Artykuł metodologiczny

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55456

⸱

22 marca 2017

 , 
1Department of Internal Medicine- Cardiology, UT Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Streszczenie

Bezpośrednie przeprogramowanie jednego typu komórek na inny stało się ostatnio potężnym paradygmatem dla medycyny regeneracyjnej, modelowania chorób i specyfikacji linii. W szczególności konwersja fibroblastów w indukowane miocyty podobne do kardiomiocytów (iCLM) przez Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 (GHMT) stanowi ważną drogę do generowania miocytów serca de novo in vitro i in vivo. Najnowsze dowody sugerują, że GHMT generuje większą różnorodność podtypów serca, niż wcześniej sądzono, co podkreśla potrzebę systematycznego podejścia do przeprowadzania dodatkowych badań. Zanim jednak bezpośrednie przeprogramowanie będzie mogło zostać wykorzystane jako strategia terapeutyczna, należy szczegółowo zrozumieć mechanistyczne podstawy konwersji linii, aby wygenerować określone podtypy serca. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania iCLM poprzez przeprogramowanie mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) za pośrednictwem GHMT.

Przedstawiamy metody izolacji MEF, produkcji retrowirusa i infekcji MEF, aby dokonać efektywnego przeprogramowania. Aby określić tożsamość podtypu przeprogramowanych komórek, szczegółowo opisujemy krok po kroku podejście do przeprowadzania immunocytochemii na iCLM przy użyciu zdefiniowanego zestawu kompatybilnych przeciwciał. Przedstawiono również metody mikroskopii konfokalnej, identyfikacji i kwantyfikacji iCLM oraz poszczególnych podtypów przedsionkowych (iAM), komorowych (iVM) i rozruszników serca (iPM). Na koniec omawiamy reprezentatywne wyniki prototypowych eksperymentów z bezpośrednim przeprogramowaniem i podkreślamy ważne aspekty techniczne naszego protokołu, aby zapewnić wydajną konwersję linii. Podsumowując, nasz zoptymalizowany protokół powinien zapewnić badaczom stopniowe podejście do przeprowadzania znaczących eksperymentów z przeprogramowaniem serca, które wymagają identyfikacji poszczególnych podtypów CM.

Wprowadzenie

Serce jest pierwszym funkcjonalnym organem, który rozwija się w zarodku1,2. W połączeniu z układem krążenia dostarcza tlen, składniki odżywcze i mechanizm usuwania odpadów podczas rozwoju. Trzy tygodnie po zapłodnieniu ludzkie serce bije po raz pierwszy, a jego prawidłowa regulacja jest utrzymywana przez kardiomiocyty (CM). Nieodwracalna utrata tych wyspecjalizowanych komórek jest zatem podstawowym problemem leżącym u podstaw postępującej niewydolności serca. Podczas gdy niektóre organizmy, takie jak danio pręgowany i Xenopus, mają potencjał regeneracji serca, serce dorosłego ssaka jest bardziej ograniczone3,5,6. Tak więc, biorąc pod uwagę krytyczną funkcję serca, nie jest zaskakujące, że choroby serca są główną przyczyną zgonów na świecie, odpowiadając za 600 000 zgonów w samych Stanach Zjednoczonych7. Dlatego terapie komórkowe mające na celu skuteczną naprawę lub wymianę uszkodzonego mięśnia sercowego cieszą się dużym zainteresowaniem klinicznym.

Przełomowe badanie Yamanaki i współpracowników8 wykazało, że wymuszona ekspresja czterech czynników transkrypcyjnych jest wystarczająca do przekształcenia w pełni zróżnicowane komórki fibroblastów w pluripotencjalne komórki macierzyste. Jednak zdolność rakotwórcza wszystkich strategii pluripotencjalnych komórek macierzystych była krytycznym problemem w ich stosowaniu do celów terapeutycznych. To zmotywowało naukowców do poszukiwania alternatywnych metod transdyferencjacji komórek przy jednoczesnym unikaniu stadium pluripotencjalnego. Ostatnio kilka grup wykazało wykonalność tej strategii, wykazując bezpośrednią konwersję mysich fibroblastów do indukowanych komórek podobnych do kardiomiocytów (iCLM) z ektopową ekspresją czynników transkrypcyjnych Gata4, Mef2c, Tbx5, a później Hand2 (odpowiednio GMT i GHMT)9,10. Co więcej, tę samą strategię można zastosować in vivo i w tkankach pochodzenia ludzkiego9,11,12. Ostatnie badania zwróciły uwagę na dodatkowe czynniki lub szlaki sygnałowe, które można modulować, aby jeszcze bardziej poprawić wydajność przeprogramowania serca13,14,15. Podsumowując, badania te pokazują potencjał ukierunkowanej transdyferencjacji w terapiach regeneracyjnych. Jednak niska skuteczność przeprogramowania CM, nieznane mechanizmy molekularne, niespójna odtwarzalność wynikająca z różnic metodologicznych 16 oraz niejednorodna natura iCLM pozostają nierozwiązane.

Aby bezpośrednio ocenić heterogeniczność iCLM, zaprojektowaliśmy dyskretny i solidny test jednokomórkowy do identyfikacji rozwoju sarkomeru i specyfikacji linii serca - dwóch niezbędnych cech funkcjonalnych kardiomiocytów. Istnieją co najmniej trzy główne typy CM w sercu, zdefiniowane przez ich lokalizację i unikalne właściwości elektryczne: przedsionkowe (AM), komorowe (VM) i rozrusznik serca (PM)17,18,19,20. W zaaranżowanej kombinacji umożliwiają prawidłowe pompowanie krwi. Podczas uszkodzenia serca może to dotyczyć jednego lub wszystkich podtypów, a rodzaj terapii komórkowej będzie musiał być rozpatrywany indywidualnie dla każdego przypadku. Obecnie większość strategii koncentruje się na ogólnym generowaniu kardiomiocytów, podczas gdy niewiele pracuje się nad badaniem mechanizmów molekularnych, które regulują specyfikację podtypów.

Poniższe badanie szczegółowo opisuje, jak prawidłowo określić ilościowo dobrze zorganizowane sarkomery i zidentyfikować różnorodny zestaw podtypów kardiomiocytów. Używając myszy reporterowej specyficznej dla rozrusznika serca (PM), jesteśmy w stanie zastosować podejście immunocytochemiczne do rozróżnienia indukowanych miocytów podobnych do przedsionków (iAM), indukowanych miocytów komorowych (iVM) i indukowanych miocytów podobnych do PM (iPMs)21. Z naszych obserwacji wynika, że tylko komórki, które wykazują organizację sarkomerową, są zdolne do spontanicznego bicia. Ta unikalna platforma przeprogramowywania pozwala na ocenę roli niektórych parametrów w organizacji sarkomerów, specyfikacji podtypów i efektywności przeprogramowania CM w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne dotyczące praktyk na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w UT Southwestern Medical Center.

1. Izolacja mysich fibroblastów embrionalnych Hcn4-GFP E12.5 (MEF)

  1. Ustaw krycie czasowe między homozygotycznymi samcami Hcn4-GFP i samicami CD-1.
  2. Złożyć w ofierze ciężarną kobietę w E12.5 poprzez eutanazję dwutlenku węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
    1. Usuń rogi macicy za pomocą kleszczy preparacyjnych, jak opisano wcześniej22,23 i umieść je na szalce Petriego na lodzie z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) bez Ca2+ lub Mg2+.
  3. Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w kapturze do hodowli tkankowej przy użyciu sterylnej techniki.
    1. Usuń zarodki z macicy i worka owodniowego za pomocą nożyczek i kleszczy preparacyjnych. Trzymaj łożysko przymocowane dla lepszej obsługi. Ciężarne samice CD-1 zazwyczaj rodzą od 10 do 14 młodych.
    2. Za pomocą kleszczy preparacyjnych pobrać wyizolowane zarodki i szybko przepłukać je dwukrotnie w 70% (v/v) EtOH.
      UWAGA: Mycie powinno być szybkie, aby zminimalizować śmierć komórek.
    3. Usuń głowę, kończyny, ogon i narządy wewnętrzne, w tym serce z izolowanych zarodków.
    4. Umieść pozostałą tkankę w 10-centymetrowym naczyniu z 1 ml 1x PBS i drobno zmielić za pomocą sterylnej żyletki do wielkości około 1mm3.
    5. Przenieść zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z PBS.
    6. Wirować w 300 x g przez 3 min. Ostrożnie odessać nadmiar PBS.
    7. Dodać 1 ml sterylnego 0,25% trypsyny-EDTA na zarodek. Inkubować komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Delikatnie mieszaj probówkę co 4 minuty. Nadmierne trawienie tkanki znacznie obniży plon.
    8. Mieszanina komórek wirowych z maksymalną prędkością (3 200 obr./min) przez 4 s.
    9. Dodać 2 ml pożywki z fibroblastów na zarodek i wymieszać. Przefiltrować przez sitko o wielkości 100 μm za pomocą pipety, aby wspomóc komórki przez sitko. Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z formułą wszystkich kolejnych pożywek.
    10. Wirować z prędkością 300 x g przez 4 min. Ostrożnie odessać supernatant.
    11. Dodać 10 ml świeżej pożywki z fibroblastów na 3 zarodki i rozcierać 6-10 razy.
    12. Umieść komórki w 1 15-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej na każde 3 przygotowane zarodki. Hodowla przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5%CO2
      13. .
    13. Po całonocnej inkubacji zastąp pożywkę świeżą pożywką o pojemności 30 ml na płytkę. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na noc.
      UWAGA: Sprawdź, czy komórki Hcn4-GFP+ nie są zanieczyszczone pod mikroskopem fluorescencyjnym. Kultura powinna być GFP- i stać się GFP+ dopiero po przeprogramowaniu.
    14. Następnego dnia zbierz komórki z 3 ml świeżej, wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA. Policz i zamroź komórki. Zazwyczaj zamrażaj komórki w ilości 3 x 106 komórek na ml. Oczekiwany plon powinien wynosić 3 x 106 komórek na zarodek.

2. Produkcja i przeprogramowanie retrowirusa

Uwaga: Następujący protokół wymaga produkcji i obsługi zakaźnych retrowirusów. Wykonaj następujące czynności w szafie bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 zgodnie z wytycznymi BSL-2 i sterylną techniką. Użyj 10% wybielacza, aby usunąć wszystkie materiały narażone na działanie retrowirusów.

