Artykuł metodologiczny

Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

DOI:

10.3791/55449

⸱

14 maja 2017

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology and Histology, Department of Veterinary Sciences, University of Antwerp, 2Cell Systems and Imaging Research Group (CSI), Department of Molecular Biotechnology, Ghent University, 3Department of Biochemistry , Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia proces pracy mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, jak również potencjału i morfologii błony mitochondrialnej - wspólnie określanych jako morfofunkcja mitochondriów - w żywych komórkach przylegających przy użyciu przenikających komórkę fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych 5-(i-6)-chlorometylo-2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny dioctanu, ester acetylowy (CM-H2DCFDA) i ester metylowy tetrametylodaminy (TMRM).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reaktywne formy tlenu (ROS) regulują podstawowe procesy komórkowe, w tym ekspresję genów, migrację, różnicowanie i proliferację. Jednak nadmierny poziom ROS wywołuje stan stresu oksydacyjnego, któremu towarzyszą nieodwracalne uszkodzenia oksydacyjne DNA, lipidów i białek. W ten sposób kwantyfikacja ROS zapewnia bezpośredni wskaźnik zastępczy dla stanu zdrowia komórek. Ponieważ mitochondria są jednym z głównych źródeł komórkowych i celów ROS, wspólna analiza funkcji mitochondriów i produkcji ROS w tych samych komórkach ma kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia wzajemnych powiązań w warunkach patofizjologicznych. W związku z tym opracowano strategię opartą na mikroskopii o wysokiej zawartości w celu jednoczesnego ilościowego oznaczania wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, potencjału błony mitochondrialnej (ΔΨm) i morfologii mitochondriów. Opiera się na zautomatyzowanej szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej i analizie obrazu żywych komórek przylegających, hodowanych na płytkach wielodołkowych i barwionych przepuszczalnymi dla komórek fluorescencyjnymi cząsteczkami reporterowymi CM-H2DCFDA (ROS) i TMRM (ΔΨm i morfologia mitochondriów). W przeciwieństwie do fluorymetrii lub cytometrii przepływowej, strategia ta umożliwia ilościowe określenie parametrów subkomórkowych na poziomie pojedynczej komórki z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną, zarówno przed, jak i po stymulacji eksperymentalnej. Co ważne, obrazowy charakter metody pozwala na wyodrębnienie parametrów morfologicznych oprócz intensywności sygnału. Połączony zestaw funkcji jest używany do eksploracyjnej i statystycznej analizy danych wielowymiarowych w celu wykrycia różnic między subpopulacjami, typami komórek i/lub leczeniem. W tym miejscu znajduje się szczegółowy opis testu wraz z przykładowym eksperymentem, który dowodzi jego potencjału do jednoznacznego rozróżniania stanów komórkowych po zaburzeniach chemicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stężenie wewnątrzkomórkowych ROS jest skrupulatnie regulowane poprzez dynamiczne współdziałanie między systemami produkującymi ROS i rozbrajającymi ROS. Brak równowagi między nimi wywołuje stan stresu oksydacyjnego. Do głównych źródeł ROS należą mitochondria1. Biorąc pod uwagę ich rolę w oddychaniu komórkowym, są one odpowiedzialne za większość wewnątrzkomórkowych cząsteczek ponadtlenkowych (O2•-)2. Wynika to głównie z wycieku elektronów doO2 w kompleksie 1 łańcucha transportu elektronów w warunkach silnego ujemnego potencjału wewnętrznej błony mitochondrialnej (Δψm), tj. hiperpolaryzacji mitochondriów. Z drugiej strony, depolaryzacja mitochondriów została również skorelowana ze zwiększoną produkcją ROS, co wskazuje na wiele trybów działania3,4,5,6,7,8. Ponadto, poprzez modyfikacje redoks w białkach maszynerii rozszczepienia i fuzji, ROS współregulują morfologię mitochondriów9. Na przykład fragmentacja jest skorelowana ze zwiększoną produkcją ROS i apoptozą10,11, podczas gdy nitkowate mitochondria zostały powiązane z niedoborem składników odżywczych i ochroną przed mitofagią12. Biorąc pod uwagę skomplikowany związek między komórkowymi ROS a morfofunkcją mitochondriów, najlepiej byłoby, gdyby oba te czynniki były oznaczane ilościowo jednocześnie w żywych komórkach. Aby to osiągnąć, opracowano test obrazowania o wysokiej zawartości oparty na zautomatyzowanej mikroskopii szerokokątnej i analizie obrazu przylegających kultur komórkowych barwionych sondami fluorescencyjnymi CM-H2DCFDA (ROS) i TMRM (mitochondrialne Δψm i morfologia). Obrazowanie o wysokiej zawartości odnosi się do ekstrakcji bogatych czasoprzestrzennie (tj. dużej liczby cech opisowych) informacji o fenotypach komórkowych przy użyciu wielu komplementarnych markerów i zautomatyzowanych analiz obrazu. W połączeniu z mikroskopią automatyczną wiele próbek może być badanych równolegle (tj. z dużą wydajnością), co zwiększa moc statystyczną testu. Rzeczywiście, główną zaletą protokołu jest to, że pozwala on na jednoczesną kwantyfikację wielu parametrów w tej samej komórce, i to dla dużej liczby komórek i warunków.

