Artykuł metodologiczny

Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz

DOI:

10.3791/55440

⸱

8 marca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine and Radiobiology, Université de Sherbrooke, 2Sherbrooke Molecular Imaging Center (CIMS), Université de Sherbrooke, 3Sherbrooke Institute of Pharmacology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptydy pochodzenia wirusowego sprzężone z koniugatami przeciwciał (AC) to podejście, które nabiera rozpędu ze względu na potencjał dostarczania ładunków molekularnych ze zwiększoną akumulacją komórek nowotworowych. Wykorzystując powszechne metody oceny koniugacji peptydów, akumulacji wewnątrzkomórkowej AC i ładunku oraz celowania w guz, protokół ten pomaga naukowcom w kluczowych początkowych fazach rozwoju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koniugaty przeciwciał (AC) zmodyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusów są potencjalnie potężną klasą czynników dostarczających komórki nowotworowe dla ładunków molekularnych stosowanych w leczeniu raka i obrazowaniu, ze względu na zwiększoną akumulację komórkową w stosunku do obecnych AC. Podczas wczesnego rozwoju AC in vitro techniki fluorescencyjne i testy radioimmunologiczne są wystarczające do określenia lokalizacji wewnątrzkomórkowej, wydajności akumulacji i swoistości komórek docelowych. Obecnie nie ma konsensusu co do znormalizowanych metod przygotowania komórek do oceny wewnątrzkomórkowej akumulacji i lokalizacji AC. Wstępne testy AC zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusa mają kluczowe znaczenie, zwłaszcza jeśli skonstruowano kilku kandydatów. Określenie akumulacji wewnątrzkomórkowej za pomocą fluorescencji może być zakłócone przez sygnał tła z AC na powierzchni komórki i komplikować interpretację akumulacji. W przypadku testów radioimmunologicznych zazwyczaj leczone komórki są frakcjonowane, a radioaktywność w różnych przedziałach komórkowych mierzona. Jednak liza komórek różni się w zależności od komórki i często przedziały jądrowe i cytoplazmatyczne nie są odpowiednio izolowane. Może to prowadzić do uzyskania wprowadzających w błąd danych na temat właściwości dostarczania ładunku. Dożylne wstrzyknięcie znakowanych radioaktywnie modyfikowanych peptydami wirusa AC u myszy z nowotworem, a następnie obrazowanie radionuklidów jest potężną metodą określania właściwości celowania w guz i dostarczania ładunku w fazie rozwoju in vivo. Jest to jednak stosunkowo niedawny postęp i niewiele grup oceniło w ten sposób AC zmodyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusów. Opisujemy przetwarzanie leczonych komórek w celu dokładniejszej oceny akumulacji AC zmodyfikowanej peptydem pochodzącym z wirusa przy użyciu mikroskopii konfokalnej i testów radioimmunologicznych. W szczególności metoda trypsynizacji komórek w celu usunięcia AC związanych z powierzchnią komórki. Udostępniamy również metodę poprawy frakcjonowania komórkowego. Wreszcie, protokół ten zapewnia metodę in vivo wykorzystującą pozytonową tomografię emisyjną (PET) do oceny początkowych właściwości celowania w guz u myszy z nowotworem. Jako przykładowy ładunek użyteczny w tym protokole używamy radioizotopu 64Cu (t1/2 = 12,7 h).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1,2. Ponadto opracowywane są również AC transportujące izotopy promieniotwórcze (potocznie nazywane radioimmunokoniugatami). Klimatyzator transportujący radioizotop do obrazowania jest dopuszczony do identyfikacji przerzutów raka gruczołu krokowego 3. Z wieloma innymi terapeutycznymi AC złożonymi do zatwierdzenia 4, optymizm jest wysoki co do przyszłości AC w celu poprawy opieki onkologicznej 5.

Mimo to, podczas dostarczania chemioterapeutyków lub radioizotopów, AC mają trudności z efektywnym gromadzeniem tych ładunków wewnątrz komórek docelowych. Ten aspekt w wielu przypadkach znacząco przyczynia się do niezdolności AC do zapewnienia długotrwałego przeżycia wolnego od choroby lub obrazowania guza z wysokim kontrastem 6,7. Ogólnie rzecz biorąc, gdy AC zwiążą swój docelowy antygen, są internalizowane w procesie znanym jako endocytoza za pośrednictwem receptora. Prądy przemienne są następnie uwięzione w endosomach i transportowane do lizosomów w celu degradacji i uwolnienia ładunku 8. Proces transportu wewnątrzkomórkowego stanowi wyzwanie dla AC, aby osiągnąć wysoką swoistość ładunku i skuteczność przeciwko docelowym komórkom nowotworowym. Na przykład wiele antygenów, takich jak Her2 (cel terapeutyczny AC Trastuzumab-emtanzyna) może przetwarzać do 85% związanych przeciwciał w ciągu pierwszych 30 minut 9. Ponadto, gdy dojdzie do degradacji, uwolnione chemioterapeutyki i radioizotopy mogą być aktywnie eksportowane przez zwiększoną ekspresję i/lub aktywność białek transportowych związanych z błoną 10,11. Degradacja lizosomów utrudnia również dostarczanie nowych ładunków biologicznych, takich jak enzymy terapeutyczne i oligonukleotydy, które można dezaktywować 12,13. W istocie, komórka rakowa jest wysoce skuteczna w znoszeniu niezbędnej wewnątrzkomórkowej akumulacji ładunków dostarczanych przez AC.

