Method Article

Analiza pojedynczych cząstek typu open source do mikroskopii superrozdzielczej za pomocą VirusMapper

DOI:

10.3791/55471

⸱

April 9th, 2017

 ,  , 
1MRC Laboratory for Molecular Cell Biology, University College London, 2Centre for Mathematics and Physics in Life Sciences and Experimental Biology (CoMPLEX), University College London, 3Department of Cell and Developmental Biology, University College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt wykorzystuje oparty na Fidżi pakiet oprogramowania open-source VirusMapper do zastosowania analizy pojedynczej cząstki do obrazów mikroskopowych o wysokiej rozdzielczości w celu wygenerowania precyzyjnych modeli struktury w nanoskali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna o wysokiej rozdzielczości obecnie rewolucjonizuje badania nad biologią komórki. Jego zdolność do przekraczania limitu rozdzielczości wynoszącego około 300 nm pozwala na rutynowe obrazowanie kompleksów i procesów biologicznych w nanoskali. Ten wzrost rozdzielczości oznacza również, że metody popularne w mikroskopii elektronowej, takie jak analiza pojedynczych cząstek, mogą być łatwo stosowane w mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości. Łącząc to podejście analityczne z obrazowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości, możliwe staje się wykorzystanie specyficznej dla cząsteczki zdolności mikroskopii fluorescencyjnej do generowania map strukturalnych elementów molekularnych w strukturze metastabilnej. W tym celu opracowaliśmy nowatorski algorytm — VirusMapper — w pakiecie jako łatwa w użyciu, wysokowydajna i przepustowa wtyczka ImageJ. W tym artykule przedstawiono szczegółowy przewodnik po tym oprogramowaniu, prezentując jego zdolność do odkrywania nowych cech strukturalnych w biologicznych kompleksach molekularnych. W tym miejscu przedstawiamy, jak zebrać kompatybilne dane i przedstawiamy protokół krok po kroku, jak używać tego algorytmu do stosowania analizy pojedynczych cząstek do obrazów o wysokiej rozdzielczości.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia super-resolution (SR) wywarła duży wpływ na biologię komórki, zapewniając możliwość obrazowania kluczowych procesów molekularnych wraz z specyficznym dla molekularnego etykietowaniem kluczowym dla ich zrozumienia. SR umożliwia teraz mikroskopii świetlnej zbliżenie się do rozdzielczości (20-150 nm), która wcześniej była osiągalna tylko za pomocą mikroskopii elektronowej (EM), zachowując jednocześnie główne zalety mikroskopii świetlnej, takie jak potencjał obrazowania żywych komórek1,2. Co więcej, zachowanie strukturalne na poziomie nanoskali pozwala na zastosowanie analizy pojedynczych cząstek (SPA) do danych SR, koncepcji szeroko stosowanej w mikroskopii elektronowej3. Korzystając ze SPA, wiele wysoce zachowanych kopii struktury może być obrazowanych i uśrednianych razem, aby poprawić rozdzielczość, precyzję lub stosunek sygnału do szumu wizualizowanego obiektu. Wykazano, że w połączeniu z SR SPA jest potężnym narzędziem do precyzyjnego mapowania składników kompleksu porów jądrowych4,5, centrosomy6 oraz wirusy, takie jak HIV7 i HSV-18.

Jednak rutynowe połączenie SR i SPA zostało zakwestionowane przez brak dostępnego oprogramowania. Z tego powodu opracowaliśmy VirusMapper, wtyczkę do popularnego oprogramowania do przetwarzania obrazów ImageJ/Fiji9. Jest to pierwszy ogólnodostępny pakiet oprogramowania do uogólnionego SPA z obrazami fluorescencyjnymi10 zaprojektowany w celu zapewnienia szybkiego, przyjaznego dla użytkownika, wielokanałowego, naiwnego uśredniania struktur obrazowanych za pomocą mikroskopii SR. Chociaż został zaprojektowany dla wirusów, może być stosowany do dowolnego kompleksu makromolekularnego, w którym różne gatunki molekularne mogą być obrazowane, identyfikowane i lokalizowane.

VirusMapper może być używany do tworzenia bardzo precyzyjnych modeli molekularnych dowolnej znanej struktury, co pozwala na obliczanie średnich wymiarów i innych parametrów. Konstrukcja algorytmu sprawia, że jest on szczególnie przydatny do rozdzielania populacji struktur, zapewniając określenie różnych orientacji lub różnych stanów morfologicznych. Dodatkowo, obrazowanie wielokanałowe może być wykorzystane do wykorzystania kanału referencyjnego w przypadkach, gdy podstawowa struktura jest dobrze znana, umożliwiając w ten sposób odkrycie struktury opartej na odniesieniach. Instrukcje dotyczące pobierania i instalowania oprogramowania znajdują się na stronie https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper. Można tam również znaleźć przykładowe dane, a użytkownikom zaleca się przećwiczenie korzystania z oprogramowania na przykładowych danych przed próbą zastosowania go do własnych.