Protokół jest podzielony na 8 części (szczegółowo opisanych w poniższym protokole): 1) Wysiewanie komórek na 96-dołkowej płytce; 2) Przygotowanie roztworów podstawowych, roztworów roboczych i buforu do obrazowania; 3) Ustawienie mikroskopu; 4) Załadunek komórek za pomocą CM-H2DCFDA i TMRM; 5) Pierwsza runda obrazowania na żywo w celu pomiaru podstawowych poziomów ROS i morfofunkcji mitochondriów; 6) Druga runda obrazowania na żywo po dodaniu nadtlenku tert-butylu (TBHP) w celu pomiaru indukowanych poziomów ROS; 7) Zautomatyzowana analiza obrazu; 8) Analiza danych, kontrola jakości i wizualizacja.

Test został pierwotnie opracowany dla normalnych ludzkich fibroblastów skórnych (NHDF). Ponieważ komórki te są duże i płaskie, dobrze nadają się do oceny morfologii mitochondriów na obrazach szerokokątnych 2D13,14. Jednak z niewielkimi modyfikacjami metoda ta ma zastosowanie do innych przylegających typów komórek. Co więcej, oprócz kombinacji CM-H2DCFDA i TMRM, przepływ pracy jest zgodny z różnymi parami barwników fluorescencyjnych o różnej specyficzności molekularnej1,15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy protokół jest opisany jako wykonany dla komórek NHDF i przy użyciu płytek wielodołkowych określonych w pliku materiałów. Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z ogólnym przeglądem przepływu pracy.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotuj kompletną pożywkę, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle Medium (DMEM) 10% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 100 j.m./ml penicyliny i 100 j.m./ml streptomycyny (PS). W przypadku 500 ml kompletnej pożywki dodaj 50 ml FBS i 5 ml PS do 445 ml DMEM.
  2. Przygotuj bufor obrazowania HBSS-HEPES (HH), uzupełniając zbilansowany roztwór soli Hanka (z magnezem i wapniem, ale bez czerwieni fenolowej) z 20 mM HEPES. W przypadku 500 ml HH dodać 10 ml roztworu podstawowego 1M HEPES do 490 ml HBSS. Sprawdź pH i, jeśli to konieczne, dostosuj do pH 7,2.
  3. Przygotować 1 mM roztwór podstawowy CM-H2DCFDA, rozpuszczając 50 μg liofilizowanego proszku CM-H2DCFDA w 86,5 μl bezwodnego DMSO. Wymieszać przez wirowanie lub pipetowanie w górę i w dół i uzyskać 20 μl porcji w brązowych probówkach do mikrowirówek. Przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C i zużyć w ciągu 1 tygodnia. W przypadku przechowywania w atmosferze N2 okres przydatności do spożycia można wydłużyć do co najmniej 1 miesiąca.
    1. Przygotować 1 mM roztwór podstawowy TMRM, rozpuszczając 25 mg proszku TMRM w 50 ml bezwodnego DMSO. Wymieszać przez wirowanie lub pipetowanie w górę i w dół i przygotować 10 μl porcji w brązowych probówkach do mikrowirówek. Przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C. To rozwiązanie jest stabilne przez co najmniej rok.
  4. Przygotować świeżą porcję nadtlenku tert-butylu (TBHP) (~ 7 M) dla każdego doświadczenia, bezpośrednio pipetując objętość z 70% roztworu podstawowego (płytka 10 μl/96-dołkowa). Podwielokrotność tę należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  5. Przygotuj roztwór roboczy przeciwciała (AB), rozcieńczając dwa przeciwciała drugorzędowe (Alexa Fluor 488 przeciwko królikowi i CY3 przeciwko królikowi) 1,000 razy w 1x buforze HH.

2. Konfiguracja mikroskopu i protokół akwizycji ( ± 15 min)

UWAGA: Akwizycja obrazu odbywa się za pomocą mikroskopu szerokokątnego wyposażonego w zautomatyzowany stolik i migawki, oraz sprzętowego systemu autofokusa wykorzystującego 20-krotny obiektyw z korekcją planu, powietrzną (NA = 0,75) i kamerę EM-CCD. Podczas ustawiania testu po raz pierwszy, do kalibracji stolika XY i optymalizacji ustawień akwizycji używana jest płytka testowa zawierająca komórki kontrolne, barwione zgodnie z instrukcjami protokołu. Jeśli ustawienia akwizycji zostały już określone, kalibrację można przeprowadzić przy użyciu pustej płytki.

  1. Obniż obiektyw do bezwzględnego poziomu podstawowego i skalibruj stolik XY zgodnie z instrukcjami oprogramowania.
  2. Upewnij się, że zainstalowane są właściwe kostki filtrujące. Aby uwidocznić CM-H2DCFDA, należy użyć standardowej kostki filtra GFP z filtrem pasmowo-przepustowym wzbudzenia 472/30 nm, zwierciadłem dichroicznym odcięcia 495 nm i filtrem emisyjnym pasmowoprzepustowym 520/35 nm. W przypadku TMRM należy użyć kostki filtrującej dla TRITC z filtrem wzbudzenia pasmowoprzepustowym 540/25 nm, zwierciadłem dichroicznym odcięcia 565 nm i filtrem emisyjnym pasmowoprzepustowym 605/55 nm.
  3. Utwórz protokół obrazowania za pomocą oprogramowania do akwizycji.
    1. Wybierz odpowiedni typ płytki wielodołkowej (producent i kod) z listy dostępnych płytek dostępnej w oprogramowaniu. Alternatywnie można zdefiniować własny format płytki wielodołkowej, korzystając z wymiarów płytki i studzienki.
    2. Wyrównaj płytkę studzienki zgodnie z instrukcjami oprogramowania, np. definiując dwa rogi z czterech zewnętrznych rowków narożnych. Ten krok obejmuje zmianę orientacji kamery.
    3. Wybierz studnie, które chcesz zdobyć. Jeśli ta opcja nie jest dostępna w oprogramowaniu, należy użyć zestawu ręcznie zdefiniowanych lokalizacji XY, które odpowiadają wybranym odwiertom.
    4. Zoptymalizuj ustawienia akwizycji (czas ekspozycji, intensywność lampy, wzmocnienie EM) dla dwóch kanałów oddzielnie za pomocą płytki testowej. Zminimalizuj ekspozycję i intensywność, ponieważ światło wzbudzające fluorescencję samo w sobie indukuje ROS. Należy jednak upewnić się, że stosunek sygnału do tła wynosi co najmniej 2 dla podstawowego CM-H2DCFDA i 3 dla TMRM przed leczeniem TBHP i że nie ma nasycenia po leczeniu TBHP. Ustawienia akwizycji w dużej mierze zależą od konfiguracji mikroskopii i zastosowanego typu komórki, ale jako odniesienie, orientacyjne ustawienia w przypadku korzystania z żarówki metalohalogenkowej o mocy 130 W jako źródła światła i ogniw NHDF barwionych zgodnie z instrukcjami protokołu są następujące: zarówno dla CM-H2DCFDA, jak i TMRM stosuje się czas naświetlania 200 ms i filtr ND 8, w połączeniu ze wzmocnieniem EM, odpowiednio 15 (13 MHz; 14 bitów) i 4 (27 MHz; 14 bitów). Po zoptymalizowaniu pod kątem określonej konfiguracji i typu komórki ten krok można pominąć.
      UWAGA: ważne jest, aby ustawienia akwizycji pozostały takie same przez cały proces obrazowania. W przypadku dużych, wielodniowych eksperymentów stabilność lampy powinna być gwarantowana przez regularną kontrolę jakości.
    5. Zdefiniuj protokół akwizycji, składający się z sekwencyjnej akwizycji lambda (długości fali). Wybierz kanał CM-H2DCFDA, który ma być rejestrowany jako pierwszy, aby zminimalizować ekspozycję na światło przed pomiarem.
    6. Zdefiniuj pętlę płytki studzienki, aby uzyskać 4 regularnie rozmieszczone, nienakładające się na siebie obrazy umieszczone wokół środka każdego dołka wyboru studzienki przy użyciu protokołu akwizycji zdefiniowanego w 2.3.4. Wybierz meandrującą akwizycję obrazu, tj. najpierw od lewej do prawej, od dołka B02 do B11, a następnie z powrotem, od prawej do lewej, od dołka C11 do C02 i tak dalej (Rysunek 2A). Oszczędza to czas w porównaniu z akwizycją obrazu od lewej do prawej. Jeśli ta opcja nie jest dostępna w oprogramowaniu, dostosuj niestandardowy zestaw lokalizacji XY utworzony w wersji 2.3.3, aby uwzględnić ten wzór obrazowania.
    7. Zapisz współrzędne XY pozycji obrazowania (np. w osobnym pliku xml), aby umożliwić łatwą rewizję w przypadku ponownej kalibracji mikroskopu. Jest to szczególnie ważne, jeśli odczyt z tego testu musi być skorelowany z barwieniem immunofluorescencyjnym post hoc (IF) dla tych samych komórek.

