Ten artykuł przedstawia protokół zoptymalizowany pod kątem produkcji chipów mikroprzepływowych oraz konfiguracji eksperymentów mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych pojedynczych komórek drożdży.
Artykuł metodologiczny
Ten artykuł przedstawia protokół zoptymalizowany pod kątem produkcji chipów mikroprzepływowych oraz konfiguracji eksperymentów mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych pojedynczych komórek drożdży.
Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae to ważny organizm modelowy w badaniach nad starzeniem się. Badania genetyczne ujawniły wiele genów o zachowanym wpływie na długość życia różnych gatunków. Jednak molekularne przyczyny starzenia się i śmierci pozostają nieuchwytne. Aby uzyskać systematyczne zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw starzenia się drożdży, potrzebujemy wysokoprzepustowych metod pomiaru długości życia i ilościowego określania różnych fenotypów komórkowych i molekularnych w pojedynczych komórkach. Wcześniej opracowaliśmy urządzenia mikroprzepływowe do śledzenia pączkujących komórek macierzystych drożdży przez cały okres ich życia, jednocześnie wypłukując nowo narodzone komórki potomne. W artykule przedstawiono metodę przygotowania chipów mikroprzepływowych oraz przeprowadzania eksperymentów mikroprzepływowych. Wiele kanałów może być używanych do jednoczesnego śledzenia komórek w różnych warunkach lub z różnych szczepów drożdży. Typowa konfiguracja może śledzić setki komórek na kanał i pozwala na obrazowanie mikroskopowe w wysokiej rozdzielczości przez cały okres życia komórek. Nasza metoda pozwala również na szczegółową charakterystykę długości życia, markerów molekularnych, morfologii komórek i dynamiki cyklu komórkowego pojedynczych komórek. Ponadto nasze urządzenie mikroprzepływowe jest w stanie wychwycić znaczną ilość świeżych komórek macierzystych, które można zidentyfikować za pomocą dalszej analizy obrazu, co umożliwia pomiar długości życia z większą dokładnością.
Pączkujące drożdże to potężny organizm modelowy w badaniach nad starzeniem. Jednak konwencjonalny test żywotności drożdży opiera się na mikrodysekcji, która jest nie tylko pracochłonna, ale także ma niską przepustowość1,2. Ponadto tradycyjne podejście oparte na mikrodysekcji nie zapewnia szczegółowego obrazu różnych cech komórkowych i molekularnych w pojedynczych komórkach macierzystych w miarę ich starzenia się. Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych umożliwiło zautomatyzowaną procedurę pomiaru długości życia drożdży, a także śledzenie markerów molekularnych i różnych fenotypów komórkowych przez cały okres ż....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Produkcja form wafli krzemowych
UWAGA: Fotomaska została zaprojektowana w oprogramowaniu AutoCAD i wyprodukowana przez firmę komercyjną. Ten projekt zawiera trzy warstwy różnych wzorów (Plik uzupełniający 1). Wysokości pierwszej, drugiej i trzeciej warstwy wynoszą odpowiednio około 4 μm, 10 μm i 50 μm. Forma wafla krzemowego została utworzona z fotomaski przy użyciu miękkiej litografii9,10.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Po zakończeniu eksperymentów, z zarejestrowanych obrazów time-lapse można wyodrębnić czas życia komórek oraz wiele fenotypów komórkowych i molekularnych. Ponieważ z każdej komórki można wyodrębnić szereg różnych cech, pierwszym krokiem analizy jest adnotacja komórek i zdarzeń, w tym wyznaczenie pozycji i granic komórek oraz czasu wystąpienia śledzonych zdarzeń, takich jak procesy pączkowania. Adnotacje te ułatwią powrót do tego samego zestawu komórek i analizę różnych cech w przyszłości. .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Urządzenie PDMS musi być świeżo wykonane. W przeciwnym razie pęcherzyki powietrza spowodowane włożeniem rurek do urządzenia będą trudne do usunięcia. Krok 3.4 jest ważny, aby poprawić wydajność ładowania ogniw poprzez koncentrację ogniw. Aby zwiększyć przepustowość eksperymentu, 4 do 6 modułów na tym samym chipie PDMS podłączonych do niezależnie działających pomp jest zwykle używanych do jednoczesnego wykonywania od 4 do 6 różnych eksperymentów (różnych szczepów lub kompozycji pożyw).
W porówn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
To badanie było wspierane przez NIH Grant AG043080 oraz National Natural Science Foundation of China (NSFC), nr 11434001. Dziękujemy Lucasowi Waldburgerowi za korektę manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3'' < 111> wafel krzemowy | Addison Engineering | ||
| SU-8 Seria 2000 i 3000 | MicroChem | ||
| Sylgard® 184 Zestaw elastomerów silikonowych | ellsworth | 2065622 | Zawiera bazę z elastomeru silikonowego Sylgard i reg; utwardzacz |
| Petriego | VWR | 391-1502 | |
| Harris Uni-core&trade stempel (ID 0,75 mm) | Sigma-Aldrich | ||
| 24 mm x 40 mm SLIP-RITE® szkło osłonowe | Thermo Fisher Scientific | 102440 | |
| Taśma klejąca 3M | ULINE | S-10223 | |
| VWR® Żyletki | VWR | 55411-050 | |
| Czysty etanol, Koptec | VWR | 64-17-5 | |
| Whoosh-Duster™ | VWR | 16650-027 | |
| Strzykawka BD 5 ml (Luer-Lock&handel; Wskazówka) | Becton, Dickinson and Company | 309646 | |
| Standardowe rurki ścienne PTFE (100 stóp, rozmiar AWG: 22, identyfikator nominalny: 0,028) | Firma dostarczająca komponenty | SWTT-22 | |
| Asortyment igieł | Firma dostarczająca komponenty | NEKIT-1 | |
| Eksykator | HACH | 2238300 | |
| Piekarnik laboratoryjny | Fisher Scientific | 13246516GAQ | |
| Mikroskop Nikon TE2000 z obiektywem 40X i 60X | Nikon | ||
| Zeiss Axio Observer Z1 z obiektywem 40X i 60X | Pompka | ||
| Longerpump | TS-1B |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie