Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55453

⸱

24 marca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Streszczenie

Wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych jest utrudniony przez nieefektywne przełożenie związków o aktywności in vitro na skuteczność w warunkach klinicznych. Jest to prawdopodobnie spowodowane brakiem uwzględnienia fizjologicznie istotnych barier penetracji komórkowej, które istnieją w zakażonym gospodarzu. Niedawno opracowaliśmy alternatywny model infekcji, który generuje duże struktury agregacji makrofagów zawierające w swoim rdzeniu gęsto upakowane M. tuberculosis (Mtb), które nadawały się do testowania wrażliwości na leki. Ten model infekcji jest niedrogi, szybki i, co najważniejsze, kompatybilny z BSL-2. W tym miejscu opisujemy procedury eksperymentalne mające na celu generowanie struktur zagregowanych Mtb/makrofagów, które wytwarzałyby Mtb z pasażami makrofagów do badania wrażliwości na leki. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób ten system infekcji można bezpośrednio dostosować do formatu płytki 96-dołkowej, wykazując zdolność przepustową do badań przesiewowych bibliotek związków przeciwko Mtb. Ogólnie rzecz biorąc, test ten jest cennym dodatkiem do obecnie dostępnego zestawu narzędzi do odkrywania leków Mtb ze względu na jego prostotę, opłacalność i skalowalność.

Wprowadzenie

Gruźlica (TB) pozostaje poważnym globalnym zagrożeniem dla zdrowia, pomimo dostępności schematów chemioterapii przeciwgruźliczej od ponad 40 lat1. Wynika to częściowo z wymogu stosowania długich okresów leczenia wynoszących ponad 6 miesięcy przy użyciu wielu kombinacji leków, co prowadzi do nieprzestrzegania zaleceń przez pacjenta2. Pojawienie się lekoopornej gruźlicy w ostatnich latach jeszcze bardziej spotęgowało problemy w dziedzinie, w której pomyślny rozwój klinicznie zatwierdzonych leków praktycznie nie istnieje3. Rzeczywiście, pomimo wyczerpującego rozwoju leków przeciwgruźliczych, tylko jeden lek został zatwierdzony przez FDA do użytku klinicznego w ciągu ostatnich 40 lat4. Dlatego pilnie potrzebne są nowe generacje leków przeciwgruźliczych, aby rozwiązać ten problem.

Kluczowym problemem w odkrywaniu leków na gruźlicę jest brak udanego przejścia od związków o aktywności in vitro do skuteczności w warunkach klinicznych5,6,7. Początkowo do badań przesiewowych leków anty-Mtb stosowano podejścia oparte na celach5, które nie były w stanie przekształcić się w całe komórki bakteryjne. Nawet jeśli używane są komórki Mtb, często wykonuje się to przy użyciu kultur wyhodowanych w bulionie, które nie przewidują dokładnie skuteczności leku in vivo8,9. Problemy te zostały rozpoznane, a testy przesiewowe leków przeciwko makrofagom zawierającym Mtb lub utajonemu Mtb zostały pomyślnie ustanowione8,10,11,12. Jednak nawet te bardziej zaawansowane testy nie uwzględniają w wystarczającym stopniu barier penetracji, które leki napotykają w nieunaczynionych zmianach płucnych oraz w ogniskach martwiczych w miejscu zakażenia. Rzeczywiście, nawet w przypadku ryfampicyny, leku pierwszego rzutu na gruźlicę, nieoptymalne dawkowanie zostało zakwestionowane z powodu niewystarczającej penetracji tkanek in vivo i płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF)13,14,15, a także zmniejszoną skuteczność przeciwko wewnątrzkomórkowej Mtb8,9. W związku z tym nowe modele i testy, które uwzględniałyby te parametry we wczesnym procesie opracowywania odprowadzeń, niewątpliwie usprawniłyby wysiłki na rzecz odkrywania leków na gruźlicę.

