Wykorzystanie bioczujników opartych na enzymach do pomiaru toniku i glutaminianu fazowego w mysich modelach choroby Alzheimera

Podsumowanie

Tutaj opisujemy konfigurację, nawigację po oprogramowaniu i analizę danych dla przestrzennie i czasowo precyzyjnej metody pomiaru tonicznych i fazowych zmian zewnątrzkomórkowego glutaminianu in vivo za pomocą układów mikroelektrod połączonych enzymami (MEA).

Streszczenie

Zakłócenie neuroprzekaźników jest często kluczowym elementem chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN), odgrywając rolę w patologii leżącej u podstaw choroby Alzheimera, choroby Parkinsona, depresji i lęku. Tradycyjnie, mikrodializa jest najpowszechniejszą (chwaloną) techniką badania zmian neuroprzekaźników, które występują w tych zaburzeniach. Ale ponieważ mikrodializa ma zdolność pomiaru powolnych 1-20 minutowych zmian na dużych obszarach tkanki, ma wadę w postaci inwazyjności, potencjalnie niszcząc wewnętrzne połączenia w mózgu i powolną zdolność do pobierania próbek. Stosunkowo nowsza technika, matryca mikroelektrod (MEA), ma wiele zalet w mierzeniu określonych zmian neuroprzekaźników w dyskretnych obszarach mózgu w miarę ich występowania, co zapewnia precyzyjne podejście przestrzenne i czasowe. Ponadto stosowanie MEA jest minimalnie inwazyjne, co pozwala na pomiar zmian neuroprzekaźników in vivo. W naszym laboratorium szczególnie interesowały nas zmiany w neuroprzekaźniku, glutaminianie, związane z patologią choroby Alzheimera. W związku z tym opisana tutaj metoda została wykorzystana do oceny potencjalnych zaburzeń hipokampa glutaminianu w transgenicznym mysim modelu choroby Alzheimera. Krótko mówiąc, zastosowana metoda polega na pokryciu wielomiejscowej mikroelektrody enzymem bardzo selektywnym dla interesującego nas neuroprzekaźnika i wykorzystaniu miejsc samoreferencyjnych do odjęcia szumu tła i zakłóceń. Po posieciu i kalibracji, MEA może być skonstruowany za pomocą mikropipety i obniżony do obszaru mózgu zainteresowania za pomocą urządzenia stereotaktycznego. W tym przypadku opisana metoda polega na znieczuleniu myszy rTg (TauP301L) 4510 i użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego celowania w podregiony (DG, CA1 i CA3) hipokampa.

Wprowadzenie

Pomiar zmian neuroprzekaźników w mózgu jest niezbędnym narzędziem dla neurobiologów badających choroby ośrodkowego układu nerwowego (OUN), które często charakteryzują się dysregulacją neuroprzekaźników. Chociaż mikrodializa w połączeniu z wysokociśnieniową chromatografią cieczową (HPLC/EC) jest najczęściej stosowaną metodą pomiaru zmian poziomów neuroprzekaźników zewnątrzkomórkowych^1,2,3,4, rozdzielczość przestrzenna i czasowa sond mikrodializacyjnych może nie być idealna dla neuroprzekaźników, takich jak glutaminian, które są ściśle regulowane w przestrzeni zewnątrzkomórkowej^5,6. Ze względu na ostatnie postępy w genetyce i obrazowaniu, istnieją dodatkowe metody, które można wykorzystać do mapowania glutaminianu in vivo. Korzystając z genetycznie kodowanych fluorescencyjnych reporterów glutaminianu (iGluSnFR) i obrazowania dwufotonowego, naukowcy są w stanie zwizualizować uwalnianie glutaminianu przez neurony i astrocyty zarówno in vitro, jak i in vivo^7,8,9. Warto zauważyć, że pozwala to na nagrywanie z większego pola widzenia i nie zakłóca wewnętrznych połączeń mózgu. Chociaż te nowe techniki optyczne pozwalają na wizualizację kinetyki glutaminianu i pomiar reakcji czuciowych wywołanych i aktywności neuronalnej, brakuje im możliwości ilościowego określenia ilości glutaminianu w przestrzeni zewnątrzkomórkowej w dyskretnych obszarach mózgu.

