej wiadomo o tym, w jaki sposób dendryty są kierowane do określonych warstw i rozszerzają pola recepcyjne o odpowiedniej wielkości, aby utworzyć połączenia synaptyczne z właściwymi partnerami presynaptycznymi5. Trudność w obrazowaniu i ilościowym określeniu ukierunkowania dendrytycznego na warstwy i kolumny utrudniła badania nad rozwojem dendrytycznych w kolumnowych i laminowanych strukturach mózgu.

Neurony rdzenia Drosophila są idealnym modelem do badania dendrytycznego routingu i składania obwodów w kolumnach i warstwach. Rdzeń muchy neuropil jest zorganizowany jako siatka 3D składająca się z 10 warstw i około 750 kolumn. Każda kolumna jest unerwiona przez zestaw aferentów, w tym fotoreceptory R7/R8 i neurony blaszki L1 - L5, których zakończenia aksonalne tworzą mapy topograficzne w sposób specyficzny dla warstwy6. Około 38 typów neuronów rdzenia jest obecnych w każdej kolumnie rdzenia i wyszukanych dendrytów w określonych warstwach i o odpowiednich rozmiarach pól, aby otrzymywać dane wejściowe od tych aferentów7. Obwody synaptyczne w rdzeniu zostały zrekonstruowane na poziomie mikroskopii elektronowej; W ten sposób partnerstwa synaptyczne są dobrze ugruntowane7,8. Ponadto dostępne są narzędzia genetyczne do oznaczania różnych typów neuronów rdzenia9,10,11. Badając trzy typy neuronów transmerdzenia (Tm) (Tm2, Tm9 i Tm20), wcześniej zidentyfikowaliśmy dwa specyficzne dla typu komórki atrybuty dendrytyczne: (i) neurony Tm rzutują dendryty w kierunku przednim lub tylnym (kierunek projekcji płaskiej), w zależności od typów komórek oraz (ii) dendryty neuronów rdzenia kończą się w określonych warstwach rdzenia w sposób specyficzny dla typu komórki (zakończenie specyficzne dla warstwy)12. Kierunek projekcji planarnej i zakończenie specyficzne dla warstwy są wystarczające do rozróżnienia tych trzech typów neuronów Tm, podczas gdy mutacje, które zakłócają odpowiedzi Tm na sygnały warstwowe i kolumnowe, wpływają na różne aspekty tych atrybutów.

Tutaj prezentujemy kompletny proces badania dendrytycznych wzorów neuronów rdzenia Drosophila w kolumnach i warstwach (Rysunek 1). Po pierwsze, pokazujemy metodę obrazowania w podwójnym widoku, która wykorzystuje niestandardowe oprogramowanie do łączenia dwóch stosów obrazów konfokalnych w celu wygenerowania wysokiej jakości obrazów izotropowych. Metoda ta wymaga jedynie konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej w celu wygenerowania wysokiej jakości obrazów, które pozwalają na wiarygodne śledzenie gałęzi dendrytycznych, bez uciekania się do mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, takiej jak STED (Stimulated Emission Depletion) lub oświetlenia strukturalnego. Po drugie, przedstawiamy metodę śledzenia altan dendrytycznych i rejestrowania powstałych śladów neurytów w tablicy kolumn referencyjnych. Po trzecie, pokazujemy metody obliczeniowe do wydobywania informacji o kierunku projekcji płaskiej i terminacji dendrytów specyficznej dla warstwy, a także do uzyskiwania szacunków dla częstotliwości rozgałęzień dendrytycznych i terminacji. Łącznie metody te pozwalają na scharakteryzowanie wzorców dendrytycznych w 3D, klasyfikację typów komórek na podstawie morfologii dendrytycznych oraz identyfikację potencjalnych defektów mutantów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwaga: Protokół zawiera trzy sekcje: obrazowanie w podwójnym widoku (sekcje 1 - 3), śledzenie i rejestracja dendrytyczne (sekcje 4 - 6) oraz analiza dendrytyczna (sekcje 7 - 9) (Rysunek 1). Kody i przykładowe pliki znajdują się w Tabeli materiałów/wyposażenia.

1. Akwizycja dwóch obrazów

UWAGA: Ten krok ma na celu uzyskanie dwóch stosów obrazów interesującego neuronu w dwóch ortogonalnych (poziomej i frontalnej) orientacjach.