  1. Produkcja retrowirusów i przygotowanie MEF
    UWAGA: Poniższy protokół dotyczy produkcji retrowirusowej na płytkach 6-dołkowych i zakażenia MEF na płytkach 24-dołkowych. W przypadku innych formatów patrz Tabela 2. MEF są platerowane w dniu -1, więc czas będzie musiał być odpowiednio skoordynowany dla każdego eksperymentu (patrz sekcja 2.3 i rysunek 2).
    1. Utrzymuj ogniwa Plat-E (PE) zgodnie z zaleceniami producenta. Krótko mówiąc, hodowla komórek PE w DMEM uzupełniona 10% FBS, 1 μg / ml puromycyny, 10 μg / ml blasticydyny, penicyliny i streptomycyny. Pasaż komórek 1:4 co dwa dni, gdy kultura osiągnie 70-90% konfluencji.
    2. Dzień -2: Dzień przed transfekcją, wysiewaj komórki Plat-E w 1 x 106 komórek/basenik na 6-dołkowej płytce w pożywce do transfekcji. Komórki powinny być zlewane w 70-80% w momencie transfekcji.
  2. Transfekcja przy użyciu komercyjnego środka do transfekcji.
    UWAGA: Komercyjne odczynniki powinny mieć temperaturę pokojową (RT) przed transfekcją. W celu transfekcji DNA dodaj indywidualnie każde plazmidowe DNA retrowirusowe (G, H, M i T), aby utworzyć koktajl GHMT9.
    1. Dzień -1: W stożkowej probówce z polistyrenu o pojemności 15 ml wymieszać 60 μl zredukowanej pożywki surowicy z 6 μl odczynnika do transfekcji na reakcję, aby uzyskać formę płytki 6-dołkowej. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Ponieważ zastosowany tutaj odczynnik do transfekcji wiąże się z tworzywami sztucznymi, dodaj bezpośrednio do zredukowanej pożywki surowicy, aby uniknąć spadku wydajności transfekcji.
    2. Dodaj w sumie 2 μg koktajlu GHMT na reakcję i delikatnie postukaj, aby go wymieszać. Nie wirować. Inkubować reakcję przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Dodaj mieszaninę z kroku 2.2.3 do komórek PE w sposób kroplowy.
    4. Inkubować transfekowane komórki Plat-E przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zapisz czas transfekcji.
  3. Wysiew mysich fibroblastów zarodkowych Hcn4-GFP.
    1. 1 godzinę przed posiewem MEF należy przygotować 24-dołkową płytkę do immunocytochemii.
      1. Dodać 12 mm szkiełko nakrywkowe z fibronektyną do dołka.
      2. Pokryć studzienki 300 μl roztworu kolagenu bydlęcego (np. SureCoat) i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
      3. Zassać roztwór powlekający bezpośrednio przed posiewem MEF.
    2. Rozmrozić zamrożoną fiolkę z HCN4-GFP MEF i przemyć x1 wstępnie podgrzanym podłożem fibroblastowym o sile 500 x g przez 5 minut.
    3. Określ żywotność komórek za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego lub podobnych barwników. Obliczyć liczbę żywotnych komórek na ml hodowli, korzystając z następującego wzoru:
      % żywotnych komórek = [1.00 - (Liczba niebieskich komórek/ Liczba wszystkich komórek)] x 100
      1. Oblicz całkowitą liczbę żywotnych komórek, korzystając z następującego wzoru:
        Komórki żywotne = % komórek żywotnych x współczynnik rozcieńczenia x 10 000 x całkowita objętość zawiesiny komórek
    4. Wysiewać 3 x 104 komórki na dołek na 24-dołkową płytkę z wcześniej przygotowanym roztworem kolagenu bydlęcego - szkiełkiem nakrywkowym fibronektyny.
  4. Transdukcja i przeprogramowanie MEFs
    UWAGA: Zgodnie z uwagami producenta, prawidłowo utrzymane komórki Plat-E wytwarzają średnie miano 1 x 107 jednostek infekcji/ml. Chociaż miano nie jest mierzone bezpośrednio dla każdego eksperymentu, kontrola GFP jest zawsze uwzględniana jako substytut skuteczności infekcji. Wysoka ekspresja i intensywność GFP (GFP+ > 95%) zazwyczaj koreluje z udanym wytwarzaniem iCLM za pośrednictwem GHMT.
    1. Dzień 0: 24 godziny po transfekcji przefiltrować pożywkę retrowirusową PE przez filtr octanu celulozy o wielkości porów 0,45 μm i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać polibren do końcowego stężenia 8 μg/ml. Ostrożnie uzupełnij komórki 2 ml świeżej pożywki do transfekcji.
      UWAGA: Ogniwa łatwo odłączają się od płytki, jeśli nośnik jest zmieniany zbyt szybko.
    2. Odessać pożywkę z hodowanych MEF i dodać świeżo zebraną pożywkę retrowirusową; powinno to dać 1,7 ml pożywki na dołek płytki 6-dołkowej. Dodać ~800 μL na dołek płytki 24-dołkowej. Włożyć płytkę MEF z powrotem do inkubatora i inkubować przez noc.
    3. Dzień 1: Powtórz kroki 2.4.1 i 2.4.2. Wyrzuć komórki po 2nd pobraniu wirusa. Zainfekowane MEF-y należy umieścić z powrotem w inkubatorze i pozwolić im odpocząć przez noc.
    4. Dzień 2: 48 godzin po indukcji, odessać pożywkę kondycjonowaną przez komórkę i przemyć x1 1x PBS. Dodać 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki iCLM do dołka na płytce 24-dołkowej.
    5. Nośnik iCLM należy wymieniać co 2-3 dni. Płytka procesowa 14 dni po indukcji wirusa do analizy immunocytochemicznej (ICC) przeprogramowania serca.