Tutaj opisane są kroki, które należy wykonać, aby użyć tej wtyczki do tworzenia modeli SPA z surowych danych. Oprogramowanie pobiera jako dane wejściowe surowe obrazy zawierające struktury z pojedynczym lub wieloma etykietami. Zwraca on, w zależności od szeregu parametrów, które są dostosowywane w miarę uruchamiania oprogramowania, modele SPA pokazujące średnie rozkłady oznaczonych komponentów w zobrazowanych strukturach.

Celem tego protokołu jest stworzenie precyzyjnych modeli SPA, dających średnie lokalizacje komponentów w obrazowanych strukturach zgodnie z potokiem przedstawionym na rysunku 1. Jak pokazano na rysunku 1, przepływ pracy oprogramowania jest podzielony na trzy etapy. Pierwszym etapem jest segmentacja dużych obrazów, w wyniku czego powstają stosy cząstek dla każdego kanału. Cząstki te są jednostkami, które zostaną uśrednione w celu stworzenia modeli i wytworzenia nasion do generowania modeli. Drugim etapem jest wygenerowanie obrazów nasion, które służą do rejestracji całego zestawu cząstek w końcowym etapie. Odbywa się to poprzez wybór kanału referencyjnego i ręczne wybieranie cząstek w tym kanale, które przyczynią się do powstania nasion. Nasiona są wybierane w tym kanale referencyjnym, ale mogą być generowane dla wszystkich kanałów. Cząstki są początkowo wyrównywane poprzez dopasowanie gaussa 2D do tego kanału. Wszystkie cząstki, które zostały wybrane i ponownie wyrównane, są następnie uśredniane w celu wytworzenia nasiona. Dla każdej wspólnej struktury widocznej w danych, które mają być modelowane, cząstki powinny być wybrane jako nasiona, które jasno i dokładnie reprezentują tę strukturę. Interfejs na tym etapie jest również przydatny do skanowania danych w poszukiwaniu takich struktur.

Ostatnim etapem jest generowanie modeli za pomocą dopasowywania szablonów. Osiąga się to poprzez rejestrację pierwotnie wyekstrahowanych cząstek do obrazów nasion wygenerowanych w poprzedniej sekcji za pomocą korelacji krzyżowej. Podzbiór zarejestrowanych cząstek jest uśredniany razem, a proces jest dalej iterowany w celu zmniejszenia błędu średniokwadratowego modelu, jeśli jest to pożądane. Ten podzbiór jest określany przez ustawienie minimalnego podobieństwa względem ziarna, które musi być spełnione. Podczas tworzenia modeli jednocześnie w wielu kanałach używane jest łączne podobieństwo lub średnia podobieństw dla każdego kanału. Powstałe modele i zarejestrowane cząstki, które się do nich przyczyniły, mogą być następnie dalej analizowane.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół i wideo uzupełniają oryginalny paper10 opisując pakiet oprogramowania bardziej szczegółowo. Zachęcamy czytelników do uważnego zapoznania się z tym dokumentem w celu uzyskania dodatkowych wskazówek dotyczących korzystania z oprogramowania. Istnieją trzy główne etapy: ekstrakcja cząstek, która dzieli duże obrazy na pojedyncze cząstki; selekcja nasion, w której wspólne struktury są identyfikowane w danych i dostosowywane w celu wytworzenia nasion, które są wykorzystywane w końcowym etapie; i generowanie modeli, w których dopasowywanie szablonów na podstawie tych nasion wyrównuje wyekstrahowane cząstki i uśrednia podzbiór w celu wytworzenia modeli SPA.