Ten protokół opisuje, jak wdrożyć koncepcję AC sprzężonych z peptydami pochodzącymi od wirusa, szczególnie w celu uniknięcia uwięzienia endosomu i lokalizacji w jądrze komórkowym. Przy takim wyrafinowaniu w manipulowaniu systemami komórkowymi gospodarza, nie jest zaskakujące, że rozwój białek i peptydów pochodzących z wirusów jako potencjalnych biofarmaceutyków od dawna jest zakorzeniony w badaniach terapeutycznych 14. Przez miliony lat wirusy ewoluowały, aby zdobyć wyjątkowy zbiór białek zdolnych do wykorzystania normalnych fizjologicznych systemów komórkowych ssaków w celu skutecznego wniknięcia do komórek gospodarza. W przypadku wirusów, które są internalizowane przez endocytozę za pośrednictwem receptora, mają one również trudności z ucieczką przed transportem do lizosomu, gdzie atak zlokalizowanego stężenia proteaz może być problematyczny dla przetrwania. Dobrze scharakteryzowanym peptydem pochodzenia wirusowego, wykorzystywanym w dostarczaniu leków do ucieczki z uwięzienia endosomu, jest białkiem transaktywatora transkrypcji (Tat) ludzkiego wirusa niedoboru odporności 15. Tat jest w stanie uciec z uwięzienia endosomu poprzez wyczuwanie niskiego pH, w którym to momencie zachodzą zmiany konformacyjne białka, które umożliwiają Tat wstawienie się i zakłócenie błony endosomalnej 16. Powoduje to, że koniugaty Tat-payload są w stanie uzyskać dostęp do cytoplazmy. Drugim elementem manipulacji wirusowej związanym z tym protokołem jest podejście stosowane do dostarczania genów terapeutycznych i leków do jądra 17. Wirusy ewoluowały, aby skutecznie manipulować maszynerią komórek gospodarza w celu przejścia przez błonę jądrową poprzez przejście przez kompleks porów jądrowych (NPC). Makrocząsteczki komórkowe zawierają (lub wiążą się z białkami, które zawierają) sygnały lokalizacji jądrowej (NLS) niezbędne do wiązania się z białkami transportu jądrowego (np. karioferyny α i β), które zapewniają wymagane ruchy przez NPC. Wirusy rozwinęły białka zawierające sekwencje NLS, które zapewniają im zdolność do wykorzystywania białek transportowych komórek gospodarza do transportu do jądra 18.

Wiele AC zostało wcześniej sfunkcjonalizowanych peptydami pochodzącymi z Tat- i NLS i przetestowanych pod kątem ich zdolności do gromadzenia się wewnątrz komórek rakowych i do zwalczania nowotworów 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 (Tabela 1). Badania dostarczające ładunki cytotoksyczne wykazały, że AC zmodyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusa są w stanie znacznie zwiększyć akumulację komórkową, cytotoksyczność i zabijanie guzów w porównaniu z niezmodyfikowanymi AC 22,26. Cechą wspólną dla tej nowatorskiej klasy AC jest ich budowa. Zazwyczaj peptydy zawierają końcową cysteinę zapewniającą wolną grupę sulfhydrylową. MAb są najpierw poddawane reakcji z nierozszczepialnym dwufunkcyjnym środkiem sieciującym zawierającym grupy N-hydroksysukcynimidu (NHS) i maleimidowe na przeciwległych końcach. Estry NHS reagują z aminami pierwszorzędowymi na mAb, tworząc wiązania amidowe. Przereagowany mAb z wolnymi grupami maleimidowymi jest następnie poddawany reakcji z grupami sulfhydrylowymi na peptydach, tworząc wiązanie tioestrowe, a tym samym łącząc peptyd i mAb. Chociaż homobifunkcyjne środki sieciujące były używane 28, heterobifunkcjonalne środki sieciujące są częściej używane w budowie peptydów pochodzących z wirusów-AC 22,23,26,31,32. Protokół ten w szczególności wykorzystuje środek sieciujący sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan (sulfo-SMCC) ze względu na łatwość użycia i dlatego, że jest on stosowany w zatwierdzonym koniugacie przeciwciało-lek Trastuzumab-emtanzyna oraz w wielu peptydach-AC pochodzących z wirusów 8,22,23,26,31,32. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE) jest podstawową metodą wstępnego określania wydajności koniugacji i półilościowego określania liczby peptydów na mAb. Mikroskopia konfokalna z użyciem znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowego specyficznego dla mAb jest zazwyczaj metodą wstępnej oceny właściwości dystrybucji wewnątrzkomórkowej AC zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusa. Do tej pory radioizotopy są głównymi ładunkami dostarczanymi przez AC modyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusów. Izotopy promieniotwórcze są korzystne, ponieważ radioaktywność w komórkach można łatwo określić ilościowo za pomocą zliczania promieniowania gamma. Ponadto AC, które są tłumaczone na mysie modele ludzkich nowotworów, zapewniają naukowcom możliwość oceny celowania w guz przy użyciu modalności obrazowania molekularnego, takich jak tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów i pozytonowa tomografia emisyjna (PET) 23,32,33. Ogólnie rzecz biorąc, metody konstruowania i walidacji stosowane głównie przez badaczy zapewniają bardzo dobrą ocenę AC zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusa na początkowym etapie rozwoju, aby skutecznie wnikać i dostarczać ładunek do komórek docelowych i do guzów.

Zmodyfikowane przez Tat- i NLS AC oświetliły kluczowe obszary dla dalszej poprawy dostarczania ładunku do wnętrza komórek rakowych i do guzów. W odniesieniu do AC zmodyfikowanych przez NLS, wydajność akumulacji wewnątrzkomórkowej może być niewielka 23,31,34. Nieefektywna akumulacja wewnątrzkomórkowa jest spowodowana ciągłym uwięzieniem endosomalnym. Celowanie w guz in vivo można również zmniejszyć zarówno za pomocą AC zmodyfikowanych Tat, jak i NLS. Aktywne sekwencje Tat i NLS zawierają kilka dodatnio naładowanych reszt. Po przyłączeniu do mAb, całkowity ładunek kationowy może być znacznie zwiększony 35. W konsekwencji AC zmodyfikowane przez Tat i NLS zwiększyły wychwyt w zdrowych tkankach i zwiększyły szybki klirens krwi.

Nasza grupa opracowała złożony związek składający się z kwasu cholowego połączonego z NLS (ChAcNLS; Rysunek 1). AC modyfikowane ChAcNLS są w stanie zwiększyć wewnątrzkomórkową akumulację dostarczonych izotopów promieniotwórczych i poprawić celowanie guza w porównaniu do zmodyfikowanych NLS i tradycyjnych AC 33,34. Mechanizm stojący za kwasem cholowym jest inspirowany zdolnością wybranych wirusów bezotoczkowych, które nie mogą polegać na fuzji błonowej, do wykorzystania kwasu cholowego do wywołania ucieczki endosomu poprzez tworzenie ceramidu. Na przykład wirus jelitowy świń rekrutuje kwas cholowy, który aktywuje sfingomielinazę, która katalizuje hydrolizę sfingomieliny do ceramidu 36,37,38. To destabilizuje błonę endosomalną i umożliwia ucieczkę wirusa. Tak więc kwas cholowy jest kolejnym składnikiem pochodzącym z wirusa, który uzupełnia NLS.