3. Barwienie immunologiczne przeprogramowanych MEFów

  1. 14 dni po indukcji ostrożnie zassać pożywkę.
  2. Przepłucz każdą studzienkę 300 μl lodowatego 1x PBS. Odessać nadmiar roztworu.
  3. Napraw komórki za pomocą 250 μl 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) na dołek na płytce 24-dołkowej. Inkubować 15 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Utrwalone komórki można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez 1 - 2 tygodnie przed barwieniem.
  4. Przepuszczalność komórek poprzez mycie studzienek x3 za pomocą 300 μL 0,1% PBS-TritonX 100 (PBST). Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej między praniami. Odessać nadmiar roztworu po ostatnim praniu.
  5. Blokuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej z 1x uniwersalnym buforem blokowym przy 300 μl/studzienkę.
  6. Przygotuj bufor do barwienia (ICC): Dodaj 1:1 z 1x PBS i 1x Uniwersalny bufor blokujący. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w buforze barwiącym ICC i inkubować przeciwciała przez noc w temperaturze 4 °C. Patrz rozdział dotyczący materiału w celu uzyskania zalecanych rozcieńczeń.
    1. Zabarwić jedną parę szkiełek myszą α-aktyniną, αGFP kurczaka i Nppa królika w celu identyfikacji iPM i iAM.
    2. Barwić jedną parę szkiełek myszą α-aktyniną, αGFP kurczaka i królikiem Myl2 w celu identyfikacji iPM i iVM.
  7. Następnego dnia przemyć studzienki x3 300 μL 0,1% PBST. Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej między praniami. Odessać nadmiar roztworu po ostatnim praniu.
  8. Przygotować drugorzędowe rozcieńczenia przeciwciał w buforze barwiącym ICC. Zapoznaj się z sekcją dotyczącą materiałów, aby zapoznać się z zalecanymi rozcieńczeniami. Inkubować przeciwciała drugorzędowe przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
    1. Wybarwić wszystkie szkiełka następującymi przeciwciałami drugorzędowymi: mysz Alexa-555, kurczak Alexa-488 i królik Alexa-647.
  9. Studzienki płuczące x3 z 300 μL 0,1% PBST. Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej między praniami. Chronić przed światłem.
  10. Dodać 2,4 μl podłoża montażowego zawierającego 1,5 μg/ml 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) do szklanego szkiełka mikroskopowego. Ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z dołka płytki 24-dołkowej, usuń nadmiar roztworu i przenieś na szkiełko podstawowe z nośnikiem montażowym. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby usunąć nadmiar objętości i powietrza.
  11. Uszczelnij prowadnice preferowanym lakierem do paznokci lub plastikowym uszczelniaczem. Zamontowane szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.

4. Identyfikacja podtypów serca za pomocą mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Do obrazowania, mikroskop konfokalny wyposażony w co najmniej 2 detektory fluorescencyjne zdolne do detekcji spektralnej na długościach fal 405, 488, 555 i 639 nm jest niezbędny do identyfikacji iPMs, iAMs i iVMs. Obrazowanie komórek za pomocą obiektywu Plan-Apochromat 20X/0,75 lub lepszego. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu producenta, skanowanie obrazów z zoomem może uzyskać obrazy o jakości 40-krotnego zanurzenia w oleju.