3. Wysiew komórek na płytce 96-dołkowej (45 - 90 min, w zależności od liczby różnych linii komórkowych)

  1. Pracuj w sterylnym środowisku, takim jak szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy 2 i noś rękawice.
  2. Odkaż wszystkie powierzchnie i materiały za pomocą 70% v/v etanolu w wodzie destylowanej.
  3. Weź z inkubatora kolbę do hodowli komórkowej z 90% zlewającą się kulturą komórkową i umieść ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  4. Umyj komórki dwukrotnie za pomocą PBS 1x.
  5. Dodać odpowiednią ilość 0,05% roztworu trypsyny-EDTA na komórki, upewniając się, że cała powierzchnia komórki jest pokryta (np. 1 ml dla kolby T25) i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  6. Jeśli wszystkie komórki są odłączone (sprawdź pod mikroskopem), dodaj pożywkę hodowlaną (DMEM + 10% FBS + 1% penicylina-streptomycyna; ± 4 ml w kolbie T25) w celu dezaktywacji roztworu trypsyny-EDTA.
  7. Wirować przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
  8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce hodowlanej. Określ ilość pożywki dla każdego typu komórki, aby uzyskać stężenie komórek zgodne ze zliczaniem komórek. Zazwyczaj 90% zlewająca się kolba T25 NHDF zawiera około 1-1,5 miliona komórek, które są ponownie zawieszane w 3-4 ml pożywki hodowlanej.
  9. Policz komórki za pomocą komory do liczenia komórek lub licznika redlic.
  10. Zasiej 8 000-10 000 komórek w każdym z wewnętrznych 60 dołków czarnej 96-dołkowej płytki z cienkim ciągłym dnem z polistyrenu lub szkła (czarne, aby uniknąć rozpraszania i przesłuchów między sąsiednimi studzienkami podczas obrazowania). W przypadku stosowania różnych warunków/zabiegów/linii komórkowych, należy równomiernie rozmieścić ich miejsca wysiewu na płytce, aby zminimalizować wpływ na płytkę (Rysunek 2A). Studzienki zewnętrzne, z wyjątkiem studzienek B01 i A01, nie są używane, ponieważ są bardziej podatne na efekty krawędziowe.
  11. Zasiej 8 000-10 000 komórek w B01. Ta studnia będzie używana do regulacji ostrości, tuż przed akwizycją obrazu.
  12. Wypełnij puste studzienki zewnętrzne podłożem, aby zminimalizować gradienty (temperatura, wilgotność itp.) między studzienkami a otoczeniem.
  13. Delikatnie postukaj w płytkę trzy razy przed umieszczeniem jej z powrotem w inkubatorze, aby uniknąć wzrostu komórek w płatach.
  14. Hodować komórki przez 24 godziny, czyli do stopnia zrostu ok. 70%.
  15. Zapisz informacje o leczeniu dla eksperymentu w arkuszu kalkulacyjnym o nazwie "Setup.xlsx". Plik powinien zawierać cztery kolumny i będzie służył do łączenia zabiegów ze studzienkami i informacjami obrazowymi podczas analizy danych. Cztery kolumny to: "Studnia", "Numer zabiegu", "Leczenie" i "Kontrola" (po jednym wierszu na studzienkę). Każdy zabieg jest sprzężony z unikalnym numerem zabiegu, który jest wykorzystywany podczas wizualizacji danych w celu określenia kolejności zabiegów na osi X wykresów. Kolumna kontrolna określa traktowanie, które pełni funkcję kontrolki dla leczenia w bieżącym wierszu. Ilustracje typowego układu eksperymentalnego i odpowiadającego mu pliku instalacyjnego są przedstawione w Rysunek 2.

4. Ładowanie komórek za pomocą CM-H2DCFDA i TMRM ( ± 45 min)

UWAGA: Obchodzenie się z komórkami w dniu eksperymentu może odbywać się w sterylnym środowisku (komora bezpieczeństwa biologicznego), ale nie jest to obowiązkowe, ponieważ komórki zostaną odrzucone lub naprawione bezpośrednio po teście.