Alternatywną metodą jest układ mikroelektrod połączonych z enzymami (MEA), który może selektywnie mierzyć poziomy neuroprzekaźników zewnątrzkomórkowych, takich jak glutaminian, za pomocą schematu zapisu opartego na samoistnym odniesieniu. Technika MEA została wykorzystana do zbadania zmian w zewnątrzkomórkowym glutaminianu po urazowym uszkodzeniu mózgu^10,11,12, aging^13,14, stress^15,16, epilepsja^17,18, choroba Alzheimera^19,20, oraz wstrzyknięcie wirusa naśladowczego²¹ i stanowi poprawę w stosunku do przestrzennych i czasowych ograniczeń związanych z mikrodializą. Podczas gdy mikrodializa ogranicza możliwość pomiaru w pobliżu synapse^22,23, MEA mają wysoką rozdzielczość przestrzenną, która pozwala na selektywne pomiary zewnątrzkomórkowego rozlewu glutaminianu w pobliżu synaps^24,25. Po drugie, niska rozdzielczość czasowa mikrodializy (1 - 20 min) ogranicza możliwość zbadania szybkiej dynamiki uwalniania i klirensu glutaminianu występującego w zakresie od milisekundy do sekundy²⁶. Ponieważ różnice w uwalnianiu lub klirensie glutaminianu mogą nie być widoczne w pomiarach tonizujących, spoczynkowych poziomów glutaminianu, może być konieczne, aby uwalnianie i klirens glutaminianu były mierzone bezpośrednio. MEA pozwalają na takie pomiary ze względu na ich wysoką rozdzielczość czasową (2 Hz) i niskie granice wykrywalności (< 1 μM). Po trzecie, MEA pozwalają na badanie subregionalnych zmian neuroprzekaźników w określonym regionie mózgu, takim jak hipokamp szczura lub myszy. Na przykład, korzystając z MEA, możemy oddzielnie celować w zakręt zębaty (DG), cornu ammonis 3 (CA3) i cornu ammonis 1 (CA1) hipokampa, które są połączone obwodem trisynaptycznym²⁷, aby zbadać subregionalne różnice w zewnątrzkomórkowym glutaminianu. Ze względu na rozmiar sond do mikrodializy (długość 1 - 4 mm) i uszkodzenia spowodowane implantacją^28,29, różnice subregionalne są trudne do rozwiązania. Co więcej, systemy optyczne pozwalają na stymulację tylko za pomocą bodźców zewnętrznych, takich jak stymulacja wąsów lub migotanie światła, które nie pozwalają na stymulację subregionalną⁷. Ostatnią zaletą MEA w porównaniu z innymi metodami jest możliwość badania tych subregionów in vivo bez zakłócania ich zewnętrznych i wewnętrznych połączeń.

Tutaj opisujemy, jak system rejestrujący (np. FAST16mkIII) w połączeniu z MEA, składający się z wielomiejscowej mikroelektrody na bazie ceramiki, może być różnie powlekany w miejscach rejestracji, aby umożliwić wykrywanie i usuwanie czynników zakłócających z sygnału analitu. Pokazujemy również, że te tablice mogą być wykorzystywane do badań opartych na amperometrii regulacji glutaminianu in vivo w podregionach hipokampa DG, CA3 i CA1 znieczulonych myszy rTg (TauP301L) 4510, powszechnie używanego mysiego modelu choroby Alzheimera. Ponadto potwierdzamy wrażliwość systemu MEA na szybką dynamikę uwalniania i klirensu glutaminianu poprzez potraktowanie myszy riluzolem, lekiem, który wykazano in vitro, że zmniejsza uwalnianie glutaminianu i zwiększa wychwyt glutaminianu^30,31,32,33, i demonstrując te odpowiednie zmiany in vivo w modelu myszy TauP301L.

