Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55482

⸱

27 marca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California, Santa Cruz

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszym opisujemy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40), zdolne do tworzenia oligomerów. Amyloid beta jest wysoce podatnym na agregację, hydrofobowym peptydem związanym z chorobą Alzheimera. Amyloidogenny charakter peptydu sprawia, że jego oczyszczanie jest wyzwaniem.

Streszczenie

Peptydy amyloidogenne, takie jak beta amyloid (Aβ) związany z chorobą Alzheimera, mogą stanowić poważne wyzwanie przy próbie uzyskania materiału o wysokiej czystości. Tutaj przedstawiamy dostosowany protokół oczyszczania HPLC do produkcji peptydów amyloidu beta 42 (Aβ42) i beta-amyloidu 40 (Aβ40) o wysokiej czystości. Odkryliśmy, że połączenie dostępnej na rynku hydrofobowej fazy stacjonarnej z poli(styrenu/diwinylobenzenu), polimerowej laboratoryjnej fazy odwróconej - styrenidenylobenzenu (PLRP-S) w warunkach wysokiego pH, umożliwia osiągnięcie wysokiej czystości (>95%) Aβ42 w jednym przebiegu chromatograficznym. Oczyszczanie jest wysoce powtarzalne i może być modyfikowane zarówno do warunków półpreparatywnych, jak i analitycznych, w zależności od ilości materiału, który ma być oczyszczony. Protokół może być również stosowany do peptydu Aβ40 z identycznym powodzeniem i bez konieczności zmiany metody.

Wprowadzenie

Choroba Alzheimera to zaburzenie neurodegeneracyjne, które dotyka ponad 35 milionów ludzi na całym świecie. 1 Jest silnie zaangażowany w początek i rozwój choroby, jest wysoce podatny na agregację, hydrofobowy peptyd Amyloid beta (Aβ). 2 Aβ ma długość od 36 do 43 aminokwasów, jednak uważa się, że wariant 42-aminokwasowy, amyloid beta 42 (Aβ42), jest najbardziej toksyczną formą białka. 3 Wynika to głównie ze zdolności Aβ42 do łatwego tworzenia rozproszonych, oligomerycznych gatunków, które są uważane za szczególnie neurotoksyczne jednostki. 4 Aby lepiej zrozumieć peptyd Aβ, konieczne jest rutynowe pozyskiwanie materiału o wysokiej czystości. Wykazano, że obecność śladowych zanieczyszczeń radykalnie zmienia właściwości peptydu w zakresie skłonności do agregacji. 5

Tradycyjnie, wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) rozdzielanie hydrofobowych peptydów, takich jak Aβ, odbywa się za pomocą kombinacji faz stacjonarnych na bazie krzemionki C4 lubC 8 i kwaśnej fazy ruchomej. 6 Jednak takie warunki mogą stanowić wyzwanie dla oczyszczania peptydu. Niski punkt izoelektryczny peptydu Aβ (pI około 5,5)7 oznacza, że w warunkach kwaśnych agregacja peptydów jest zwiększona, w wyniku czego powstają szerokie, nierozdzielcze piki HPLC, które często są trudne do wyizolowania (Figura 2A). Co więcej, tak szerokie piki często zawierają zanieczyszczenia, które mogą wpływać na profil agregacji peptydu i zwykle wymagają kolejnych rund oczyszczania, co może dramatycznie wpłynąć na ilość wytwarzanego peptydu.

Faza stacjonarna poli(styrenu/diwinylobenzenu), PLRP-S, stanowi alternatywny sposób oczyszczania peptydów hydrofobowych. Faza stacjonarna została wykorzystana do oczyszczania wielu różnych białek i informacyjnych kwasów rybonukleinowych (mRNA). 8,9 Faza stacjonarna PLRP-S nie wymaga dodatkowego ligandu alkilowego do separacji faz wstecznych, a co ważniejsze, jest stabilna chemicznie przy wysokim pH, co prowadzi do deagregacji peptydu. 7 W niniejszym dokumencie przedstawiamy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Oczyszczanie preparatywne peptydu Aβ40 lub Aβ42 metodą HPLC