  1. Biblioteka obrazów: rób 8-bitowe obrazy z kanałami DAPI, Alexa-488, Alexa-555 i Alexa-647 (kanały). Czas zatrzymania piksela wynoszący 6 s, rozmiar klatki 1024, krok linii co 2 i uśrednianie 2 są wystarczające dla obrazów o wysokiej rozdzielczości.
  2. Dla każdego slajdu zacznij od jednej krawędzi i rozpocznij skanowanie w górę iw dół w czerwonym kanale fluorescencyjnym (kanał) w poszukiwaniu komórek α-aktynina + sarkomer + (patrz Rysunek 3 i Rysunek 5A dla przykładów). Prążki sarkomeru są łatwiejsze do wizualnej identyfikacji w długości fali 555 nm.
    1. Po zidentyfikowaniu komórki α-aktyniny + sarkomeru + przełącz się na zielony kanał i zanotuj, czy jest dodatni (iPM). Przełącz się na komputer, aby ocenić dalekoczerwony kanał 647 (iAM lub iVM).
      UWAGA: Komórki, które są α-aktyniną + / Sarkomerem + / Hnc4-GFP + / Nppa-/Myl2- są oznaczone jako iPM. Ekspresja GFP będzie widoczna w całej komórce (Figura 4A).
    2. Plamie przesuwają się za pomocą α-aktyniny (mysz-Alexa555), Hcn4-GFP (kurczak-Alexa488), Nppa (królik-Alexa647) i DAPI. Komórki, które są α-aktyniną + / Sarkomerem + / Hnc4-GFP-/Nppa+ to iAM. Barwienie Nppa pojawi się okołojądrowe i punktowe (ryc. 4B).
    3. Szkiełka barwienia z α-aktyniną (mysz-Alexa555), Hcn4-GFP (kurczak-Alexa488), Myl2 (królik-Alexa647). Komórki dodatnie dla α-aktyniny + / Sarkomeru + / Hnc4-GFP-/Myl2+ to iVM. Barwienie Myl2 będzie wykazywało prążkowaną formę wzdłuż włókna sarkomeru. Ze względu na różnice w jakości barwienia i płaszczyźnie Z, prążki mogą nie zawsze być łatwo widoczne (ryc. 4C).

5. Kwantyfikacja

UWAGA: Aby ocenić rzeczywistą liczbę potencjalnie przeprogramowanych MEF-ów, 2 dołki z 24-dołkowej płytki są wysiewane równolegle do dołków eksperymentalnych i zbierane jeden dzień po posiewie. Całkowita liczba posianych komórek jest następnie określana przez uśrednienie dwóch studzienek. Staje się to rzeczywistą całkowitą liczbą posianych komórek (aTotal).

