Method Article

Prosta metoda ekstrakcji i analizy glukozynolanu za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC)

DOI:

10.3791/55425

⸱

March 15th, 2017

 , 
1German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, 2Institute of Ecology, Friedrich Schiller University Jena

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy bardzo szczegółowo sprawdzony i solidny protokół ekstrakcji glukozynolanów z mielonych materiałów roślinnych. Po zastosowaniu sulfatazy w kolumnie ekstraktów, desulfoglucozynolany są eluowane i analizowane za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glukozynolany to dobrze zbadana i bardzo zróżnicowana klasa naturalnych związków roślinnych. Odgrywają ważną rolę w odporności roślin, jakości oleju rzepakowego, aromatach spożywczych i zdrowiu ludzi. Aktywność biologiczna glukozynolanów jest uwalniana po uszkodzeniu tkanki, gdy są one mieszane z enzymem mirozynazą. Powoduje to powstawanie ostrych i toksycznych produktów rozpadu, takich jak izotiocyjaniany i nitryle. Obecnie zidentyfikowano ponad 130 strukturalnie różnych glukozynolanów. Struktura chemiczna glukozynolanu jest ważnym wyznacznikiem powstającego produktu, co z kolei decyduje o jego aktywności biologicznej. Te ostatnie mogą wahać się od szkodliwych (np. progoittryna) do korzystnych (np. glukorafanina). Każdy gatunek rośliny zawierający glukozynolany ma swój specyficzny profil glukozynolanu. Z tego powodu ważne jest, aby prawidłowo zidentyfikować i wiarygodnie określić ilościowo różne glukozynolany obecne w liściach kapustnych, nasionach i roślinach okopowych lub, w przypadku badań ekologicznych, u ich dzikich krewnych. W tym miejscu przedstawiamy dobrze zwalidowaną, ukierunkowaną i solidną metodę analizy profili glukozynolanu w szerokim zakresie gatunków roślin i organów roślinnych. Nienaruszone glukozynolany są ekstrahowane ze zmielonych materiałów roślinnych za pomocą mieszaniny metanolu i wody w wysokich temperaturach, aby wyłączyć aktywność mirozynazy. Następnie otrzymany ekstrakt przenosi się do kolumny jonowymiennej w celu oczyszczenia. Po leczeniu sulfatazą desulfogozynolany są eluowane wodą, a eluat jest liofilizowany. Pozostałość jest pobierana w dokładnej objętości wody, która jest analizowana za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) z detektorem fotodiodowym (PDA) lub ultrafioletowym (UV). Detekcję i kwantyfikację uzyskuje się poprzez porównanie czasów retencji i widm UV komercyjnych wzorców referencyjnych. Stężenia są obliczane na podstawie krzywej referencyjnej sinigryny i dobrze ustalonych współczynników odpowiedzi. Omówiono tutaj zalety i wady tej prostej metody w porównaniu z szybszymi i bardziej zaawansowanymi technologicznie metodami.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szacuje się, że rośliny produkują ponad 200 000 różnych rodzajów związków chemicznych1. Wydaje się, że tylko mniejszość tych związków odgrywa rolę w pierwotnym metabolizmie roślin, który napędza wzrost i rozmnażanie; Większość z nich to tak zwane metabolity wtórne. Pomimo swojej nazwy, metabolity wtórne są często krytyczne dla przetrwania i rozmnażania roślin, ponieważ służą do przyciągania zapylaczy lub obrony rośliny przed patogenami i roślinożercami1.

Glukozynolany to bardzo zróżnicowana klasa metabolitów wtórnych, które były badane przez ponad 150 lat2. Do tej pory zidentyfikowano ponad 130 strukturalnie różnych glukozynolanów3. Ogólnie rzecz biorąc, glukozynolany można podzielić na różne klasy w zależności od aminokwasu, z którego są syntetyzowane. Na przykład glukozynolany indolu są syntetyzowane z aminokwasu tryptofanu, podczas gdy fenyloalanina stanowi szkielet podstawowy do syntezy aromatycznych glukozynolanów4. W obrębie klas występuje wysoki poziom różnorodności strukturalnej, który jest spowodowany sekwencyjnymi etapami wydłużania łańcuchów w szlakach biosyntezy, takich jak klasa glikozynolanów alifatycznych, lub modyfikacjami łańcucha bocznego (np. hydroksylacja)4,5. Jeden gatunek rośliny glukozynolanu może zawierać do 37 różnych glukozynolanów należących do różnych klas strukturalnych6. Mimo że gatunki roślin mają typowe profile glukozynolanu, wewnątrzgatunkowe różnice w typach glukozynolanów są często spotykane wśród osobników i populacji6,7. Nienaruszone glukozynolany są przechowywane w wakuolach komórek roślinnych i można je znaleźć w każdym organie naziemnym lub podziemnym7,8,9. Po rozpadzie komórki (np. przez roślinożerność) glukozynolany są uwalniane i mieszane z enzymem mirozynazą, uruchamiając bombę z olejkiem musztardowym10. Ze względu na aktywność mirozynazy i w zależności od struktury glukozynolanu, warunków reakcji i obecności enzymów modyfikujących, powstają różne ostre, toksyczne lub szkodliwe związki, takie jak nitryle i (izo)tiocyjaniany11. Produkty reakcji mają wysoką aktywność biologiczną; Na przykład służą jako środki odstraszające owady roślinożerne12. Odziedziczalność i szlaki biosyntezy glukozynolanów są dobrze zbadane, głównie ze względu na ich znaczenie dla odporności roślinożerców i patogenów, ich wartość jako składników smakowych gorczycy i kapusty oraz ich negatywny (progoitryna) i pozytywny (glukorafanina) wpływ na zdrowie człowieka5,13,14.

Ze względu na duże zainteresowanie glukozynolanami jako związkami biologicznie aktywnymi, metody ekstrakcji i wykrywania oparte na wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (HPLC) wyposażonej w detektory ultrafioletowe (UV) lub fotodiodowe (PDA) są powszechnie stosowane od lat 8015. W oparciu o tę metodę Wspólnoty Europejskie wydały standardowy protokół, który został przetestowany i zatwierdzony w kilku laboratoriach do analizy glukozynolanów w nasionach oleistych (Brassica napus, colza, Canola16). Inni dodali do tej metody (np. poprzez określenie dodatkowych współczynników odpowiedzi dla glukozynolanów, które nie są obecne w rzepaku)17. Pomimo rosnącej dostępności platform chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS) i wysokoprzepustowych protokołów do analizy glukozynolanu18,19, oryginalna metoda HPLC-UV/PDA jest nadal szeroko stosowana przez naukowców. Głównym powodem jest to, że metoda ta jest prosta, opłacalna i stosunkowo dostępna dla laboratoriów bez rozbudowanej infrastruktury wiedzy chemiczno-analitycznej. Aby służyć tej społeczności, szczegółowo opisujemy tutaj protokół ekstrakcji glukozynolanów z materiałów roślinnych i analizy ich desulfoform za pomocą HPLC-PDA.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów potrzebnych do ekstrakcji glukozynolanu

  1. Przygotuj 500 ml 70% metanolu (MeOH) w wodzie (ultraczystej) w szklanej butelce. Na 100 próbek i 5 wzorców potrzeba 420 ml 70% MeOH.
  2. Przygotować 20 mM octanu sodu (NaOAc) (pH = 5,5) przez dodanie 0,82 g NaOAc lub 1,36 g NaOAc x 3 H2O w 500 ml wody; dostosować pH za pomocą chlorowodoru (HCl). Przechowuj NaOAc w lodówce. Na 100 próbek i 5 wzorców potrzeba 370 ml 20 mM NaOAc (pH = 5,5) w wodzie.
  3. Aby przygotować materiał kolumny, wymieszaj 10 g usieciowanego żelu dekstranowego (typ G-25) ze 125 ml ultraczystej wody. Powstałą mieszaninę przechowywać w lodówce (4 °C).
  4. Przygotowanie roztworu sulfatazy
    1. Rozpuść 10 000 jednostek sulfatazy arylowej (typ H-1 z Helix pomatia) w 30 ml ultraczystej wody i dodaj 30 ml absolutnego etanolu (EtOH). Dobrze wymieszaj roztwór i przenieś go do jednej probówki wirówkowej o pojemności 250 ml lub wielu mniejszych probówek, w zależności od dostępności.
    2. Odwirować mieszaninę przy 2,650 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT). Przenieść supernatant (stany) nad osadem (stanami) do zlewki; dodać 90 ml EtOH i wymieszać. Odwirować mieszaninę w jednej lub kilku probówkach wirówkowych o sile 1,030 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odrzucić supernatanty. Rozpuść i połącz granulki w sumie 25 ml ultraczystej wody. Dobrze przemieszać, dozować do probówek o pojemności 1 ml i przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C; Będą one przechowywane przez co najmniej jeden rok.
  5. Przygotowanie roztworu referencyjnego sinigryny
    1. Odważyć około 9 mg monohydratu sinigryny z dokładnością do 1 μg (np. 8,769 mg). Przenieść go do kolby miarowej o pojemności 10 ml i rozpuścić monohydrat sinigryny w 10,0 ml ultraczystej wody.
    2. Obliczyć molowość roztworu podstawowego i przygotować pięć odniesień sinigryny w zakresie od 50 do 750 μM, rozcieńczając roztwór podstawowy. Aby zapoznać się ze szczegółowym przykładem, zobacz Plik uzupełniający S1.
    3. Dozować różne wzorce sinigryny do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml i zamrażać je w temperaturze 20 °C. Do każdej partii ekstrakcyjnej należy dołączyć serię pięciu odniesień sinigryny. Przy obliczaniu stężeń należy zawsze używać prawidłowych wartości molowości dla aktualnie stosowanych odniesień sinigryny.

2. Przygotowanie instalacji do ekstrakcji

  1. Przygotuj stojak na kolumny do pipet Pasteura (informacje na temat przygotowania kolumn, patrz krok 3.1). Oznacz stojak lub kolumny, aby śledzić numery próbek (patrz Rysunek 1).
  2. Przygotować blok zawierający taką samą liczbę oznakowanych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml (patrz krok 3.3 i rysunek 1)

figure-protocol-1
Rysunek 1: Stojak do ekstrakcji glukozynolanu. Widok z przodu (po lewej) i widok z góry (po prawej) samodzielnie wykonanego stojaka kolumnowego i bloku do ekstrakcji glukozynolanu. Wysokość: 100 mm, odległość między przesuniętymi otworami (do mocowania kolumn pipet Pasteura): 30 mm (oś x) x 15 mm (oś y). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Przygotowanie kolumn i probówek do mikrowirówek

  1. Przygotować jedną kolumnę na próbkę i pięć dodatkowych kolumn dla pięciu próbek referencyjnych sinigryny.
    1. W każdej szklanej pipecie umieść kawałek waty szklanej o wymiarach około 1 cm x 1 cm. Za pomocą drewnianego lub szklanego patyczka dociśnij watę szklaną do punktu, w którym pipeta się zwęża. Wata szklana powinna zapobiegać wypływaniu materiału kolumny, ale nie należy jej używać zbyt dużo, ponieważ spowolni to wymywanie kolumn. Podczas pracy z wełną szklaną należy nosić rękawice.
  2. Umieść kolumny na stojaku kolumnowym (patrz Rysunek 1). Umieść stojak kolumny w tacy laboratoryjnej (taca na odpady), aby wyłapać eluenty używane do kolejnych płukań kolumny.
  3. Odciąć pierwsze 5 mm od końcówki plastikowej końcówki do pipety o pojemności 1 ml i odpipetować 0,5 ml przygotowanego materiału kolumny (żel G-25 w wodzie, patrz krok 1.3) do każdej kolumny. Przed pipetowaniem dobrze wstrząsnąć butelką zawierającą materiał kolumny. Wyrzuć nieszczelne kolumny (materiał G-25 wybiegający przez warstwę wełny szklanej) i zastąp je nowymi.
    1. Po odpipetowaniu materiału kolumny do kolumn dodaj 1 ml ultraczystej wody, aby spłukać materiał.
  4. Przygotować jedną probówkę reakcyjną o pojemności 2 ml na próbkę i pięć probówek dla pięciu próbek referencyjnych sinigryny; oznaczyć je. Za pomocą igły preparacyjnej wykonaj otwory w nasadkach do późniejszego liofilizacji i umieść przygotowane probówki w bloku probówki dokładnie w taki sam sposób, jak kolumny (krok 2.2, patrz rysunek 1).