Protokół

1. Powlekanie układu mikroelektrod enzymami lub warstwą matrycy

1. Przygotowanie roztworu matrycy białkowej
   1. Odważyć 10 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
   2. Dodać 985 μl wody demineralizowanej do probówki mikrowirówki zawierającej BSA. Wymieszać roztwór przez ręczne mieszanie (ponowne pipetowanie za pomocą pipety 1 000 μl ~ 3 razy, aż do rozpuszczenia BSA).
      UWAGA: Nie używaj wiru do mieszania roztworu, ponieważ może to spowodować wprowadzenie powietrza do roztworu. Należy również ustawić pipetę na objętość <1 000 μl (np. 700 μl), aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby roztwór można umieścić w mikrowirówce.
   3. Po rozpuszczeniu roztworu BSA dodać 5 μl 25% roztworu aldehydu glutarowego. Wymieszaj roztwór, odwracając zamkniętą probówkę 3 - 5 razy. Otrzymany roztwór to 1% BSA z 0,125% aldehydu glutarowego.
   4. Odstawić roztwór matrycy białkowej na 5 minut. Roztwór będzie miał jasnożółty kolor.
2. Przygotowanie pożądanego roztworu enzymatycznego (np. oksydazy glutaminianu)
   1. Przygotuj roztwór oksydazy glutaminianowej, dodając przefiltrowaną wodę DI do liofilizowanego, oczyszczonego enzymu (np. 50 μl wody DI dodanej do 25 jednostek oksydazy glutaminianu, aby uzyskać 0,5 U/μL).
      UWAGA: Podwielokrotność roztworu podstawowego (np. 1 μl) i przechowywać podwielokrotności w pojemnikach o odpowiedniej wielkości (np. probówkach mikrowirówek o pojemności 500 μl) w temperaturze -20 °C. Podwielokrotności mogą być przechowywane w tych warunkach przez okres do 6 miesięcy.
   2. Dodać 4 μl roztworu BSA/aldehydu glutarowego do probówki z mikrowirówką zawierającą oksydazę glutaminianu. Wymieszać roztwór przez ręczne mieszanie (ponowne pipetowanie pipetą o pojemności 10 μl. Pipeta powinna być ustawiona na objętość < 5 μl). Otrzymany roztwór to 1% BSA, 0,125% aldehydu glutarowego i 0,1 U/μL oksydazy glutaminianu. Roztwór do powlekania należy natychmiast zużyć.
      Uwaga: Roztwór powlekający oksydazę glutaminianu można zużyć tylko w ciągu 15 minut. Chociaż kilka MEA może być pokrytych jednym przygotowanym roztworem, zaleca się, aby nie przekraczać użytecznego okna czasowego dla oksydazy glutaminianu. Liczba elektrod, które można pokryć w ciągu 15 minut, jest różna. Ogólnie rzecz biorąc, jednorazowo można pokryć od 4 do 6 elektrod.
3. Powlekanie MEA
   1. Zazwyczaj para miejsc zapisu na MEA jest pokryta pożądanym enzymem (oksydazą glutaminianową), a inna para miejsc zapisu (miejsc) zapisu ("wartowniczych") jest pokryta nieaktywną matrycą białkową.
   2. Użyj mikrostrzykawek Hamiltona z końcówką (np. 10 μl), aby pokryć MEA oksydazą L-glutaminianu lub nieaktywnym roztworem matrycy białkowej (BSA + aldehyd glutarowy). Procedury stosowane w przypadku powłok enzymatycznych lub nieaktywnych białek są takie same.
   3. Strzykawki należy oczyścić przed i po użyciu (3 płukania wodą DI, 3 płukania metanolem, 5 płukań wodą DI).
      UWAGA: Dedykowane strzykawki służą do nakładania warstw enzymu (oksydazy glutaminianowej) lub matrycy białkowej. Nie należy używać tej samej strzykawki do podania innego roztworu. Zaleca się wykonanie powłok białkowo-macierzowych przed powlekaniem enzymatycznym.
   4. Pobrać oksydazę glutaminianu lub matrycę białkową za pomocą 10 μl strzykawki Hamiltona. Delikatnie nacisnąć tłok, aby dozować małą kulkę roztworu na końcu strzykawki (uwidocznioną za pomocą mikroskopu preparacyjnego).
   5. Używając mikroskopu preparacyjnego do namierzenia miejsc rejestracji MEA, nałóż roztwór na odpowiednie miejsca zapisu, krótko kontaktując się z miejscami nagrywania z kroplą/kulką roztworu, która reprezentuje jedną warstwę. Trzy warstwy są wystarczające zarówno dla macierzy białkowej, jak i płaszcza enzymatycznego. Grube warstwy mogą zmniejszyć czułość MEA.
   6. Podnieś kroplę roztworu prosto do góry i z miejsc nagrań (tj. końcówka strzykawki nie powinna ocierać się o powierzchnię MEA).
   7. Ustaw minutnik na 1 minutę. Jest to minimalny wymagany czas między nałożeniem powłoki w miejscu (miejscach) rejestracji. Pozostawić pokryte enzymami MEA do utwardzenia w temperaturze 4 °C przez 5-7 dni.
   8. Zapisz liczbę nałożonych warstw, czas potrzebny na nałożenie powłok, numer elektrody oraz imię i datę w zeszycie laboratoryjnym.