1. Konfiguracja przed uruchomieniem pakietu oprogramowania

  1. Przygotować próbki badanej struktury na szkiełku nakrywkowym lub w odpowiednich warunkach doświadczalnych.
  2. Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości, takiej jak mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM)11 lub wymuszone zubożenie emisji (STED)12 mikroskopia.
    UWAGA: Dokładne szczegóły dotyczące sposobu przygotowania i obrazowania próbek zależą w dużej mierze od charakteru badanej struktury, dlatego należy zapoznać się z odpowiednią literaturą. Na przykład dokładna metoda przygotowania i obrazowania próbek wirusa krowianki, takich jak te zastosowane w niniejszym dokumencie, została opisana w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.
  3. Twórz obrazy wielu pól widzenia, pokazujące dużą liczbę oddzielnych kopii struktury lub cząstek, najlepiej tysiące. Cząstki obrazu, które są jak najlepiej oddzielone od siebie i zapewniają, że obrazy są wolne od brudu lub innych struktur fluorescencyjnych, które nie są interesujące.
  4. Otwórz wszystkie obrazy zawierające cząsteczki na Fidżi, przeciągając pliki na pasek narzędzi Fidżi lub wybierając "Plik">"Otwórz".
  5. Wybierz "Obraz">"Stos">"Narzędzia">"Konkatenuj", aby połączyć obrazy w jeden stos. Następnie, jeśli wynikowy obraz jest Hyperstack, zamień go w stos, wybierając "Obraz">"Hyperstacks"> "Hyperstack to Stack".
    UWAGA: Końcowy stos powinien mieć interkalowane kanały. Jeśli istnieją dwa kanały, pierwszy wycinek w stosie powinien być kanałem 1 z pierwszego obrazu, drugi wycinek powinien być odpowiadającym mu kanałem 2, trzeci wycinek powinien być kanałem 1 z drugiego obrazu i tak dalej.

2. Wyodrębnij cząstki

  1. Wybierz obraz do segmentacji i wybierz "Wyodrębnij struktury wirusowe". Wybierz miejsce, w którym chcesz zapisać wyekstrahowane cząstki i wyświetl okno dialogowe "Wyodrębnij struktury wirusowe" (Rysunek 2).
  2. Przypisz parametry ekstrakcji ze wstępnymi oszacowaniami, wprowadzając je do okna dialogowego "Wyodrębnij struktury wirusowe" w następujący sposób. Dostosuj te parametry po wyświetleniu podglądu segmentacji obrazu.
    1. Ustaw liczbę kanałów w zestawie danych jako liczbę różnych kanałów fluorescencyjnych, które zostały zobrazowane (np. 2).
    2. Ustaw kanał odniesienia, z którego pobierane są cząstki, poprzez wykrycie pików w tym kanale, wprowadzając numer wybranego kanału. Wybierz najbardziej spójny kanał; czyli kanał, w którym najwięcej cząstek ma ten sam wygląd.
      UWAGA: Jeśli to możliwe, cząstki w tym kanale będą miały centralne maksimum.
    3. Wybierz, czy chcesz zastosować rozmycie gaussowskie przed detekcją. Ustaw rozmycie gaussowskie przed wykryciem na 0, aby nie stosować rozmycia; jeśli wartość ta zostanie zwiększona, przed wykryciem maksimów lokalnych stosowany jest filtr rozmycia gaussowskiego o podanym promieniu. Użyj tej funkcji, jeśli kanał odniesienia nie ma centralnego maksimum (np. kształt pierścienia); Rozmycie wywołuje pojawienie się jednego.
      UWAGA: Segmentowane obszary zainteresowania (ROI) nie mają zastosowanego rozmycia gaussowskiego, ponieważ ta funkcja jest używana tylko do pozycjonowania ROI w kanale odniesienia.
    4. Ustaw promień ROI (który zostanie ustawiony wokół każdego lokalnego maksimum) w pikselach. Wybierz taką wartość, aby zwrot z inwestycji był nieco większy niż największe cząstki, tak jak na rysunku 3. Na przykład, jeśli największe cząstki wydają się mieć średnicę około 30 pikseli (oszacowaną w przybliżeniu na oko), ustaw promień ROI na 20 pikseli.
    5. Ustaw liczbę ROI do użycia na klatkę na początkową, stosunkowo niewielką wartość poniżej 100.
    6. Ustaw maksymalne nakładanie się ROI. Jeśli cząstki są dobrze oddzielone, utrzymuj je małe; jeśli cząstki są zgrupowane, zwiększ to, aby umożliwić nakładanie się ROI.
  3. Wybierz "pokaż podgląd".
    UWAGA: Gdy ta opcja jest wybrana, pojawią się wyodrębnione ROI dla kanału referencyjnego skojarzonego z bieżącą klatką.
  4. Dostosuj promień ROI, liczbę ROI i maksymalne nakładanie się ROI, aby uzyskać ROI o odpowiedniej wielkości wokół jak największej liczby cząstek, jak pokazano na rysunku 3.
  5. Wybierz "OK", aby uruchomić segmentację. Zamknij obraz i menedżera ROI.
    UWAGA: Nie zmieniaj nazw plików zestawów cząstek. Nazwy te muszą być w formacie "Cząstki wirusa - kanał X" dla poniższych sekcji.