Ponieważ ta dziedzina się naprzód i w przyszłości pojawiają się postępy w dostarczaniu ładunków przez AC zmodyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusa, jest to odpowiedni czas, aby dostarczyć wizualne demonstracje ich biochemicznych i funkcjonalnych cech podczas początkowego rozwoju. W tym miejscu opisujemy nasz protokół wstępnej oceny AC modyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusa w celu skutecznego, ale prostego określenia akumulacji wewnątrzkomórkowej i celowania w guz na wczesnym etapie rozwoju. Jako przykładowe systemy modelowe wykorzystujemy dostępne na rynku mAb 7G3 i A14. Procedura 1 opisuje użycie SDS-PAGE jako metody, która pozwala na podejmowanie decyzji "go/no go" dla skonstruowanych AC. Procedura 2 opisuje metodę wykorzystującą trypsynizację pozwalającą na lepszą wizualizację wewnątrzkomórkowej dystrybucji i akumulacji AC. Procedura 3 opisuje metodę ulepszonego frakcjonowania wewnątrzkomórkowego w celu dokładnego określenia lokalizacji jądrowej. W tej procedurze wykorzystujemy ładunek 64Cu (t1/2 = 12,7 h), ponieważ jest on podatny na wypływ komórkowy i jest emiterem pozytonów 10. W związku z tym Procedura 4 opisuje charakterystykę ukierunkowania guza in vivo za pomocą obrazowania PET w celu wizualizacji wychwytu guza w stosunku do tła (tj. zdrowych tkanek niedocelowych) i określenia, czy przykładowy AC może specyficznie i skutecznie celować w nowotwory. Metody te są wystarczające dla badaczy opracowujących AC zmodyfikowane peptydami pochodzącymi z wirusa w celu zidentyfikowania kandydatów do dalszego rozwoju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane doświadczenia na zwierzętach in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem i zgodnie z etycznymi wytycznymi Komitetu Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke.

1. Koniugacja peptydów przeciwciał

UWAGA: ChAcNLS może być syntetyzowany u dowolnego komercyjnego producenta peptydów lub na platformie usług syntezy peptydów powiązanej z uniwersytetem. Syntezę ChAcNLS można znaleźć w odwołaniu 34. Do procedur 1 i 2 należy użyć mAb 7G3, który jest specyficzny dla antygenu białaczki IL-3Rα 39.

  1. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotować roztwór 7G3 o stężeniu 10 mg/ml (~1 mg przeciwciała całkowitego) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,6.
  2. Rozpuścić sulfo-SMCC w dimetylosulfotlenku (DMSO) w stężeniu 5-10 mM. Najlepiej sprawdza się dokładne wirowanie roztworu, aby osiągnąć całkowite rozpuszczenie.
  3. Dodać do probówki zawierającej 7G3 rozpuszczony roztwór sulfo-SMCC (zwykle między 5-20 μl, w zależności od pożądanego stosunku molowego sulfo-SMCC-do-7G3). Zaleca się badanie proporcji sulfo-SMCC-do-7G3 10-, 25- i 50-do-1. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Oczyść i zagęścić 7G3 derywatyzowany maleimidem za pomocą urządzenia do ultrafiltracji i wymiany buforu w PBS, pH 7,0. Wirować przy 8 000 x g przez około 5 minut. Wylej przepływ i napełnij PBS, pH 7,0 i ponownie odwiruj.
    1. Wykonaj to 7-8 razy, aby całkowicie wymienić bufor. Odzyskaj skoncentrowane białko 7G3, umieszczając urządzenie filtrujące do góry nogami w czystej probówce do mikrowirówki. Wirować przez 2 minuty przy 1 000 x g. Objętość odzysku powinna wynosić około 0,3 ml
  5. Do probówki zawierającej aktywowany maleimidem 7G3 dodać 2-krotny molowy nadmiar ChAcNLS w stosunku do stosunku sulfo-SMCC do 7G3 użytego w poprzednim etapie i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Na przykład, jeśli zastosowano stosunek 10 do 1 sulfo-SMCC do 7G3, użyj stosunku 20 do 1 ChAcNLS do 7G3. Całkowita objętość nie powinna ulec znaczącym zmianom.
    UWAGA: Chociaż ChAcNLS nie powoduje wytrącania się podczas procesu koniugacji, jest to możliwość, która może wystąpić w przypadku innych peptydów. Obserwuj probówkę podczas reakcji pod kątem oznak wytrącania się, które najprawdopodobniej powstaje, gdy peptydy są hydrofobowe. W takich przypadkach warto ponownie przyjrzeć się peptydowi będącemu przedmiotem zainteresowania w celu zaprojektowania zmian zapewniających zwiększoną hydrofilowość.
  6. Zagęścić 7G3-ChAcNLS za pomocą urządzenia ultrafiltracyjnego do żądanego stężenia i wymiany buforowej w PBS o pH 7,4 (patrz krok 1.4). Wydajność odzysku białka całkowitego powinna wynosić ≥ 75% pierwotnego materiału wyjściowego.
  7. Wykonaj SDS-PAGE w celu oceny skonstruowanych kandydatów na 7G3-ChAcNLS przy użyciu 12% żelu poliakrylamidowego (zapewnia wystarczającą separację sprzężonych łańcuchów ciężkich i lekkich ChAcNLS od łańcuchów niesprzężonych). Wymieszać 10 μg 7G3-ChAcNLS w buforze ładującym PAGE zawierającym 2 μl β-merkaptoetanolu i załadować do studzienki.
  8. Ustaw odpowiednie napięcie (120 V przez 1 godzinę dla żelu 12%) i uruchom elektroforezę. Przerwij elektroforezę, gdy przód barwnika Coomassie dotrze do dna żelu.
    UWAGA: Nie pozwól, aby przód barwnika Coomassie spływał z żelu.
  9. Usunąć żel z aparatu do elektroforezy i spłukać roztworem odbarwiającym zawierającym 10% v/v lodowatego kwasu octowego i 20% v/v metanolu.
  10. Zrób zdjęcie żelu i linijką i zmierz odległość (cm) migrowaną dla wzorców i koniugatów 7G3. Oblicz wartość współczynnika retencji (Rf), która jest odległością migrowaną podzieloną przez długość żelu (od miejsca, w którym białko jest ładowane do frontu migracji Coomassie). Wykreślić masę cząsteczkową (MW) w logarytmie w stosunku do wartości Rf z każdego wzorca białka i ekstrapolować wielkość koniugatów 7G3.
  11. Oblicz liczbę peptydów na przeciwciało, dzieląc różnicę w MW między koniugatami 7G3 a niezmodyfikowanym 7G3 przez 1768,5 g/mol (MW ChAcNLS).
  12. Wykonaj cyfrowe zdjęcia żelu barwionego Coomassie i wykonaj analizę densytometryczną. W tym momencie wybór wiodącego kandydata może opierać się na AC z maksymalną liczbą cząsteczek ChAcNLS, która nie zawiera znaczących gatunków zagregowanych.

2. Mikroskopia konfokalna do oceny akumulacji wewnątrzkomórkowej

UWAGA: Ważne jest, aby przetestować selektywność komórek wewnątrzkomórkowej akumulacji mAb modyfikowanych peptydami przed opracowaniem preparatów o interesującym ładunku. Ponieważ wykazano również, że Tat ma skłonność do niespecyficznej penetracji komórek, warto najpierw przeanalizować akumulację wewnątrzkomórkową i selektywność komórek przed podjęciem kosztownych etapów rozwoju z drogimi ładunkami. Z tego powodu Procedura 1 powinna również modyfikować nieistotne kontrolne mAb specyficzne dla danej izotypu. W pozostałej części protokołu będziemy pracować z AC zmodyfikowanymi za pomocą 10 cząsteczek ChAcNLS na przeciwciało. Schemat zawierający kluczowe kroki dla procedur 2 i 3 jest opisany na rysunku 2.

UWAGA: Ten etap protokołu obejmuje obchodzenie się z paraformaldehydem i manipulowanie nim. Podczas obsługi należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Traktuj docelowe komórki TF-1a 200 nM 7G3-ChAcNLS, w tym zmodyfikowanymi kontrolnymi mAb. Inkubować 5 x 106 komórek antygenowo-dodatnich z koniugatami przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  2. Po 1 godzinie usunąć supernatant i przemyć 1 ml 3x w lodowatym PBS. Dodać świeżą pożywkę i inkubować przez dodatkową godzinę w temperaturze 37 °C.
  3. Po dodatkowej godzinie usuń supernatant i przemyj 3x w 1 ml lodowatego PBS. Dodać 0,5 ml PBS zawierającego 0,25% trypsyny i kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w temperaturze 37 °C przez 3 do 30 minut.
    UWAGA: Podczas wstępnych testów pilotażowych zaleca się, aby nie trypsynizować komórek w celu określenia różnic w akumulacji wewnątrzkomórkowej AC. Protokół ten promuje stosowanie trypsyny i pokazujemy, w jaki sposób poprawia to ocenę wydajności akumulacji wewnątrzkomórkowej różnych kandydatów na AC.
    1. Przetestuj różne czasy inkubacji, sprawdzając wzrokowo, czy wszystkie komórki są odłączane. Ponadto należy inkubować podwielokrotności komórek roztworami barwiącymi żywotność i przeprowadzić analizę cytometryczną przepływową, jak opisano wcześniej 40.
    2. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 1,5 ml pożywki dla hodowli komórkowych RPMI 1640/10% płodowej surowicy bydlęcej. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i przemyć 3x w 0,5 ml lodowatego PBS.
  4. Utrwalić komórki w 0,5 ml PBS zawierającym 1% paraformaldehydu i 1% sacharozy na lodzie przez 30 min. Umyć komórki 3x w 0,5 ml lodowatego PBS i odwirować przy 250 x g przez 5 min. Przepuszczalność komórek w 0,5 ml PBS zawierającym 0,15% Triton X-100 przez 5 min na lodzie. Umyj komórki w lodowatym PBS i powtórz wirowanie.
  5. Zawieś komórki w 0,1 ml PBS zawierającym 2 μg/ml (lub stężenie zalecane przez producenta) antymysiego (specyficznego dla izotypu) drugorzędowego przeciwciała poliklonalnego Fc sprzężonego z AlexaFluor 647 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
    1. Wirować przy 250 x g przez 5 minut i myć komórki 3x w 0,5 ml lodowatego PBS. Zawieś komórki w 0,5 ml PBS.
      PAUZA: Komórki można przechowywać w lodówce.
      UWAGA: Konieczne jest wybranie przeciwciała drugorzędowego, które rozpoznaje prawidłowy izotyp interesującego nas mAb. AF647 został wybrany ze względu na jego emisję dalekiej podczerwieni, która nie zakłóca barwienia jądra jodkiem propidyny (PI).
  6. Dodać PI do stężenia 10 μg/ml do pojemnika z komórkami. Następnie zamontuj 1 x 105 komórek na szkiełkach za pomocą nośnika montażowego i przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
  7. Zbadaj komórki za pomocą obiektywu zanurzeniowego Plan Apo 60X NA 1.42 w odwróconym laserowym skaningowym mikroskopie konfokalnym. Wykrywanie fluorescencji PI za pomocą lasera argonowego 488 nm i zestawu spektralnego pryzmatu skanującego dla 600 - 650 nm. Do fluorescencji AF647 należy użyć lasera helowo-neonowego o długości fali 633 nm oraz zestawu pryzmatów skaningowych spektralnych o długości fali 650 - 700 nm. Zbieraj sekwencyjne emisje fluorescencji z PI i AF647.
    UWAGA: Użyj tego samego ustawienia podczas oceny i porównania komórek. Będziesz jednak musiał dostosować ustawienia dla komórek trypsynizowanych w porównaniu z komórkami nietrypsynizowanymi.
  8. Korzystaj z oprogramowania mikroskopowego do pozyskiwania obrazów. Zbieraj obrazy za pomocą szeregowych poziomych odcinków optycznych o wymiarach 1 024 x 1 024 pikseli z 2-krotnym uśrednianiem linii wykonanym w odstępach 0,5 μm na całej grubości komórki. Przedstaw obrazy jako ułożone w stos projekcje z czterech kolejnych warstw z maksymalną intensywnością fluorescencji.
  9. Analizuj komórki za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Zapisz wzorzec dystrybucji komórkowej koniugatów. W szczególności oceń, czy fluorescencja wewnątrzkomórkowa w cytoplazmie jest zgrupowana i blisko powierzchni komórki, czy też rozproszona i jednorodna. Oceń również względną intensywność fluorescencji na komórkę.