2. Galwanizacja z m-fenylenodiaminą dla poprawy selektywności

1. Przygotowanie roztworu dichlorowodorku m-fenylenodiaminy (mPD)
   UWAGA: Pokryj warstwę wykluczającą, mPD, aby zapobiec utlenianiu dopaminy i innych dużych, interferencyjnych cząsteczek (np. kwasu askorbinowego), poprawiając w ten sposób selektywność czujnika glutaminianu/_H2O2 w stosunku do innych potencjalnie interferencyjnych cząsteczek.
   1. Odmierzyć 50 ml 0,05 M buforowanej soli fizjologicznej (PBS) w kolbie miarowej i przenieść 50 ml 0,05 M PBS do większej (150 ml) kolby Erlenmeyera.
   2. Używając rurki podłączonej do zbiornika azotu (np. używając rurki podłączonej do eżektora ciśnieniowego), przymocuj końcówkę pipety (np. końcówkę P200) do otwartego końca rurki. Umieść rurkę z dołączoną końcówką pipety w roztworze PBS i luźno przykryj roztwór parafilmem. Włącz azot i delikatnie bąbelkuj roztwór na 20 minut.
   3. Odważyć 0,045 g mPD.
      Uwaga: mPD jest substancją potencjalnie rakotwórczą. Ważenie mPD powinno być wykonywane przy użyciu wagi umieszczonej w dygestorium. Podczas korzystania z mPD należy nosić rękawiczki i maskę. Upewnij się, że okap jest sprawny, a skrzydło jest pociągnięte do odpowiedniego poziomu roboczego. Natychmiast wyczyść powierzchnie, które mogły zostać zanieczyszczone mPD, aby uniknąć trwałego zabrudzenia.
   4. Po bulgotaniu przenieś całe mPD do odgazowanego roztworu PBS. Przykryj otwór kolby parafilmem i delikatnie zawiruj roztworem, aby rozpuścić mPD w roztworze. Należy unikać agresywnego mieszania lub stosowania wiru, ponieważ może to spowodować wprowadzenie gazów do roztworu.
   5. Przenieść roztwór do zlewki o pojemności 50 ml. Mieszadło nie jest konieczne.
2. Galwanizacja elektrody
   1. Zaopatrzyć się w elektrodę referencyjną. Używaj elektrod referencyjnych przeznaczonych wyłącznie do powlekania mPD. Do procedur kalibracji należy użyć innej elektrody referencyjnej.
   2. Umieść plastikowe ramię uchwytu elektrody odniesienia nad zlewką. Sprawdź, czy w szklanej elektrodzie referencyjnej nie ma pęcherzyków powietrza (może nie być w stanie zobaczyć). Delikatnie przesuń dystalny koniec elektrody referencyjnej, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza z końcówki.
   3. Umieścić elektrodę odniesienia przez otwór w plastikowym ramieniu i opuścić do zlewki zawierającej PBS. Upewnij się, że elektroda referencyjna nie styka się z dnem zlewki.
   4. Podłącz elektrodę odniesienia do sceny głównej (np. 2 pA/mV) i podłącz (np. złącze DIP) MEA, która ma być pokryta mPD, do sceny głównej.
   5. Opuścić MEA do roztworu zlewki tak, aby tylko końcówka MEA była zanurzona w roztworze. Nie zanurzaj końcówek MEA w cieczy poza czarną "bańką" (czarną izolacją znajdującą się nad końcówką MEA). Może to spowodować uszkodzenie MEA.
   6. Przeprowadź kalibrację "testową", aby sprawdzić funkcjonalność kanałów elektrod i połączenia ze sceną czołową.
      UWAGA: Chociaż ustawienia sprzętowe powinny odzwierciedlać używany sprzęt, szczegóły związane z typem analitu/zakłócenia i stężeniem nie muszą być wprowadzane do kalibracji "testowej". Tryb kodowania powinien być ustawiony na "Amperometria", a tryb "Zastosowany V" powinien wynosić -0,7 V. Sprawdź typowe nagrywanie dla wszystkich kanałów.
   7. Anuluj, wybierając opcję "Anuluj", gdy zostanie zweryfikowana łączność wszystkich witryn nagrywania. Nie ma potrzeby zapisywania danych kalibracyjnych.
   8. Wybierz ikonę "Galwanizacja" na pulpicie. Pojawi się menu narzędzia do galwanizacji. Sprawdź, czy zostały wprowadzone poprawne ustawienia:
      Amplituda P-P: 0,25
      Przesunięcie: -0,5
      Częstotliwość: 0,05
      Czas trwania (min): 20
   9. Wybierz przycisk "pauza", aby rozpocząć galwanizację. Pole czasu, który upłynął, powinno rozpocząć odliczanie.
   10. Po zakończeniu (cały czas, który upłynął), wybierz "kolejny MEA" w wyskakującym menu, aby rozpocząć powlekanie mPD dodatkowego MEA. Zastąp platerowany MEA MEA, który ma być pokryty mPD i powtórz procedurę galwanizacji za pomocą narzędzia do galwanizacji.
       UWAGA: Zaleca się stosowanie przygotowanego roztworu mPD nie więcej niż 2 razy lub w ciągu 1 godziny. Przygotuj świeży roztwór, aby przygotować więcej niż 2 MEA.
   11. Wybierz "wyjdź z oprogramowania", aby zakończyć galwanizację. Opłucz końcówki elektrod pokryte mPD wodą DI (aby uniknąć pozostałości soli) i przechowuj (24 godziny) przed kalibracją.
   12. Wyjąć elektrodę odniesienia z roztworu i spłukać wodą demineralizowaną przed umieszczeniem w odpowiednim roztworze do przechowywania (np. 3 M NaCl). Upewnij się, że końcówka elektrody referencyjnej jest zanurzona w roztworze. Powoli zanurz szklaną elektrodę odniesienia w roztworze, aby uniknąć uszkodzenia szkła.
   13. Roztwór mPD należy wyrzucić do odpowiednio oznakowanego pojemnika na odpady niebezpieczne.