  1. Przygotuj następujące bufory do oczyszczania metodą HPLC.
    1. Przygotuj bufor A (20 mM NH4OH), dodając 1,3 mL NH4OH (roztwór 28%) do 1000 mL wody ultra czystej.
    2. Przygotuj bufor B (80% acetonitryl z 20 mM NH4OH), dodając 1,3 mL NH4OH (roztwór 28%) do roztworu zawierającego 800 mL chromatograficznie czystego acetonitrylu i 200 mL wody ultra czystej.
    3. Przygotuj bufor do rozpuszczania próbki (0,1% NH4OH), dodając 100 µL NH4OH (roztwór 28%) do 100 mL wody ultra czystej.
  2. Skonfiguruj aparat HPLC zgodnie z rysunkiem 1.
    1. Podłącz butelki z buforem A i buforem B do wejść pompy HPLC za pomocą węży polimerowych. Przymocuj węże polimerowe do pompy HPLC za pomocą jednokomponentowego złączki. Upewnij się, że wąż polimerowy każdego buforu jest podłączony do odpowiedniego zaworu wejściowego aparatu. Wyposaż pompę HPLC w odgazownik.
    2. Połącz pompę HPLC z wejściem kolumny preparatywnej 300 Å 8 µm 25 mm х 300 mm za pomocą węży polimerowych (rysunek 1B, kolumna najbardziej z lewej strony, patrz lista materiałów).
      1. Przymocuj węże polimerowe do kolumny preparatywnej za pomocą jednokomponentowej złączki dokręcanej ręcznie. Upewnij się, że kolumna polimerowa jest zorientowana poprawnie.
        UWAGA: Faza stacjonarna kolumny preparatywnej składa się z cząstek poli(styren-divinylbenzenu). Poprawna orientacja kolumny polimerowej jest oznaczona na zewnętrznej obudowie pojedynczą strzałką kierunkową.
    3. Połącz wyjście kolumny z detektorem o podwójnej długości fali za pomocą węży polimerowych i ustaw detektor na długości fali 214 nm i 280 nm.
      1. Zmień długość fali, modyfikując parametry długości fali detekcji w opcji metody konfiguracji aparatu w wbudowanym oprogramowaniu HPLC.
    4. Przymocuj węże polimerowe do wejścia detektora długości fali za pomocą jednokomponentowej złączki dokręcanej ręcznie. Przymocuj węże polimerowe do zaworu wyjściowego detektora długości fali. Przymocuj węże polimerowe do zaworu wyjściowego detektora HPLC za pomocą jednokomponentowej złączki dokręcanej ręcznie. Będzie to wąż do zbierania próbek.
      UWAGA: Brak silnego chromoforu w peptydzie Aβ oznacza, że jako podstawową długość fali ultrafioletowej (UV) do zbierania pików należy użyć 214 nm.

Układ chromatografii cieczowej o wysokiej wydajności (HPLC) do rozdzielania i analizy związków.
Rycina 1: Schemat układu doświadczalnego aparatury HPLC wykorzystanej do oczyszczania peptydów beta-amyloidowych. (A) Czwórkowy pompą HPLC wyposażoną w odgazowywacz i detektor o zmiennych długościach fali ustawiony na 214 nm i 280 nm; (B) Kolumny HPLC używane do oczyszczania peptydów beta-amyloidowych, od lewej do prawej: kolumna preparatywna 25 x 300 mm2, kolumna półpreparatywna 7,5 x 300 mm2 oraz kolumna analityczna 4,6 x 250 mm2; (C) Ręczny dozownik z 20 µL stalowym pętlą dozującą, używany do HPLC analitycznego; (D) Ręczny dozownik z 10 mL stalowym pętlą dozującą, używany do oczyszczania preparatywnego i półpreparatywnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Skonfiguruj oprogramowanie HPLC tak, aby uruchomić metodę oczyszczania zgodnie z Tabelą 1. Wprowadź metodę oczyszczania, zmieniając parametr harmonogramu rozpuszczalnika (w opcji konfiguracji metody instrumentu wbudowanej w oprogramowanie HPLC). Włącz pompę HPLC, klikając przycisk „on” w oprogramowaniu HPLC.
    UWAGA: Pompa rozpocznie dostarczanie początkowego stosunku buforu A i buforu B przez kolumnę preparatywną oraz instrument HPLC.
    1. Pozostaw system w stanie równowagi przez 30 minut.
Czas / min% buforu Aa% buforu BbPrzepływd / mL min-1
080206
4575,524,56
45,0180206
52,0180206
52,0273276
8573276
92595c6

Tabela 1: Harmonogram oczyszczania peptydów Aβ42 i Aβ40 przy użyciu kolumny polimerowej 25 × 300 mm. aBufor A – H2O z 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH; cPrzeprowadzono przez 15 min w celu przemywania kolumny przed kolejnym wstrzyknięciem próbki; dAby uzyskać przepływ 6 mL/min na aparaturze HPLC, limit ciśnienia należy zmniejszyć do 200 bar.

