Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży

DOI:

10.3791/55412

⸱

30 marca 2017

 ,  ,  ,  , 
1The State Key Laboratory for Artificial Microstructures and Mesoscopic Physics, School of Physics, Peking University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences at Center for Quantitative Biology, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia protokół zoptymalizowany pod kątem produkcji chipów mikroprzepływowych oraz konfiguracji eksperymentów mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych pojedynczych komórek drożdży.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae to ważny organizm modelowy w badaniach nad starzeniem się. Badania genetyczne ujawniły wiele genów o zachowanym wpływie na długość życia różnych gatunków. Jednak molekularne przyczyny starzenia się i śmierci pozostają nieuchwytne. Aby uzyskać systematyczne zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw starzenia się drożdży, potrzebujemy wysokoprzepustowych metod pomiaru długości życia i ilościowego określania różnych fenotypów komórkowych i molekularnych w pojedynczych komórkach. Wcześniej opracowaliśmy urządzenia mikroprzepływowe do śledzenia pączkujących komórek macierzystych drożdży przez cały okres ich życia, jednocześnie wypłukując nowo narodzone komórki potomne. W artykule przedstawiono metodę przygotowania chipów mikroprzepływowych oraz przeprowadzania eksperymentów mikroprzepływowych. Wiele kanałów może być używanych do jednoczesnego śledzenia komórek w różnych warunkach lub z różnych szczepów drożdży. Typowa konfiguracja może śledzić setki komórek na kanał i pozwala na obrazowanie mikroskopowe w wysokiej rozdzielczości przez cały okres życia komórek. Nasza metoda pozwala również na szczegółową charakterystykę długości życia, markerów molekularnych, morfologii komórek i dynamiki cyklu komórkowego pojedynczych komórek. Ponadto nasze urządzenie mikroprzepływowe jest w stanie wychwycić znaczną ilość świeżych komórek macierzystych, które można zidentyfikować za pomocą dalszej analizy obrazu, co umożliwia pomiar długości życia z większą dokładnością.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pączkujące drożdże to potężny organizm modelowy w badaniach nad starzeniem. Jednak konwencjonalny test żywotności drożdży opiera się na mikrodysekcji, która jest nie tylko pracochłonna, ale także ma niską przepustowość1,2. Ponadto tradycyjne podejście oparte na mikrodysekcji nie zapewnia szczegółowego obrazu różnych cech komórkowych i molekularnych w pojedynczych komórkach macierzystych w miarę ich starzenia się. Opracowanie urządzeń mikroprzepływowych umożliwiło zautomatyzowaną procedurę pomiaru długości życia drożdży, a także śledzenie markerów molekularnych i różnych fenotypów komórkowych przez cały okres życia komórek macierzystych3,4,5,6,7,8. Po załadowaniu komórek drożdży do urządzenia mikroprzepływowego, można je śledzić pod mikroskopem za pomocą automatycznego obrazowania poklatkowego. Za pomocą narzędzi do przetwarzania obrazowania można wyodrębnić różne fenotypy komórkowe i molekularne3,6,8, w tym długość życia, rozmiar, reporter fluorescencyjny, morfologia komórki, dynamika cyklu komórkowego itp., z których wiele jest trudnych lub niemożliwych do uzyskania przy użyciu tradycyjnej metody mikrodysekcji. Urządzenia mikroprzepływowe zyskały na znaczeniu w badaniach nad starzeniem drożdży od czasu ich pomyślnego opracowania kilka lat temu3,4,6,7. Kilka grup opublikowało następnie różne warianty wcześniejszych projektów5, a wiele laboratoriów drożdży wykorzystało do swoich badań urządzenia mikroprzepływowe.

W hodowli komórkowej podlegającej wykładniczemu wzrostowi, liczba starych komórek macierzystych, które są dostępne do obserwacji, jest znikoma. Dlatego ogólną zasadą konstrukcyjną urządzenia mikroprzepływowego do pomiarów długości życia jest zachowanie komórek macierzystych i usunięcie komórek potomnych. Jedna z takich konstrukcji wykorzystuje fakt, że drożdże ulegają asymetrycznemu podziałowi komórek. Struktury w urządzeniu będą zatrzymywać większe komórki macierzyste i umożliwiać wypłukiwanie mniejszych komórek potomnych. Chip mikroprzepływowy opisany w tym artykule wykorzystuje miękką podkładkę z polidimetylosiloksanu (PDMS) (pionowe kolumny penisa) do uwięzienia komórek macierzystych (ryc. 1). Urządzenia o podobnej konstrukcji zostały wcześniej zgłoszone3,4,6,7. Protokół ten wykorzystuje prostszą procedurę wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych i prostą metodę ładowania komórek, która jest zoptymalizowana pod kątem eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym. Jednym z kluczowych parametrów w urządzeniu mikroprzepływowym jest szerokość elektrod PDMS używanych do wychwytywania komórek macierzystych. Nasze urządzenie wykorzystuje szersze elektrodki, które mogą utrzymać więcej komórek macierzystych pod każdą elektrodą, w tym znaczną część świeżych komórek macierzystych, które można śledzić przez cały okres ich życia. Oprócz pomiarów długości życia, protokół ten jest przydatny w eksperymentach z obrazowaniem poklatkowym pojedynczych komórek, gdy komórki muszą być śledzone przez wiele pokoleń lub gdy konieczna jest obserwacja przez cały okres życia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja form wafli krzemowych