  1. Przygotuj mózgi much, które zawierają słabo oznakowane neurony rdzenia (~10 komórek/płat mózgu) z markerem GFP błony (mCD8GFP), jak wcześniej opisano12. Wybarwić mózg króliczym anty-GFP (dla dendrytów neuronów rdzenia) i mysim mAb24B10 (dla aksonów fotoreceptorów), przeciwciałami pierwszorzędowymi i fluorescencyjnymi przeciwciałami drugorzędowymi (Alexa 488 anty-królicze i Alexa 568 anty-mysie przeciwciała), jak opisano wcześniej13. Oczyść mózg w 70% glicerolu w 1x PBS.
  2. Aby zamontować mózg w orientacji poziomej (ryc. 2A, B), przenieś oczyszczony glicerolem mózg muchy do 20 μl kropli środka mocującego zapobiegającego blaknięciu na środku szkiełka.
  3. Przymocuj małe plamy gliny w 4 rogach szkiełka nakrywkowego, aby zapobiec zgnieceniu próbki mózgu przez szkiełko nakrywkowe podczas montażu.
    UWAGA: Łaty gliniane zapewniają amortyzację, aby zapobiec zgnieceniu próbki przez szkiełko nakrywkowe. Każda plama gliny powinna mieć około 1 mm średnicy.
  4. Pod mikroskopem preparacyjnym ustaw mózgi w pozycji brzusznej do góry i umieść szkiełko nakrywkowe na górze, aby zabezpieczyć mózg. Użyj wypukłej powierzchni grzbietowej mózgu jako punktu orientacyjnego, aby określić orientację próbki mózgu (ryc. 2A).
  5. Uzyskaj pierwszy stos obrazów (widok poziomy) za pomocą mikroskopu konfokalnego. Użyj soczewki obiektywowej o wysokim stopniu NA (takiej jak soczewka obiektywowa z glicerolem 63X 1,3 N.A. lub soczewką zanurzeniową w oleju) i 2,5-krotnym zoomem cyfrowym (rozmiar piksela wynosi 0,105 μm na piksel; średnia liczba to 2). Zdobądź ponad 180 przekrojów optycznych (512 x 512 pikseli), aby pokryć rdzeń neuropil z krokiem o wielkości 0,2 μm.
  6. Ponownie zamontuj mózg zgodnie z opisem w krokach 1.3 - 1.4, ale ustaw mózg w pozycji przedniej do góry (widok z przodu).
  7. Uzyskaj drugi stos obrazów (widok z przodu) tego samego neuronu, zgodnie z opisem w kroku 1.5.
    UWAGA: Znalezienie tego samego neuronu może być trudne, gdy w płacie wzrokowym znajduje się wiele neuronów. Aby zidentyfikować te same neurony w obu orientacjach, mogą być wymagane stosy obrazów o mniejszym powiększeniu z obu widoków (na przykład użyj powiększenia 0,7 i rozmiaru kroku 0,45 μm, aby uzyskać stosy obrazów o niskiej rozdzielczości). Jeśli obraz jest większy niż 512 x 512, obraz powinien zostać przycięty do 512 x 512 przed kombinacją obrazu, a rozmiar piksela powinien utrzymywać się na poziomie 0,105 μm na piksel podczas obrazowania dużego pola. Utrata sygnału jest potencjalnym problemem dla tkanek głębokich. Jeśli sygnał jest słaby, wyobraź sobie brzuszną połowę mózgu. Aby zmniejszyć fotowybielanie podczas skanowania, używaj jak najmniejszej mocy lasera. Użyj wskaźnika zasięgu, aby sprawdzić, czy nie ma prześwietlenia przed uzyskaniem stosów obrazów. Jeśli to możliwe, użyj mikroskopu konfokalnego wyposażonego w detektory GaAsP.
  8. Zidentyfikuj i zapisz lokalizację neuronu będącego przedmiotem zainteresowania w odniesieniu do rdzenia neuropil (prawy/lewy [R/L] i grzbietowy/brzuszny [D/V]). Sprawdź, czy próbka przesunęła się podczas akwizycji obrazu, sprawdzając stos obrazów.
    UWAGA: Przenoszenie próbki jest często spowodowane niewłaściwym montażem. Jeśli dojdzie do przemieszczenia próbki, stos obrazów nie może być użyty do rejestracji i należy go wyrzucić. Ponownie zamontuj próbkę i uzyskaj stosy obrazów z tego samego neuronu.

2. Dekonwolucja obrazu

UWAGA: Krok dekonwolucji wykorzystuje oprogramowanie do dekonwolucji obrazów do przywrócenia uzyskanych obrazów, które uległy degradacji przez rozmycie i szum. Chociaż ten krok jest opcjonalny, znacznie poprawia jakość obrazu. Zaleca się używanie nieskomplikowanych stosów obrazów do rejestracji i kombinacji obrazów w sekcji 3.

  1. Uruchom program dekonwolucyjny w trybie interaktywnym. Załaduj stos obrazów (w formacie lsm lub określonym formacie mikroskopowym), wybierając Menu:File/Open (lub Ctrl-o) w oknie głównym.
  2. Kliknij, aby wybrać załadowany stos obrazów i wybierz Menu:Ops, aby otworzyć okno operacji obrazu. Użyj domyślnego klasycznego algorytmu szacowania maksymalnego prawdopodobieństwa (CMLE).
  3. W oknie obsługi obrazu kliknij zakładkę "Parametry". Wprowadź odpowiednie parametry dla medium immersyjnego obiektywu (np. olej, gliceryna itp.), medium do zatapiania (np. olejek immersyjny itp.) oraz przysłony numerycznej (NA; tutaj użyto 1.3). Sprawdź pozostałe parametry, aby upewnić się, że prawidłowo odzwierciedlają warunki obrazowania. Kliknij zakładkę "Ustaw wszystkie zweryfikowane", aby sfinalizować ustawienia parametrów.
  4. W oknie obsługi obrazu kliknij zakładkę "Operacja". Przypisz miejsce docelowe wyjścia (np. c). Wprowadź odpowiednie liczby w polu "Sygnał/szum na kanał" (np. "12 12 12 12" jest dobrym punktem wyjścia, podczas gdy ustawienie domyślne to "20 20 20 20"). Użyj ustawień domyślnych dla pozostałych parametrów.
  5. Kliknij kartę "Uruchom polecenie", aby rozpocząć dekonwolucję stosu obrazów; proces ten może zająć do kilkudziesięciu minut, w zależności od komputera.
  6. W oknie głównym kliknij i wybierz zdekonwoluowany stos obrazów. Wybierz Menu:Zapisz jako, aby zapisać zdekonwoluowany obraz w formacie pliku obrazu ICS (.ics i .ids).
    UWAGA: Każdy stos obrazów zawiera dwa pliki: plik ics zawiera informacje nagłówka, a plik ids zawiera nieprzetworzone informacje o obrazie.
    1. Zmień nazwy plików stosu obrazów zgodnie z orientacją obrazowania (np. nazwij stosy obrazów w widoku poziomym H.ids i H.ics, a stos obrazów w widoku z przodu F.ids i F.ics).

3. Kombinacja obrazów z podwójnym widokiem

Uwaga: Ten krok łączy dwa stosy obrazów w celu wygenerowania obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości za pomocą oprogramowania MIPAV.