3. Wybierz nasiona

  1. Wybierz "Generuj nasiona", wybierz folder, w którym zapisywane są wyekstrahowane cząstki, a następnie wyświetl okno dialogowe i okna "Generuj nasiona" (Rysunek 4).
  2. Przypisz początkowe parametry selekcji nasion, wprowadzając je do okna dialogowego "Generuj nasiona" w następujący sposób.
    1. Ustaw kanał odniesienia, który zostanie dopasowany, aby wyrównać i wyśrodkować wszystkie kanały. Wybierz kanał, w którym większość cząstek ma taki sam wygląd i który ma centralne maksimum, jeśli to możliwe.
    2. Zaznacz pola wyboru dla wszystkich kanałów, dla których ma zostać wygenerowane ziarno.
    3. Wybierz, czy nasiona mają być obracane o 90°. Użyj tej funkcji, aby wyrównanie było spójne z innymi modelami
    4. Wybierz, czy chcesz zastosować rozmycie gaussowskie przed wyrównaniem. Ustaw promień rozmycia dla każdego kanału na 0, aby nie stosować rozmycia. Zwiększ tę wartość, aby zastosować filtr rozmycia gaussowskiego o danym promieniu przed ponownym wyrównaniem. Użyj tej funkcji, jeśli cząstki nie mają centralnego maksimum; Rozmycie wywołuje pojawienie się jednego.
      UWAGA: Rozmycie nie zostanie zastosowane do nasion, ponieważ ta funkcja ma na celu tylko uzyskanie spójnego wyrównania.
    5. Wybierz, czy chcesz używać korekcji przesunięcia, aby oddzielnie wyśrodkować początki dla kanałów niereferencyjnych, ale nie obracać ich, zaznaczając lub odznaczając pola "Korekcja przesunięcia" dla każdego kanału.
      UWAGA: Użyj tego, jeśli kanały nie są dobrze wyrównane ze sobą; Może być również przydatny do wyrównywania innych kanałów wyłącznie zgodnie z odniesieniem, bez korekcji przesunięcia.
  3. Wybierz cząstki, które chcesz użyć jako nasiona. Przeszukaj sekwencję cząstek, aby znaleźć cząstkę, która przypomina strukturę, która ma być modelowana, i zapisz numer klatki.
  4. Wprowadź liczbę w polu "Ramki do użycia", a pojawi się więcej okien (Rysunek 5). Wprowadź wiele numerów ramek oddzielonych przecinkami.
  5. Wyświetlanie ramek źródłowych i wynikowych średnich nasion w wyświetlonych oknach.
    UWAGA: Dziennik zasugeruje nasiona podobne do średniej.
  6. Dostosuj kanał odniesienia, promień rozmycia gaussowskiego i opcje korekcji przesunięcia, aby zoptymalizować proces wyboru inicjatora, tak aby pewna liczba znalezionych klatek początkowych miała podobny wygląd. Kontynuuj dodawanie nasion, aż zostaną utworzone średnie nasiona, które zadowalająco przypominają strukturę widoczną w danych, które mają być modelowane.
  7. Nazwij nasiona i miejsce, w którym zostaną zapisane, a następnie wybierz "OK", aby zapisać końcowe obrazy nasion do późniejszego wykorzystania podczas generowania modelu.