UWAGA: Fotomaska została zaprojektowana w oprogramowaniu AutoCAD i wyprodukowana przez firmę komercyjną. Ten projekt zawiera trzy warstwy różnych wzorów (Plik uzupełniający 1). Wysokości pierwszej, drugiej i trzeciej warstwy wynoszą odpowiednio około 4 μm, 10 μm i 50 μm. Forma wafla krzemowego została utworzona z fotomaski przy użyciu miękkiej litografii9,10.

  1. Piecz wafel silikonowy w temperaturze 200 °C przez 10 minut, aby odparować parę wodną. Spin coat ujemny fotorezystor SU-8 na płytce krzemowej.
    UWAGA: Wiruj SU-8 3005 przy 5,000 obr./min przez 30 s, aby wytworzyć pierwszą warstwę, SU-8 2010 przy 3,000 obr./min przez 30 s, aby wygenerować drugą warstwę i SU-8 3025 przy 2,000 obr./min przez 30 s, aby wygenerować trzecią warstwę.
  2. Miękki wyprasz powlekaną płytkę przed przeniesieniem wzoru. Wyrównaj i naświetl płytkę w trybie "bezpośredniego kontaktu" za pomocą wyrównywacza maski.
    UWAGA: Wafel piec na miękko przez 2 minuty w temperaturze 95 °C dla pierwszej warstwy, 3 minuty w temperaturze 95 °C dla drugiej warstwy i 15 minut w temperaturze 95 °C dla trzeciej warstwy. Dawkę ekspozycyjną należy stosować przy 100 mJ/cm2 dla pierwszej warstwy, 130 mJ/cm2 dla drugiej warstwy i 200 mJ/cm2 dla trzeciej warstwy.
  3. Po naświetleniu upiecz wafel i wywołaj go za pomocą wywoływacza SU-8. Osuszyć wafel za pomocą pistoletu N2 i wypiekać go na twardo w temperaturze 200 °C przez 30 minut
    UWAGA: Silikonowa forma waflowa jest przymocowana do plastikowej szalki Petriego o średnicy 15 cm za pomocą taśmy klejącej, stroną ze wzorem skierowaną do góry. Zazwyczaj umieszczamy kilka identycznych struktur chipów na tej samej formie, co pozwala na wytwarzanie wielu chipów mikroprzepływowych w tym samym czasie. Każda forma może być wielokrotnie wykorzystywana do wytwarzania chipów mikroprzepływowych.