  1. Generowanie matryc do kombinacji obrazów.
    1. Uruchom program MIPAV. Załaduj stosy obrazów H i F, wybierając Menu:Plik/Otwórz obraz (A) z Dysku (lub Ctrl-f) /H.ids i F.ids; W oknie pojawią się dwa obrazy.
    2. Wybierz obraz H, klikając obraz i wybierz Menu:Narzędzia/Narzędzia do konwersji/RGB/Grays; w oknie pojawią się obrazy GrayG, GrayB i GrayR.
    3. Zamknij GrayR i GrayB, pozostawiając GrayG tylko w oknie.
    4. Wybierz obraz F, klikając obraz i wybierz Menu:Narzędzia/Narzędzia do konwersji/RGB/Grays. W oknie zostaną wyświetlone obrazy GrayG1, GrayB1 i GrayR1.
    5. Zamknij GrayR1 i GrayB1 i pozostaw tylko GrayG1 w oknie. Na tym etapie w oknie znajdują się tylko GrayG i GrayG1.
    6. Wybierz GrayG (podświetlenie), wybierz Menu:Algorytmy/Rejestracja/Zoptymalizowana automatyczna rejestracja obrazu; pojawi się okno dialogowe "Zoptymalizowana automatyczna rejestracja obrazu 3D".
      1. W opcjach wprowadzania zmień "Stopnie swobody" z domyślnego "Affine-12" na "Specyficzne przeskalowanie-9". W polu "Obroty" wprowadź od -105 do 105 w polu "Zakres próbkowania kąta obrotu" (domyślnie: od -30 do 30 stopni), 10 w polu "Przyrost kąta zgrubnego" (domyślnie: 15 stopni) i 3 w polu "Przyrost kąta precyzyjnego" (domyślnie: 6 stopni).
    7. Kliknij przycisk OK; pierwsza matryca "GrayG_To_GrayG1.mtx" zostanie wygenerowana i zapisana w folderze obrazu. Zamknij wszystkie okna obrazów i przejdź do następnego kroku; Ten krok zajmie co najmniej 15 minut.
    8. Załaduj stosy obrazów H i F, wybierając Menu:Plik/Otwórz obraz (A) z Dysku (lub Ctrl-f) /H.ids i F.ids, jak w kroku 3.1.1.
    9. Wybierz obraz H, klikając na niego i wybierz Menu:Narzędzia/Narzędzia do konwersji/RGB/Gray; pojawi się okno dialogowe "RGB->Gray". Kliknij przycisk OK; w oknie pojawią się obrazy "HGray". Zachowaj HGray i zamknij obraz H.
    10. Powtórz krok 3.1.9 dla obrazu F; obrazy "FGray" pojawią się w oknie. Zachowaj FGray i zamknij obraz F; w oknie pozostaną tylko HGray i FGray.
    11. Wybierz obraz HGray (podświetlenie) i przejdź do Menu:Algorytmy/Narzędzia transformacji/Przekształć. Pojawi się okno dialogowe "Przekształć/Ponownie próbkuj obraz". Kliknij zakładkę "Resample" i zmień rozmiar resample na rozmiar "HGray" na "FGray". Następnie kliknij kartę "Przekształć" i załaduj "GrayG_To_GrayG1.mtx", wybierając opcję "Odczytaj macierz z pliku". Kliknij OK; W oknie pojawi się obraz HGray_transform. Zamknij obraz HGray, aby w oknie pozostały tylko HGray_transform i FGray.
    12. Wybierz obraz "HGray_transform" (podświetlenie) i przejdź do Menu:Algorytmy/Rejestracja/Zoptymalizowana automatyczna rejestracja obrazu. Pojawi się okno dialogowe "Zoptymalizowana automatyczna rejestracja obrazu 3D". W polu "Obroty" wprowadź od -5 do 5 w polu "Zakres próbkowania kąta obrotu" (domyślnie: od -30 do 30 stopni), 3 w polu "Przyrost kąta zgrubnego" (domyślnie: 15 stopni) i 1 w polu "Przyrost kąta precyzyjnego" (domyślnie: 6 stopni). Kliknij przycisk OK.
      UWAGA: Matryca afiniczna (HGray_transform_To_FGray.mtx) zostanie wygenerowana i zapisana w folderze obrazów, a obraz "HGray_Transform_register" zostanie wyświetlony w oknie. Ten krok zajmie co najmniej 40 minut.
    13. Zamknij obraz "HGray_transform"; w oknie powinny pozostać tylko "HGray_Transform_register" i "FGray".
    14. Wybierz obraz "HGray_Transform_register" (podświetlenie) i przejdź do Menu:Algorytmy/ Rejestracja/Automatyczna rejestracja B-Spline 2D/3D. Pojawi się okno dialogowe "B-Spline Automatic Registration-3D intensity". Wybierz "Najmniejsza kwadratowość" w funkcji Koszt (domyślnie jest to Współczynnik korelacji).
