Artykuł metodologiczny

Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów

DOI:

10.3791/55482

⸱

27 marca 2017

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California, Santa Cruz

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszym opisujemy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40), zdolne do tworzenia oligomerów. Amyloid beta jest wysoce podatnym na agregację, hydrofobowym peptydem związanym z chorobą Alzheimera. Amyloidogenny charakter peptydu sprawia, że jego oczyszczanie jest wyzwaniem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptydy amyloidogenne, takie jak beta amyloid (Aβ) związany z chorobą Alzheimera, mogą stanowić poważne wyzwanie przy próbie uzyskania materiału o wysokiej czystości. Tutaj przedstawiamy dostosowany protokół oczyszczania HPLC do produkcji peptydów amyloidu beta 42 (Aβ42) i beta-amyloidu 40 (Aβ40) o wysokiej czystości. Odkryliśmy, że połączenie dostępnej na rynku hydrofobowej fazy stacjonarnej z poli(styrenu/diwinylobenzenu), polimerowej laboratoryjnej fazy odwróconej - styrenidenylobenzenu (PLRP-S) w warunkach wysokiego pH, umożliwia osiągnięcie wysokiej czystości (>95%) Aβ42 w jednym przebiegu chromatograficznym. Oczyszczanie jest wysoce powtarzalne i może być modyfikowane zarówno do warunków półpreparatywnych, jak i analitycznych, w zależności od ilości materiału, który ma być oczyszczony. Protokół może być również stosowany do peptydu Aβ40 z identycznym powodzeniem i bez konieczności zmiany metody.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Alzheimera to zaburzenie neurodegeneracyjne, które dotyka ponad 35 milionów ludzi na całym świecie. 1 Jest silnie zaangażowany w początek i rozwój choroby, jest wysoce podatny na agregację, hydrofobowy peptyd Amyloid beta (Aβ). 2 Aβ ma długość od 36 do 43 aminokwasów, jednak uważa się, że wariant 42-aminokwasowy, amyloid beta 42 (Aβ42), jest najbardziej toksyczną formą białka. 3 Wynika to głównie ze zdolności Aβ42 do łatwego tworzenia rozproszonych, oligomerycznych gatunków, które są uważane za szczególnie neurotoksyczne jednostki. 4 Aby lepiej zrozumieć peptyd Aβ, konieczne jest rutynowe pozyskiwanie materiału o wysokiej czystości. Wykazano, że obecność śladowych zanieczyszczeń radykalnie zmienia właściwości peptydu w zakresie skłonności do agregacji. 5

Tradycyjnie, wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) rozdzielanie hydrofobowych peptydów, takich jak Aβ, odbywa się za pomocą kombinacji faz stacjonarnych na bazie krzemionki C4 lubC 8 i kwaśnej fazy ruchomej. 6 Jednak takie warunki mogą stanowić wyzwanie dla oczyszczania peptydu. Niski punkt izoelektryczny peptydu Aβ (pI około 5,5)7 oznacza, że w warunkach kwaśnych agregacja peptydów jest zwiększona, w wyniku czego powstają szerokie, nierozdzielcze piki HPLC, które często są trudne do wyizolowania (Figura 2A). Co więcej, tak szerokie piki często zawierają zanieczyszczenia, które mogą wpływać na profil agregacji peptydu i zwykle wymagają kolejnych rund oczyszczania, co może dramatycznie wpłynąć na ilość wytwarzanego peptydu.

Faza stacjonarna poli(styrenu/diwinylobenzenu), PLRP-S, stanowi alternatywny sposób oczyszczania peptydów hydrofobowych. Faza stacjonarna została wykorzystana do oczyszczania wielu różnych białek i informacyjnych kwasów rybonukleinowych (mRNA). 8,9 Faza stacjonarna PLRP-S nie wymaga dodatkowego ligandu alkilowego do separacji faz wstecznych, a co ważniejsze, jest stabilna chemicznie przy wysokim pH, co prowadzi do deagregacji peptydu. 7 W niniejszym dokumencie przedstawiamy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparatywne oczyszczanie HPLC peptydu Aβ40 lub Aβ42