4. Generuj modele

  1. Wybierz opcję "Generuj modele na podstawie nasion", wybierz folder, w którym zapisywane są wyodrębnione cząstki, a następnie wyświetl okno dialogowe "Generuj modele" (Rysunek 6).
  2. Załaduj nasiona dla każdego kanału, korzystając z pól wyboru.
    UWAGA: Nasiona zostaną zapisane w podfolderze, który został nazwany w oknie dialogowym "Generuj nasiona". Domyślna nazwa to "Analiza". Zwróć uwagę, aby wybrać średnie początkowe, a nie ramki, które są również zapisywane w celach informacyjnych.
  3. Przypisz początkowe parametry generowania modelu, wprowadzając je w oknie dialogowym "Generuj modele" w następujący sposób. Dostosuj te parametry później.
    1. Umożliwia wybranie, czy do wyrównania ma być używany kanał odniesienia, który oblicza translacje i obroty tylko na podstawie kanału odniesienia i stosuje je do wszystkich kanałów. Jeśli korzystasz z tej opcji, wybierz kanał, który ma być używany jako odniesienie.
      UWAGA: Ta opcja powinna być wybierana tylko w celu użycia jednego kanału jako odniesienia, na przykład w przypadku odnajdywania struktury opartej na odniesieniach. W przeciwnym razie spowoduje to mniej dokładne modele. Kanały powinny być dobrze wyrównane, jeśli korzystasz z tej opcji.
    2. Wybierz, czy intensywność obrazu ma być kwadratowa podczas dopasowywania szablonu. Uwydatni to drobne różnice, więc wykorzystaj to przy tworzeniu modelu, który ma szczególnie subtelne cechy.
    3. Wybierz minimalne podobieństwo względem ziarna, korzystając z suwaka "Minimalne podobieństwo względem ziarna" lub wpisując liczbę w polu.
      UWAGA: Używane będą tylko cząstki o podobieństwie do nasion większe niż ta granica. 60-80% to zazwyczaj dobry wybór na początek.
    4. Ustaw maksymalną liczbę iteracji na 1, zoptymalizuj minimalne podobieństwo względem ziarna i zwiększ je później, zgodnie z wymaganiami.
    5. Zaznacz pola, aby wybrać elementy procesu generowania modelu, które zostaną wyświetlone.
      UWAGA: "Pokaż nasiona" wyświetli nasiona, które zostały załadowane z polami w górnej części okna dialogowego. "Pokaż modele" wyświetli wszystkie iteracje modeli, które zostały utworzone z uśrednienia podzbioru cząstek, który spełnia minimalne podobieństwo względem nasion. Opcja "Pokaż MSE" spowoduje wyświetlenie obrazu błędu średniokwadratowego (MSE), który podkreśla obszary modelu, które są najbardziej zmienne. Opcja "Pokaż cząstki" spowoduje wyświetlenie podzbioru cząstek, które są używane do tworzenia modeli, zarejestrowanych zgodnie z najwyższą iteracją wyświetlanego modelu.
  4. Wybierz opcję "Pokaż podgląd", aby wygenerować podgląd modeli i wyświetlić wyniki.
    UWAGA: Jest to najbardziej wymagający obliczeniowo etap procesu. Czas pracy zestawu kilku tysięcy cząstek o średnicy kilkudziesięciu pikseli na komputerze stacjonarnym powinien wynosić około 10 minut. Jeśli problemem jest czas obliczeń, użytkownicy powinni najpierw wypróbować algorytm na mniejszym podzbiorze danych lub użyć mniejszego promienia zwrotu z inwestycji w kroku 2.2.4, jeśli to możliwe.
  5. Przeglądaj wygenerowane modele i optymalizuj parametry, zwłaszcza minimalne podobieństwo do nasion. Zwiększaj minimalne podobieństwo do nasion, aż do momentu, gdy w modelu zostaną uwzględnione tylko prawdziwe cząstki modelowanej morfologii.
  6. Zwiększ maksymalną liczbę iteracji za pomocą suwaka "Maksymalna liczba iteracji" lub wprowadzając liczbę w polu i pozwól procesowi generowania modelu na iterację. Użyj wartości około 10, aby uzyskać maksymalną iterację.
  7. Nazwij modele i wybierz "OK", aby zapisać stosy ewolucji modelu, które zawierają wszystkie iteracje końcowego procesu generowania modelu.
    UWAGA: Jeśli minimalne podobieństwo w stosunku do nasion jest tak wysokie, że żadne cząstki nie mają tego podobieństwa, nic nie zostanie zaktualizowane. Jeśli wtyczka wydaje się być zawieszona, rozważ możliwość, że minimalne podobieństwo jest zbyt wysokie.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy oprogramowanie na modelu poxvirus, wirusa krowianki. Jeden z najbardziej złożonych wirusów ssaków, krowianka, pakuje około 80 różnych białek w cząsteczkę w kształcie cegły o wymiarach 350 x 270 x 250 nm3 13,14. Mikroskopia elektronowa umożliwia rozpoznanie trzech podstruktur: centralnego rdzenia, który zawiera genom dsDNA; dwie struktury białkowe, zwane ciałami bocznymi, które otaczają rdzeń; i pojedynczą dwuwarstwową otoczkę proteolipidową15. Duży rozmiar, złożona struktura i podatność na rekombinowane znakowanie białek fluorescencyjnych sprawiają, że krowianka jest doskonałym systemem do demonstracji przepływu pracy VirusMapper.

Korzystając z opisanego tutaj oprogramowania, można modelować rozkład różnych białek na wirionie krowianki. Białko zostało znakowane i zobrazowane, prawdopodobnie w połączeniu z innym białkiem o znanym występowaniu jako odniesienie, a oprogramowanie wykorzystano zgodnie z opisem do stworzenia średnich modeli lokalizacji tego białka na cząsteczce. W tym przykładzie modelowano dwa białka, wewnętrzne białko rdzeniowe L4 i główny boczny składnik ciała F17.