      1. Kliknij "Wykonaj rejestrację dwuprzebiegową". W sekcji Pass 1 wprowadź 2 w polu "Gradient Descent Minimize Step Size (sample units)" (wartość domyślna to 1) i wprowadź 10 w polu "Maksymalna liczba iteracji:" (wartość domyślna to 10). W sekcji Pass 2 wprowadź 1 w polu "Gradient Descent Minimize Step Size (sample units)" (wartość domyślna to 0,5) i wprowadź 2 w polu "Maksymalna liczba iteracji:" (wartość domyślna to 10).
        UWAGA: Macierz NLT "HGray_transform_register.nlt" zostanie zapisana w folderze obrazów, a obraz "HGray_transform_register_registered" zostanie wyświetlony w oknie. Ten krok zajmie co najmniej 5 minut.
    15. Zamknij wszystkie obrazy w oknie.
  2. Generowanie obrazu referencyjnego dla kombinacji obrazów.
    UWAGA: Ten krok ma na celu wygenerowanie zarejestrowanego obrazu poziomego do połączenia.
    1. Załaduj stosy obrazów H i F, wybierając Menu:Plik/Otwórz obraz (A) z Dysku (lub Ctrl-f) /H.ids i F.ids; w oknie pojawią się dwa obrazy.
    2. Wybierz obraz H (podświetlenie) i przejdź do Menu:Algorytmy/Narzędzia transformacji/Przekształć; pojawi się okno dialogowe "Przekształć/Ponownie próbkuj obraz". Kliknij kartę "Ponowne próbkowanie" i zmień rozmiar ponownego próbkowania z "H" na "F". Następnie kliknij zakładkę "Przekształć" i załaduj "GrayG_To_GrayG1.mtx", wybierając "Odczytaj macierz z pliku". Kliknij przycisk OK; W oknie pojawi się obraz H_transform. Zamknij obraz H, ale pozostaw H_transform i F w oknie.
    3. Wybierz obraz "H_transform" (podświetlenie) i przejdź do Menu:Algorytmy/Narzędzia transformacji/Przekształć; pojawi się okno dialogowe "Przekształć/Zmień próbkowanie obrazu". Kliknij zakładkę "Ponowne próbkowanie" i zmień rozmiar ponownego próbkowania z "H_transform" na "F". Następnie kliknij kartę "Przekształć" i załaduj "HGray_transform_To_FGray.mtx", wybierając "Odczytaj macierz z pliku". Kliknij OK; W oknie pojawi się obraz "H_transform_transform". Zamknij obraz H_transform; w tym momencie na oknie pozostaną tylko H_transform_transform i F.
    4. Wybierz obraz "H_transform_transform" (podświetlenie) i przejdź do Menu:Algorytmy/Narzędzia transformacji/Transformacja nieliniowa; pojawi się okno dialogowe "Nieliniowa transformacja B-splajnu". Następnie załaduj "HGray_transform_register.nlt" i kliknij OK; W oknie pojawi się obraz "H_transform_transform_registered". Zapisz obraz jako plik ics. Zamknij wszystkie obrazy w oknie.
  3. Łączenie stosów obrazów
    UWAGA: Ten krok polega na połączeniu dwóch stosów obrazów uzyskanych w orientacji ortogonalnej (poziomej i czołowej) w jeden stos o wysokiej rozdzielczości.
    1. Przejdź do Menu:Wtyczki/Ogólne/Rejestracja siatkówki Drosophila; pojawi się okno dialogowe "Rejestracja siatkówki Drosophila v2.9". Prześlij "H.ics" z obrazu H, "H_transform_transform_registered" z kroku 3.2.4 w Image H-Registered, "F.ics" z Image F, "GrayG_To_GrayG1.mtx" z kroku 3.1.7 w Transformation 1-Green (opcjonalnie), "HGray_transform_To_FGray.mtx" z kroku 3.1.12 w Transformacji 2-Affine i "HGray_transform_register.nlt" z kroku 3.1.14 w Transformacji 3-Nonlinear (opcjonalnie).
      1. Wybierz SqRt(Intensity-H x Intensity-F) i Bez skalowania w "Rescale H to F". Zachowaj domyślne opcje dla pozostałych parametrów. Kliknij przycisk OK; Ten krok zajmie około 3 min.
        UWAGA: Po przetworzeniu zostaną wygenerowane 3 zestawy obrazów: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (końcowy ponownie połączony obraz), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (zielony kanał dla H, F i końcowego ponownie połączonego obrazu) i redChannelsImage-Rxreg-Ry-Rcomp.ids (czerwony kanał dla H, F i końcowego ponownie połączonego obrazu); Wszystkie pliki wyjściowe zostaną przeskalowane na 512 x 512 x 512
        2. .
    2. Otwórz plik "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" w oprogramowaniu do wizualizacji obrazów. Zapisz stos obrazów w formacie ims i zmień nazwę pliku; Ten ponownie połączony plik obrazu zostanie użyty do śledzenia i rejestracji neurytów.

4. Śledzenie neurytów i przypisywanie punktów odniesienia

UWAGA: Ten krok polega na śledzeniu neurytów (4.1) i przypisaniu punktów odniesienia do rejestracji (4.2) za pomocą oprogramowania do wizualizacji obrazów.

  1. Śledzenie neurytów
    1. Uruchom oprogramowanie do wizualizacji obrazu. Otwórz ponownie połączony plik obrazu. Przejdź do Menu:Edycja/Pokaż korektę wyświetlania i wyłącz kanał fotoreceptora (czerwony).
    2. Wizualizuj obraz w trybie "Surpass". Włącz "stereo" i użyj trybu "Quad Buffer" do wizualizacji obrazów 3D, jeśli komputer jest wyposażony w system stereografu.
    3. Przejdź do Menu:Surpass/Filaments, aby dodać nowe filamenty. Kliknij zakładkę "Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie".
    4. Kliknij kartę "Rysuj" i wybierz "Autogłębokość".
    5. Wybierz "Ustawienia", zaznacz "Linia" i wprowadź odpowiednią liczbę pikseli, aby uzyskać lepszą wizualizację (w tym protokole używana jest linia 4-pikselowa). Zaznacz "Pokaż dendryty", "Punkt początkowy" i "Punkty rozgałęzień". Ustaw "Jakość renderowania" na 100%.
    6. Wybierz zakładkę "Rysuj" i rozpocznij śledzenie neurytów. Zacznij od aksonu, a następnie przejdź do dendrytów (rysunek 2D). Aksony i dendryty neuronów transmedulla są łatwe do odróżnienia.
      UWAGA: Neuron Tm rozciąga swój akson od ciała komórki i rzutuje aż do wyższego centrum przetwarzania wzrokowego, zrazika. System automatycznie zdefiniuje pierwszy długi filament jako akson, a pozostałe krótkie włókna jako dendryty. Podczas śledzenia utrzymuj punkt początkowy na początku filamentu (aksonu) i upewnij się, że śledzone neuryty są połączone. Sprawdź punkty rozgałęzień i punkt początkowy. Jeśli dendryty nie są połączone, nowy punkt początkowy zostanie zdefiniowany na niepołączonym żarniku.
    7. Po obrysowaniu wróć do "Ustawień", odznacz "Punkt początkowy" i "Punkt rozgałęzienia", a następnie przejdź do Menu:Przekrocz/Eksportuj wybrane obiekty. /. Zapisz filament jako plik programu inventor (*.iv).
  2. Przypisywanie punktów odniesienia
    1. Wybierz "Pokaż regulację wyświetlania" i włącz oba kanały obrazowania. W tym przykładzie kanał 1 to barwienie fotoreceptora, a kanał 2 to neuron Tm20 (GFP).
    2. Przejdź do Menu:Przekrocz/Pomiar. Wybierz zakładkę "Edycja" i zaznacz "konkretny kanał:" (wybierz kanał fotoreceptora [czerwony]).
    3. Przypisz punkty odniesienia do górnej warstwy. Przejdź do Menu:/Przekrocz/Punkty pomiaru, aby utworzyć nowe punkty pomiarowe. Zaznacz początek warstwy M1 jako warstwę górną. Kolejność punktów jest następująca: równikowa, przednio-równikowa, przednia, przednio-brzuszna, brzuszna, tylno-brzuszna, tylna, tylno-równikowa i środkowa (ryc. 3F); Zdefiniuj środkowy fotoreceptor jako ten, który jest związany z największą liczbą procesów dendrytycznych.
    4. Przypisz warstwy R8 i R7 jak w kroku 4.2.3 (Rysunek 3G). W krokach 4.2.3 i 4.2.4 należy utworzyć trzy indywidualne punkty pomiarowe.
    5. Wyeksportuj współrzędne punktów dla każdej warstwy. Kliknij zakładkę "Statystyki", wybierz "Szczegółowe", "Określone wartości" i "Pozycja; " i kliknij "Eksportuj statystyki po wyświetleniu karty do pliku". Zapisz jako "Wartości oddzielone przecinkami" (*.csv).
    6. Otwórz trzy pliki csv (z kroków 4.2.3 - 4.2.4) i połącz współrzędne 27 punktów odniesienia w nowy plik csv, kopiując i wklejając (kolejność to Góra, R8 i R7). Zapoznaj się z tabelą materiałów/wyposażenia i postępuj zgodnie z formatem przykładowego pliku.

5. Rejestracja nieliniowa ciała sztywnego i TPS

UWAGA: Ten krok polega na zarejestrowaniu śladów neurytów (w formacie iv) w tablicy kolumn referencyjnych i wygenerowaniu zarejestrowanego pliku swc za pomocą programu MIPAV. Ta sekcja wymaga następujących plików: ponownie połączonego stosu obrazów (.ids) z kroku 3.3, pliku punktu odniesienia (.csv) z kroku 4.2 oraz pliku filamentu śladowego neurytu (.iv) z kroku 4.1.

  1. Przejdź do Menu:Plugins/Generic/DrosophilaStandardColumnRegistration. Pojawi się okno "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1".
  2. Załaduj pliki obrazów (.ids), plik punktów odniesienia (.csv) i plik filamentu (.iv).
  3. Wybierz 9 punktów na warstwę.
  4. Wybierz pozycję obrazowanego neuronu (LV/RD lub RV/LD).
  5. Wybierz "Rejestracja sztywna i TPS" oraz "Rejestracja sztywna", aby odpowiednio zarejestrować ciało nieliniowe i sztywne.
  6. Zaznacz opcję "Utwórz plik SWC", aby wygenerować następujące pliki wyjściowe: zarejestrowany plik śledzenia neurytu w formacie swc (definicja znajduje się w sekcji Specyficzne materiały/sprzęt), zarejestrowany plik IV (.iv), współrzędne znormalizowanego neurytu (.txt), przekształcone współrzędne (.txt) i połączony obraz (.ids).
  7. Zmień nazwę pliku swc. Zastosuj skrót lokalizacji na końcu nazwy pliku (krok 1.7). Na przykład użyj "Tm20_3_RV.swc" dla neuronu Tm20 #3 znajdującego się w brzusznej połowie prawego rdzenia.

6. Standaryzacja do konfiguracji prawobrzusznej

UWAGA: Ten krok polega na konwersji śladów neurytów (w formacie swc) na standardową konfigurację RV (prawo-brzuszną) za pomocą niestandardowego skryptu "RV_standardization.m." Tutaj skrypt został napisany w języku laboratorium matrycowego. Nazwy wejściowych plików swc powinny mieć następujący format: "NeuronName_Number_Configuration.swc" (np. Tm20_3_LV.swc).