  1. Przygotować następujące do oczyszczania metodą HPLC.
    1. Przygotować bufor A (20 mM NH4OH), dodając 1,3 ml NH4OH (28% roztwór) do 1,000 ml ultraczystej wody.
    2. Przygotować bufor B (80% acetonitrylu z 20 mM NH4OH) przez dodanie 1,3 ml NH4OH (28% roztwór) do roztworu 800 ml acetonitrylu klasy HPLC i 200 ml wody ultraczystej.
    3. Przygotować bufor do rozpuszczania próbki (0,1% NH4OH) przez dodanie 100 μl NH4OH (28% roztwór) do 100 ml ultraczystej wody.
  2. Ustaw przyrząd HPLC, jak pokazano na rysunku 1.
    1. Umieścić butelki z rozpuszczalnikiem zawierające bufor A i bufor B do wlotów pompy HPLC za pomocą rurki polimerowej. Podłącz rurkę polimerową do pompy HPLC za pomocą jednoczęściowej złączki. Upewnij się, że rurka polimerowa każdego bufora jest podłączona do odpowiedniego zaworu wlotowego przyrządu. Wyposażyć pompę HPLC w odgazowywacz.
    2. Połączyć pompę HPLC z wlotem kolumny preparatywnej 300 Å 8 μm 25 mm x 300 mm (rysunek 1B, skrajna lewa kolumna, patrz lista materiałów) za pomocą rurki polimerowej.
      1. Przymocuj rurkę polimerową do kolumny preparatywnej za pomocą jednoczęściowego szczelnego mocowania palcowego. Upewnij się, że kolumna polimerowa jest zorientowana we właściwy sposób.
        UWAGA: Faza stacjonarna kolumny preparatywnej składa się z cząstek poli(styrenu-diwinylobenzenu). Prawidłowa orientacja kolumny polimerowej jest oznaczona na zewnętrznej obudowie pojedynczą strzałką kierunkową.
    3. Podłącz wylot kolumny do detektora podwójnej długości fali za pomocą rurki polimerowej i ustaw detektor długości fali na 214 nm i 280 nm.
      1. Zmień długość fali, zmieniając parametry długości fali wykrywania w opcji metody konfiguracji przyrządu wbudowanego oprogramowania HPLC.
    4. Przymocuj rurkę polimerową do wlotu detektora długości fali za pomocą jednoczęściowego szczelnego mocowania palcowego. Podłącz rurkę polimerową do zaworu wyjściowego detektora długości fali. Przymocuj rurkę polimerową do zaworu wylotowego detektora HPLC za pomocą jednoczęściowego szczelnego złącza palcowego. Będzie to rurka do pobierania próbek.
      UWAGA: Brak silnego chromoforu na peptydzie Aβ dyktuje, że 214 nm powinno być używane jako podstawowa długość fali ultrafioletowej (UV) do zbierania pików.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Układ doświadczalny instrumentu HPLC używanego do oczyszczania peptydów beta amyloidu. A) czwartorzędowa pompa HPLC wyposażona w odgazowywacz i detektor o zmiennej długości fali, ustawiona na 214 nm i 280 nm; (B) kolumny HPLC stosowane do oczyszczania peptydów beta amyloidu, od lewej do prawej, kolumna preparatywna 25 x 300mm, kolumna półpreparatywna 7,5 x 300 mm2 i kolumna analityczna 4,6 x 250mm2; (C) Wtryskiwacz ręczny z pętlą wtryskową ze stali nierdzewnej o pojemności 20 μl, stosowany do analitycznej HPLC; (D) Wtryskiwacz ręczny z pętlą iniekcyjną ze stali nierdzewnej o pojemności 10 ml stosowany do oczyszczania preparatywnego i półpreparatywnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zaprogramuj oprogramowanie HPLC tak, aby uruchamiało metodę oczyszczania, jak pokazano w Tabeli 1. Wprowadź metodę oczyszczania, zmieniając parametr harmonogramu rozpuszczalnika (w opcji metody konfiguracji przyrządu wbudowanej w oprogramowanie HPLC). Włącz pompę HPLC, klikając przycisk "włącz" w oprogramowaniu HPLC.
    UWAGA: Pompa zacznie podawać stosunek rozruchowy buforu A i buforu B przez kolumnę preparatywną i przyrząd HPLC.
    1. Pozostaw system na 30 minut, aby w pełni się zrównoważyć.
Czas / min % buforu Aa % bufora Bb Natężenie przepływud / ml min-1 0 Rozdział 80 20 6 Rozdział 45 75,5 pkt. 24,5 pkt. 6 Lokal mieszkalny 45.01 Rozdział 80 20 6 Norma 52.01 Rozdział 80 20 6 52.02 MIEJSCE 73 Rozdział 73 27 Rozdział 27 6 Rozdział 85 73 Rozdział 73 27 Rozdział 27 6 Rozdział 92 5 95stopni Celsjusza 6

Tabela 1: Harmonogram oczyszczania peptydów Aβ42 i Aβ40 przy użyciu kolumny polimerowej 25 × 300 mm. ZABufor A -H2Oz 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH; cDziałał przez 15 minut w celu umycia kolumny przed następnym wstrzyknięciem próbki; dAby uruchomić natężenie przepływu 6 ml/min na oprzyrządowaniu HPLC, limit ciśnienia musi zostać zmniejszony do 200 barów.