Użyto rekombinowanego wirusa krowianki, który ma F17 oznaczone GFP i L4 oznaczone mCherry16. Oczyszczony wirus rozcieńczono w 1 mM Tris, pH 9 i powiązano z umytymi, wysokowydajnymi szkiełkami nakrywkowymi, pokrywając je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Próbki następnie utrwalono poprzez zastosowanie 4% formaldehydu w PBS przez 20 minut. Szkiełka nakrywkowe montowano natychmiast na szkiełkach w podłożu do mocowania zapobiegającego blaknięciu. Obrazowanie przeprowadzono za pomocą karty SIM na komercyjnym mikroskopie SIM. Wybrano pole widzenia zawierające setki wirusów, a obrazy uzyskano za pomocą 5 przesunięć fazowych i 3 obrotów siatki za pomocą laserów o długości fali 561 nm (okres siatki 32 μm) i 488 nm (okres siatki 32 μm). Obrazy uzyskano za pomocą kamery sCMOS i przetworzono za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Kanały zostały wyrównane na podstawie wielokolorowego slajdu z koralików zobrazowanego z tymi samymi ustawieniami akwizycji obrazu. Po rekonstrukcji karty SIM i wyrównaniu kanałów obrazy zostały otwarte na Fidżi i połączone w jeden stos obrazów.

Cząsteczki wirusa zostały wyodrębnione z obrazów przy użyciu kanału L4 jako odniesienia i bez stosowania rozmycia gaussowskiego, ponieważ te cząstki mają centralne maksimum. W tym eksperymencie wyekstrahowano około 15 000 cząstek.

Ze względu na geometrię krowianki, ciała boczne mają wyraźnie różny wygląd w zależności od orientacji wirusa. Zobrazowaliśmy dwie orientacje, w których można było rozróżnić jedno lub dwa ciała boczne. Odnosiliśmy się do tych orientacji odpowiednio jako czołowej i strzałkowej.

Osobne nasiona dla orientacji czołowej i strzałkowej zostały wybrane poprzez przeszukiwanie listy cząstek na etapie "Generowanie nasion" (Rysunki 4 i 5); wybrano cząstki, które były wyraźnie w jednej lub drugiej orientacji. Kanał L4 został użyty jako kanał referencyjny do wyrównania nasion względem siebie. Również w tym przypadku rozmycie gaussowskie nie było konieczne. Wybrano 5 cząstek dla każdej orientacji i uśredniono je w celu wytworzenia nasion.

Modele zostały wygenerowane dla każdej orientacji na podstawie tych nasion. Nie użyto ani kanału referencyjnego, ani kwadratowych wartości intensywności. Maksymalna liczba iteracji została początkowo ustawiona na 1, a minimalne podobieństwo zostało ustalone tak, aby obejmowało około 1000 cząstek w każdym przypadku, co dawało spójny wygląd dla każdej orientacji. Następnie zwiększono maksymalną liczbę iteracji, aby umożliwić konwergencję modelu. W ten sposób wygenerowano modele dla dwóch orientacji w dwóch kanałach (rysunek 7).

figure-results-1
Rysunek 1: Obieg pracy programu VirusMapper. Wtyczka jest podzielona na trzy główne etapy. Cząsteczki wirusa są ekstrahowane z dużych obrazów, obrazy szablonowe lub nasiona są wybierane półręcznie z danych, a końcowe modele SPA są generowane na podstawie danych poprzez odniesienie do nasion. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Okno dialogowe "Wyodrębnij struktury wirusowe". Po wybraniu opcji "Wyodrębnij struktury wirusowe" pojawi się to okno dialogowe. Parametry powinny być wypełnione wstępnymi szacunkami w celu optymalnej segmentacji. Następnie można wybrać opcję "Pokaż podgląd", co pozwala na podgląd ROI i precyzyjne dostrojenie parametrów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Ustawianie parametrów ekstrakcji. Po wyświetleniu podglądu ROI, które zostaną wyodrębnione, promień ROI, liczba ROI i maksymalne nakładanie się ROI są dostosowywane w celu osiągnięcia takiej sytuacji. Obszary zainteresowania są nieco większe niż cząstki, wszystkie cząstki są uwzględniane w obszarze zwrotu z inwestycji, a obszary robocze mogą nakładać się na siebie na tyle, aby umożliwić oddzielenie zgrupowanych cząstek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Generowanie nasion pasujących do szablonu. Okno dialogowe "Generuj nasiona" (1) określa parametry, które należy przypisać. Sekwencja cząstek odniesienia (2) pozwala użytkownikowi na skanowanie cząstek w kanale referencyjnym. Gdy cząstka jest oglądana w sekwencji cząstek odniesienia, wyrównane cząstki dla wszystkich kanałów mogą być viewed w wyrównanych podglądach cząstek (3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Dodawanie obrazów źródłowych. Gdy nasiona są dodawane do pola "Ramki do użycia", wyświetlana jest średnia wszystkich nasion (4) i odpowiednich ramek (5). Cząstki, które są podobne do aktualnych średnich nasion, są sugerowane w oknie dialogowym (6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Okno dialogowe "Generuj modele". Po wybraniu opcji "Generuj modele na podstawie nasion" pojawi się to okno dialogowe. Parametry powinny być wypełnione wstępnymi szacunkami dla optymalnego generowania modelu oraz powinny być wybrane elementy procedury generowania modelu, które mają być pokazane podczas obliczeń. Następnie można wybrać opcję "Pokaż podgląd", co pozwoli na uruchomienie procesu generowania modelu i precyzyjne dostrojenie parametrów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Modele wygenerowane za pomocą programu VirusMapper. Wiriony krowianki z białkiem rdzeniowym L4 znakowanym mCherry i białkiem F17 bocznego ciała oznaczonym EGFP zobrazowano za pomocą karty SIM. Modele zostały następnie wygenerowane za pomocą oprogramowania, zgodnie z opisem w protokole. Dwie orientacje, czołowa i strzałkowa, wyróżniają się wyglądem ciał bocznych. Podziałka = 100 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki tej metodzie naukowcy są przygotowani do połączenia mocy mikroskopii SPA i SR w celu wygenerowania wysoce precyzyjnych, wielokanałowych modeli 2D architektury białkowej wirusów i innych kompleksów makromolekularnych. Należy jednak wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii.