3. Znakowana radioizotopowo konstrukcja prądu przemiennego i frakcjonowanie komórkowe w celu oceny skuteczności dostarczania wewnątrzkomórkowego 64 Cu

UWAGA: Procedury 3 i 4 obejmują obchodzenie się z radioaktywnością i manipulowanie nią. Przed wykonaniem tych kroków badacze powinni odbyć zatwierdzone szkolenie w zakresie bezpieczeństwa i protokoły zatwierdzone przez organ ds. bezpieczeństwa radiologicznego ich instytucji macierzystej.

UWAGA: Dla procedur 3 i 4 używamy mAb A14, który jest specyficzny dla inwazyjnego antygenu raka pęcherza moczowego IL-5Rα41. Ponadto, wszystkie eksperymenty są wrażliwe na czas ze względu na krótki okres półtrwania wynoszący 64Cu. Ogólnie rzecz biorąc, najlepiej nie czekać dłużej niż 1 tydzień na przeprowadzenie eksperymentów in vitro i nie dłużej niż 72 godziny w przypadku badań in vivo.

  1. W probówce o pojemności 1,7 ml zawiesić kwas 2,2'-(7-(2-((2,5-dioksopirolidyn-1-ylo)oksy)-2-oksoetylo)-1,4,7-triazonano-1,4-diylo)dioctowy (NOTA-NHS) w DMSO do stężenia 10 mM.
  2. 50-krotny nadmiar molowy NOTA-NHS reagować z A14 (materiał wyjściowy 2 mg) w 0,1 M wodorowęglanie sodu o pH 8,6 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w objętości ≤ 0,5 ml (końcowa objętość NOTA-NHS nie powinna przekraczać 2% v/v całkowitej objętości).
  3. Oczyść i wymień bufor NOTA-A14 za pomocą urządzenia do ultrafiltracji w PBS, pH 7,6 (patrz krok 1.4).
  4. Aby następnie dołączyć ChAcNLS, wykonaj kroki 1.2-1.6.
  5. Reaguj NOTA-A14-ChAcNLS (partie 250 μg) ze 100 megabekereliami (MBq) 64CuCl2 w 0,1 M wodorowęglanie sodu, pH 5,5 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C ≤ 0,1 ml. Rozdział 64Cu jest wytwarzany na cyklotronie TR-PET w CIMS 42.
  6. Skoncentrować 64Cu-A14-ChAcNLS w PBS o pH 7,4 za pomocą urządzenia ultrafiltracyjnego do żądanego stężenia (patrz krok 1.4).
  7. Określić skuteczność znakowania radioizotopowego 64Cu-A14-ChAcNLS metodą natychmiastowej chromatografii cienkowarstwowej (ITLC) przy użyciu pasków chromatograficznych i 0,1 M, pH 5,5 cytrynianu sodu (eluent ITLC) jako rozpuszczalnika. Nałożyć 0,5 μl podwielokrotności roztworu reakcyjnego na pasek ITLC. Wykonaj autoradiogram paska i uzyskaj obraz cyfrowy.
    1. Wykonać densytometrię, aby uzyskać proporcję związanych i wolnych 64Cu. Jeśli zawartość wolnych 64Cu wynosi > 5%, wróć do poprzedniego kroku i wykonaj dodatkowe oczyszczanie.
    2. Ponadto należy wykonać SDS-PAGE z barwieniem Coomassie, aby ocenić agregacje. Wykonać drugą SDS-PAGE, a następnie autoradiogram żelu, aby ustalić, czy istnieją znakowane radioaktywnie gatunki agregatów.
  8. Punkt kontrolny jakości wiązania powinowactwa: Inkubować 64koniugaty Cu-A14 w rosnących stężeniach (0-100 nM) w dwóch egzemplarzach z 1 x 106 komórkami docelowymi na ml. Aby oszacować niespecyficzne wiązanie, wymieszaj zduplikowane próbki 64koniugatów Cu-A14 z komórkami w obecności 100-krotnego nadmiaru molowego nieznakowanego A14.
    1. Po 1 godzinie inkubacji na lodzie umyć komórki i policzyć całkowite próbki związanych przeciwciał oraz całkowite próbki niespecyficznych związanych przeciwciał w liczniku gamma. Wiązanie grafowo-specyficzne (całkowite związane przeciwciało - niespecyficzne przeciwciało związane) przeciwko reaktywnemu wolnemu 64Cu-A14 (nM) zastosowanemu w teście. Określ stałą dysocjacji (Kd) za pomocą regresji nieliniowej za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów.
  9. W przypadku badań akumulacji komórkowej 64Cu: Traktuj komórki 100 nM z 64koniugatów A14 znakowanych Cu przez 1 h, 6 godzin i 24 godziny w temperaturze 37 °C, jak opisano wcześniej33. Należy uwzględnić dodatkowe parametry, takie jak leczenie w obecności niezmodyfikowanego A14 w celu zablokowania miejsc IL-5Rα oraz w temperaturze 4 °C w celu zablokowania internalizacji za pośrednictwem receptora.
  10. W określonych punktach czasowych, jak opisano wcześniej w krokach 2.3 - 2.3.2, dodać 0,5 ml PBS zawierającego 0,25% trypsyny i EDTA w temperaturze 37 °C, a następnie zneutralizować i przemyć.
  11. Inkubować komórki w buforze do lizy błony plazmatycznej zawierającym 1% NP-40, 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 bufor na lodzie przez 10 min. Odwirować komórki zlizowane błoną plazmatyczną przy 90 x g przez 5 min.
  12. Usunąć supernatant i umieścić w świeżej probówce. Reprezentuje to frakcję cytoplazmatyczną. Przemyj jądra 3x w lodowatym PBS i dodaj popłuczyny do frakcji cytoplazmatycznej.
  13. Upewnij się, że fiolki zawierające frakcję jądrową i cytoplazmatyczną są szczelnie zamknięte. Następnie umieść je w liczniku gamma skalibrowanym na 64Cu w celu przeliczenia surowych zliczeń na MBq.
  14. Określ jakość izolacji jąder, wykonując analizę Western blot dla Laminy A/C, ograniczonego białka jądrowego, i Rab7, obfitego białka cytoplazmatycznego na lizacie całych komórek, frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych.
    1. Potraktuj 5 x 106 komórek 500 μl buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) i buforu do lizy błony plazmatycznej w kroku 3.12 zawierającym 1%, 2% i 4% NP-40. Ponadto izolowane jądra należy poddać działaniu 500 μl buforu RIPA w celu uzyskania wyizolowanych białek jądrowych.
    2. Wytrącić izolowane białka jądrowe, cytoplazmatyczne i całe komórki, używając 4 razy większej objętości próbki zimnego acetonu przez 60 minut w temperaturze -20 °C. Odwirować przy 13 000 x g przez 10 minut i zdekantować supernatant, uważając, aby nie usunąć osadu białkowego. Dodaj 100 μl PBS, aby rozpuścić białka.
    3. Załaduj 10 μg białka do każdej studzienki 10% żelu SDS-PAGE. Wykonać elektroforezę zgodnie z opisem w 1.7-1.9. Wykonaj transfer Western Blot zgodnie z wcześniejszym opisem w refeference 43.
    4. Zidentyfikuj znaczniki drabiny, które najlepiej odpowiadają MW ~40 kDa. Przetnij membranę na pół przy tym markerze. Zbadaj blot zawierający białka o wyższej MW za pomocą przeciwciał specyficznych dla Laminy A/C. Zbadaj błonę z białkami o niższym MW za pomocą przeciwciał specyficznych dla Rab 7. Western blot jest dobrze znaną techniką i nie jest opisana w tym protokole.