  1. Podgrzać bufor HH do temperatury 37 °C.
  2. Przygotować roztwór roboczy 20 μM TMRM, rozcieńczając 1 mM roztwór podstawowy 50 razy w buforze HH (dodać 490 μl buforu HH do 1 podwielokrotności 10 μl roztworu podstawowego TMRM).
  3. Przygotuj roztwór ładujący z 2 μM CM-H,2DCFDA i 100 nM TMRM. W tym celu rozcieńczyć 1 mM CM-H2DCFDA roztwór podstawowy 500x i 20 μM roztwór roboczy TMRM 200x w buforze HH.
    1. Zazwyczaj dla 60 studzienek przygotuj 7,5 ml roztworu ładującego, dodając 15 μl CM-H2DCFDA i 37,5 μl roztworu TMRM do 7447,5 μl HH.
  4. Wyrzuć pożywkę hodowlaną z komórek, obracając płytkę do góry nogami jednym płynnym ruchem.
  5. Delikatnie przemyć komórki dwukrotnie buforem HH za pomocą pipety wielokanałowej (100 μl/studzienkę). Wyrzuć bufor HH pomiędzy etapami mycia, obracając płytkę do góry nogami jednym ruchem płynu.
  6. Załaduj komórki CM-H2DCFDA i TMRM, dodając 100 μl roztworu ładującego do każdej studzienki, ponownie za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez 25 minut w ciemności, w temperaturze pokojowej. Nie zapomnij dobrze B01.
  7. W ciągu tych 25 minut przygotuj roztwory robocze utleniacza TBHP i upewnij się, że mikroskop i akcesoria są włączone.
    1. Przygotować roztwór roboczy I: Rozcieńczyć 7M roztwór podstawowy 70x do 100 mM (10 μl podstawowego roztworu w 690 μl buforze HH).
    2. Przygotować roztwór roboczy II: Rozcieńczyć WS I 100x do 1 mM (10 μL WS I w 990 μl buforu HH).
    3. Przygotować roztwór roboczy III: Rozcieńczyć WS III 25x do 40 μM (dla 60 dołków dodać 300 μL WS II w 7200 μL buforu HH).
  8. Po 25 minutach ponownie przemyć komórki dwukrotnie 100 μl buforu HH, jak opisano powyżej.
  9. Dodać 100 μl buforu HH do wszystkich 60 studzienek wewnętrznych.

5. Pierwsza runda obrazowania na żywo w celu zmierzenia podstawowych poziomów ROS i morfofunkcji mitochondriów (± 15 min)

  1. Upewnij się, że oprogramowanie do akwizycji jest sprawne, a protokół obrazowania jest załadowany.
  2. Zamontuj płytkę na mikroskopie, włącz sprzętowy system autofokusa i użyj dobrze B01, aby wyregulować przesunięcie autofokusa za pomocą kanału TMRM. Ponieważ procedura ta indukuje wzrost intensywności sygnału CM-H2DCFDA, studzienka ta jest wyłączona z dalszej analizy obrazu.
  3. Uruchom protokół obrazowania.

6. Druga runda obrazowania na żywo po dodaniu TBHP do pomiaru indukowanych poziomów ROS (± 20 min)

  1. Ostrożnie wyjmij 96-dołkową płytkę z mikroskopu.
  2. Dodać 100 μl TBHP WS III (40 μM) do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej (daje to stężenie 20 μM TBHP w studzienkach). Związek ten jest stosowany jako wewnętrzna kontrola pozytywna barwienia CM-H2DCFDA (sygnał powinien wzrosnąć), a także jako środek do pomiaru indukowanych poziomów ROS.
    UWAGA: H2O2 może być również stosowany zamiast TBHP, ale ten związek jest mniej stabilny, a zatem mniej niezawodny.
  3. Odczekać co najmniej 3 minuty, aby umożliwić pełną reakcję TBHP z CM-H2DCFDA.
  4. W tym czasie dodać 100 μl roztworu roboczego przeciwciała (1/1 000) do dołka A01.
  5. Zamontuj płytkę z powrotem na mikroskopie i ponownie sprawdź ostrość za pomocą dołka B01.
  6. Uzyskaj te same pozycje, co w pierwszej rundzie obrazowania, korzystając z tego samego protokołu obrazowania.
  7. Eksportuj uzyskane zestawy danych w jednym folderze jako indywidualne pliki tiff przy użyciu znormalizowanej nomenklatury, która obejmuje odniesienie do płytki, przed lub po zabiegu TBHP, studzienki, pola i kanału, oddzielone podkreśleniami, np. "P01_Pre_B02_0001_C1" dla płytki 1, obróbki przed TBHP, studzienki B02, pola 1 i kanału 1. Informacje te będą wykorzystywane podczas analizy obrazu (np. w celu wyboru odpowiednich ustawień segmentacji), a także podczas analizy danych (w celu powiązania danych analitycznych z właściwymi zabiegami).
  8. Uzyskanie płaskich obrazów pola dla obu kanałów we wszystkich czterech pozycjach wokół środka studni A01 przy użyciu protokołu akwizycji. Zapisz je jako osobne pliki TIFF w tym samym folderze, co inne obrazy, korzystając z następującej ustandaryzowanej nomenklatury: "P01_FF_A01_0001_C1" dla płyty 1, pola 1 i kanału 1. Upewnij się, że sygnały mieszczą się w zakresie dynamiki; W przypadku wysycenia należy użyć roztworu roboczego przeciwciała o niższym stężeniu.
  9. Wyrzuć płytkę lub zachowaj ją do dalszego przetwarzania.
    UWAGA: Zamiast wyjmować płytkę z mikroskopu i używać pipety wielokanałowej do dodawania roztworu TBHP, można zainstalować automatyczną pipetę na stoliku mikroskopu i połączyć ją z oprogramowaniem do akwizycji, aby działała po otrzymaniu wyzwalacza. Pozwala to na dodanie TBHP do każdego odwiertu bezpośrednio po pierwszym przejęciu, przed przejściem do następnego odwiertu. W ten sposób, po zakończeniu pierwszej rundy obrazowania, druga może rozpocząć się od razu, a wszystkie studzienki będą miały równy czas inkubacji z TBHP.