4. Ekstrakcja glukozynolanów

  1. Zważyć liofilizowany i drobno zmielony materiał roślinny (zwykle 50,0-100,0 mg suchej masy; końcowe stężenia glukozynolanu w ekstrakcie powinny mieścić się w zakresie krzywej odniesienia) z dokładnością do 0,1 mg w 2-mililitrowych, znakowanych, okrągłodennych probówkach reakcyjnych. Do każdej probówki dodać dwie małe metalowe kulki (o średnicy 3 mm) jako opóźniacze wrzące.
    UWAGA: Protokół może być również stosowany do świeżych, błyskawicznie mrożonych materiałów, które zostały zmielone w ciekłym azocie i przechowywane w stanie zamrożonym do czasu ekstrakcji. Zwiększ ilość ważonego materiału do ekstrakcji i procent MeOH w cieczy ekstrakcyjnej do 85%, aby skompensować rozcieńczenie przez wodę w materiałach19.
  2. Odpipetować 1 ml 70% MeOH do każdej probówki i krótko przetrząsnąć. Zamknij probówki i uszczelnij je nasadkami zabezpieczającymi przed umieszczeniem ich tak szybko, jak to możliwe, w gorącej łaźni wodnej (90-92 °C) na kilka minut (~5 min), aż 70% MeOH po prostu się zagotuje. Uwaga: Podczas tego kroku noś okulary ochronne!
  3. Umieścić probówki z próbkami w łaźni ultradźwiękowej na 15 minut. W międzyczasie wyjmij sulfatazę i pięć próbek referencyjnych sinigryny z zamrażarki, aby rozmrozić je w temperaturze pokojowej.
  4. Po ultrasonizacji należy odwirować probówki z próbkami o stężeniu 2 700 x g w wirówce stołowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej; w każdej probówce powinna powstać osadka. Dodać supernatanty do oznakowanych kolumn i odpipetować pięć próbek referencyjnych do oddzielnych kolumn.
    1. Podczas pipetowania supernatantów należy trzymać końcówkę daleko nad granulkami, aby uniknąć pipetowania materiałów roślinnych. Należy pamiętać, że w przypadku stosowania próbek suszonych objętość supernatantu będzie mniejsza niż 1,0 ml.
  5. Dodać 1 ml 70% MeOH do pozostałych granulek w probówkach z próbkami i zawirować probówki przed umieszczeniem ich w łaźni ultradźwiękowej na 15 minut. Ponownie odwirować probówki, jak w kroku 4.4, i dodać supernatanty do odpowiednich kolumn; ze względu na właściwości materiału kolumny, ujemnie naładowana grupa siarczanowa glukozynolanów zostanie specjalnie zatrzymana na kolumnie.
  6. Umyć kolumny ekstraktami w trzech sekwencyjnych krokach.
    1. Odpipetować 2 x 1 ml 70% MeOH na każdą kolumnę. Poczekaj, aż kolumna wyschnie, zanim dodasz następny 1 ml; Spowoduje to usunięcie z ekstraktów większej ilości związków niepolarnych (np. Chlorofilu).
    2. Wypłucz MeOH, dodając 1 ml ultraczystej wody do każdej kolumny.
    3. Odpipetować 2 x 1 ml 20 mM buforu NaOAc do każdej kolumny, aby stworzyć optymalne warunki dla reakcji sulfatazy.
  7. Wyjmij stojak z kolumnami z tacki na odpady i osusz nóżki stojaka chusteczką. Umieść stojak nad blokiem z fiolkami i oznaczonymi probówkami. Upewnij się, że każda końcówka kolumny znajduje się w odpowiedniej, oznaczonej probówce o pojemności 2 ml (patrz rysunek 1).
  8. Dodać 20 μl roztworu sulfatazy do kolumn. Upewnij się, że sulfataza dociera do powierzchni materiału kolumny. Odpipetować 50 μl buforu NaOAc na każdą kolumnę, aby wypłukać sulfatazę. Przykryj kolumny folią aluminiową i odstaw na noc.
    UWAGA: Ze względu na działanie sulfatazy, grupa siarczanowa zostanie usunięta, uwalniając desulfoglucozynolany z kolumny, aby mogły eluować się z wodą. Szczegółowy opis można znaleźć w Crocoll et al.19.
  9. Następnego dnia wymyć odsulfoglucozynolany przez pipetowanie 2 x 0,75 ml ultraczystej wody na każdą kolumnę. Gdy wszystkie kolumny wyschną, podnieś stojak kolumny i wyjmij go z rurek reakcyjnych.
    1. Zakryj probówki (upewnij się, że są otwory w nakrętkach) i zamroź je w ciekłym azocie lub w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 30 minut. Próbki liofilizować przez 12-24 godziny (w zależności od liczby próbek i pojemności liofilizatora) w celu usunięcia całej wody.
  10. Po liofilizacji ponownie rozpuść pozostałość w dokładnej objętości (zwykle 1,0 ml) ultraczystej wody. Przenieść próbki i pięć odniesień sinigryny do znakowanych fiolek HPLC. Próbki należy przechowywać w lodówce (4 °C) przez okres do dwóch tygodni lub w zamrażarce (-20 °C) przez okres do jednego roku przed analizą za pomocą HPLC.
  11. Pozostaw szklane kolumny do wyschnięcia pod maską na noc i wyrzuć je po wyschnięciu. Odzyskaj metalowe kulki z probówek na próbki użytych w kroku 4.5 w celu ponownego użycia i umieść probówki w koszu na odpady.

