Ilościowa wizualizacja nacieku leukocytów w mysim modelu piorunującego zapalenia mięśnia sercowego za pomocą mikroskopii świetlnej

Summary

Tutaj opisujemy podejście do mikroskopii świetlnej w celu wizualizacji nacieku leukocytów CD45⁺ w mysim modelu aseptycznego, piorunującego zapalenia mięśnia sercowego, które jest indukowane przez leczenie myszami CD11c.DTR toksyną dyfterytową dotchawiczą.

Abstract

Mikroskopia fluorescencyjna (LSFM), w połączeniu z protokołami oczyszczania chemicznego, stała się złotym standardem do analizy fluorescencyjnie znakowanych struktur w dużych próbkach biologicznych i jest ograniczona do rozdzielczości komórkowej. Tymczasem ciągłe udoskonalanie podstawowych protokołów i zwiększona dostępność specjalistycznych systemów komercyjnych umożliwiają nam badanie mikrostruktury całych narządów myszy, a nawet pozwalają na scharakteryzowanie zachowania komórek w różnych podejściach do obrazowania żywych komórek. W tym miejscu opisujemy protokół przestrzennej wizualizacji całego montażu i kwantyfikacji populacji leukocytów CD45 ⁺ w sercach myszy z zapaleniem skóry. W metodzie wykorzystano transgeniczny szczep myszy (CD11c.DTR), który, jak wykazano niedawno, służy jako solidny, indukowalny model do badania rozwoju piorunującego śmiertelnego zapalenia mięśnia sercowego, charakteryzującego się letalnymi zaburzeniami rytmu serca. Protokół ten obejmuje indukcję zapalenia mięśnia sercowego, barwienie komórek za pośrednictwem przeciwciał dożyciowych, przygotowanie narządów i LSFM z późniejszym komputerowym przetwarzaniem obrazu. Chociaż protokół jest przedstawiany jako metoda wysoce dostosowana do naszego konkretnego zagadnienia naukowego, reprezentuje plan łatwo regulowanego systemu, który może również celować w zupełnie inne struktury fluorescencyjne w innych narządach, a nawet u innych gatunków.

Introduction

Podczas ewolucji mikroskopii świetlnej pojawiło się wiele wyspecjalizowanych form, wszystkie z nich zostały opracowane w celu zminimalizowania ograniczeń w procesie wizualizacji dla poszczególnych próbek. Jedną z takich metod jest mikroskopia fluorescencyjna z użyciem arkuszy świetlnych (LSFM). Po raz pierwszy opracowany w 1903 roku przez Siedentopfa i Zsigmondy'ego¹ i znajdujący swoje pierwsze podstawowe zastosowania biologiczne na początku lat 90. ², LSFM stał się najpotężniejszym jak dotąd narzędziem mikroskopowym do wizualizacji dużych okazów, takich jak nienaruszone narządy myszy, z rozdzielczością sygnału fluoresce....

Protocol

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi UE i zostały zatwierdzone przez odpowiednie władze lokalne w Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Niemcy). Zwierzęta były wykorzystywane i trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF).

1. Indukcja zapalenia mięśnia sercowego przez toksynę błonicy (DTX)

1. Przygotować roztwór DTX do indukcji zapalenia mięśnia sercowego, rozcieńczając roztwór podstawowy DTX solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do roztworu roboczego o stężeniu 1 μg/ml.
2. Nan....

Results

Przedstawione podejście LSFM analizuje rozkład i ilość leukocytów w sercach myszy po indukcji ciężkiego zapalenia mięśnia sercowego. Rycina 1A wyjaśnia protokół wstępnego leczenia transgenicznych myszy CD11c.DTR w celu indukcji zapalenia mięśnia sercowego. Ten krok stanowi niezbędny wyzwalacz do rekrutacji leukocytów do mięśnia sercowego. Po udanym zastosowaniu DTX u zwierząt rozwijają się poważne objawy chorobowe, takie jak ogólne osłabienie, jadłowstręt i utrata masy ci.......

Discussion

We współczesnych naukach przyrodniczych mikroskopowa wizualizacja procesów biologicznych odgrywa coraz większą rolę. W tym kontekście, w ciągu ostatnich dwóch stuleci dokonano wielu zmian, które pomagają odpowiedzieć na pytania, na które do tej pory nie można było odpowiedzieć. Po pierwsze, istnieje wyraźna tendencja do zasadniczego zwiększania rozdzielczości mikroskopów świetlnych. Z mikroskopią oświetlenia strukturalnego (SIM)^21,22, mikroskopią wymuszonej emisj.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Toksyna błonicza	Sigma Aldrich	D0564
sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Biochrom	L182-10
ketamina [50 mg/mL]	Inresa	PZN 4089014
ksylazyna [2 %]	Ceva
	Braun	REF 9161502	Braun Omincan F
Cewnik żylny zamieszkany	Becton Dickinson	REF 381923	BD Insyte Autoguard
	Harvard Apparatus	73-0044	Przeciwciało MiniVent
anit-CD45 (AF647)	BioLegend	103124
dwuwodny sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)	Carl Roth	8043.2
(21 G)	BD Biosciences	REF 387455	BD valu-set
paraformaldehyd	Rurka PE Sigma Aldrich	P6148
(5 ml)	Carl Roth	EKY9.1	Etanol Rotilabo
	Carl Roth	9065.4
eter dibenzylowy	Rotator rurkowy Sigma-Aldrich	108014
	Miltenyi Biotec	130-090-753	MACSmix
agarozy (o niskim zżelowaniu)	Sigma Aldrich	Forma A4018
(15 x 15 x 5 mm)	Tissue Tek	4566	Cryomold
system mikroskopów arkuszowych LaVision	Biotec		Ultramikroskop
korpus mikroskopu	Olympus		MVX10
obiektyw	Olympus		0.5  NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5  mm
Kamera sCMOS 5,5MP	Andor Technology
488 nm OPSL (50mW) laser	Koherentny
647 nm  laser diodowy (50mW)	Koherentne
oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazu 3D	Bitplane		IMARIS Ver. 8.3
transgeniczny szczep myszy	Steffen Jung i wsp.		CD11c.DTR
wt szczep myszy	Envigo		Balb/c Ola Hsd J
Moduł laserowy	LaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Soczewka obiektywowa