7. Przetwarzanie i analiza obrazu (± 30 min na płytkę 96-dołkową)

UWAGA: Całe przetwarzanie obrazów odbywa się w FIJI (http://fiji.sc), dołączonej wersji darmowego oprogramowania ImageJ. Powstał dedykowany skrypt do automatycznej analizy wewnątrzkomórkowych sygnałów ROS i mitochondrialnych, a także parametrów morfologicznych (RedoxMetrics.ijm, dostępny na życzenie). Podstawowe algorytmy są opisane w Sieprath et al.1.

  1. Upewnij się, że FIJI jest zainstalowany i działa.
  2. Uruchom FIJI i zainstaluj zestaw makr (Wtyczki - > Makra - > Zainstaluj ...). Spowoduje to wywołanie szeregu nowych makropoleceń, a także zestawu narzędzi do optymalizacji ustawień analizy, jak pokazano na Rysunek 3A.
  3. Otwórz interfejs konfiguracji, aby ustawić ustawienia analizy, klikając przycisk "S" (Rysunek 3B).
    1. Wybierz typ obrazu, liczbę kanałów i studnię, która została użyta do uzyskania obrazów płaskiego pola.
    2. Wskaż, który kanał zawiera komórki (kanał CM-H2DCFDA) lub mitochondria (kanał TMRM) i dostosuj parametry wstępnego przetwarzania i segmentacji dla każdego kanału w zależności od jakości obrazu (Rysunek 3B). Zaznacz pola wyboru "Tło" i "Kontrast", aby wykonać odpowiednio odejmowanie tła lub adaptacyjne wyrównanie histogramu z ograniczonym kontrastem16. Zdefiniuj sigma dla gaussowskiego rozmycia komórek i Laplace'owskiego wzmocnienia mitochondriów. Wybierz algorytm automatycznego progowania i wypełnij limity wykluczania rozmiaru (w pikselach). Jeśli zamiast algorytmu automatycznego progowania wybrano stały próg, wypełnij górny próg.
    3. Przetestuj ustawienia segmentacji na kilku wybranych obrazach pozyskanych zestawów danych, otwierając je i klikając przyciski "C" lub "M" w menu odpowiednio segmentacji komórek lub mitochondriów, a następnie dostosuj ustawienia, jeśli to konieczne. Przykładowy wynik jest pokazany w Rysunek 3C.
  4. Uruchom analizę wsadową w interesujących Cię folderach, klikając przycisk "#" i wybierając folder z obrazami. Dla każdego folderu spowoduje to utworzenie nowego katalogu "Output", zawierającego indywidualne zestawy ROI (pliki zip) i pliki wynikowe (.txt) dla każdego obrazu. Dla obu kanałów plik z wynikami zawiera deskryptory intensywności i morfologii. Plik wyników kanałów (komórek) CM-H2DCFDA zawiera dla każdego deskryptora średnią wartość łącznych zwrotów z inwestycji na jednym obrazie. Dla kanału TMRM plik wyników zawiera dla każdego deskryptora wartość dla każdego indywidualnie segmentowanego mitochondrialnego ROI.
  5. Po analizie wsadowej zweryfikuj wizualnie wydajność segmentacji na "stosie weryfikacyjnym", hiperstosie wszystkich obrazów z odpowiednią nakładką ROI, klikając przycisk "V". W ten sposób artefakty, takie jak nadmierna/niedostateczna segmentacja, nieostre obrazy lub cząsteczki kurzu/włókna na obrazach, mogą być już szybko wykryte. Dalszą selekcję można przeprowadzić podczas kontroli jakości danych (por. § 8).