5. Pomiary HPLC pobranych próbek

  1. Rozdzielić glukozynolany w kolumnie C18 o odwróconych fazach (4,6 x 150 mm, 3 μm, 300 A) o gradiacji acetonitrylu i wody (patrz tabela 1) o przepływie 0,75 ml/min i temperaturze kolumny 40 °C. Przeprowadzić detekcję i oznaczanie ilościowe przy 229 nm.
  2. Zmierzyć odniesienia sinigryny w tej samej kolumnie, ale przy użyciu dostosowanej metody gradientu w celu zmniejszenia zużycia rozpuszczalnika (patrz tabela 2). Zacznij od wstrzyknięcia pięciu odniesień sinigryny, zaczynając od odniesienia o najniższym stężeniu. Następnie wstrzyknąć próbki, łącznie z wstrzyknięciem metanolu (ślepa próba) po co dziesiątej próbie, aby oczyścić kolumnę i zapobiec przenoszeniu pików.
pkt. Rozdział pkt. Rozdział Rozdział pkt.
Czas [min]Przepływ [mL/min]% A wody% B PKW
10,750Rozdział 98cyfra arabska
350,7506535
Rozdział 400,750Rozdział 98cyfra arabska
Temperatura kolumny 40 °C.

Tabela 1: Gradient acetonitrylu i wody do separacji glukozynolanu i analizy na HPLC z odwróconymi fazami.

pkt. pkt. pkt. pkt.
Czas [min]Przepływ [mL/min]% A wody% B PKW
10,750Rozdział 98cyfra arabska
100,75089,3Rozdział 10.7
110,750Rozdział 98cyfra arabska
Temperatura kolumny 40 °C.

Tabela 2: Skrócony gradient acetonitrylu i wody do ilościowego oznaczania pięciu odniesień do sinigryny używanych do ilościowego oznaczania glukozynolanów.

6. Identyfikacja i kwantyfikacja glukozynolanu

  1. identyfikacja
    1. Porównaj widma UV i czasy retencji pików w próbkach z dostępnymi na rynku, czystymi odniesieniami glukozynolanu. Na rysunku 2 przedstawiono przykłady widm UV z różnych klas glukozynolanu.
    2. Zidentyfikuj nieznane glukozynolany za pomocą wzorców referencyjnych lub na LC-MS18,19, jeśli to możliwe.
    3. Zidentyfikuj nieznane glukozynolany za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), jeśli to możliwe.
    4. Porównaj widma UV i czasy zatrzymywania pików z tymi na rysunku 2 i w tabeli 3, bazach danych lub odniesieniach do literatury.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Widma UV najczęstszych klas glukozynolanu. Widma absorpcyjne UV (200-350 nm) sześciu desulfoglucozynolianów (GSL), oparte na roztworach wykonanych z dostępnych na rynku związków odniesienia ekstrahowanych w sposób opisany tutaj, reprezentujących najpowszechniejsze klasy strukturalne. Podana jest nazwa zwyczajowa, nazwa konstrukcyjna (w nawiasach) i klasa konstrukcyjna. A) Sinigrin (2-propenyl GSL), alkenyl; B) glukoerucyna (4-metylotiobutyl GSL), tioalkenyl; C) glukorafanina (4-metylosulfinlybutyl GSL), sulfinyl; (D) glukobrascyna (indol-3-ylometyloGSL), indol; E) glukonasturtiina (2-fenyloetylo-GSL), aromatyczna; (F) sinalbina (4-hydroksybenzyl GSL), aromatyczna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Kwantyfikacji
    1. Zintegruj obszar pod pikami pięciu odniesień sinigryny i próbek.
    2. Obliczyć krzywą kalibracyjną pięciu zmierzonych odniesień sinigryny w oparciu o zintegrowany obszar. Użyj równania linii regresji (patrz równanie 1), aby obliczyć interpolowaną ilość glukozynolanów (patrz równanie 2).
    3. Aby obliczyć stężenie różnych glukozynolanów, pomnóż interpolowaną ilość (x) przez współczynnik odpowiedzi (M) dla wykrywania przy 229 nm z EC (1990)16, Buchner (1987)15, lub Brown et al. (1993)17; konsensus współczynników odpowiedzi najczęściej wykrywanych desulfoglukozynolanów podano w tabeli 3.
      UWAGA: Współczynniki odpowiedzi mogą się różnić w zależności od systemu - może to być powodem, dla którego różne referencje podają różne wartości (patrz Piśmiennictwo 15-17). Niemniej jednak wartości są w większości dość zbliżone i mieszczą się w podobnym zakresie z klasami konstrukcyjnymi. Zgodnie z konwencją należy ustawić współczynnik odpowiedzi niezidentyfikowanych glukozynolanów na 1, chociaż dla nieznanych glukozynolanów indolu o widmie UV podobnym do glukobrasicyny i innych glukozynolanów indolu (ryc. 2) wskazane byłoby użycie 0,25 jako czynnika odpowiedzi, aby uzyskać realistyczne oszacowanie stężenia (tabela 3).
    4. Aby obliczyć końcową ilość glukozynolanów (xt) w próbce, należy wziąć pod uwagę współczynnik rozcieńczenia (D) i masę próbki (w) użytą do analizy (patrz równanie 3).
      figure-protocol-3 (1)
      figure-protocol-4 (2)
      figure-protocol-5 (3)
      y = powierzchnia piku
      m = nachylenie referencyjnej 5-punktowej krzywej regresji
      c = punkt przecięcia linii regresji z osią y
      x = ilość glukozynolanów w ekstrakcie
      xt = stężenie glukozynolanów w próbce roślinnej
      D = współczynnik rozcieńczenia
      M = współczynnik odpowiedzi dla detekcji przy 229 nm od Buchnera (1987) lub Browna i in. (1993)
      w = masa próbki użytej do ekstrakcji

