Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Summary

Ten artykuł przedstawia proces pracy mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, jak również potencjału i morfologii błony mitochondrialnej - wspólnie określanych jako morfofunkcja mitochondriów - w żywych komórkach przylegających przy użyciu przenikających komórkę fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych 5-(i-6)-chlorometylo-2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny dioctanu, ester acetylowy (CM-H₂DCFDA) i ester metylowy tetrametylodaminy (TMRM).

Abstract

Reaktywne formy tlenu (ROS) regulują podstawowe procesy komórkowe, w tym ekspresję genów, migrację, różnicowanie i proliferację. Jednak nadmierny poziom ROS wywołuje stan stresu oksydacyjnego, któremu towarzyszą nieodwracalne uszkodzenia oksydacyjne DNA, lipidów i białek. W ten sposób kwantyfikacja ROS zapewnia bezpośredni wskaźnik zastępczy dla stanu zdrowia komórek. Ponieważ mitochondria są jednym z głównych źródeł komórkowych i celów ROS, wspólna analiza funkcji mitochondriów i produkcji ROS w tych samych komórkach ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia wzajemnych powiązań w warunkach patofizjologicznych. W związku z tym opracowano strategię opartą na mikroskopii o wysokiej zawartości w celu jednoczesnego ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, potencjału błony mitochondrialnej (ΔΨ_m) i morfologii mitochondriów. Opiera się na zautomatyzowanej szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej i analizie obrazu żywych komórek przylegających, hodowanych na płytkach wielodołkowych i barwionych przepuszczalnymi dla komórek fluorescencyjnymi cząsteczkami reporterowymi CM-H₂DCFDA (ROS) i TMRM (ΔΨ_m i morfologia mitochondriów). W przeciwieństwie do fluorymetrii lub cytometrii przepływowej, strategia ta umożliwia ilościowe określenie parametrów subkomórkowych na poziomie pojedynczej komórki z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, zarówno przed, jak i po stymulacji eksperymentalnej. Co ważne, obrazowy charakter metody pozwala na wyodrębnienie parametrów morfologicznych oprócz intensywności sygnału. Połączony zestaw funkcji jest używany do eksploracyjnej i statystycznej analizy danych wielowymiarowych w celu wykrycia różnic między subpopulacjami, typami komórek i/lub leczeniem. W tym miejscu znajduje się szczegółowy opis testu wraz z przykładowym eksperymentem, który dowodzi jego potencjału do jednoznacznego rozróżniania stanów komórkowych po zaburzeniach chemicznych.

Introduction

Stężenie wewnątrzkomórkowych ROS jest skrupulatnie regulowane poprzez dynamiczne współdziałanie między systemami produkującymi ROS i rozbrajającymi ROS. Brak równowagi między nimi wywołuje stan stresu oksydacyjnego. Do głównych źródeł ROS należą mitochondria¹. Biorąc pod uwagę ich rolę w oddychaniu komórkowym, są one odpowiedzialne za większość wewnątrzkomórkowych cząsteczek ponadtlenkowych (^O2•-)². Wynika to głównie z wycieku elektronów do_O2 w kompleksie 1 łańcucha transportu elektronów w warunkach silnego ujemnego potencjału wewnętrznej błony mitochondrialnej (Δψ_m), tj.

Protocol

Poniższy protokół jest opisany jako wykonany dla komórek NHDF i przy użyciu płytek wielodołkowych określonych w pliku materiałów. Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z ogólnym przeglądem przepływu pracy.

1. Przygotowanie odczynników

1. Przygotuj kompletną pożywkę, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle Medium (DMEM) 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 100 j.m./ml penicyliny i 100 j.m./ml streptomycyny (PS). W przypadku 500 ml kompletnej pożywki dodaj 50 ml FBS i 5 ml PS do 445 ml DMEM.
2. Przygotuj bufor obrazowania HBSS-HEPES (HH), uzupełniając zbilansowany roztwór soli Hank....

Results

Test został przetestowany za pomocą kilku eksperymentów kontrolnych, których wyniki opisano w Sieprath et al.¹. Krótko mówiąc, odpowiedź fluorescencyjna CM-H₂DCFDA i TMRM na obcie wywołane zmiany w wewnątrzkomórkowych ROS i Δψ_m została określona ilościowo w celu określenia zakresu dynamicznego. W przypadku CM-H₂DCFDA, NHDF wykazał liniowy wzrost sygnału fluorescencji po potraktowaniu rosnącymi stężeniami TBHP w zakresie od .......

Discussion

W artykule opisano metodę mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS i morfofunkcji mitochondriów w NHDF. Jego skuteczność została zademonstrowana w studium przypadku NHDF leczonego SQV. Wyniki potwierdzają wcześniejsze dowody z literatury, w których zaobserwowano podwyższony poziom ROS lub dysfunkcję mitochondriów po leczeniu inhibitorami proteazy HIV typu 1, choć w oddzielnych eksperymentach 19,20,21,22,23,2.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynniki
Tetrametylorodamina, ester metylowy, nadchloran (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (Ogólny wskaźnik stresu oksydacyjnego)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimetylosulfotlenek	Sigma)Aldrich	D8418
MatriPlate 96-dołkowa płytka MicroWell ze szklanym dnem 630 µ L-Black 0,17 mm Low Glass	Lided Brooks life science systems	MGB096-1-2-LG-L
HBSS bez czerwieni fenolowej 500 ml	Lonza	BE10-527F
DMEM wysoka glukoza z L-glutaminą	Lonza	BE12-604F
Sól fizjologiczna z fosforanem (PBS) bez Ca i Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
Roztwór trypsyny-versenu (EDTA)	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka Anty-królik IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	Przeciwciało używane do pozyskiwania obrazu płaskiego pola
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka Anty-królik IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	Przeciwciało używane do pozyskiwania obrazu płaskiego pola
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sprzęt
Mikroskop szerokokątny zaćmienia Nikon Ti	Nikon
Perfect Focus System (PFS)			Sprzętowy system autofokusa
CFI Plan Apo Lambda 20X	obiektyw Nikon
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 z modułem JOBS	Nikon		To oprogramowanie służy do sterowania mikroskopem i programowania/wykonywania automatycznej akwizycji obrazu ImageJ
(FIJI) Wersja 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Wersja 1.0.44	Rstudio
R wersja 3.3.2