Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bezpośrednie przeprogramowanie jednego typu komórek na inny stało się ostatnio potężnym paradygmatem dla medycyny regeneracyjnej, modelowania chorób i specyfikacji linii. W szczególności konwersja fibroblastów w indukowane miocyty podobne do kardiomiocytów (iCLM) przez Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 (GHMT) stanowi ważną drogę do generowania miocytów serca de novo in vitro i in vivo. Najnowsze dowody sugerują, że GHMT generuje większą różnorodność podtypów serca, niż wcześniej sądzono, co podkreśla potrzebę systematycznego podejścia do przeprowadzania dodatkowych badań. Zanim jednak bezpośrednie przeprogramowanie będzie mogło zostać wykorzystane jako strategia terapeutyczna, należy szczegółowo zrozumieć mechanistyczne podstawy konwersji linii, aby wygenerować określone podtypy serca. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół generowania iCLM poprzez przeprogramowanie mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) za pośrednictwem GHMT.
Przedstawiamy metody izolacji MEF, produkcji retrowirusa i infekcji MEF, aby dokonać efektywnego przeprogramowania. Aby określić tożsamość podtypu przeprogramowanych komórek, szczegółowo opisujemy krok po kroku podejście do przeprowadzania immunocytochemii na iCLM przy użyciu zdefiniowanego zestawu kompatybilnych przeciwciał. Przedstawiono również metody mikroskopii konfokalnej, identyfikacji i kwantyfikacji iCLM oraz poszczególnych podtypów przedsionkowych (iAM), komorowych (iVM) i rozruszników serca (iPM). Na koniec omawiamy reprezentatywne wyniki prototypowych eksperymentów z bezpośrednim przeprogramowaniem i podkreślamy ważne aspekty techniczne naszego protokołu, aby zapewnić wydajną konwersję linii. Podsumowując, nasz zoptymalizowany protokół powinien zapewnić badaczom stopniowe podejście do przeprowadzania znaczących eksperymentów z przeprogramowaniem serca, które wymagają identyfikacji poszczególnych podtypów CM.
Wprowadzenie
Serce jest pierwszym funkcjonalnym organem, który rozwija się w zarodku1,2. W połączeniu z układem krążenia dostarcza tlen, składniki odżywcze i mechanizm usuwania odpadów podczas rozwoju. Trzy tygodnie po zapłodnieniu ludzkie serce bije po raz pierwszy, a jego prawidłowa regulacja jest utrzymywana przez kardiomiocyty (CM). Nieodwracalna utrata tych wyspecjalizowanych komórek jest zatem podstawowym problemem leżącym u podstaw postępującej niewydolności serca. Podczas gdy niektóre organizmy, takie jak danio pręgowany i Xenopus, mają potencjał regeneracji serca, serce dorosłego ssaka jest bardziej ograniczone
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne dotyczące praktyk na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w UT Southwestern Medical Center.
1. Izolacja mysich fibroblastów embrionalnych Hcn4-GFP E12.5 (MEF)
- Ustaw krycie czasowe między homozygotycznymi samcami Hcn4-GFP i samicami CD-1.
- Złożyć w ofierze ciężarną kobietę w E12.5 poprzez eutanazję dwutlenku węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
- Usuń rogi macicy za pomocą kleszczy preparacyjnych, jak opisano wcześniej22,23 i umieść je na szalce Petr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystując reporterową linię myszy specyficzną dla PM, opracowaliśmy strategię wielokrotnego barwienia immunohistochemicznego w celu identyfikacji różnych endogennych miocytów, co przedstawiono na Rysunku 1. Po wykonaniu kroków reprogramowania pokazanych na Rysunku 2, indukcję podtypów specyficznych kardiomiocytów (CM) można wykryć już w 4. dniu21, choć przy niskim wskaźniku. W 14. dniu eksperyment można zakończyć i ocenić organ.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejsze badanie przedstawia strategię bezpośredniego przeprogramowania konwersji MEF w zróżnicowany zestaw podtypów serca poprzez ekspresję czynników transkrypcyjnych serca za pośrednictwem retrowirusa Gata4, Mef2c, Tbx5 i Hand2 (GHMT). Stosując podejście do barwienia immunologicznego multipleksowego w połączeniu z myszą reporterową specyficzną dla PM, jesteśmy w stanie zidentyfikować iAM, iVM i iPM w rozdzielczości pojedynczej komórki. Taki test pozwala na stworzenie eksperymentalnego systemu in vitro zdolneg.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
A.F.-P. był wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach grantu nr 2015165336. N.V.M był wspierany przez granty z NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838) i March of Dimes (#5-FY14-203). Wyrażamy uznanie dla Young-Jae Nam, Christiny Lubczyk i Minoti Bhakta za ich ważny wkład w rozwój protokołu i analizę danych. Dziękujemy również Johnowi Sheltonowi za cenny wkład techniczny oraz członkom laboratorium Munshi za dyskusję naukową.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5796 | Składnik pożywki iCLM, pożywki Plat-E, fibroblastów i pożywki transfekcyjnej |
| Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Składnik pożywki iCLM |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Sigma | F2442 | Składnik pożywki iCLM, pożywki Plat-E, fibroblasty i pożywki transfekcyjnej |
| Insulina-Transferyna-Selen G | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | Składnik pożywki iCLM |
| MEM roztwór witaminowy | Thermo Fisher Scientific | 11120-052 | Składnik pożywki iCLM |
| Aminokwasy MEM | Thermo Fisher Scientific | 1601149 | Składnik pożywki iCLM |
| Aminokwasy endogenne | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | Składnik pożywki iCLM |
| Antybiotyk-Antybiotyki | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Składnik pożywki iCLM |
| B-27 suplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Składnik pożywki iCLM |
| Inaktywowana termicznie surowica końska | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | Składnik pożywki iCLM |
| NaPyrcenian | Thermo Fisher Scientific | 11360-70 | Składnik pożywki iCLM |
| Penicylina/Streptomycyna | Thermo Fisher Scientific | 1514022 | Składnik pożywek Plat-E i pożywek fibroblastów |
| Puromycyna | Thermo Fisher Scientific | A11139-03 | Składnik pożywki Plat-E |
| Blasticidyna | Gemini Bio-Products | 400-128P | Składnik podłoża Plat-E |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Składnik podłoża Fibroblasty |
| Konfokalny skaning laserowy LSM700 | Zeiss | Do analizy konfokalnej | |
| Odczynnik do transfekcji FuGENE 6 | Promega | E2692 | Odczynnik do transfekcji |
| Opti-MEM Medium o obniżonej surowicy | Thermo Fisher Scientific | 31985-070 | Odczynnik do transfekcji |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | Odczynnik indukcyjny. Stosować w końcowym stężeniu 8 μ M / ml |
| Platinium-E (PE) Retrowirusowa linia komórkowa packaginy, Ecotropic | CellBiolabs | RV-101 | Retrowirusowa linia komórkowa pacaking |
| Trypsyna 0,25% EDTA | Thermo Fisher Scientific | For MEF i dysocjacja Plat-E | |
| Mysia anty i alfa-aktynina (klon EA-53) | Przeciwciało Sigma | A7811 | do analizy konfokalnej. Stosować w 1:200 |
| Przeciwciało anty-GFP IgY | Thermo Fisher Scientific | A10262 | do analizy konfokalnej. Stosować w 1:200 |
| Rabbit Pab anty-NPPA | Abgent | AP8534A | Przeciwciało do analizy konfokalnej. Stosować w stosunku 1:400 |
| Rabbit Pab anty Myl2 IgG | ProteinTech | 10906-1-AP | Przeciwciało do analizy konfokalnej. Stosować w proporcji 1:200 |
| Roztwór Vectashield z DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Vector Labs | H-1500 | Barwnik do analizy konfokalnej |
| Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus Thermo | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 x 75 x 1,0 mm |
| BioCoat Szkiełka nakrywkowe Fibronectin 12 mm | NeuVitro Corp | GG-12-1.5 | Szkiełka nakrywkowe do analizy konfokalnej |
| 100 μ m sitko komórkowe | Thermo Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 0,45 μ m Filtry strzykawkowe SFCA 25MM | Thermo Fisher Scientific | 09-740-106 | Do filtracji wirusów |
| 6 ml Strzykawki | Covidien | 8881516937 | Do filtracji wirusów |
| Koza anty-Chicken IgY (H& L) A488 | Abcam | AB150169 | Przeciwciało drugorzędowe do analizy konfokalnej. Stosować w 1:400 |
| Osioł anty-królik A647 IgG(H+L) | Thermo Fisher Scientific | A31573 | Przeciwciało drugorzędowe do analizy konfokalnej. Użyj w 1:400 |
| Koza anty-mysie IgG (H + L) A555 | Thermo Fisher Scientific | A21422 | Przeciwciało drugorzędowe do analizy konfokalnej. Stosować w 1:400 |
| Triton X-100 | Sigma | 93443-100ml | Do przepuszczalności komórek |
| PBS firmy Dulbecco bez CaCl2 i MgCl2 (D-PBS) | Sigma | D8537 | |
| Power Block 10x Uniwersalny odczynnik blokujący | Thermo Fisher Scientific | NC9495720 | Rozcieńczony do 1x w H2O |
| 16% wodny roztwór paraformaldehydu (PFA) | Electro Microscopy Sciences | 15710 | Stosować w 4% rozcieńczonym w dH2O |
| 6 cm płytki | Olympus | 25-260 | |
| 6-dołkowe | Genesee Scientific | 25-105 | |
| 24-dołkowe | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 10 cm Szalki do hodowli tkankowych | Corning | 4239 | |
| 15 cm Naczynia do hodowli tkankowych | Thermo Fisher Scientific | 5442 | |
| 15 ml Probówki stożkowe | Corning | 4308 | |
| 50 ml Probówki stożkowe | Corning | 4249 | |
| 0,4% roztwór błękitu trypanowego | Sigma | T8154 | Dla żywotności |
| Alkohol etylowy 200 proof | Thermo Fisher Scientific | 7005 | |
| Wybielacz | Thermo Fisher Naukowy | 6009 |
Bibliografia
- Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