Nasiona powinny być tak dobrane, aby reprezentowały strukturę, która jest konsekwentnie widoczna. W związku z tym surowe dane powinny być dokładnie sprawdzone przed wyborem nasion. Jest to ważne dla zapobiegania tendencyjnym modelom. Wybory mogą być weryfikowane poprzez badanie minimalnych progów podobieństwa potrzebnych do uwzględnienia określonej liczby cząstek w modelach. Oczywiste jest, że dla wyboru ziarna, im wyższy musi być ten próg dla danej liczby cząstek, tym bardziej ta struktura jest widoczna w danych.

Koncepcja dopasowywania szablonów jest szczególnie przydatna, gdy dane są niejednorodne. Należy zidentyfikować wszystkie widoczne struktury i stworzyć różne modele dla każdego przypadku. Rozdzielając heterogeniczne struktury w jednym kanale, ale jednocześnie tworząc modele w drugim kanale, mogą pojawić się wzorce, które nie byłyby od razu widoczne.

Inną kwestią, o której należy pamiętać podczas korzystania z tego algorytmu, jest to, że procedura iteracji zmaksymalizuje asymetrię stochastyczną. Na przykład podczas modelowania konstrukcji z dwoma maksymami symetrycznymi, wszystkie niewielkie asymetrie między maksimami zostaną wyrównane ze sobą podczas iteracji, a zatem ostateczny model będzie maksymalnie asymetryczny. Jeśli nie odzwierciedla to znanej symetrii w modelowanej konstrukcji, należy to wziąć pod uwagę. Obecnie jedynym sposobem na uniknięcie tej maksymalizacji jest ograniczenie liczby iteracji do 1, chociaż potencjalnym osiągnięciem byłoby włączenie przez VirusMapper osi symetrii do procesu generowania modelu. Wszelkie nowe wersje programu VirusMapper będą dostępne na wspomnianej stronie internetowej (patrz Tabela materiałów). Użytkownicy znajdą tutaj również FAQ, aby odpowiedzieć na wszelkie często zadawane pytania.

Oprogramowanie zgodnie z opisem ma zastosowanie do każdej konstrukcji, którą można zobrazować z rozdzielczością wystarczającą do wizualizacji cech, które użytkownik chce modelować. Chociaż SPA może poprawić rozdzielczość, z pewnością nie poprawi widoczności obiektów, które w innym przypadku nie są widoczne. Protokół ten nie jest zatem metodą na poprawę jakości danych. Podobnie jak w przypadku każdej techniki, staranne przygotowanie próbki i optymalizacja strategii obrazowania zapewnią najczystsze dane i najlepsze modele wynikowe.

Wybór metody obrazowania SR jest również ważny i ogólnie rzecz biorąc, będzie zależał od dostępnej próbki. VirusMapper został zatwierdzony do pracy z kartami SIM i STED10, a także może być używany z wysokiej jakości danymi z mikroskopii lokalizacyjnej, ale w tym przypadku należy zachować ostrożność, ponieważ rzadkie etykietowanie może powodować problemy podobne do tych związanych z maksymalizacją asymetrii.

Obecnie VirusMapper jest jedynym ogólnodostępnym algorytmem do analizy pojedynczych cząstek obrazów fluorescencyjnych i jedynym oprogramowaniem do uśredniania 2D SPA ogólnego przeznaczenia. W innych badaniach, w których wykorzystano te same zasady, 4,6,8 wykorzystano niestandardowe oprogramowanie wyspecjalizowane dla każdego konkretnego badania. Opublikowano algorytmy ogólnego przeznaczenia do rekonstrukcji danych 3D 5,18, chociaż nie dostarczono żadnego oprogramowania.