  1. Oczyszczanie próbki peptydu Aβ
    Uwaga: Surowy peptyd otrzymano w drodze automatycznej syntezy peptydów w fazie stałej. 10
    1. Rozpuścić 3 mg surowego peptydu Aβ w 4 ml buforu do rozpuszczania próbki. Sonizować próbkę przez 30-60 s w temperaturze pokojowej i z częstotliwością 40 kHz, aby ułatwić rozpuszczanie.
    2. Wstrzyknąć całą próbkę do kolumny HPLC za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę ze stali nierdzewnej o rozmiarze 16 rozmiarów. Uruchom metodę oczyszczania zgodnie z opisem w kroku podrzędnym 1.3.
      UWAGA: System umożliwia wstrzykiwanie próbki za pomocą ręcznego wtryskiwacza wyposażonego w pętlę iniekcyjną ze stali nierdzewnej o pojemności 10 ml (rysunek 1D). Pożądany peptyd Aβ będzie eluował między 72 a 74 minutami jako ostry rozdzielczy pik (ryc. 2C).
    3. Pobrać próbkę do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Potwierdzić tożsamość piku Aβ za pomocą spektrometrii mas z bezpośrednim wtryskiem zebranego eluentu. 11 Przechowuj eluent do 12 godzin w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Nie zaleca się przechowywania roztworu przez okres dłuższy niż 12 godzin ze względu na możliwość utlenienia peptydu.
    4. Wyizolować oczyszczony peptyd przez błyskawiczne zamrożenie zebranych podwielokrotności/podwielokrotności peptydu Aβ w ciekłym azocie i liofilizować. Przeprowadzić liofilizację przez liofilizację próbki w temperaturze -60 °C i ciśnieniu 20 mTorr przez okres 24 godzin.
    5. Uruchom analityczny protokół HPLC zgodnie z poniższym opisem, aby określić czystość peptydu Aβ. Peptydy należy przechowywać w postaci liofilizowanej w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.

2. Analityczna analiza HPLC oczyszczonego białka Aβ

  1. Przygotować HPLC zgodnie z opisem w podsekcji 1.1 powyższego protokołu.
  2. Ustawić analityczną HPLC zgodnie z krokiem 1.2.1 i jak pokazano na rysunku 1 z kolumną analityczną 4.6 × 250 mm (rysunek 1B, skrajna prawa kolumna) i ręcznym wtryskiwaczem z pętlą wtryskową ze stali nierdzewnej o pojemności 20 μl (rysunek 1C) zamontowanymi na urządzeniu.
  3. Zaprogramuj oprogramowanie HPLC tak, aby uruchamiało metodę analityczną, jak pokazano w tabeli 2, postępując zgodnie z instrukcjami podobnymi do tych w kroku 1.3.
Czas / min % buforu Aa % bufora Bb Natężenie przepływu / ml min-1 0 95 Rozdział 95 5 1 Rozdział 30 50 Rozdział 50 Rozdział 1

Tabela 2: Harmonogram analizy czystości peptydu Aβ metodą HPLC. ZABufor A -H2Oz 20 mM NH4OH; b80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH.