  1. Oczyszczanie próbki peptydu Aβ
    Note: Surowy peptyd uzyskano w wyniku automatycznej syntezy peptydów w fazie stałej.10
    1. Rozpuść 3 mg surowego peptydu Aβ w 4 mL buforu do rozpuszczania próbek. Sonikuj próbkę przez 30–60 s w temperaturze pokojowej i przy częstotliwości 40 kHz w celu ułatwienia rozpuszczenia.
    2. Wstrzyknij całą próbkę na kolumnę HPLC za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 5 mL wyposażonej w stalową igłę o kalibrze 16. Przeprowadź metodę oczyszczania zgodnie z podpunktem 1.3.
      UWAGA: System umożliwia wstrzyknięcie próbki za pomocą ręcznego dozownika wyposażonego w stalową pętlę dozującą o pojemności 10 mL (Ryc. 1D). Pożądany peptyd Aβ wyeluuje między 72. a 74. minutą jako ostra, dobrze rozdzielona fala (Ryc. 2C).
    3. Zbierz próbkę do stożkowej probówki do wirowania o pojemności 50 mL. Potwierdź tożsamość fali Aβ za pomocą bezpośredniego wstrzyknięcia i spektrometrii mas zebranego eluatu.11 Przechowuj eluat przez maksymalnie 12 godzin w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Nie zaleca się przechowywania roztworu dłużej niż 12 godzin ze względu na możliwość utleniania peptydu.
    4. Wyizoluj oczyszczony peptyd poprzez szybkie zamrożenie zebranych porcji peptydu Aβ w ciekłym azocie i liofilizację. Przeprowadź liofilizację przez suszenie pod wakuum w temperaturze -60 °C i pod ciśnieniem 20 mTorr przez 24 godziny.
    5. Wykonaj analityczną procedurę HPLC zgodnie z poniższym opisem, aby określić czystość peptydu Aβ. Przechowuj peptydy w postaci liofilizowanej w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.

2. Analiza białka Aβ po oczyszczeniu metodą HPLC

  1. Przygotuj bufory do HPLC zgodnie z podsekcją 1.1. powyższego protokołu.
  2. Skonfiguruj analityczny system HPLC zgodnie z krokiem 1.2.1 oraz jak pokazano na rysunku 1, montując kolumnę analityczną 4.6 × 250 mm (rysunek 1B, kolumna najbardziej z prawej) oraz ręczny dozownik z 20 µL stalowym pętlą dozującą (rysunek 1C) na urządzeniu.
  3. Skonfiguruj oprogramowanie HPLC do uruchomienia metody analitycznej przedstawionej w tabeli 2, postępując zgodnie z instrukcjami podobnymi do tych w kroku 1.3.
Czas / min% buforu Aa% buforu BbSzybkość przepływu / mL min-1
09551
3050501

Tabela 2: Harmonogram analizy czystości peptydu Aβ metodą HPLC. aBufor A – H2O z 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH.

  1. Analiza czystości peptydu Aβ
    1. Przygotuj roztwór peptydu o stężeniu 1 mg/mL poprzez rozpuszczenie peptydu w buforze próbkowym.
      UWAGA: przepis na bufor można znaleźć w podsekcji 1.1. Stężenie białka oznacza się poprzez pomiar pochłaniania białka przy 280 nm (A280 nm).12 Współczynnik molarnego wygaszania (ε) używany do wyznaczania stężenia to ε = 1 490 dm3 mol-1 cm-1.13
    2. Wprowadzić 20 µL 1 mg/mL (222 µM) roztwór na kolumnę HPLC i uruchom metodę analityczną skonfigurowaną w kroku 2.3.
      UWAGA: Pozostały roztwór nie użyty do analizy można szybko zamrozić w ciekłym azocie i liofilizować w celu odzyskania peptydu Aβ. Szczegóły liofilizacji podano w podsekcji 1.4.4. Peptyd Aβ eluuje z kolumny analitycznej pomiędzy 16 a 18 minutą (Rysunek 2D). Wykorzystaj wbudowane oprogramowanie analityczne do integracji dostarczane wraz z aparatem HPLC w celu określenia czystości peptydu Aβ. Czystość określa się poprzez zintegrowanie powierzchni poszczególnych pików na chromatogramie i obliczenie procentowej powierzchni piku peptydu. Zwykle po oczyszczeniu >95% powinno zostać potwierdzone.