3. Kalibracja MEA do wykrywania i selektywności glutaminianu (Rysunek 1)²¹

1. Przygotowanie roztworów potrzebnych do kalibracji.
   UWAGA: Patrz Tabela 1.
2. Przeprowadzić kalibrację przy ciągłym mieszaniu (mieszadło magnetyczne zasilane bateryjnie) w temperaturze 37 °C. Włączyć poduszkę grzewczą lub łaźnię z obiegiem wody i uzyskać małe mieszadło. Mieszaj powoli, ale na tyle szybko, że po dodaniu (poniżej) szybko osiągniesz nowy płaskowyż.
3. Podłącz stację czołową (2 pA/mV) do systemu sterowania nagrywaniem i włóż końcówkę MEA do 40 ml wymieszanego 0,05 M PBS (użyj zlewki o pojemności 50 ml).
4. Podłączyć elektrodę odniesienia. Przesuń koniec, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
5. Otwórz program do nagrywania i kliknij "Kalibracja". Upewnij się, że ustawienia są poprawne (sprawdź, czy wybrano miejsca wartownicze, ponieważ może się to zmienić w przypadku różnych elektrod), wybierz numer MEA i naciśnij "Start".
6. Odczekaj 5 - 10 minut na zrównoważenie; rozpocznij po ustabilizowaniu się linii podstawowej (zmiana < 0,004 nA/min).
7. Wybierz "Linia podstawowa" i dodaj 500 μl 20 mM kwasu askorbinowego (interferencyjny; końcowy [250 μM]) i wybierz "Interferencyjny" (AA jest uważany za zakłócenia obejmujące cały mózg), gdy prąd osiągnie nowy, stały plateau, jeśli taki istnieje. Odczekaj 0,5 - 1 minutę między dodaniami. Jeśli MEA jest prawidłowo galwanizowany, nie należy zaobserwować prawie żadnych zmian.
8. Dodać 40 μL 20 mM L-glutaminianu (końcowy [20 μM]), a gdy prąd osiągnie nowy, stały plateau, zaznacz 1. dodatek "Analit". Powtórz trzy razy, aby uzyskać w sumie 3 dodatki glutaminianu.
9. Dodać 40 μl DA. Nie wybieraj opcji "Analit"; wybrać "Substancja badana" - DA może zakłócać tylko w obszarach zawierających DA.
10. Dodać 40 μl nadtlenku. Nie wybieraj opcji "Analit"; wybrać "Substancja badana".
11. Kliknij przycisk "Stop" po zakończeniu kalibracji.
12. Aby określić funkcjonalność MEA, kliknij kartę obliczeń i zapisz następujące parametry w notatniku laboratoryjnym.
    1. W przypadku projektu MEA (3 000 μm²) używanego w tych kalibracjach należy użyć MEA o nachyleniu ≥ 0,004 nA/μM, ale w niektórych eksperymentach można użyć niższych nachyleń. Jeśli różnica w nachyleniu między miejscami pokrytymi enzymami i niepokrytymi jest mniejsza niż 10%, należy użyć tych MEA tylko do uwolnienia wywołanego lub wyczyścić/wyrzucić MEA.
    2. Stosować granicę wykrywalności (LOD) ≤ 1,5 μM. Jeśli LOD jest większy niż 1,5 μM, należy użyć tych MEA tylko do wywołanego uwalniania i wychwytu. Nie używaj tych elektrod do rejestrowania poziomów tonicznych.
    3. Użyj selektywności dla pożądanego analitu (tj. glutaminianu) w stosunku do interferencji > 20 dowolnych jednostek. Jeśli selektywność jest mniejsza niż 20, wyczyść MEA.
    4. Zastosować liniowość (R²) krzywej kalibracyjnej ≥ 0,90. Jeśli liniowość jest mniejsza niż 0,90, wyczyść lub wyrzuć MEA.
13. Zapisz plik z # MEA, datą i inicjałami osoby kalibrującej.

4. Montaż mikropipety

UWAGA: Mikropipety (szklane kapilarne) powinny mieć końcówkę o wewnętrznej średnicy 10 - 15 μm.

1. Umieść mikropipetę centralnie między wszystkimi czterema miejscami zapisu platyny i zamontuj 50-100 μm nad MEA, używając lepkiego wosku i gliny modelarskiej.
2. Aby załadować mikropipetę, użyj strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej glutaminianem lub roztworem KCl, sterylnego filtra strzykawkowego 0,22 μm i napełniacza pipet o długości 97 mm w rozmiarze 28, a następnie napełnij mikropipetę. Oznacza to, że włóż igłę do górnej części mikropipety i napełnij ją na dole mikropipety (końcem w kierunku MEA), upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
3. Podłącz mikropipetę do systemu wyrzucania ciśnienia pod ciśnieniem 2 - 20 psi na około 1 s.