4. Obrazowanie PET Ocena celowania w guz

UWAGA: Techniki wszczepiania komórek nowotworowych myszom w celu generowania heterotopowych ksenoprzeszczepów są dobrze znane i większość laboratoriów posiada własne protokoły dostosowane do ich układu nowotworowego. W związku z tym nie jest to objęte protokołem. Model ksenoprzeszczepu będzie nieotyłym myszami z cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) z inwazyjnymi guzami pęcherza moczowego IL-5Rα-dodatnimi HT-1376 i HT-B9. IL-5Rα-dodatnie inwazyjne komórki guza pęcherza moczowego stanowią > 66% wszystkich komórek w ksenoprzeszczepie. W przeciwieństwie do tego, tylko ~11% komórek HT-B9 dodatnich IL-5Rα było zawartych w rozwiniętych ksenoprzeszczepach41. W związku z tym model ten stanowi doskonały przykład do oceny celowania w guz AC w dwóch guzach, które reprezentują przewidywalną heterogeniczność guza pacjenta.

  1. W grupach zawierających ≥ 4 myszy (NOD/SCID) wstrzyknij 20-30 μg (6-9 MBq) 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS i 64Cu-A14 do żyły ogonowej.
  2. Tego samego dnia należy umieścić cylindryczny fantom (24,8 ml) zawierający 5 MBq 64Cu, aby przekształcić liczbę radioaktywnych substancji na sekundę na wstrzykniętą dawkę na gram tkanki (%ID/g).
  3. Odczekaj 48 godzin, a następnie znieczul myszy, umieszczając je w komorze indukcyjnej o przepływie 1,5 l/min tlenu z 2% izofluranem. Nałóż sterylną maść okulistyczną na oczy myszy po indukcji i przed umieszczeniem w skanerze PET.
  4. Szybko przenieś mysz na stół skanera PET w pozycji leżącej do przodu ze stożkiem nosowym dla izofluranu. Ustaw sondy oddechowe i doodbytnicze oraz monitoruj temperaturę i częstość oddechów, aby upewnić się, że warunki fizjologiczne są utrzymane podczas eksperymentu, jak opisano wcześniej 44.
  5. Rozpocznij akwizycję danych PET przy użyciu zwykłego ustawienia trybu próbkowania i okna energetycznego 250 - 650 keV. Zazwyczaj 45-minutowy skan statyczny na mysz jest wystarczający, aby zapewnić wystarczającą ilość zbieżnych zdarzeń do rekonstrukcji i wytworzenia wysokiej jakości obrazów PET.
  6. Po zeskanowaniu 64Cu-AC wyjmij mysz ze skanera i umieść ją z powrotem w klatce. Pozwól, aby mysz wystarczająco się zregenerowała przed powrotem do obiektu dla zwierząt.
  7. Uzyskaj zrekonstruowane obrazy przy użyciu 20 iteracji trójwymiarowego algorytmu maksymalizacji oczekiwań maksymalnego prawdopodobieństwa.
  8. Wykonaj analizę obszaru zainteresowania (ROI) guza i narządów do oceny wizualnej za pomocą oprogramowania AMIDE.
    1. Narysuj ROI, aby uzyskać ilościowe dane %ID/g ręcznie za pomocą ustawienia narzędzia 3D Freehand i ostrożnie nakreśl guzy lub sąsiedni mięsień uda. Liczba pikseli w ROI zostanie przekonwertowana na %ID/g z poprzedniego kroku 4.2.
  9. Porównaj 64obrazy Cu-A14, 64Cu-A14-ChAcNLS, 64Cu-A14-NLS pod kątem kontrastu guza, ilościowego zwrotu z inwestycji %ID/g i stosunku guza do tła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dla Procedury 1, konstrukcja 7G3 zmodyfikowana za pomocą ChAcNLS przy użyciu sulfo-SMCC jako środka sieciującego jest bardzo niezawodna. Zazwyczaj, po załadowaniu do 12% żelu i przeanalizowaniu przez SDS-PAGE, powoduje to wyraźny stopniowy wzrost MW proporcjonalny do rosnących stosowanych stosunków sulfo-SMCC do 7G3 i pozwala na indywidualną ocenę łańcuchów ciężkich i lekkich pod kątem koniugacji ChAcNLS (Rysunek 3). 7G3 reagował w proporcjach 10-, 20-, 25- i 50-do-1 sulf...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównymi celami ogólnoustrojowego dostarczania środków przeciwnowotworowych jest zwiększenie akumulacji w miejscu guza i wychwytu w komórkach nowotworowych oraz zmniejszenie niepożądanych skutków ubocznych w zdrowych tkankach. Ukierunkowane dostarczanie ładunków molekularnych AC do komórek nowotworowych jest bardzo obiecującym podejściem do leczenia i wykrywania nowotworów. Jednak brak skuteczności spowodowany uwięzieniem endosomów i degradacją lizosomów pozostaje ważnym wyzwaniem. Chociaż protokół ten wykorzystuje pepty...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Towarzystwo Badań nad Rakiem (Kanada) i CIMS. Autorzy dziękują dr Samii Ait-Mohand i Jean-Francois Beaudoinowi za pomoc. Dr Angel Lopez (Uniwersytet Australii Południowej) za mAb A14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sulfo-SMCCThermo Scientific22122Do wyboru jest wiele homo- i hetero-bifunkcyjnych sieciowników maleimidowych.
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-0,5 mlEMD MilliporeUFC505096Dostępne są opakowania po 8, 24 i 96 ml. Wybierz zgodnie ze swoimi potrzebami.
Precision Plus Protein Kaleidoscope StandardsBioRad1610375EDUMulicolor rekombinowane białka od 10 do 250 kDa.
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermo Scientific25200056objętości 100 lub 500 ml do wyboru.
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H + L), koniugat Alexa Fluor 647Thermo ScientificA-212351 - 10 μ g / ml zalecane
NOTA-NHSCheMatechC100
Przeciwciało Lamin A/C (N-18)Santa Cruz Biotechnologysc-6215
Przeciwciało Rab7Santa Cruz Biotechnologysc-376362
A14 mAbBD Biosciences555902
NuPAGE LDS Bufor do próbek (4x)Thermo ScientificNP0007
2- MerkaptoetanolSigma AldrichM3148-25ML
Ogniwa TF-1aATCCATCC CRL-2003
RPMI 1640 mediumATCCATCC 30-2001
RIPA bufor do lizy i ekstrakcjiThermo Scientific89900
AMIDE oprogramowanie do obrazowania medycznegodostępne pod adresem amide.sourceforge.netCałkowicie za darmo do pobrania
Mikroskop konfokalny FluoView FV1000Olympus
Oprogramowanie FluoviewPaski Olympuswww.olympus-lifescience.com
ITLC Biodex150-771