  1. Otwórz skrypt "RV_standardization.m".
  2. Edytuj te parametry w sekcji "Dane wejściowe użytkownika":
    1. Wpisz nazwy neuronów bez numeracji (np. Tm2, Tm20 itd.) w polu "neuron_names."
      UWAGA: Wartość domyślna w "file_end_in" to "_*.swc", która wyszukuje pliki o nazwach zawierających "_*.swc" ("*" to symbol wieloznaczny pasujący do dowolnej liczby znaków). Wartość domyślna "swc_file_end_out" to "_f.swc", co spowoduje dodanie "_f" na końcu nazwy pliku po standaryzacji.
    2. Określ katalog, w którym znajdują się pliki swc w "directory_in". Określ katalog, do którego trafią standardowe pliki w "directory_swcout".
  3. Uruchom skrypt.
  4. Opcjonalnie: Użyj Vaa3D14, aby zwizualizować pliki swc i sprawdzić poprawność konwersji.

7. Obliczanie częstości rozgałęzień i zakończeń dendrytycznych

UWAGA: Ten krok wykorzystuje pliki swc o sztywnym korpusie do obliczenia estymatorów Kaplana-Meiera dla prawdopodobieństwa, że segment dendrytyczny osiągnie określoną długość bez zakończenia. Ten skrypt używa dwóch funkcji Dendritic_Tree_Toolbox: extractDendriticSegmentLengthDistribution i estimateDendriticSegmentLengthProbability.

  1. Otwórz skrypt "Branch_term_P.m".
  2. Edytuj te parametry w sekcji "Dane wejściowe użytkownika":
    1. Określ ścieżkę do plików swc zarejestrowanych w bryle sztywnej w polu "pathToSWCFiles" (np. /Rigid_Registered_swc/). Określ ścieżkę, która będzie przechowywać dane wyjściowe grafiki w "pathToOutput". Określ nazwę neuronów lub typów neuronowych w "neuron_names" (np. Tm2, Tm20 itp.).
  3. Uruchom skrypt; dane wyjściowe to krzywa oszacowania Kaplana-Meiera dla dendrytycznego rozgałęziania i zakończenia.
    UWAGA: Opcjonalnie: Zastosuj metodę dopasowania funkcji, aby wyodrębnić z estymatorów Kaplana-Meiera lokalne prawdopodobieństwo, że segment dendrytyczny rozgałęzi się lub zakończy.

8. Wykreśl rozkład specyficznych dla warstwy zakończeń dendrytycznych altan

UWAGA: Ten krok przedstawia rozkład końcówek dendrytycznych w różnych warstwach rdzenia w postaci wykresu słupkowego. Można to zastosować do jednego neuronu, grupy neuronów lub grup neuronów. Skrypt używa funkcji extractDistributionAlongAxis z Dendritic_Tree_Toolbox.

  1. Otwórz skrypt "Layer_term.m".
  2. Edytuj te parametry w sekcji "Dane wejściowe użytkownika":
    1. Określ katalog, który zawiera nieliniowe zarejestrowane pliki swc w "pathToSWCFiles" (np. /Non_linear_Registered_swc/). Określ katalog dla danych wyjściowych grafiki w "pathToOutput". Określ nazwę neuronów lub typów neuronowych w "neuron_names" (np. Tm2, Tm20 itp.).
  3. Uruchom skrypt samouczka. Wynikiem jest histogram proporcji węzłów końcowych w określonych warstwach rdzenia.

9. Wykreśl kierunek rzutowania płaskiego dendrytów

UWAGA: Ten krok przedstawia płaskie kierunki rzutowania dendrytów jako wykres biegunowy. Skrypt używa funkcji extractAngularDistribution z Dendritic_Tree_Toolbox.