  1. Sarkomer+
    1. Sprawdź wzrokowo każdą komórkę na szkiełku nakrywkowym pod kątem prawidłowego α-aktyniny+/Sarkomer+ (prawe panele Rysunek 3) i zapisz (Rysunek 5B-i).
    2. Zetrzyj w tabeli całkowitą liczbę α-aktyniny + / Sarkomeru + na każdym szkiełku nakrywkowym i podziel przez rzeczywistą całkowitą liczbę posianych komórek (aTotal) (Figura 5B-iii). Na przykład, jeśli aTotal = 12 500 komórek, a 100 komórek było α-aktynina + / sarkomer +, to 0,8% posianych MEF zostało przeprogramowanych. Przeciętny eksperyment przeprogramowywania da 1% komórek α-aktyniny + / sarkomeru + (ryc. 5C).
  2. Podtyp+
    UWAGA: Aby zapoznać się z poniższymi krokami, zapoznaj się z rysunkiem 5B/C, aby zapoznać się z reprezentatywnym przepływem pracy kwantyfikacji iCLM. Krótko mówiąc, dla każdej komórki sarkomeru + tabelarycznie, jeśli jest ona unikalna dla któregokolwiek z podtypów (Rysunek 5B-i). Oblicz % podtypu (Rysunek 5B-iii), dzieląc liczbę komórek podtypu+ przez średnią komórkę sarkomer+ x 100 (Figura 5B-i). Aby obliczyć bezwzględną % wydajności podtypu (rysunek 5B-iv), podziel liczbę komórek podtypu+ z rysunku 5B-i przez całkowitą liczbę komórek wysiewanych x 100 (rysunek 5B-ii).
    1. Dla każdej z komórek α-aktyniny + / Sarkomeru + oceń, czy są to GFP+, Nppa+ czy Myl2+.
    2. Tabelaryczne zestawienie całkowitej liczby komórek α-aktyniny + / Sarkomeru + / Hnc4-GFP + / Nppa-/Myl2-, aktyniny + / Sarkomeru + / Hnc4-GFP - / Nppa+ i α-aktyniny + / Sarkomeru + / Hnc4-GFP-/Myl2+ (Figura 5B-i).
    3. Aby obliczyć procent każdego podtypu, podziel liczbę komórek podtypu+ przez całkowitą liczbę komórek α-aktyniny+/sarkomer+ w tej studzience i pomnóż przez 100. GHMT generuje iPM, iAM i iVM w mniej więcej równych proporcjach (Rysunek 5B-iii).
    4. Aby obliczyć bezwzględną liczbę komórek podtypu+, podziel całkowitą liczbę komórek podtypu+ dla warunków eksperymentalnych przez aCałkowita i pomnóż przez 100 (Rysunek 5B-ii). Średnio iPM stanowią 0,3% całej populacji zakażonych komórek, iAM 0,3%, a iVM 0,25% (Rysunek 5B-iv).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykorzystując myszy reporterowe specyficzne dla PM, opracowaliśmy strategię multipleksowego barwienia immunohistochemicznego w celu identyfikacji różnorodnych endogennych miocytów, co przedstawiono na Rysunku 1. Po wykonaniu etapów przeprogramowania pokazanych na Rysunku 2, indukcję CM specyficznych dla danego podtypu można wykryć już w 4. dniu21, choć przy niskiej wydajności. W 14. dniu eksperyment można zakończyć i ocenić organiz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsze badanie przedstawia strategię bezpośredniego przeprogramowania konwersji MEF w zróżnicowany zestaw podtypów serca poprzez ekspresję czynników transkrypcyjnych serca za pośrednictwem retrowirusa Gata4, Mef2c, Tbx5 i Hand2 (GHMT). Stosując podejście do barwienia immunologicznego multipleksowego w połączeniu z myszą reporterową specyficzną dla PM, jesteśmy w stanie zidentyfikować iAM, iVM i iPM w rozdzielczości pojedynczej komórki. Taki test pozwala na stworzenie eksperymentalnego systemu in vitro zdolneg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