5. Umieść miniaturową elektrodę referencyjną do użytku in vivo

1. Przygotować roztwór galwaniczny (50 g NaCl/90 ml 1 M HCl w zlewce o pojemności 100 ml (kąpiel galwaniczna)) i przeciąć elektrodę do kąpieli (o długości ~ 10 cm drutu platynowego (Pt) (średnica ~ 0,02")).
2. Wytnij kawałek srebrnego drutu pokrytego teflonem o długości 10 - 15 cm (0,008 cala goły) i użyj żyletki, aby zeskrobać ~ 1 cm powłoki teflonowej z każdego końca srebrnego drutu.
3. złoty szpilkę na jednym końcu i umieść jeden koniec odsłoniętego srebrnego drutu w kąpieli galwanicznej.
4. Za pomocą zasilacza prądu stałego (należy używać tylko zasilacza prądu stałego o mocy wyjściowej ~ 9 - 15 VDC max.), clamp "czerwony" (+) przewód do przygotowanego srebrnego przewodu (elektrody odniesienia) po stronie złotego pinu. Clamp "" (-) przewód do katody kąpieli Pt.
5. Podłącz zasilacz prądu stałego. Poszukaj prawidłowego procesu powlekania — na elektrodzie do kąpieli powinny pojawić się bąbelki; Elektroda referencyjna zmienia kolor na srebrno-szary.
   ostrożność: Nie zmieniaj przewodów [(-) kontra Czerwony (+)] — kąpiel galwaniczna zostanie w takim przypadku zniszczona i konieczne będzie wykonanie nowego roztworu galwanicznego. Złe rozwiązanie zmieni kolor na żółty: NIE UŻYWAĆ!
   UWAGA: Reakcja powlekania trwa zazwyczaj 2-5 minut: Ag⁰ + Cl^- → AgCl + e^-
6. Przetestuj elektrodę odniesienia.
   1. Ustaw multimetr na ustawienie 100 - 200 mV DC.
   2. Umieścić wzorcową (tj. uprzednio przetestowaną elektrodę, o której wiadomo, że działa) elektrodę odniesienia w 3 M NaCl i porównać z nowo platerowaną elektrodą odniesienia.
      UWAGA: Jeśli używasz nowej elektrody referencyjnej, przed użyciem namocz ją w 3 M NaCl (zalecane 12 godzin).
   3. Umieść "czerwony" (+) przewód na złotym bolcu badanej elektrody odniesienia. Umieść "" (-) przewód na elektrodzie wzorcowej. Dopuszczalny zakres odczytu to ± 10 mV. 0 mV jest idealne dla 2 elektrod referencyjnych.