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
  2. Younes, A., et al. Results of a pivotal phase II study of brentuximab vedotin for patients with relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. Journal of Clinical Oncology. 30 (18), 2183-2189 (2012).
  3. Bouchelouche, K., Choyke, P. L., Capala, J. Prostate specific membrane antigen- a target for imaging and therapy with radionuclides. Discovery Medicine. 9 (44), 55-61 (2010).
  4. Hamilton, G. S. Antibody-drug conjugates for cancer therapy: The technological and regulatory challenges of developing drug-biologic hybrids. Biologicals. 43 (5), 318-332 (2015).
  5. Deonarain, M. P., Yahioglu, G., Stamati, I., Marklew, J. Emerging formats for next-generation antibody drug conjugates. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (5), 463-481 (2015).
  6. Barok, M., Joensuu, H., Isola, J. Trastuzumab emtansine: mechanisms of action and drug resistance. Breast Cancer Research. 16 (2), (2014).
  7. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23 (9), 1137-1146 (2005).
  8. Alley, S. C., Okeley, N. M., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (4), 529-537 (2010).
  9. Austin, C. D., et al. Endocytosis and sorting of ErbB2 and the site of action of cancer therapeutics trastuzumab and geldanamycin. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5268-5282 (2004).
  10. Bryan, J. N., et al. Comparative uptakes and biodistributions of internalizing vs. noninternalizing copper-64 radioimmunoconjugates in cell and animal models of colon cancer. Nuclear Medicine and Biology. 32 (8), 851-858 (2005).
  11. Chen, R., et al. CD30 Downregulation, MMAE Resistance, and MDR1 Upregulation Are All Associated with Resistance to Brentuximab Vedotin. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (6), 1376-1384 (2015).
  12. Fuchs, H., Weng, A., Gilabert-Oriol, R. Augmenting the Efficacy of Immunotoxins and Other Targeted Protein Toxins by Endosomal Escape Enhancers. Toxins (Basel). 8 (7), (2016).
  13. Olsnes, S., Sandvig, K., Petersen, O. W., van Deurs, B. Immunotoxins--entry into cells and mechanisms of action. Immunology Today. 10 (9), 291-295 (1989).
  14. Zheng, D., et al. Virus-derived anti-inflammatory proteins: potential therapeutics for cancer. Trends in Molecular Medicine. 18 (6), 304-310 (2012).
  15. Kristensen, M., Birch, D., Morck Nielsen,, H, Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), (2016).
  16. Yezid, H., Konate, K., Debaisieux, S., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Mechanism for HIV-1 Tat insertion into the endosome membrane. Journal of Biological Chemistry. 284 (34), 22736-22746 (2009).
  17. Escriou, V., Carriere, M., Scherman, D., Wils, P. NLS bioconjugates for targeting therapeutic genes to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (2), 295-306 (2003).
  18. Pouton, C. W., Wagstaff, K. M., Roth, D. M., Moseley, G. W., Jans, D. A. Targeted delivery to the nucleus. Advanced Drug Delivery Reviews. 59 (8), 698-717 (2007).
  19. Anderson, D. C., et al. Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide. Biochemical Biophysical Research Communications. 194 (2), 876-884 (1993).
  20. Chen, P., et al. Nuclear localizing sequences promote nuclear translocation and enhance the radiotoxicity of the anti-CD33 monoclonal antibody HuM195 labeled with 111In in human myeloid leukemia cells. Journal of Nuclear Medicine. 47 (5), 827-836 (2006).
  21. Cornelissen, B., Hu, M., McLarty, K., Costantini, D., Reilly, R. M. Cellular penetration and nuclear importation properties of 111In-labeled and 123I-labeled HIV-1 tat peptide immunoconjugates in BT-474 human breast cancer cells. Nuclear Medicine and Biology. 34 (1), 37-46 (2007).
  22. Costantini, D. L., Chan, C., Cai, Z., Vallis, K. A., Reilly, R. M. (111)In-labeled trastuzumab (Herceptin) modified with nuclear localization sequences (NLS): an Auger electron-emitting radiotherapeutic agent for HER2/neu-amplified breast cancer. Journal of Nuclear Medicine. 48 (8), 1357-1368 (2007).
  23. Fasih, A., et al. (1)(1)(1)In-Bn-DTPA-nimotuzumab with/without modification with nuclear translocation sequence (NLS) peptides: an Auger electron-emitting radioimmunotherapeutic agent for EGFR-positive and trastuzumab (Herceptin)-resistant breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 189-200 (2012).
  24. Hu, M., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
  25. Kameyama, S., et al. Effects of cell-permeating peptide binding on the distribution of 125I-labeled Fab fragment in rats. Bioconjugate Chemistry. 17 (3), 597-602 (2006).