A.F.-P. był wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach grantu nr 2015165336. N.V.M był wspierany przez granty z NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838) i March of Dimes (#5-FY14-203). Wyrażamy uznanie dla Young-Jae Nam, Christiny Lubczyk i Minoti Bhakta za ich ważny wkład w rozwój protokołu i analizę danych. Dziękujemy również Johnowi Sheltonowi za cenny wkład techniczny oraz członkom laboratorium Munshi za dyskusję naukową.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEMSigmaD5796Składnik pożywki iCLM, pożywki Plat-E, fibroblastów i pożywki transfekcyjnej
Medium 199Thermo Fisher Scientific11150059Składnik pożywki iCLM
Surowica bydlęca płodu (FBS)SigmaF2442Składnik pożywki iCLM, pożywki Plat-E, fibroblasty i pożywki transfekcyjnej
Insulina-Transferyna-Selen GThermo Fisher Scientific41400-045Składnik pożywki iCLM
MEM roztwór witaminowyThermo Fisher Scientific11120-052Składnik pożywki iCLM
Aminokwasy MEMThermo Fisher Scientific1601149Składnik pożywki iCLM
Aminokwasy endogenneThermo Fisher Scientific11140-050Składnik pożywki iCLM
Antybiotyk-AntybiotykiThermo Fisher Scientific15240062Składnik pożywki iCLM
B-27 suplementThermo Fisher Scientific17504044Składnik pożywki iCLM
Inaktywowana termicznie surowica końskaThermo Fisher Scientific26050-088Składnik pożywki iCLM
NaPyrcenianThermo Fisher Scientific11360-70Składnik pożywki iCLM
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific1514022Składnik pożywek Plat-E i pożywek fibroblastów
Puromycyna Thermo Fisher ScientificA11139-03Składnik pożywki Plat-E
Blasticidyna   Gemini Bio-Products400-128PSkładnik podłoża Plat-E
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061Składnik podłoża Fibroblasty
Konfokalny skaning laserowy LSM700ZeissDo analizy konfokalnej
Odczynnik do transfekcji FuGENE 6PromegaE2692Odczynnik do transfekcji 
Opti-MEM Medium o obniżonej surowicyThermo Fisher Scientific31985-070Odczynnik do transfekcji 
PolybreneMilliporeTR-1003-GOdczynnik indukcyjny. Stosować w końcowym stężeniu 8 μ M / ml
Platinium-E (PE) Retrowirusowa linia komórkowa packaginy, EcotropicCellBiolabsRV-101Retrowirusowa linia komórkowa pacaking
Trypsyna 0,25% EDTAThermo Fisher ScientificFor MEF i dysocjacja Plat-E
Mysia anty i alfa-aktynina (klon EA-53)Przeciwciało SigmaA7811do analizy konfokalnej. Stosować w 1:200
Przeciwciało anty-GFP IgYThermo Fisher ScientificA10262do analizy konfokalnej. Stosować w 1:200
Rabbit Pab anty-NPPA AbgentAP8534APrzeciwciało do analizy konfokalnej. Stosować w stosunku 1:400
Rabbit Pab anty Myl2 IgG ProteinTech10906-1-APPrzeciwciało do analizy konfokalnej. Stosować w proporcji 1:200
Roztwór Vectashield z DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Vector LabsH-1500Barwnik do analizy konfokalnej
Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus ThermoFisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1,0 mm
BioCoat Szkiełka nakrywkowe Fibronectin 12 mmNeuVitro CorpGG-12-1.5Szkiełka nakrywkowe do analizy konfokalnej
100 μ m sitko komórkoweThermo Fisher Scientific08-771-19
0,45 μ m Filtry strzykawkowe SFCA 25MMThermo Fisher Scientific09-740-106Do filtracji wirusów
6 ml StrzykawkiCovidien8881516937Do filtracji wirusów
Koza anty-Chicken IgY (H& L) A488AbcamAB150169Przeciwciało drugorzędowe do analizy konfokalnej. Stosować w 1:400
Osioł anty-królik A647 IgG(H+L) Thermo Fisher ScientificA31573Przeciwciało drugorzędowe do analizy konfokalnej. Użyj w 1:400
Koza anty-mysie IgG (H + L) A555Thermo Fisher ScientificA21422Przeciwciało drugorzędowe do analizy konfokalnej. Stosować w 1:400
Triton X-100Sigma93443-100mlDo przepuszczalności komórek 
PBS firmy Dulbecco bez CaCl2 i MgCl2 (D-PBS)SigmaD8537
Power Block 10x Uniwersalny odczynnik blokującyThermo Fisher ScientificNC9495720Rozcieńczony do 1x w H2O
16% wodny roztwór paraformaldehydu (PFA)Electro Microscopy Sciences 15710Stosować w 4% rozcieńczonym w dH2O
6 cm  płytkiOlympus25-260
6-dołkoweGenesee Scientific25-105
24-dołkoweGenesee Scientific25-107
10 cm Szalki do hodowli tkankowychCorning4239
15 cm  Naczynia do hodowli tkankowychThermo Fisher Scientific5442
15 ml Probówki stożkoweCorning4308
50 ml Probówki stożkoweCorning4249
0,4% roztwór błękitu trypanowegoSigmaT8154Dla żywotności
Alkohol etylowy 200 proofThermo Fisher Scientific7005
WybielaczThermo Fisher Naukowy6009
płytki płytki

Bibliografia

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231(2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243(2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137(2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807(2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bezpo rednie przeprogramowanieprzeprogramowanie GHMTindukowane kardiomiocytyimmunocytochemiamikroskopia konfokalnaorganizacja sarkomer wspecyfikacja podtyputransdukcja retrowirusowa

Powiązane artykuły