6. Ogólna chirurgia zwierząt dla nagrań MEA

1. Przygotowanie do zabiegu
   1. Umieść narzędzia chirurgiczne w środku dezynfekującym poprzedniego wieczoru.
   2. Wyjmij narzędzia ze środka dezynfekującego i dokładnie spłucz, a następnie umieść narzędzia na sterylnej podkładce chirurgicznej. Zaopatrz się w poduszkę grzewczą.
   3. Skalibrować dwie elektrody i założyć mikropipetę zgodnie z opisem w procedurach 3 i 4.
   4. Wykonać elektrodę odniesienia zgodnie z opisem w rozdziale 5.
   5. Zrobić 200 μM glutaminianu i 70 mM KCl. Patrz Tabela 1.
   6. Zdobądź zwierzę i zapisz jego wagę na arkuszach chirurgicznych.
   7. Przygotuj znieczulenie i włącz poduszkę grzewczą.
2. Wykonaj operację MEA
   1. Za pomocą izofluranu (4% przepływu tlenu) znieczul zwierzę w komorze indukcyjnej, aż częstość oddechów znacznie się zmniejszy i zwierzę nie zareaguje na szczypanie palca u nogi lub ogona. Rejestruj częstość oddechów i temperaturę ciała co 15 minut.
   2. Umieść zwierzę w urządzeniu stereotaktycznym za pomocą pasków nausznych, aby ustabilizować głowę. Upewnij się, że zwierzę jest bezpieczne, a głowa się nie porusza. Zmniejsz przepływ izofluranu do 1,5 - 3% tlenu. Upewnij się, że poduszka grzewcza jest prawidłowo umieszczona pod zwierzęciem i ustawiona na 37 °C, aby zapewnić dodatkowe ciepło. Niezapewnienie dodatkowego ciepła może skutkować głęboką hipotermią i przedwczesną śmiercią zwierzęcia.
   3. Nałóż maść na oczy za pomocą sterylnego bawełnianego aplikatora i zapisz częstość oddechów oraz temperaturę ciała. Za pomocą trymera zasilanego bateryjnie ogol czubek głowy. Użyj małych nożyczek chirurgicznych, aby usunąć sierść w pobliżu uszu.
   4. W tym momencie załóż sterylne rękawice chirurgiczne. Nałóż jod, a następnie alkohol (trzy razy) na skórę głowy.
   5. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie prosto na środku skóry głowy i rozprowadź skórę za pomocą zacisków bull dog. Weź sterylną bawełnianą końcówkę, aby wchłonąć krew. Użyj nadtlenku wodoru, aby ułatwić pojawienie się bregmy i lambdy.
   6. Sprawdź, czy głowica jest prawidłowo ustawiona, mierząc współrzędne D/V i M/L bregmy i lambdy. Zmiany współrzędnych powinny wynosić zero, jeśli głowa znajduje się na płaskiej płaszczyźnie. W razie potrzeby wyreguluj głowicę i nauszniki, aby zapewnić płaską płaszczyznę.
   7. Znajdź bregmę i wyzeruj współrzędne. Używając żądanych współrzędnych, przesuń się w lewo i w prawo i zaznacz za pomocą trwałego markera. Za pomocą kauteryzatora/markera zrób duży kwadrat wokół znaku, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca, aby dotrzeć do żądanego obszaru.
   8. Za pomocą sterylnego narzędzia obrotowego wywierć wokół kwadratowego znaku. Wchłoń krew za pomocą sterylnego bawełnianego aplikatora. Dokładnie zdezynfekuj wiertło przed każdym użyciem.
   9. Przymocuj MEA do głowicy i napełnij pipetę pierwszym pożądanym roztworem. Należy upewnić się, że należy pozostawić przerwę w pipecie bez roztworu, aby można było zbadać usuwany roztwór. Przymocuj rurkę do szklanej mikropipety.
   10. Włączyć zbiornik azotu i wyrzutnik ciśnienia (psi=5, czas=0,6 s). Przed rozpoczęciem przetestuj (naciśnij ręczny czerwony przycisk), aby upewnić się, że pipeta nie jest zatkana.
   11. Skalibruj mikropipetę. Zacznij od 0 na siatce celowniczej i umieść kawałek niebieskiej taśmy na scenie czołowej, aby wskazać punkt początkowy. Włącz czytnik cyfrowy i zresetuj go do zera. Zejdź o 1 mm w dół (DV) i policz liczbę znaczników, o ile roztwór przesunął się na siatce. 10 znaczników powinno być równych 1 mm (1 mm = 250 nL), więc 1 znacznik = 25 nL.
   12. Umieść elektrodę odniesienia w odległym miejscu od MEA, tak aby nadal miała kontakt z mózgiem w płynie, aby zakończyć obwód.
   13. Znajdź bregmę z dołączonym MEA i wyzeruj czytnik cyfrowy. Przesuń MEA do żądanych współrzędnych. Powoli opuść MEA, aż końcówka dotknie mózgu. Wyzeruj współrzędną DV i POWOLI opuść MEA do mózgu.
   14. W programie do nagrywania kliknij żądaną skalibrowaną elektrodę, a następnie kliknij "Wykonaj eksperyment". Następnie system rozpocznie rejestrowanie poziomów toniku dla interesującego analitu, podczas gdy zwierzę jest znieczulane.
   15. Powiększ do osi, która pomoże w obserwacji linii bazowej i pozwól elektrodzie na linię bazową przez 20 - 45 minut.
   16. Po ustabilizowaniu się linii bazowej ustaw eżektor ciśnienia na .6 s i 5 psi i naciśnij czerwony przycisk na eżektorze ciśnienia, aby wysunąć. Zapisać czas i ciśnienie, a także objętość/znaczniki przesunięte na arkuszu iniekcji (rysunek 2). Zrób wszelkie niezbędne notatki (np. większe wartości szczytowe, efekty rozcieńczenia, zatkana pipeta, hałaśliwa linia podstawowa/o-scope).
   17. W przypadku wstrzyknięć z glutaminianem należy odczekać 3 - 5 minut między wstrzyknięciami. W przypadku wstrzyknięć KCl należy odczekać 1 - 2 minuty między wstrzyknięciami. Wstrzyknąć przy tym samym ciśnieniu i czasie co najmniej 3 razy. Zmień czas i powtórz. Staraj się nie zmieniać ciśnienia, chyba że mikropipeta jest zatkana.
   18. Jeśli mikropipeta jest zatkana, zwiększ ciśnienie do 30 psi.
   19. Nagrywaj z pożądanych obszarów mózgu, powtarzając po obu stronach mózgu przy użyciu różnych rozwiązań. Nagrywaj linię bazową w każdym nowym regionie przez 20 minut.
   20. Weź MEA z dołączoną mikropipetą, spłucz wodą demineralizowaną i zanurz w PBS przez noc, aż cała krew zniknie.
   21. Poddaj zwierzę eutanazji i zachowaj mózg we wstępnie oznakowanej tubie i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -80 °C lub zachowaj jedną stronę do utrwalenia. Aby poddać zwierzę eutanazji, należy przedawkować izofluran (wdychanie). Wykonaj dekapitację za pomocą nożyczek chirurgicznych i wypreparuj pożądane obszary.

7. Czyszczenie powlekanych MEA po użyciu

1. Nie czyścić MEA, jeśli nie są używane. Jeśli na powierzchni znajdują się kłaczki lub kurz, wyczyść metanolem i pozostaw do wyschnięcia na 24 godziny przed nałożeniem powłoki.
2. Włączyć łaźnię wodną (80 °C) i moczyć końcówkę MEA przez 30 minut. Ostrożnie przetrzyj końcówkę elektrody aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, które mogą pozostać na końcówce elektrody. Nie dopuścić do zamoczenia czarnej "części izolacyjnej" MEA.
3. Używając trzech różnych sonikatorów, zanurz końcówkę MEA w (1) Citrisolv, dostępnym w handlu rozpuszczalniku i środku czyszczącym (2) izopropylu i (3) wodzie DI na 5 minut. Ostrożnie przetrzyj końcówkę elektrody aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, które mogą pozostać na końcówce elektrody.
4. Zbadaj końcówki pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że warstwy zostały pomyślnie usunięte.