2. Produkcja mikroprzepływowych układów scalonych

  1. Umieść czystą łódkę wagową na wadze i wytaruj wagę. Wlej 50 g bazy PDMS do łódki wagowej.
  2. Dodać 5 g utwardzacza PDMS do łodzi wagowej (stosunek w/w 1:10 do podstawy PDMS).
    UWAGA: Ta objętość jest oparta na szalce Petriego o średnicy 15 cm z formą. Dostosuj ilość odczynnika, jeśli używasz szalki Petriego o innym rozmiarze.
  3. Wymieszaj bazę PDMS i utwardzacz za pomocą jednorazowej pipety. Zacznij od krawędzi łodzi ważącej i powoli przesuwaj się do środka. Mieszaj dokładnie przez kilka minut, aż w całej mieszance utworzą się małe bąbelki; dokładne wymieszanie jest niezbędne do polimeryzacji PDMS.
  4. Powoli wlewać mieszaninę na szalkę Petriego; mieszanina musi całkowicie pokryć formę wafla krzemowego.
  5. Umieść szalkę Petriego w próżni na 10 minut, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza z mieszaniny PDMS. Jeśli na powierzchni mieszaniny pozostaną bąbelki, użyj pipety, aby je wydmuchać.
  6. Formę waflową krzemową inkubować za pomocą PDMS w piecu w temperaturze 75 °C przez około 2 godziny.
  7. Delikatnie oderwij warstwę spolimeryzowanego PDMS od formy wafla krzemowego, unikając uszkodzenia konstrukcji formy waflowej. Alternatywnie, wytnij PDMS bezpośrednio z formy wafla krzemowego z minimalnym marginesem 5 mm wokół wzoru za pomocą jednoostrzowej przemysłowej żyletki; delikatnie oderwij warstwę PDMS od formy waflowej.
  8. Umieść warstwę PDMS na stole stroną ze wzorem skierowaną do góry. Ostrożnie wytnij pojedynczy wiór za pomocą przemysłowej żyletki z pojedynczą krawędzią, zachowując odpowiedni margines od krawędzi każdego pojedynczego wióra, aby uniknąć uszkodzenia konstrukcji.
  9. Stroną ze wzorem skierowaną do góry, użyj pisaka (średnica wewnętrzna 0,75 mm), aby wybić otwory prosto w dół przez okręgi wlotowe i wylotowe po obu stronach kanałów.
    UWAGA: Otwory te tworzą ścieżkę przepływu medium. Dlatego ważne jest, aby przejść przez koła i przebić się przez całą warstwę PDMS. Upewnij się, że kolumny PDMS zostały wyjęte z otworu.
  10. Sprawdź każdy wybity otwór, ponownie wkładając igłę do dziurkacza do otworu. Upewnij się, że igła może wyjść z drugiej strony, wskazując, że nie ma blokady. Przyłóż taśmę do powierzchni wzoru, a następnie delikatnie odklej taśmę, aby usunąć cząsteczki kurzu. Powtórz ten krok co najmniej trzy razy. Pozostaw czysty kawałek taśmy klejącej na PDMS, aby utrzymać sterylizację.
  11. Powtórz tę procedurę po przeciwnej stronie PDMS i pozostaw również ostatni kawałek taśmy.
  12. Przygotuj szklankę nakrywkową o wymiarach 24 mm x 30 mm i grubości 0,13-0,17 mm. Spryskaj szkło 70% etanolem i osusz odpylaczem, aby wysterylizować powierzchnię; Dodatkowo szkło można umyć wodą z autoklawem i wysuszyć odpylaczem.
  13. Przenieś szkło nakrywkowe i PDMS na plastikową płytkę. Usuń taśmę klejącą z PDMS i umieść wzór stroną skierowaną do góry. Unikaj kontaktu z powierzchnią wzoru podczas przenoszenia.
  14. Umieść plastikową płytkę w maszynie plazmowej. Zastosować plazmę tlenową do PDMS i szkła nakrywkowego, aby nadać powierzchniom hydrofilowość o następujących parametrach pracy: ekspozycja, 75 s; stabilizacja gazu, 20 cc/min; ciśnienie, 200; i moc, 100 W.
  15. Ostrożnie umieść PDMS na szkle nakrywkowym, łącząc obie powierzchnie hydrofilowe (powierzchnie, które były skierowane do góry podczas obróbki plazmowej). Upewnij się, że między PDMS a szkłem nakrywkowym nie ma pęcherzyków powietrza.
  16. Inkubować chip PDMS w piecu w temperaturze 75 °C przez co najmniej 2 godziny
    UWAGA: Wadliwe mikroprzepływy mogą powodować wyciek cieczy na mikroskop podczas eksperymentu. Dlatego ważne jest, aby sprawdzić połączenie między PDMS a szkłem nakrywkowym, lekko podnosząc PDMS z krawędzi za pomocą pęsety. Delikatne uniesienie PDMS nie powinno oddzielać go od szkła nakrywkowego, co wskazuje na udane połączenie.