Wyniki chromatografii, wykres absorbancji w funkcji czasu, analiza rozdziału białek, oznaczone piki.
Rycina 2: Przykładowe chromatogramy HPLC peptydu Aβ42. (A) Tradycyjna C4 oczyszczanie krzemionkowe, warunki: bufor A: H2O z 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA), bufor B: MeCN (acetonitryl) z 0,1% TFA, gradient: od 20 do 27% buforu B w ciągu 40 min, a następnie izokratycznie 27% buforu B; (B) Oczyszczanie przygotowawcze z użyciem kolumny 25 x 300 mm2 kolumna polimerowa, warunki: Bufor A: H2O z 20 mM NH4OH, bufor B: 80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH, gradient: 20 do 27% buforu B w ciągu 70 min, a następnie izokratycznie 27% buforu B; (C) Optymalizowana oczyszczalna oczyszczanie przy użyciu kolumny 25 x 300 mm2 kolumna polimerowa, warunki opisano w tabeli 1 znajdującej się w podsekcji 1.3 tekstu opisu protokołu; (D) HPLC analityczne przy użyciu kolumny 4,6 x 250 mm2 kolumna polimerowa, warunki: bufor A: H2O z 20 mM NH4OH, bufor B: 80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH, gradienta 5–50% buforu B w ciągu 30 min. Na częściach A, B i C szczyt odpowiadający Aβ42 oznaczono gwiazdką. Zbieranie oznaczonego szczytu Aβ42 na części C wykazuje czystość >95%, jak pokazano na części D. Identyfikację pików Aβ42 wykonano metodą spektrometrii masowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oczyszczanie peptydu Aβ42 przy użyciu kombinacji fazy stacjonarnej PLRP-S i ruchomej fazy o wysokim pH prowadzi do powstania ostrego, wyraźnego piku dla peptydu Aβ w czasie retencji od 72 do 74 min (Rysunek 2C). Tożsamość piku potwierdza się za pomocą bezpośredniej spektrometrii mas zebranego eluentu. Eluent może być przechowywany w roztworze w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 12 h. Dłuższy okres przechowywania może prowadzić do utlenienia białka. W celu wyizolowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oczyszczanie peptydu Aβ metodą HPLC jest w dużym stopniu zależne od wyboru zarówno fazy stacjonarnej zastosowanej w oczyszczaniu, jak i fazy ruchomej wybranej do elucji peptydu. Niski punkt izoelektryczny peptydu i wysoka skłonność do agregacji sprawiają, że tradycyjne warunki chromatograficzne do rozdzielania białek hydrofobowych (faza stacjonarna C4 lub C8 sprzężona z kwaśnym mobilnym eluentem) są trudne, a peptyd Aβ eluuje jako przedłużony szeroki, nierozwiązany pik (Figura 2A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować firmie Agilent za pomoc techniczną. Kate Markham i Rafael Palomino są uznawani za ich początkową pomoc w syntezie i oczyszczaniu peptydu Aβ, a dr Hsiau-Wei Lee dziękuje się za pomoc w przygotowaniu ryciny 1 manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa ćwiartkowa Agilent 1260 Infinity IIAgilentG7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Podwójny detektor o zmiennej długości faliAgilentG7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Wtryskiwacz ręczny Agilent 1260 Infinity II wyposażony w pętlę na próbki ze stali nierdzewnej o pojemności 10 mlAgilent0101-1232http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II wyposażony w 20 i mikro; L pętla na próbki ze stali nierdzewnejAgilentG1328C
http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector Pierścień Wspornik montażowy stojakaAgilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5  &mikro; m 4,6 x 250 mm (analityczny)AgilentPL1512-5501http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ 42 lub Aβ 40 peptydówSyntetyzowany we własnym zakresie przy użyciu zautomatyzowanego syntezatora peptydów CEM liberty.
Wodorotlenek amonu (NH4OH, roztwór 28%)Fisher ScientificA669-500
AcetonitrylFisher ScientificA998-4
Woda klasy HPLCFisher ScientificW5-4
Falcon 50 ml stożkowa probówka wirówkowaFisher Scientific14-954-49A Złączka
Supelco PEEK Jednoczęściowa dokręcana na palc, opakowanie 5 szt.Sigma-AldrichZ227250
Normject 5  sterylna strzykawka ccFisher Scientific1481729
16 Gauge SS IgłaReodyna3725-086
Wtryskiwacz ręczny

Bibliografia

  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
  4. Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
  5. Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
  7. Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
  8. Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
  9. Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
  10. Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
  11. Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
  12. Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
  13. Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
  14. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071(2009).
  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie oligomer w peptydowychstacjonarna faza polimerowawarunki wysokiego pHkolumna preparatywnadetektor dwud ugo ciowyr wnowa enie buforurozpuszczanie pr bki
Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.