8. Analiza

1. Aby przeanalizować dane, najpierw wyeksportuj żądany eksperyment, klikając dwukrotnie zakończony eksperyment i wybierając opcję "eksportuj dane" z menu rozwijanego pliku.
2. Zapisz te dane w żądanej lokalizacji pliku i otwórz program do analizy. Kliknij "otwórz" w programie do analizy i wybierz ostatnio zapisany plik.
3. Daj programowi kilka chwil na wgranie pliku, a następnie sprawdź eksperyment w zakładce znaczniki zdarzeń. W obszarze Wyjście zaznacz pola wyboru żądanych parametrów. Na przykład linia bazowa, amplituda, powierzchnia piku (powierzchnia pod krzywą),_wzrost T i T₈₀.
4. Kliknij przycisk Odśwież, a następnie przeanalizuj, aby wyeksportować dane do arkusza kalkulacyjnego (może to potrwać kilka minut). Program wyświetli monit o zapisanie pliku w żądanej lokalizacji. Po zapisaniu plik można edytować w arkuszu kalkulacyjnym.

Wyniki

Chociaż ta technologia może być używana do pomiaru zmian w sygnalizacji glutaminergicznej w wielu typach modeli zwierzęcych, takich jak urazowe uszkodzenie mózgu, starzenie się, stres i epilepsja, tutaj pokazujemy, jak technologia MEA może być wykorzystana do badania zmian glutaminergicznego w transgenicznym mysim modelu ludzkiej tauopatii^19,20. Mysz rTg (TauP301L) 4510 wyraża mutację P301L w tau związaną z otępieniem czołowo-skro...

Dyskusja

Technika MEA pozwala na pomiar szybkiej kinetyki uwalniania i wychwytu neuroprzekaźników in vitro i in vivo. W związku z tym technologia generuje szeroką gamę danych wyjściowych, w tym poziomy neuroprzekaźników tonicznych, wywołane uwalnianie neuroprzekaźników i usuwanie neuroprzekaźników. Jednakże, ponieważ stosowanie MEA jest stosunkowo złożoną procedurą, istnieje wiele czynników, które mogą wymagać optymalizacji, aby zapewnić skuteczne stosowanie. Na przykład podczas kalibracji można zauważyć, że nie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
FAST-16mkIII-8-kanałowe	Quanteon	16mkIII
	CenMet	W4 lub 8-TRK
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A-3059	10 g (wygasa po 1 miesiącu)
Aldehyd glutarowy	Sigma-Aldrich	G-6257	100 ml (wygasa po 6 miesiącach)
Oksydaza glutaminianu	US Biological lub Sigma Aldrich	G4001-01 lub 100646	50 UI (wygasa po 6 miesiącach)
Strzykawki Hamilton	Hamilton	#80383	2 strzykawki
Metanol	BDH	UN1230	4 L
dichlorowodorek m-fenylenodiaminy (mPD)	ACROS Organics	1330560250	25 g
Elektrody referencyjne (RE-5B)	BAS	MF-2079	3 elektrody
Zasilane bateryjnie Magnetyczne Płytka mieszająca	Cole-parmer	EW-04804-01	Można kupić od innego dostawcy
Glutaminian	Sigma-Aldrich	G-1626	100 g
Kwas askorbinowy	TCI	50-81-7	500 g
Chlorowodorek dopaminy	Alfa Aesar	62-31-7	5 g
Kwas nadchlorowy	VWR	UN2920	500 mL
Chlorek postasowy	VWR	7447-40-7	1 kg
Chlorek sodu	VWR	7647-40-7	1 kg
Chlorek wapnia	MP	153502	100 g
Wodorotlenek sodu	BDH	1310732	500 g
Szklane pipety wyrzutowe	CenMet
Lepki wosk	Kerrlab	625	Można kupić od innego dostawcy
Microsy-strzykawka	World Precision Instruments	MF28G-5
Modelina	WalMart		Można kupić od innego dostawcy
Picospritzer III	Parker
Silver wire	AM systems	#786500
Kwas solny	BDH	7647010	2,5 L
Drut platynowy	AM Systems	778000
Pistolet lutowniczy	Lowes lub Home Depot		Można kupić od innego dostawcy
Multimetr	WalMart		Można kupić od innego dostawcy
PhysioSuite	Kent Scientific	Można kupić od innego dostawcy
			Można kupić od innego dostawcy
Urządzenie	stereotaktyczneStoelting		Można kupić od innego dostawcy
Digital Lab Standard	Stoelting		Można kupić od innego dostawcy
Mikroskop Meiji EMZ	Wiertarka Meiji	EMZ-5
	Dremel	Micro
Metricide	Metrex	102800
Skalpel	VWR		Można kupić od innego dostawcy
Nożyczki chirurgiczne	VWR		Można kupić od innego dostawcy
Sterylne waciki bawełniane	Puritan	25806	Można kupić od innego dostawcy
Maść do oczu	Puralube Maść		Uzyskaj od weterynarza
Waciki jodowe	VWR	S48050	Można kupić od innego dostawcy
Waciki nasączone alkoholem	Lokalna apteka		Można kupić od innego dostawcy
Sterylna serweta chirurgiczna	Dynarex	4410	Można kupić od innego dostawcy
Sterylna sól fizjologiczna	Teknova	S5815	Można zrobić własne rozwiązanie za pomocą filtrów
Nadtlenek wodoru (3%)	Lokalna apteka		Można kupić od innego dostawcy
Podkładka grzewcza	WalMart		Można kupić od innego dostawca