Aby zaspokoić tę potrzebę, niedawno stworzyliśmy niedrogi, szybki i kompatybilny z BSL-2 alternatywny model infekcji do testowania skuteczności leków Mtb16. Ten model infekcji wytworzył gęsto upakowany Mtb w dużych strukturach agregatów makrofagów, które podsumowały fizjologicznie istotne bariery penetracji komórkowej i wygenerowały Mtb z pasażami makrofagów ze zmienionym stanem fizjologicznym przypominającym utajony Mtb. Mtb uzyskany z tego modelu infekcji połączono z testem mikromiareczkowania rezazuryny (REMA) w celu oceny skuteczności leku, który dał wyniki zgodne z innymi modelami infekcji wewnątrzkomórkowych i dobrze korelował z raportowaną zdolnością powszechnych leków na gruźlicę do osiągania wysokich stężeń płynu mózgowo-rdzeniowego w stosunku do stężeń w surowicy16.

Tutaj szczegółowo opisujemy generowanie struktur agregatów Mtb/makrofagów w celu wytworzenia Mtb z pasażami makrofagów, nadających się do testowania wrażliwości na leki za pomocą REMA. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób ten system infekcji można dostosować do formatu 96-dołkowego w celu zapewnienia zgodności z przepływowymi badaniami przesiewowymi potencjalnych leków przeciwgruźliczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Ponieważ M. tuberculosis mc26206 jest szczepem awirulentowym17,18, wszystkie prace w tym protokole mogą być wykonywane w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).

1. Warunki hodowli białka zielonej fluorescencji wyrażającego M. tuberculosis mc26206 (Mtb-GFP)

UWAGA: Szczep auksotrofowy M. tuberculosis H37Rv mc26206 (ΔpanCD, ΔleuCD) przekształcony za pomocą plazmidu pMN437 eksprymującego gfp jest używany w całym tym protokole16. Możliwe jest zastąpienie szczepu Mtb-GFP szczepem typu dzikiego bez ekspresji GFP, aby umożliwić łatwiejszy dostęp do szczepu dla badaczy. Jednak ekspresja gfp jest pożądana, aby umożliwić wizualne potwierdzenie fagocytozy i tworzenie agregatów Mtb/makrofagów. W celu długotrwałego przechowywania, Mtb-GFP zamrożono w temperaturze -80 °C w kompletnych pożywkach 7H9 (opisanych w kroku 1.1) uzupełnionych 20% glicerolem.

  1. Przygotować kompletną pożywkę Mtb-GFP (7H9-C), uzupełniając pożywkę 7H9 10% Middlebrook OADC, 0,02% tyloksapolu, 24 μg/ml kwasu D-pantotenowego, 50 μg/ml L-leucyny i 50 μg/ml higromycyny B.
  2. Rozmrozić jedną fiolkę Mtb-GFP i dodać do 10 ml 7H9-C w kolbie PETG o pojemności 30 ml z kwadratowym dnem.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej (50 obr./min). Wykonuj pomiary gęstości optycznej (OD600) co kilka dni, aż OD600 osiągnie 1.0 (około 5-8 dni).
  4. Rozcieńczyć i pasażować kulturę w razie potrzeby, aby utrzymać OD600 w zakresie 0,2-1,0.
  5. W przypadku infekcji należy użyć ustalonej hodowli Mtb-GFP w logarytmicznej fazie wzrostu (OD600 0,6-1). Aby uniknąć grudkowatych kultur, należy poddać sonikację kolby hodowlanej Mtb w łaźni wodnej (130 W; impulsy 3 x 5 s) raz lub dwa razy w tygodniu

2. Warunki hodowli komórek THP-1

  1. Przygotuj kompletną pożywkę komórkową THP-1 (RPMI-C), uzupełniając pożywkę RPMI 1640 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminy i 10 mM HEPES.
  2. Inkubować komórki w kolbie T-75 w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 .
  3. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub cytometrii przepływowej co drugi dzień i utrzymuj komórki THP-1 w gęstości od 0,1 do 0,6 miliona na ml.