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda umożliwia wykrywanie i separację powszechnie występujących desulfoglucozynolianów we wszystkich klasach strukturalnych (Rysunek 3). Szkodliwa progoityna 2-hydroksyglukozynolanu pojawia się stosunkowo wcześnie w chromatogramie i jest wyraźnie oddzielona od korzystnego glukorafaniny glukozynolanu, jedynego suloksyglikozynolanu metylu w tej próbce. Sinigryna, glukonapina i glukobrassicanapin tworzą eluotropową serię glukozynolanu alkenylu o rosnącej długości łańcucha bocznego (odpowiednio C3, C4 i C5). Podobny szereg logiczny jest widoczny dla dwóch glukozynolanów metylotioalkenylu, glukoiberyny (C3) i glukoerucyny (C4). Piki trzech glukozynolanów indolu, glukobrasicyny i jej pochodnych 4-hydroksy i 1-metoksyglukozycyny (neoglukobrasicyny), są również wyraźnie oddzielone. Należy zauważyć, że piki neoglukozysicyny i glukoerucyny, a także glukonasturtyny, jedynego aromatycznego glukozynolanu w tej próbce, są szczególnie wysokie w tym ekstrakcie z kapustnych ze względu na dodanie ekstraktów z korzeni do mix9.

figure-results-1
Rysunek 3: Chromatogram ekstraktu glukozynolanu. Szczegół (1-32 min) chromatogramu HPLC uzyskanego z analizy połączonych próbek korzeni i pędów Brassica nigra, B. rapa i B. oleracea. Etykiety pików wskazują czas retencji i skróty zidentyfikowanych desulfoglucozynolianów (GSL). PRO = progoitryna (2-OH-3-butenyl GSL); RAPH = glukorafanina (4-metylosulfinlybutyl GSL); SIN = sinigryna (2-propenyl GSL), GNA = glukonapina (3-butenyl GSL); 4OH = 4-hydroksyglukozycyna; IBV = glukoiberweryna (3-metylotiopropyl GSL); GBN = glukobrassicanapina (4-pentenyl GSL); ERU = glukoerucyna (4-metylotiobutyl GSL); GBC = glukobrasicyna (indol-3-ylometyloGSL); NAS = glukonasturtyna (2-fenyloetylo-GSL); NEO = neoglukozicyna (1-MeOH-glukobrassicyna). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Glukozynolany metylosulfinylu o dłuższych łańcuchach, które są powszechnie spotykane w roślinie modelowej Arabidopsis, również wykazują serię eluotropową, co widać w ekstrakcie z korzenia Rorippa austriaca. Glukohesperalina (C6), glukozyberyna (C7), glukohirsutyna (C8) i glukoarabina (C9) pojawiają się w regularnych odstępach czasu na chromatogramie (ryc. 4). Wraz z widmami UV pików, takie eluotropowe szeregi logiczne mogą być używane do klasyfikacji i tymczasowej identyfikacji nieznanych glukozynolanów.

figure-results-2
Ryc. 4: Chromatogram (ramka 9-30 min) desulfoglucozynolianów w ekstrakcie z korzenia Rorippa austriaca. Etykiety pików wskazują czas retencji i skróty zidentyfikowanych desulfoglucozynolianów (GSL). HES = glukohesperyna (6-metylosulfinyloheksyl GSL); SBE = glukozyberyna (7-metylosulfinylheptyl GSL); GBC = glukobrasicyna (indol-3-ylometyloGSL); HIR = glukohirsutyna (8-metylosulfinlyoktyl GSL); ARA = glukoarabin (9-metylosulfinylnonylglukozynolan glinylu); NEO = neoglukozicyna (1-MeOH-glukobrassicyna). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
Nazwa zwyczajowaStruktura łańcucha bocznegoRt (min)*229 nmodniesienie#
Glukozynolany alifatyczne
GlukokapparynaMetylu3,51brązowy
Sinigrin powiedział:2-propenylRozdział 5.51Brązowy, EC
Glukonapina3-butenylPytanie 9,5Pytanie 1.11Ec
Glukobrassicanapin4-pentenylRozdział 13,5Pytanie 1,15Ec
Glucoiberverin (Glukoiberweryna)3-metylotiopropylRozdział 10,90,8brązowy
Glukoerucyna4-metylotiobutyl14,00,9brązowy
Glukoiberyna3-metylosulfinylopropyl3.7Rozdział 1.2brązowy
Glukorafanina4-metylosulfinylbutylPytanie 4.90,9brązowy
Glukolizyna5-metylosulfinylpentyl7,60,9brązowy
Glukohesperyna6-metylosulfinyloheksylPytanie 10,51brązowy
Glusozyberyna7-metylosulfinylheptylRozdział 13,51brązowy
Glukohirsutyna8-metylosulfinyloctylRozdział 16,81.1brązowy
Glukoarabin9-metylosulfinylnonyl20,51
Glukocheirolin3-metylosulfonylopropylRozdział 4.20,9brązowy
Progoitryn2(R)-OH-3-butenylRozdział 4.5Godzina 1,09Buchner, Komisja Europejska
Glukonapoleiferyna2-OH-5-pentenyl8.31Ec
Glukozynolany indolu
4-hydroksyglukozicyna4-hydroksyindol-3-ylometyloRozdział 11.20,28Buchner, Komisja Europejska
Glukobrasicynaindol-3-ylometyloRozdział 15,30,29Buchner, Komisja Europejska
4-metoksyglukobrasicyna4-metoksyindol-3-ylometyloRozdział 18,20,25Buchner, Komisja Europejska
Neoglukozycyna1-metoksyindol-3-ylometylo22,50,2Buchner, Komisja Europejska
glukozynolany aromatyczne
Sinalbin4-hydroksybenzylRozdział 8.10,5Buchner Buchner
Glusozybaryna2(R)-OH-2-fenyloetyloRozdział 12.10,95Zobacz dalej
Glukobarbaryna2(S)-OH-2-fenyloetyloPytanie 12,70,95Buchner Buchner
GlukotropaeolinaBenzylowegoRozdział 13,80,95Buchner, Komisja Europejska
Glukonasturtiina2-fenyloetylo18,00,95Buchner, Komisja Europejska
nieznane - alifatyczne/aromatyczne widmo podobne do UV1Ec
Nieznany - Widmo indolopodobne0,25Ec
* przybliżony czas retencji (Rt) zaokrąglony do najbliższych 0,1 minuty (± 0,3 minuty w zależności od kolumny, jakość eluentu). Czasy retencji są określane na platformach HPLC ThermoFisher/Dionex Ultimate wyposażonych w kolumnę C18 (150 x 4,6 mm, wielkość cząstek 3 mikrometry) oraz kolumnę wstępną C18 (10 x 4,6 mm, wielkość cząstek 5 mikrometrów) z programem gradientu jak w tabeli 1.
# Referencje dla czynników odpowiedzi: Buchner, R. w Glukozynolany w rzepaku (red. J.P. Wathelet) 50-58 (Martinus Nijhoff Publishers, 1987); Brown, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, M. & Gershenzon, J. Zmienność akumulacji glukozynolanu między różnymi narządami i etapami rozwoju Arabidopsis thaliana. Fitochemia. 62 (3), 471-481, doi:10.1016/S0031-9422(02)00549-6, (2003); EC. Nasiona oleiste - oznaczanie glukozynolanów Wysokosprawna chromatografia cieczowa. Dziennik Urzędowy Wspólnot Europejskich. L 170/28. Załącznik VIII 03.07.27-34 (1990).