  26. Kersemans, V., Cornelissen, B., Minden, M. D., Brandwein, J., Reilly, R. M. Drug-resistant AML cells and primary AML specimens are killed by 111In-anti-CD33 monoclonal antibodies modified with nuclear localizing peptide sequences. Journal of Nuclear Medicine. 49 (9), 1546-1554 (2008).
  27. Mie, M., et al. Intracellular delivery of antibodies using TAT fusion protein. Biochemical Biophysical Research Communications. 310 (3), 730-734 (2003).
  28. Niesner, U., et al. Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides. Bioconjugate Chemistry. 13 (4), 729-736 (2002).
  29. Stein, S., et al. A disulfide conjugate between anti-tetanus antibodies and HIV (37-72)Tat neutralizes tetanus toxin inside chromaffin cells. FEBS Letters. 458 (3), 383-386 (1999).
  30. Tolstikov, V. V., Cole, R., Fang, H., Pincus, S. H. Influence of endosome-destabilizing peptides on efficacy of anti-HIV immunotoxins. Bioconjugate Chemistry. 8 (1), 38-43 (1997).
  31. Gao, C., Leyton, J. V., Schimmer, A. D., Minden, M., Reilly, R. M. Auger electron-emitting 111In-DTPA-NLS-CSL360 radioimmunoconjugates are cytotoxic to human acute myeloid leukemia (AML) cells displaying the CD123/CD131 phenotype of leukemia stem cells. Applied Radiation and Isotopes. 110, 1-7 (2015).
  32. Leyton, J. V., et al. Auger electron radioimmunotherapeutic agent specific for the CD123+/CD131- phenotype of the leukemia stem cell population. Journal of Nuclear Medicine. 52 (9), 1465-1473 (2011).
  33. Paquette, M., et al. NLS-cholic acid conjugation to IL-5Rα-specific antibody improves cellular accumulation and in vivo tumor-targeting properties in a bladder cancer model. Bioconjugate Chemistry. , (2018).
  34. Beaudoin, S., et al. ChAcNLS, a Novel Modification to Antibody-Conjugates Permitting Target Cell-Specific Endosomal Escape, Localization to the Nucleus, and Enhanced Total Intracellular Accumulation. Molecular Pharmaceutics. 13 (6), 1915-1926 (2016).
  35. Boswell, C. A., et al. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics. Bioconjugate Chemistry. 21 (12), 2153-2163 (2010).
  36. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. The crucial role of bile acids in the entry of porcine enteric calicivirus. Virology. 456-457, 268-278 (2014).
  37. Shivanna, V., Kim, Y., Chang, K. O. Ceramide formation mediated by acid sphingomyelinase facilitates endosomal escape of caliciviruses. Virology. 483, 218-228 (2015).
  38. Stancevic, B., Kolesnick, R. Ceramide-rich platforms in transmembrane signaling. FEBS Letters. 584 (9), 1728-1740 (2010).
  39. Testa, U., Pelosi, E., Frankel, A. CD 123 is a membrane biomarker and a therapeutic target in hematologic malignancies. Biomarker Research. 2 (1), 4(2014).
  40. King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 155-166 (2000).
  41. Paquette, M., et al. Targeting IL-5Rα with antibody-conjugates reveals a strategy for imaging and therapy for invasive bladder cancer. Oncoimmunology. 6 (10), e1331195(2017).
  42. Zeisler, S. Production of 64Cu on the Sherbrooke TR-PET cyclotron. Journal or Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 257 (1), (2004).
  43. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  44. Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments. (82), e50761(2013).
  45. Wakankar, A. A., et al. Physicochemical stability of the antibody-drug conjugate Trastuzumab-DM1: changes due to modification and conjugation processes. Bioconjugate Chemistry. 21 (9), 1588-1595 (2010).
  46. Liu, J., Abid, S., Lee, M. S. Analysis of monoclonal antibody chimeric BR96-doxorubicin immunoconjugate by sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis with ultraviolet and laser-induced fluorescence detection. Analytical Biochemistry. 229 (2), 221-228 (1995).
  47. Rege, K., Patel, S. J., Megeed, Z., Yarmush, M. L. Amphipathic peptide-based fusion peptides and immunoconjugates for the targeted ablation of prostate cancer cells. Cancer Research. 67 (13), 6368-6375 (2007).
  48. Zhan, J., Ge, L., Shen, J., Wang, K., Zheng, S. A trans-Golgi network retention signal YQRL fused to ricin A chain significantly enhances its cytotoxicity. Biochemical Biophysical Research Communications. 313 (4), 1053-1057 (2004).
  49. Zhan, J., Stayton, P., Press, O. W. Modification of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences, enhances its cytotoxicity and translocation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 46 (1), 55-60 (1998).
  50. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Antibody ConjugatesCellular AccumulationConfocal MicroscopyRadioimmunoassaysPET ImagingCell FractionationTrypsinizationNuclear LocalizationTumor TargetingFluorescence Microscopy

Powiązane artykuły