3. Protokół infekcji do generowania struktur agregacji Mtb/Macrophage

  1. Przygotowanie komórek THP-1 (na płytkę 96-dołkową)
    1. Odwirować 7 x 106 komórek THP-1 przy 250 x g przez 5 minut. Zawiesić w 7 ml RPMI-C.
  2. Przygotowanie do MTB-GFP
    1. Wirować 2,8 x 108 Mtb-GFP przy 3 200 x g przez 5 minut w wirówce z odchylanym kubełkiem, stosując konwersję OD600 1,0 = 3 x 108 bakterii/ml.
    2. Przemyć raz za pomocą RPMI-C i odwirować jak w kroku 3.2.1.
    3. Zawiesić ponownie w 7 ml RPMI-C i wirować przez 10 s.
  3. Zakażenie
    UWAGA: Zobacz rysunek 1, aby zapoznać się z szablonem.
    1. Przygotować 96-dołkową płytkę, dodając 200 μl sterylnej wody w rzędach A i H oraz kolumnach 1 i 12 jako obwódkę wodną, aby zapobiec parowaniu pożywki.
    2. Dodaj 200 μl RPMI-C do kolumny 2 (od B2 do G2) dla kontrolki tła (puste).
    3. W celu zakażenia należy dodać zawiesinę Mtb-GFP (krok 3.2) do zawiesiny komórek THP-1 (krok 3.1) i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Ostateczna gęstość komórek THP-1 wynosi 5 x 105 na ml, a odpowiadająca jej wielokrotność infekcji wynosi 40.
    4. Wlać zawiesinę THP-1/Mtb-GFP do zbiornika o pojemności 25 ml.
    5. Dodać 200 μl zawiesiny THP-1/Mtb-GFP do wszystkich pozostałych 96 dołków (od B3 do G11) za pomocą pipety wielokanałowej.
      UWAGA: W przypadku pracy z wieloma płytkami 96-dołkowymi, należy regularnie zawieszać pozostałą zawiesinę THP-1/Mtb w zbiorniku, aby zapewnić równomierne dodanie mieszanki do każdej studzienki.
    6. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 7-10 dni.
    7. Zmieniaj pożywkę co 2 dni, powoli usuwając 100 μl zużytej pożywki z górnej części każdej studzienki i delikatnie dodając 100 μl wstępnie podgrzanego RPMI-C za pomocą wielokanałowej pipety. Nie należy ponownie zawieszać studni i naruszać agregatów Mtb/makrofagów na dnie studni.
    8. Codziennie badaj wzrokowo studzienki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (obiektyw 4-10X), zwracając uwagę na wielkość agregatów Mtb / makrofagów. W dniach 7-10 agregaty Mtb/makrofagów powinny być wystarczająco duże (patrz rysunek 2 w celu odniesienia), aby można było przystąpić do badania skuteczności leku (sekcja 4).
    9. W razie potrzeby uchwyć obrazy 96 studzienek za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania komórek wyposażonego w jasne pole i zestawy filtrów GFP, aby udokumentować tworzenie się agregatów Mtb/makrofagów.
      UWAGA: Jeśli użytkownicy nie mają dostępu do zautomatyzowanego systemu obrazowania, obrazy reprezentatywnych studzienek można wykonać za pomocą dowolnego odpowiedniego mikroskopu z GFP i funkcją jasnego pola.