Tabela 3: Czynniki odpowiedzi najczęściej spotykanych desulfo-glukozynolanów w ekstraktach roślinnych i ich przybliżone czasy retencji w kolumnach C18. Eluenty, gradient, temperatura kolumny i natężenie przepływu, jak w tabeli 1.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Największymi zaletami tej uznanej i szeroko stosowanej metody jest to, że jest solidna, dość prosta i stosunkowo tania w przeliczeniu na próbkę. Większość sprzętu potrzebnego do ekstrakcji i analizy powinna być dostępna w standardowym laboratorium lub może być zbudowana samodzielnie, z wyjątkiem HPLC-PDA. Kolejną zaletą jest to, że desulfoglucozynolany rozpuszczone w wodzie są chemicznie dość stabilne, gdy są przechowywane w chłodnych i hermetycznych fiolkach (HPLC), dzięki czemu ekstrakty można łatwo wysłać do analizy HPLC w inne miejsce. W przeciwieństwie do platform LC-MS, które wymagają specjalistycznego szkolenia i rozległego doświadczenia praktycznego w zarządzaniu oprogramowaniem i analizie danych, HPLC-UV/PDA można łatwo uruchomić po krótkim okresie szkolenia. To nie tylko obniża koszty zabiegu, ale także sprawia, że metoda ta jest bardziej dostępna dla szerokiego grona naukowców, w tym studentów.

Ogólnie rzecz biorąc, przy starannym przestrzeganiu opisanych powyżej procedur powinno wystąpić kilka problemów. Ogólnie rzecz biorąc, piki glukozynolanu są bardzo dobrze oddzielone w chromatogramie. Jeśli tak nie jest, program gradientu można dostosować poprzez zmniejszenie szybkości wzrostu acetonitrylu w eluencie. Alternatywnie, zbudowanie nowej kolumny wstępnej (200-500 wstrzyknięć) lub kolumny (1500-2000 wstrzyknięć) może rozwiązać ten problem. Niekiedy chromatogramy pojedynczych próbek w partii mogą wykazywać bardzo małe piki lub nie wykazywać ich wcale. Jest to zwykle spowodowane błędami pipetowania podczas dodawania sulfatazy (np . kolumna została pominięta lub sulfataza nie została prawidłowo wypłukana do kolumny). Alternatywnie, stężenie glukozynolanu w materiałach doświadczalnych mogło być niższe niż oczekiwano, a do ekstrakcji użyto zbyt małej ilości materiału. W tym drugim przypadku objętość wstrzykniętego ekstraktu można zwiększyć do 100 μl lub zagęścić dokładną podwielokrotność (np . 800 μl) ekstraktu. To ostatnie można osiągnąć poprzez liofilizację ekstraktu, rozpuszczenie pozostałości w mniejszej objętości (np . 100 μl) wody i ponowne wstrzyknięcie przy użyciu tej samej krzywej odniesienia. W obliczeniach dotyczących pierwotnego stężenia ekstraktu liczby należy pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia. Jeśli to nie rozwiąże problemu, materiały należy ponownie wydobyć przy użyciu większej ilości materiału wyjściowego. Jeżeli jest to więcej niż 100 mg, objętość rozpuszczalników ekstrakcyjnych i rozmiar probówek należy dostosować proporcjonalnie, aby utrzymać wydajność ekstrakcji.