  1. Analiza czystości peptydu Aβ
    1. Przygotować roztwór oczyszczonego peptydu o stężeniu 1 mg/ml przez rozpuszczenie peptydu w roztworze buforowym próbki.
      UWAGA: Recepturę bufora można znaleźć w podrozdziale 1.1. Stężenie białka określa się, mierząc absorpcję białka przy 280nm (A 280 nm). 12 Molowy współczynnik ekstynkcji (ε) używany do określenia stężenia wynosi ε = 1,490 dm3 mol-1 cm-1. 13
    2. Wstrzyknąć 20 μl roztworu o stężeniu 1 mg/ml (222 μM) do kolumny HPLC i uruchomić metodę analityczną, która została skonfigurowana w kroku 2.3.
      UWAGA: Pozostały roztwór, który nie został użyty do analizy, można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i poddać liofilizacji w celu odzyskania peptydu Aβ. Szczegóły dotyczące liofilizacji można znaleźć w podsekcji 1.4.4. Peptyd Aβ będzie wymywał się z kolumny analitycznej między 16 a 18 minutami (ryc. 2D). Użyj wbudowanego oprogramowania do analizy integracyjnej, które jest dołączone do instrumentu HPLC, aby określić czystość peptydu Aβ. Czystość określa się poprzez całkowanie każdego z poszczególnych pików w widmie i obliczanie procentowej powierzchni piku peptydu. Zazwyczaj należy ustalić oczyszczenie na poziomie >95%.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Reprezentatywne ślady HPLC Aβ42. (A) Tradycyjne oczyszczanie krzemionkiC4, warunki: Bufor A:H2Oz 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA), Bufor B: MeCN (acetonitryl) z 0,1% TFA, gradient: 20 do 27% buforu B przez 40 minut, a następnie izokratyczny 27% bufor B; (B) Oczyszczanie preparatywne przy użyciu kolumny polimerowej 25 x 300 mm2 , warunki: bufor A:H2Oz 20 mM NH4OH, bufor B: 80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH, gradient: 20 do 27% buforu B przez 70 minut, a następnie izokratyczny 27% bufor B; (C) Zoptymalizowane oczyszczanie preparatywne przy użyciu kolumny polimerowej o wymiarach 25 x 300mm2, warunki opisano w tabeli 1 znajdującej się w podsekcji 1.3 tekstu opisu protokołu; (D) Analityczna HPLC przy użyciu kolumny polimerowej 4,6 x 250 mm2, warunki: Bufor A:H2Oz 20 mM NH4OH, bufor B: 80% MeCN / 20% H2O z 20 mM NH4OH, gradient od 5 do 50% buforu B przez 30 min. Dla części A, B i C pik odpowiadający Aβ42 jest oznaczony gwiazdką. Zebranie oznaczonego piku Aβ42 w części C ujawnia czystość >95%, jak pokazano w części D. Do określenia tożsamości piku Aβ42 użyto spektrometrii mas. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie peptydu Aβ42 za pomocą kombinacji fazy stacjonarnej PLRP-S i fazy ruchomej o wysokim pH powoduje powstanie ostrego, rozdzielczego piku peptydu Aβ w czasie retencji między 72 a 74 minutami (Rysunek 2C). Potwierdzenie tożsamości piku odbywa się za pomocą spektrometrii mas z bezpośrednim wstrzyknięciem pobranego eluentu. Eluent można przechowywać w temperaturze -20 °C w roztworze do 12 godzin. Dłuższe okresy przechowywania mogą powodować utlenianie białka. Aby w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oczyszczanie peptydu Aβ metodą HPLC jest w dużym stopniu zależne od wyboru zarówno fazy stacjonarnej zastosowanej w oczyszczaniu, jak i fazy ruchomej wybranej do elucji peptydu. Niski punkt izoelektryczny peptydu i wysoka skłonność do agregacji sprawiają, że tradycyjne warunki chromatograficzne do rozdzielania białek hydrofobowych (faza stacjonarna C4 lub C8 sprzężona z kwaśnym mobilnym eluentem) są trudne, a peptyd Aβ eluuje jako przedłużony szeroki, nierozwiązany pik (Figura 2A).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować firmie Agilent za pomoc techniczną. Kate Markham i Rafael Palomino są uznawani za ich początkową pomoc w syntezie i oczyszczaniu peptydu Aβ, a dr Hsiau-Wei Lee dziękuje się za pomoc w przygotowaniu ryciny 1 manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa ćwiartkowa Agilent 1260 Infinity IIAgilentG7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Podwójny detektor o zmiennej długości faliAgilentG7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Wtryskiwacz ręczny Agilent 1260 Infinity II wyposażony w pętlę na próbki ze stali nierdzewnej o pojemności 10 mlAgilent0101-1232http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
Agilent 1260 Infinity II wyposażony w 20 i mikro; L pętla na próbki ze stali nierdzewnejAgilentG1328C
http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector Pierścień Wspornik montażowy stojakaAgilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5  &mikro; m 4,6 x 250 mm (analityczny)AgilentPL1512-5501http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ 42 lub Aβ 40 peptydówSyntetyzowany we własnym zakresie przy użyciu zautomatyzowanego syntezatora peptydów CEM liberty.
Wodorotlenek amonu (NH4OH, roztwór 28%)Fisher ScientificA669-500
AcetonitrylFisher ScientificA998-4
Woda klasy HPLCFisher ScientificW5-4
Falcon 50 ml stożkowa probówka wirówkowaFisher Scientific14-954-49A Złączka
Supelco PEEK Jednoczęściowa dokręcana na palc, opakowanie 5 szt.Sigma-AldrichZ227250
Normject 5  sterylna strzykawka ccFisher Scientific1481729
16 Gauge SS IgłaReodyna3725-086
Wtryskiwacz ręczny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
  4. Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
  5. Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
  7. Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
  8. Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
  9. Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
  10. Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
  11. Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
  12. Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
  13. Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
  14. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071(2009).
  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie oligomer w peptydowychstacjonarna faza polimerowawarunki wysokiego pHkolumna preparatywnadetektor dwud ugo ciowyr wnowa enie buforurozpuszczanie pr bki

Powiązane artykuły