3. Przygotowanie do eksperymentu

  1. Przygotowanie probówki.
    1. Zanurz rurki wejściowe i wyjściowe w 70% roztworze etanolu oddzielnie 1 dzień przed przygotowaniem chipa PDMS.
    2. Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml wodą w autoklawie, aby umyć probówki. Umyć każdą probówkę, podłączając rurkę do strzykawki i przepłukując ją wodą.
    3. Powtórz etap mycia co najmniej 3 razy, aby usunąć pozostałości etanolu.
  2. Zbadaj kanały PDMS pod mikroskopem optycznym z obiektywem 10X, aby upewnić się, że struktura jest spójna i nienaruszona. Ustabilizuj chip PDMS na platformie mikroskopu za pomocą taśmy klejącej.
    UWAGA: W kroku 2 wykonaj wiele chipów jednocześnie, aby upewnić się, że istnieją chipy zapasowe, zwłaszcza jeśli tworzysz urządzenie po raz pierwszy.
  3. Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml wodą z autoklawy. Przymocować strzykawkę do pompy strzykawkowej i włożyć odpowiednie rurki wejściowe i wyjściowe. Ustaw prędkość prania na 750 μl/h, aby płukać wióry przez około 10 minut. W tym okresie pęcherzyki powietrza na kanałach odgałęzień należy zmyć; Jeśli pozostały bąbelki, ręcznie dostosuj prędkość, aby je wyeliminować.
  4. Przygotowanie próbki drożdży.
    1. Przenieść 1 ml przygotowanej próbki drożdży (OD600 0,6-0,8) do dwóch probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i wirować przez 5 minut przy 3,000 x g.
    2. Usunąć większość supernatantu z każdej probówki i połączyć pozostałą część, tworząc próbkę o pojemności 0,5 ml.
  5. Wstrzymaj pompę strzykawkową i wyjmij rurki wejściowe z chipa PDMS.
  6. Ręcznie odwróć pompę strzykawkową, aby zassać mały pęcherzyk powietrza (o długości od 1 do 2 cm) do każdej rurki wejściowej. Przejdź do zasysania próbki drożdży; Pęcherzyk powietrza pokaże granicę próbki i wskaże, ile próbki zostało pobrane.
    UWAGA: Należy unikać zasysania próbki do strzykawki.
  7. Włóż rurkę wejściową z powrotem do układu PDMS i uruchom ponownie pompę, aby załadować ogniwa z prędkością 750 μL/h.
  8. Pozostaw pompę strzykawkową włączoną na 10 minut, a następnie zbadaj postęp ładowania komórek pod mikroskopem; udane ładowanie uwięzi komórki pod ponad 60% filarem zawieszenia.
  9. Przełącz się na roztwór odżywczy i dostosuj prędkość do 400 μl/h do hodowli komórek.
  10. Wybierz pozycje obserwacyjne dla mikroskopu.
    UWAGA: W przypadku pomiarów żywotności obrazy były wykonywane raz na 15 minut za pomocą mikroskopu optycznego z obiektywem 40x. W przypadku fluorescencyjnej analizy reporterowej obrazy były wykonywane raz na 15 minut za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem olejowym 60X.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po eksperymentach, z zarejestrowanych obrazów poklatkowych można wyodrębnić długość życia komórek oraz wiele komórkowych i molekularnych fenotypów. Ponieważ istnieje wiele różnych cech, które można wyodrębnić z każdej komórki, pierwszym krokiem analizy jest dodanie adnotacji do komórek i zdarzeń, w tym pozycji i granic komórek oraz czasu różnych wydarzeń, które są śledzone, takich jak zdarzenia pączkowania. Te adnotacje ułatwią powrót do tego samego zestawu komórek i analizowanie różnych ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urządzenie PDMS musi być świeżo wykonane. W przeciwnym razie pęcherzyki powietrza spowodowane włożeniem rurek do urządzenia będą trudne do usunięcia. Krok 3.4 jest ważny, aby poprawić wydajność ładowania ogniw poprzez koncentrację ogniw. Aby zwiększyć przepustowość eksperymentu, 4 do 6 modułów na tym samym chipie PDMS podłączonych do niezależnie działających pomp jest zwykle używanych do jednoczesnego wykonywania od 4 do 6 różnych eksperymentów (różnych szczepów lub kompozycji pożyw).

W porówn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez NIH Grant AG043080 oraz National Natural Science Foundation of China (NSFC), nr 11434001. Dziękujemy Lucasowi Waldburgerowi za korektę manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3'' < 111> wafel krzemowyAddison Engineering
SU-8 Seria 2000 i 3000MicroChem
Sylgard® 184 Zestaw elastomerów silikonowychellsworth2065622Zawiera bazę z elastomeru silikonowego Sylgard i reg; utwardzacz
PetriegoVWR391-1502
Harris Uni-core&trade stempel (ID 0,75 mm)Sigma-Aldrich
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® szkło osłonoweThermo Fisher Scientific102440
Taśma klejąca 3MULINES-10223
VWR® ŻyletkiVWR55411-050
Czysty etanol, KoptecVWR64-17-5
Whoosh-Duster™VWR16650-027
Strzykawka BD 5 ml (Luer-Lock&handel; Wskazówka)Becton, Dickinson and Company309646
Standardowe rurki ścienne PTFE (100 stóp, rozmiar AWG: 22, identyfikator nominalny: 0,028)Firma dostarczająca komponentySWTT-22
Asortyment igiełFirma dostarczająca komponentyNEKIT-1
EksykatorHACH2238300
Piekarnik laboratoryjnyFisher Scientific13246516GAQ
Mikroskop Nikon TE2000 z obiektywem 40X i 60XNikon
Zeiss Axio Observer Z1 z obiektywem 40X i 60XPompka
LongerpumpTS-1B
29002513 strzykawkowa Zeiss

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
  2. Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
  3. Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
  4. Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275(2012).
  5. Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
  6. Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  7. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143(2013).
  8. Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
  9. Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
  10. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
  11. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  12. Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
  13. Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
  14. Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Microfluidic DeviceYeast LifespanBudding YeastCell LoadingMicroscope ImagingPDMS ChipFlow RateYeast SampleImage AnalysisCellular Phenotypes

Powiązane artykuły