Dodatkowym atutem jest to, że metoda ta została dobrze zwalidowana. Wynika to z faktu, że została ona opisana jako standardowa metoda oznaczania ilościowego glukozynolanów w rzepaku, dla której procedury i dokładność zostały potwierdzone w kilku laboratoriach16. Ponadto podłoże genetyczne, biosynteza i funkcje biologiczne glukozynolanów są przedmiotem intensywnych badań, m.in. nad modelowym gatunkiem roślin Arabidopsis thaliana 4,6,12. W związku z tym wiele czynników odpowiedzi dla dokładnej kwantyfikacji desulfoglucozynolianów w odniesieniu do sinigryny jest dobrze zdefiniowanych i publicznie dostępnych15,17. Mimo że protokoły oparte na LS-MS są bardziej przepustowe, bardziej czułe i są w stanie (wstępnie) zidentyfikować glukozynolany, dla których nie są dostępne żadne normy 18,19,20, brak uniwersalnych współczynników odpowiedzi dla LC-MS ogranicza dokładną kwantyfikację stężeń glukozynolanu18. Co więcej, metody te zwykle nie obejmują etapu liofilizacji, a ilość wody w świeżym materiale roślinnym nie jest uwzględniana w obliczeniach, co utrudnia dokładne określenie ilościowe. Wreszcie, ponieważ nasza metoda ekstrakcji obejmuje etap oczyszczania i zatężania oparty na kolumnie, może być również stosowana do "brudnych" próbek o niskim stężeniu glukozynolanów, takich jak gleby21.

W porównaniu z metodami opartymi na LC-MS, które zwykle ekstrahują świeżo zamrożone materiały, używają 96-dołkowych płytek do ekstrakcji i nie zawierają krokusulfatazy 18,19, nasza metoda jest stosunkowo czasochłonna i pracochłonna. Dzięki stojakom kolumnowym opisanym w tym artykule, jedna osoba może pobrać około 100-150 próbek w ciągu jednego dnia. Elucja (następnego dnia), liofilizacja (przez noc) i ponowne rozpuszczenie mogą nastąpić w ciągu następnych dwóch dni. Dzięki zautomatyzowanemu wtryskiwaczowi HPLC, czasowi pracy i równoważenia wynoszącemu 40-45 minut na wstrzyknięcie oraz braku nieprzewidzianych zdarzeń, uzyskanie danych dla tego zestawu próbek zajęłoby 3-4 dni. W przypadku gdy oprogramowanie HPLC umożliwia automatyczną kwantyfikację na podstawie krzywej sinigryny, ręczna kontrola chromatogramów i przypisania pików dla 100 próbek może zająć tylko kolejną 1 lub 2 godziny, zanim dane będą mogły być wykorzystane do analiz statystycznych.

Pomimo rosnącej dostępności wzorców glukozynolanu, tylko niewielka część z ponad 130 kandydatów może być obecnie kupiona na rynku. Jednak z kilkoma odniesieniami dla każdej z klas biosyntezy; dostęp do baz danych literaturowych określających związki występujące wcześniej w gatunkach roślin (np. Fahey i wsp.Rozdział 22); podstawowa znajomość zasad chromatograficznych, takich jak logika szeregów eluotropowych (np. dla rosnącej liczby C w łańcuchu bocznym w związkach alifatycznych, rysunki 3 i 4); oraz walidację pojedynczych próbek na LC-MS19 lub izolowanych glukozynolanów na NMR23, można łatwo przezwyciężyć to ograniczenie. Większość protokołów analiz glukozynolanu wykorzystuje wewnętrzne krzywe odniesienia (tj. określone stężenie do ekstrakcji sinigryny lub sinalbiny do rozpuszczalnika ekstrakcyjnego 16,17,19). Zasadniczo wewnętrzne krzywe odniesienia są bardziej odpowiednie do korygowania błędów przetwarzania poszczególnych próbek, a tym samym teoretycznie zapewniają wyższą precyzję. Pomimo tej przewagi preferujemy stosowanie pięciopunktowej zewnętrznej krzywej odniesienia, ponieważ często analizujemy różne dzikie gatunki, z których niektóre zawierają wysoki poziom sinigryny (np. Brassica nigra24) lub sinalbiny (np. Sinapis alba25), dwóch odniesień glukozynolanu, dla których dostępne są czynniki odpowiedzi. Co więcej, dodanie wewnętrznych wzorców do każdej próbki zwiększa koszt analiz, ponieważ wzorce referencyjne glukozynolanu wysokiej jakości są zwykle dość drogie.