4. Test hamowania wzrostu w celu oceny skuteczności leku przeciwko Mtb pochodzącemu z agregatów Mtb/Makrofagów

  1. Przygotowanie leku (trzy razy dla dwóch leków)
    UWAGA: Zobacz rysunek 1A, aby zapoznać się z szablonem.
    1. Na oddzielnej płytce 96-dołkowej dodać 125 μl pożywki 7H9-C do B2 do G10.
    2. Przygotować dwa leki o podwójnym najwyższym pożądanym stężeniu końcowym w 1 ml 7H9-C, aby uwzględnić rozcieńczenie w kroku 4.2.4.
    3. Dodać 250 μl każdego leku do studzienek B11-C11-D11 i E11-F11-G11, odpowiednio w celu trzykrotnego leczenia.
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej seryjnie rozcieńczyć badane leki dwukrotnie, przenosząc 125 μl z B11-G11 do B10-G10. Mieszać pipetując 5 razy na każdym etapie.
    5. Kontynuuj przesuwanie 125 μl od kolumny do kolumny (od prawej do lewej) po płytce i zatrzymaj się za kolumną 4.
    6. Po wymieszaniu kolumny 4 wyrzucić 125 μl do pojemnika na odpady. Kolumny 2 i 3 nie powinny zawierać żadnych leków, które mogłyby być stosowane jako tło (ślepa próba) i dodatnie kontrole wzrostu.
      UWAGA: Alternatywnie postępuj zgodnie z szablonem na rysunku 1B, aby przetestować biblioteki leków. Każda 96-dołkowa płytka może pomieścić 58 leków w jednym stężeniu. Przygotuj tę płytkę leku, używając dwukrotnie pożądanego stężenia końcowego, ponieważ zostanie ona rozcieńczona na pół w kroku 4.2.4.
  2. Leczenie farmakologiczne:
    1. Pobrać 96-dołkową płytkę zawierającą makrofagi zakażone Mtb (agregaty Mtb/makrofagi).
    2. Ostrożnie zdekantować wszystkie odpowiednie studzienki (od B2 do G11) za pomocą pipety wielokanałowej. Wykonaj to w dwóch etapach: najpierw usuń 150 μl bez przechylania płytki, a następnie usuń pozostałą pożywkę (~50 μl), przechylając płytkę i wkładając końcówkę pipety do dolnej krawędzi studzienki. Ponieważ agregaty Mtb/makrofagów przylegają do dna studni, nie należy tracić żadnego materiału.
    3. Delikatnie dodać 100 μl pożywki 7H9-C do wszystkich odpowiednich studzienek (od B2 do G11) płytki zawierającej agregaty Mtb/makrofagów.
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 100 μl z płytki zawierającej 96 dołków leku (krok 4.1) do odpowiednich dołków płytki infekcyjnej.
    5. Umieścić w szczelnie zamkniętej torbie i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C.