8. Analiza danych, kontrola jakości (QC) i wizualizacja

Przetwarzanie i analiza surowych danych odbywa się za pomocą darmowego oprogramowania statystycznego R (http://www.rproject.org - wersja 3.3.2) oraz RStudio (http://www.rstudio.com/ - wersja 1.0.44). Aby szybko uzyskać i zobrazować wyniki, stworzono intuicyjną aplikację Shiny17 (dostępną na żądanie), która integruje i wizualizuje dane na mapach cieplnych i wykresach skrzynkowych, a także przeprowadza analizy statystyczne. Ogólnie rzecz biorąc, przepływ pracy składa się z dwóch następujących po sobie kroków. Po pierwsze, dane są przetwarzane i sprawdzane dla każdej płytki 96-dołkowej w celu wykrycia nieprawidłowych punktów danych. Po drugie, wyselekcjonowane dane ze wszystkich płyt danego eksperymentu są łączone i analizowane za pomocą nieparametrycznych testów wielowymiarowych18 i analizy głównych składowych.

  1. Upewnij się, że języki R i RStudio są zainstalowane i działają.
  2. Uruchom program RStudio.
  3. Otwórz błyszczącą aplikację RedoxMetrics i uruchom aplikację (wybierz, czy chcesz uruchomić ją w zewnętrznej przeglądarce).
  4. Na stronie "input" (dane wejściowe) wybierz katalog, w którym znajdują się pliki wyników z pliku RedoxMetrics.ijm.
  5. Upewnij się, że w tym katalogu znajduje się również "Setup.xlsx" (utworzony w kroku 3.15).
  6. Pliki z wynikami i informacje o konfiguracji są automatycznie importowane, przestawiane i wizualizowane.
    1. Strona "konfiguracja eksperymentalna" pokazuje układ eksperymentu. Skorzystaj z tej strony w celu weryfikacji.
    2. Następna strona, "Wyniki dla każdej płytki" pokazuje dane dla każdej płytki osobno w układzie płytek wielodołkowych oznaczonych kolorami, a także na wykresach skrzynkowych z wartościami odstającymi oznaczonymi nazwą studni i numerem obrazu. To ostatnie pozwala na łatwą kontrolę i identyfikację nieprawidłowych punktów danych (ekstremalnie wysokie lub niskie wartości w porównaniu ze średnimi wartościami zmierzonymi dla tego konkretnego leczenia - patrz Rysunek 4 dla przykładu).
      Korzystając z tych informacji, sprawdź obrazy odpowiadające nieprawidłowym punktom. W przypadku wykrycia nieprawidłowości należy je usunąć z analizy. Większość nieprawidłowości jest spowodowana nieprawidłową segmentacją, gdy (część) obrazu jest nieostra lub gdy silnie fluorescencyjne cząsteczki pyłu zakłócają prawidłową segmentację. Skrajne przypadki można już szybko wykryć za pomocą narzędzia do weryfikacji stosu (krok 7.5), ale na tym etapie odkrywane są bardziej subtelne zjawiska. Jeżeli nie można znaleźć żadnego wyraźnego lub technicznego powodu dla nieprawidłowej wartości, obraz nie powinien być usuwany z analizy.
    3. Opcjonalnie: utwórz nowy arkusz kalkulacyjny o nazwie "Drop.xlsx" z tylko jedną kolumną o nazwie "Upuść". W tej kolumnie wymień nazwy plików (w tym rozszerzenie ".tif") wszystkich obrazów, które muszą zostać usunięte z analizy (zidentyfikowanych w kroku 7.5 lub kroku 8.6.2). Prześlij ten plik za pomocą strony "wejście".
    4. Strona "Wyniki całego eksperymentu" pokazuje wyniki ze wszystkich płytek łącznie. Jeśli został przesłany plik upuszczania, jest on używany do usuwania określonych punktów danych z analizy.
      Dla każdego parametru indywidualnie dane są normalizowane dla każdej płyty zgodnie z odpowiednimi kontrolkami. Dane ze wszystkich płytek są następnie łączone, a następnie wykonywane są nieparametryczne testy wielowymiarowe z pakietu nparcomp18. Jeśli porównuje się tylko 2 zabiegi, wykonuje się dwa testy próbkowe dla nieparametrycznego problemu Behrensa-Fishera. W przypadku więcej niż 2 zabiegów stosuje się nieparametryczny test wielokrotnego porównania opartego na kontraście. Wyniki są wizualizowane za pomocą wykresów skrzynkowych.
    5. Strona "analiza skupień" pokazuje wyniki analizy głównych składowych (pakiet "statystyk" rdzenia PCA - R). Dane z 5 parametrów (podstawowy i indukowany ROM oraz potencjał błony mitochondrialnej, rozmiar i kołowość) są łączone w celu rozróżnienia różnych zabiegów w oparciu o czuły profil redoks. W tym celu przeprowadzana jest analiza głównych składowych (PCA) (pakiet "statystyk" rdzenia R). Wyniki są wizualizowane za pomocą biplot (pakiet ggbiplot - http://github.com/vqv/ggbiplot).
    6. Użyj strony "pobierz dane", aby pobrać ramki danych zaplecza zawierające przetworzone i przegrupowane dane, tak aby można je było ponownie wykorzystać do bardziej zaawansowanej wizualizacji danych lub analiz statystycznych.