Podsumowując, pomimo czasochłonnych kroków, protokół ten zapewnia prostą i dostępną metodę ekstrakcji i ilościowego oznaczania glukozynolanów w próbkach roślinnych. Należy jednak wziąć pod uwagę, że poziomy glukozynolanu same w sobie są jedynie wskaźnikiem potencjalnej aktywności biologicznej, postrzeganej jako konieczność reakcji z mirozynazą, a różnice w produktach reakcji mogą wynikać z pojedynczego glukozynolanu11. W celu potwierdzenia znaczenia biologicznego należy przeprowadzić testy walidacyjne.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMvD dziękuje dr Michaelowi Reicheltowi (Instytut Ekologii Chemicznej im. Maxa Plancka, Jena, Niemcy) za dostarczenie pierwszych próbek referencyjnych, kiedy zaczęła stosować tę metodę 16 lat temu. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, Holandia), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, Holandia) i Christian Ristok (iDiv, Lipsk) są doceniani za ulepszenie protokołu na przestrzeni lat. Mirka Macel i Martine Huberty (Uniwersytet w Tybindze, Niemcy) zostały uznane za upoważnione do wykorzystania chromatogramu Rorippa. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Niemieckiego Centrum Integracyjnych Badań nad Bioróżnorodnością (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, ufundowane przez Niemiecką Fundację Badawczą (FZT 118).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Metanol HiPerSolv CHROMANORM® klasa gradientowa do HPLC VWR20864.320
Octan sodu (NaOAc)Sigma-AldrichW302406-1KG-K
HClVWR1.09057.1000
SephadexSigma-AldrichA25120-10G
(−)-Sinigrin hydrate
z chrzanu 		Sigma-AldrichS1647-500MG
Sulfataza arylowaSigma-AldrichS9626-10KU
EtanolVWR20816.298
Pipeta PasteuraCarl Roth4518.1
Wełna szklanaCarl Roth7377.1
Szklany/drewniany patyczekVWRHERE1080766
2 ml probówki reakcyjneVWR211-2120
Igła preparcyjnaCarl RothKX93.1
Naczynia laboratoryjne RotilaboCarl Roth0772.1Taca na odpady
Klipsy uszczelniające RotilaboCarl RothN217.1
Liofilizator Freezone 12 LLabconco7960030
Acetonitryl o super gradiencieVWR83639.320
Łaźnia wodnaVWR462-5112
Kąpiel ultradźwiękowaFisher ScientificFB 15061
Elektroda PHThermo Fisher ScientificSTARA2115
Wirówka Heraeus Multifuge X1Thermo Fisher Scientific75004210
Kolumna wstępnaThermo Fisher Scientific69697Kolumna C18 (4,6 x 10 mm, 5 &mikro; m, 300 & Aring ;) 
Kolumna Acclaim 300Thermo Fisher Scientific60266Kolumna C18 (4,6 x 150 mm, 3 i mikro; m, 300 & Aring ;) 
HPLC Ultimate 3000Thermo Fisher Scientificz piecem kolumnowym i detektorem UV lub PDA
Kolba 1 000 mlVWR215-1595
Związki referencyjne glukozynolanuPhytoplanróżnehttp://www.phytoplan.de/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartmann, T. From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism. Phytochemistry. 68 (22-24), 2831-2846 (2007).
  2. Will, H., Laubenheimer, A. Ueber das Glucosid des weissen Senfsamens. Justus Liebigs Annalen der Chemie. 199 (1), 150-164 (1879).
  3. Agerbirk, N., Olsen, C. E. Glucosinolate structures in evolution. Phytochemistry. 77, 16-45 (2012).
  4. Halkier, B. A., Gershenzon, J. Biology and biochemistry of glucosinolates. Ann Rev Plant Biol. 57, 303-333 (2006).
  5. Sønderby, I. E., Geu-Flores, F., Halkier, B. A. Biosynthesis of glucosinolates - gene discovery and beyond. TIPS. 15 (5), 283-290 (2010).
  6. Kliebenstein, D. J., et al. Genetic control of natural variation in Arabidopsis glucosinolate accumulation. Plant Physiol. 126 (2), 811-825 (2001).
  7. van Leur, H., Raaijmakers, C. E., van Dam, N. M. A heritable glucosinolate polymorphism within natural populations of Barbarea vulgaris. Phytochemistry. 67 (12), 1214-1223 (2006).
  8. Kelly, P. J., Bones, A., Rossiter, J. T. Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea. Planta. 206 (3), 370-377 (1998).
  9. van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A. Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems. Phytochem Rev. 8 (1), 171-186 (2009).
  10. Ratzka, A., Vogel, H., Kliebenstein, D. J., Mitchell-Olds, T., Kroymann, J. Disarming the mustard oil bomb. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (17), 11223-11228 (2002).
  11. Wittstock, U., Kliebenstein, D. J., Lambrix, V., Reichelt, M., Gershenson, J. Integrative Phytochemistry: From ethnobotany to molecular ecology: Recent Advances in Phytochemistry. Romeo, J. T. 37, Ch. 5 Pergamon (2003).
  12. Hopkins, R. J., van Dam, N. M., van Loon, J. J. A. Role of glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic interactions. Ann Rev Entomol. 54 (1), 57(2009).
  13. Kliebenstein, D. J., Gershenzon, J., Mitchell-Olds, T. Comparative quantitative trait loci mapping of aliphatic, indolic and benzylic glucosinolate production in Arabidopsis thaliana leaves and seeds. Genetics. 159 (1), 359-370 (2001).
  14. Mithen, R., Bennett, R., Marquez, J. Glucosinolate biochemical diversity and innovation in the Brassicales. Phytochemistry. 71 (17-18), 2074-2086 (2010).
  15. Buchner, R. Glucosinolates in rapeseed. Wathelet, J. P. , Martinus Nijhoff Publishers. 50-58 (1987).
  16. Oil seeds - determination of glucosinolates High Perfomance Liquid Chromatography. Official Journal of the European Communities. , L 170/28. Annex VIII 03.07 27-34 (1990).
  17. Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M., Gershenzon, J. Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 62 (3), 471-481 (2003).
  18. Glauser, G., Schweizer, F., Turlings, T. C. J., Reymond, P. Rapid Profiling of Intact Glucosinolates in Arabidopsis Leaves by UHPLC-QTOFMS Using a Charged Surface Hybrid Column. Phytochem Analysis. 23 (5), 520-528 (2012).
  19. Crocoll, C., Halkier, B. A., Burow, M. Current Protocols in Plant Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
  20. Griffiths, D. W., Bain, H., Deighton, N., Botting, N. P., Robertson, A. A. B. Evaluation of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry for the identification and quantification of desulphoglucosinolates. Phytochem Analysis. 11 (4), 216-225 (2000).
  21. Gimsing, A. L., Kirkegaard, J. A. Glucosinolates and biofumigation: fate of glucosinolates and their hydrolysis products in soil. Phytochem Rev. 8 (1), 299-310 (2009).
  22. Fahey, J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P. The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants. Phytochemistry. 56, 5-51 (2001).
  23. de Graaf, R. M., et al. Isolation and identification of 4-α-rhamnosyloxy benzyl glucosinolate in Noccaea caerulescens showing intraspecific variation. Phytochemistry. 110 (0), 166-171 (2015).
  24. van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea. Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).
  25. Gols, R., et al. Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions. Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glucosinolate ExtractionHPLC AnalysisMethanol Water ExtractionIon Exchange PurificationSulfatase TreatmentDesulfoglucosinolate ElutionFreeze Drying ProcessRetention Time ComparisonUV Spectra DetectionSinigrin Reference Curve

Related Articles