5. Kwantyfikacja skuteczności leku za pomocą testu mikromiareczkowania resazuryny

  1. Przygotować roztwór podstawowy rezazuryny o końcowym stężeniu 0,8 mg/ml wH2O. Przefiltrować przez membranę PVDF o wielkości porów 0,22 μm do sterylizacji.
  2. Przygotować roztwór roboczy rezazuryny, mieszając podstawowy roztwór rezazuryny,H2Oi Tween-80 (20% roztwór wH2O) w stosunku 2:1:1. Końcowe stężenia wynoszą 0,4 mg/ml rezazuryny i 5% Tween-80.
  3. Za pomocą czytnika płytek ustawić program do odczytu fluorescencji przy wzbudzeniu 530 nm i emisji 590 nm co 30 minut przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Czytnik płytek wstępnie podgrzanych do 37 °C.
  4. Dodać 20 μl roztworu roboczego resazuryny do wszystkich odpowiednich studzienek (od B2 do G11) płytki poddanej działaniu leku (krok 4.11) za pomocą pipety wielokanałowej.
  5. Umieść tabliczkę na czytniku płytek i uruchom program skonfigurowany w kroku 5.3.
    UWAGA: Aby ułatwić przetwarzanie dużych objętości płytek testowych, wystarczy rozwinąć test w inkubatorze o temperaturze 37 °C i wykonywać pojedyncze odczyty fluorescencji co 24 godziny. Dotyczy to również użytkowników, którzy nie mają dostępu do czytnika płytek z możliwością kinetyczną i inkubacyjną
    6. .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby potwierdzić stabilność adaptacji tego modelu infekcji do formatu płytki 96-dołkowej, zbadaliśmy tutaj podatność Mtb pochodzących z naszego zaadaptowanego modelu infekcji w płytce 96-dołkowej na ryfampicynę (RIF) oraz moksifłoksacynę (MOXI), zgodnie ze schematem przedstawionym na rysunku 1A. Wykazujemy, że generowanie struktur agregatów Mtb/makrofagów, kluczowych dla tego testu, może być wiarygodnie realizowane w formacie płytki 96-dołkowej (r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu szczegółowo opisaliśmy alternatywny model infekcji Mtb , który nadaje się do testowania skuteczności leków. Model ten uwzględnia dwa kluczowe czynniki, które powinny być bardziej brane pod uwagę podczas wczesnego procesu opracowywania leków na gruźlicę: obecność fizjologicznie istotnych barier dla przenikania leków oraz zmiany metaboliczne Mtb podczas infekcji. Podczas gdy wcześniej pokazaliśmy korzyści płynące z naszego modelu infekcji i zaproponowaliśmy możliwość zwiększenia skali infekc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Frankowi Wolschendorfowi za dostęp do automatycznego czytnika płytek obrazowych Cytation 3. Prace te zostały częściowo sfinansowane z grantu NIH R01-AI104499 dla OK. Część prac została wykonana w obiektach UAB CFAR oraz przez UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, które są finansowane przez NIH/NIAID P30 AI027767 i NIH 5P30 AR048311.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
7H9BD Difco271310Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta
Middlebrook OADCBD Biosciences212351
TyloxapolSigmaT8761Przygotuj 20% roztwór podstawowy w filtrze H2O; sterylizuj
filtr Kwas D-pantotenowy sól półwapniowaSigmaP5710Przygotować 24 mg/ml roztwór podstawowy w H2O; filtr sterylizuj
L-leucynęMP Biomedicals194694Przygotuj 50 mg/ml roztwór podstawowy w H2O; sterylizuj filtr
Hygromycyna BEMD Millipore400051Przygotuj roztwór podstawowy 200 mg/ml w H2O
Nalgene Kwadratowa butelka z pożywką PETGThermo Fisher2019-0030
RPMI 1640 mediaHycloneSH30027.01
Płodowa surowica bydlęcaAtlanta BiologicalsS12450H
L-glutaminaCorningMT25005CI
HEPESHycloneSH30237.01
Cytacja 3 czytnik płytekBiotekWymienny z dowolnym czytnikiem płytek fluorescencyjnych i mikroskopem
OprogramowanieGen5 BiotekNagrywanie i analiza wersja rezasurin
Ryfampicyna Fisher Scientific BP2679250Przygotuj 10 mg/ml roztworu podstawowego w H2O
Chlorowodorek moksyfloksacynyAcros Organics457960010Przygotuj 10 mg/ml roztworu podstawowego w H2O
Sól sodowa rezazurynySigmaR7017Przygotuj 800 μ g/ml roztworu podstawowego w H2O; sterylizacja filtra
Tween-80Fisher Scientific T164500Przygotuj 20% roztwór podstawowy w sterylizacji filtra H2O;

Bibliografia

  1. Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
  2. Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
  3. Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
  4. Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
  5. Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
  6. Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
  7. Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
  8. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645(2009).
  9. Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
  10. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114(2014).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
  12. Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
  13. Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117(2015).
  14. van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
  15. Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
  16. Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
  17. Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
  18. Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
  19. Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
  20. Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
  21. Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Struktury agregat w makrofag wbadanie wra liwo ci na lekitest rezazurynowyformat p ytki 96 do kowejmonocyty THP1model zgodny z poziomem BSL 2wysokoprzepustowe przesiewaniemikroskopia fluorescencyjnabarwnik ywotno ci
Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.