      UWAGA: Typowe pułapki i potencjalne rozwiązania wymieniono w Tabeli 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test został przetestowany za pomocą kilku eksperymentów kontrolnych, których wyniki opisano w Sieprath et al.1. Krótko mówiąc, odpowiedź fluorescencyjna CM-H2DCFDA i TMRM na obcie wywołane zmiany w wewnątrzkomórkowych ROS i Δψm została określona ilościowo w celu określenia zakresu dynamicznego. W przypadku CM-H2DCFDA, NHDF wykazał liniowy wzrost sygnału fluorescencji po potraktowaniu rosnącymi stężeniami TBHP w zakresie od ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano metodę mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS i morfofunkcji mitochondriów w NHDF. Jego skuteczność została zademonstrowana w studium przypadku NHDF leczonego SQV. Wyniki potwierdzają wcześniejsze dowody z literatury, w których zaobserwowano podwyższony poziom ROS lub dysfunkcję mitochondriów po leczeniu inhibitorami proteazy HIV typu 1, choć w oddzielnych eksperymentach 19,20,21,22,23,2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy stwierdzają, że nie ma konkurujących ze sobą interesów finansowych ani innych konfliktów interesów. Autor korespondencyjny zapewnia również, że wszyscy autorzy zostali poproszeni o ujawnienie wszelkich konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania były wspierane przez Uniwersytet w Antwerpii (TTBOF/29267, TTBOF/30112), Specjalny Fundusz Badawczy Uniwersytetu w Gandawie (projekt BOF/11267/09), NB-Photonics (kod projektu 01-MR0110) oraz inicjatywę CSBR (Centers for Systems Biology Research) z Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO; Nr katalogowy: CSBR09/013V). Fragmenty tego manuskryptu zostały zaadaptowane z innej publikacji1, za zgodą Springera. Autorzy dziękują Geertowi Meesenowi za pomoc przy mikroskopie szerokokątnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki
Tetrametylorodamina, ester metylowy, nadchloran (TMRM)ThermoFisher ScientificT668
CM-H2DCFDA (Ogólny wskaźnik stresu oksydacyjnego)ThermoFisher ScientificC6827
DimetylosulfotlenekSigma)AldrichD8418
MatriPlate 96-dołkowa płytka MicroWell ze szklanym dnem 630 µ L-Black 0,17 mm Low GlassLided Brooks life science systemsMGB096-1-2-LG-L
HBSS bez czerwieni fenolowej 500 mlLonzaBE10-527F
DMEM wysoka glukoza z L-glutaminąLonzaBE12-604F
Sól fizjologiczna z fosforanem (PBS) bez Ca i MgLonzaBE17-516F
HEPES 1 M 500 mLLonza17-737F
Roztwór trypsyny-versenu (EDTA)LonzaBE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka Anty-królik IgG (H+L)Jackson711-166-152Przeciwciało używane do pozyskiwania obrazu płaskiego pola
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment osiołka Anty-królik IgG (H+L)Jackson711-546-152Przeciwciało używane do pozyskiwania obrazu płaskiego pola
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt
Mikroskop szerokokątny zaćmienia Nikon TiNikon
Perfect Focus System (PFS)Sprzętowy system autofokusa
CFI Plan Apo Lambda 20Xobiektyw Nikon
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 z modułem JOBSNikonTo oprogramowanie służy do sterowania mikroskopem i programowania/wykonywania automatycznej akwizycji obrazu ImageJ
(FIJI) Wersja 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Wersja 1.0.44Rstudio
R wersja 3.3.2

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, article ID 329635 1-17 (2012).
  3. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
  4. Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
  5. Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
  6. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
  7. Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
  8. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  9. Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
  10. Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology? Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
  11. Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
  12. Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
  13. Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
  14. Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
  15. Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
  16. Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , Academic Press Professional, Inc. 474-485 (1994).
  17. Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , https://CRAN.R-project.org/package=shiny (2017).
  18. Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
  19. Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
  20. Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
  21. Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
  22. Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
  23. Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
  24. Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
  25. Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
  26. Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035(2015).
  27. Invitrogen. Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006).
  28. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  29. Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
  30. Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
  31. Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
  32. Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
  33. Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
  34. Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
  35. Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
  36. Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
  37. Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
  38. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

High content MicroscopyReactive Oxygen SpeciesMitochondrial Membrane PotentialMitochondrial MorphologyCellular Redox ProfilingFluorescence MicroscopyImage AnalysisCM H2DCFDA StainingTMRM StainingPrincipal Component Analysis

Powiązane artykuły