W przypadku użycia zgodnie z opisem w tym artykule, VirusMapper może być używany do tworzenia precyzyjnych, dokładnych i solidnych modeli makromolekularnej architektury białkowej wirusów i innych kompleksów. Dzięki tym modelom naukowcy mogą dokonywać precyzyjnych pomiarów średnich wymiarów badanych struktur, co potencjalnie pozwala im dojść do wniosków biologicznych, które w innym przypadku nie byłyby możliwe.

Co więcej, dzięki wielokanałowym możliwościom tej techniki, możliwe jest mapowanie nieograniczonej liczby białek i składników w kompleksach oraz odkrywanie nowej organizacji białek. Badanie zmian w strukturze w nanoskali w różnych biologicznie istotnych warunkach, takich jak różne etapy cyklu życiowego wirusa, może dostarczyć cennych informacji na temat biologii.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Corinie Beerli, Jerzemu Samolejowi, Pedro Matosowi Pereirze, Christopherowi Bleckowi i Kathrin Scherer za ich wkład w oryginalny rozwój i walidację VirusMappera. Serdecznie dziękujemy również Arturowi Yakimovichowi za krytyczną lekturę rękopisu. Praca ta została sfinansowana z grantów Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BB/M022374/1) (R.H.); podstawowe finansowanie dla Laboratorium Molekularnej Biologii Komórki MRC, University College London (J.M.); Europejska Rada ds. Badań Naukowych (649101-UbiProPox) (J.M.); oraz Rada ds. Badań Medycznych (MR/K015826/1) (R.H. i J.M.). R.G. jest finansowany przez Radę ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych (EP/M506448/1).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
FidżiOprogramowanie do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym
NanoJ-VirusMapperopracowane przez laboratoriumWtyczka Open source-Fiji (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper)
Nośnik montażowy VectaShieldVector LabsH-100
Elyra PS1Zeiss
ZENZeissOprogramowanie do przetwarzania obrazu dla karty SIM
Wysokowydajne szkiełko nakrywkoweZeiss  474030-9000-000
Koraliki TetraSpeckThermoFisherT7279
Henriques

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Henriques, R., Griffiths, C., Rego, E. H., Mhlanga, M. M. PALM and STORM: Unlocking live-cell super-resolution. Biopolymers. 95 (5), 322-331 (2011).
  2. Gustafsson, N., Culley, S., et al. Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations. Nat Commun. 7, 12471(2016).
  3. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  4. Szymborska, A., de Marco, A., Daigle, N., Cordes, V. C., Briggs, J. A. G., Ellenberg, J. Nuclear pore scaffold structure analyzed by super-resolution microscopy and particle averaging. Science. 341 (6146), 655-658 (2013).
  5. Broeken, J., Johnson, H., et al. Resolution improvement by 3D particle averaging in localization microscopy. Methods Appl Fluoresc. 3 (1), 14003(2015).
  6. Burns, S., Avena, J., Unruh, J., Yu, Z. Structured illumination with particle averaging reveals novel roles for yeast centrosome components during duplication. Elife. , (2015).
  7. Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (22), 8564-8569 (2012).
  8. Laine, R. F., Albecka, A., Svan de Linde,, Rees, E. J., Crump, C. M., Kaminski, C. F. Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging. Nat Commun. 6, 5980(2015).
  9. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Gray, R. D. M., Beerli, C. VirusMapper: open-source nanoscale mapping of viral architecture through super-resolution microscopy. Sci Rep. 6, 29132(2016).
  11. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J of Micros. 198 (2), 82-87 (2000).
  12. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Let. 19 (11), 780(1994).
  13. Chung, C. -S., Chen, C. -H., Ho, M. -Y., Huang, C. -Y., Liao, C. -L., Chang, W. Vaccinia virus proteome: identification of proteins in vaccinia virus intracellular mature virion particles. J Virol. 80 (5), 2127-2140 (2006).
  14. Moss, B. Poxviridae: the viruses and their replication. Fields virology. , Ovid. (2010).
  15. Condit, R. C., Moussatche, N., Traktman, P. In a nutshell: structure and assembly of the vaccinia virion. Adv Virus Res. 66 (6), 31-124 (2006).
  16. Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., et al. Vaccinia virus entry is followed by core activation and proteasome-mediated release of the immunomodulatory effector VH1 from lateral bodies. Cell Rep. 4 (3), 464-476 (2013).
  17. Nanoj-virusmapper. , Available from: https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper (2016).
  18. Fortun, D., Guichard, P., Unser, M. Reconstruction From Multiple Poses in Fluorescence Imaging: Proof of Concept. IEEE J Sel Topics Signal Process. 10 (1), 61-70 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single particle AnalysisSuper resolution MicroscopyVirusMapper PluginImageJ SoftwareFluorescence ImagingStructural ModelingMolecular ArchitectureParticle ExtractionSeed GenerationModel Evolution

Related Articles