  1. Otwórz skrypt "Planar_proj.m."
  2. Edytuj następujące parametry w sekcji "Dane wejściowe użytkownika".
    1. Określ katalog, który zawiera nieliniowe zarejestrowane pliki swc w "pathToSWCFiles" (np. /Non_linear_Registered_swc/). Określ katalog dla danych wyjściowych grafiki w "pathToOutput". Określ nazwę neuronów lub typów neuronów w "neuron_names" (np. Tm2, Tm20 itp.).
  3. Uruchom skrypt; dane wyjściowe to wykres biegunowy kierunków rzutowania płaskiego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z przedstawionej tutaj procedury obrazowania w podwójnym widoku, mózg muchy zawierający słabo oznaczone neurony Tm20 został zobrazowany w dwóch ortogonalnych kierunkach. Przed obrazowaniem mózg został zabarwiony odpowiednimi pierwszorzędowymi i drugorzędowymi przeciwciałami w celu wizualizacji GFP i aksonów fotoreceptorów związanych z błoną. W celu obrazowania mózg został najpierw zamontowany w orientacji poziomej (ryc. 2A, B). Neuron Tm20 znakowany GFP i otac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy, jak obrazować i analizować dendrytyczne altany neuronów rdzenia Drosophila . Pierwsza sekcja, obrazowanie w dwóch widokach, opisuje dekonwolucję i łączenie dwóch stosów obrazów w stos obrazów o wysokiej rozdzielczości. Druga sekcja, śledzenie i rejestracja dendrytów, opisuje śledzenie i rejestrację dendrytów neuronów rdzenia do układu kolumn referencyjnych. Trzecia sekcja, analiza dendrytyczna, opisuje użycie niestandardowych skryptów do analizowania wzorców dendrytycznych. Razem protokoły te z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Intramural Research Program of the National Institutes of Health, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (grant HD008913 dla C.-H.L.) oraz Center for Information Technology (P.G.M., N.P., E.S.M. i M.M.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software
Huygens ProfessionalScientific Volume Imagingwersja 16.05do dekonwolucji obrazu (https://svi.nl).  komercyjne oprogramowanie
MIPAVw wersji 7.3.0do rekombinacji i rejestracji obrazu (http://mipav.cit.nih.gov/); darmowa
wtyczka MIPAV: PlugInDrosophila
RetinalRegistration.class		darmowa
wtyczka MIPAV: PlugInDrosophilaStandard
ColumnRegistration.class		freeware
ImarisBitplanedo śledzenia neurytów i przypisywania punktów odniesienia do rejestracji obrazu (http://www.bitplane.com); komercyjne oprogramowanie
Vaa3Ddo wizualizacji plików swc ( https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
MatlabMathworksR2014bdo analizy morfometrycznej dendrytów (http://www.mathworks.com); oprogramowanie komercyjne
Zestaw narzędzi Matlab: TREES1.14v1.14do analizy dendrytycznych parametrów morfometrycznych (http://www.treestoolbox.org/download.html); darmowy
zestaw narzędzi Matlab: Dendritic_Tree_Toolboxv1.0Do obliczania parametrów morfometrycznych (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Nazwa<strong>FirmaNumer katalogowyKomentarze
Sample files
plikuhttp://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
Kody i przykładowe pliki do łączenia i rejestracjihttps://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Przykład punktu odniesienia https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=
1471880596000&api=v2
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
System komputerowy
MS Windows Windows 7 x64 lub Macintosh OS X 10.7 lub nowszy3GHz 64-bitowy czterordzeniowy procesor, 16G RAM (minimum)
Opcjonalnie: Quadro4000  (lub wyższa) karta graficznaNvidiado stereograficznej wizualizacji dendrytów.
Opcjonalnie: NVIDIA 3D vision2Nvidiahttp://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Opcjonalnie: wyświetlacz LCD 120 Hz dla NVIDIA 3D vision2http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
NazwaCompanyNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki do obrazowania
24B10przeciwciało Badania rozwojowe Hybridoma Bank24B10
GFP Tag PrzeciwciałoThermofisher ScientificG10362
Koza anty-królik (H+L), Alexa Fluor 488Thermofisher ScientificA11034
Kozia anty-mysz (H+L), Alexa Fluor 568Thermofisher ScientificA21124
VECTASHIELD Średni montaż przeciwblakowyVector LaboratoriesH-1000
Montaż  Glina FisherS04179
70% glicerolu w 1x PBS
Okulary nakrywkowe, wysoka wydajność, D = 0,17  mmZeiss474030-9000-000
definicja SWC obrazów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
  2. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
  3. Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743(2010).
  4. Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. Making a visual map: mechanisms and molecules. Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).
  5. Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. Wiring dendrites in layers and columns. J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).
  6. Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. 1363-1491 (1993).
  7. Takemura, S. Y., et al. A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics. Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).
  8. Takemura, S. Y., et al. Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).
  9. Gao, S., et al. The neural substrate of spectral preference in Drosophila. Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).
  10. Karuppudurai, T., et al. A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila. Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).
  11. Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system. Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).
  12. Ting, C. Y., et al. Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila. Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).
  13. Ting, C. Y., et al. Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion. Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).
  14. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
  15. Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla. J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).
  16. Takemura, S. Y., et al. Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway. Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).
  17. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
  18. Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).
  19. Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. Automated analysis of NeuronJ tracing data. Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).
  20. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  21. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  22. Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).
  23. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. JASA. 53, 457-481 (1958).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza morfologii dendryt wstosy obraz w konfokalnychobrazowanie dwuwidokowerejestracja ledzenia dendryt wzako czenia specyficzne dla warstwykierunek projekcji planarnejcz stotliwo ci rozga zie dendrytycznychplatforma MIPAVskrzynki narz dziowe MATLABneurony meduli Drosophila

Powiązane artykuły