Artykuł metodologiczny

Rejestracja EEG u noworodków szczurów poruszających się w swobodnym ruchu przy użyciu nowej metody

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55489

⸱

29 maja 2017

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2Brain Science Institute, South China Normal University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę przeznaczoną do rejestrowania elektroencefalografii (EEG) u swobodnie poruszających się noworodków z padaczką i opisujemy jej procedury, cechy i zastosowania. Ta metoda pozwala na rejestrację EEG przez więcej niż 1 tydzień.

Streszczenie

EEG jest użyteczną metodą wykrywania aktywności elektrycznej w mózgu. Ponadto jest szeroko stosowanym narzędziem diagnostycznym w przypadku różnych schorzeń neurologicznych, takich jak padaczka i zaburzenia neurodegeneracyjne. Jednak uzyskanie zapisów EEG u noworodków jest technicznie trudne, ponieważ wymaga specjalistycznego obchodzenia się z nimi i dużej staranności. W tym artykule przedstawiamy nowatorską metodę zapisu EEG u nowonarodzonych szczeniąt szczurów (P8-P15). Zaprojektowaliśmy prostą i niezawodną elektrodę wykorzystującą komputerowe loci pinów; można go łatwo wszczepić do czaszki szczeniaka szczura, aby rejestrować wysokiej jakości sygnały EEG w normalnym i padaczkowym mózgu. Szczeniętom podano dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie neurotoksyny kwasu kainowego (KA) w celu wywołania napadów padaczkowych. Implantacja chirurgiczna wykonywana w tym zabiegu jest tańsza niż inne zabiegi EEG u noworodków. Metoda ta pozwala na rejestrację wysokiej jakości i stabilnych sygnałów EEG przez ponad 1 tydzień. Co więcej, procedura ta może być również stosowana u dorosłych szczurów i myszy w celu zbadania padaczki lub innych zaburzeń neurologicznych.

Wprowadzenie

Jest dobrze znane, że ciągła komunikacja między neuronami jest niezbędna do uzyskania normalnego funkcjonowania mózgu. Komunikacja międzyneuronalna odbywa się przede wszystkim w synapsach, gdzie informacja z jednego neuronu jest przekazywana do drugiego neuronu. Ta transmisja synaptyczna jest pośredniczona przez dwa rodzaje dedykowanych układów strukturalnych: synapsy elektryczne lub chemiczne 1. Elektrofizjologia to dziedzina, która wychwytuje potencjał elektryczny wytwarzany podczas komunikacji międzyneuronalnej, która kontroluje ogólne funkcje i zachowanie organizmu 2. EEG jest najczęściej stosowaną metodą spośród wielu technik elektrofizjologicznych.

EEG to technika używana do wykrywania zmian w sygnałach elektrycznych wytwarzanych przez bodźce wewnętrzne lub zewnętrzne. Ponadto jest to niezbędny test do diagnozy klinicznej i przewidywania wyników różnych schorzeń neurologicznych, takich jak padaczka, choroba Parkinsona i Alzheimera, a także działanie czynników farmakologicznych i toksykologicznych 3. Ogólnie rzecz biorąc, pacjent z padaczką wykazuje nadpobudliwość i upośledzoną łączność funkcjonalną w mózgu; są one podsumowane jako międzynapadowe wyładowania padaczkowe (IED) i mogą być rejestrowane przez EEG w postaci ostrych, przemijających skoków; ostre fale; kompleksy kolczasto-falowe; lub polyspikes 4. Główną cechą mózgu padaczkowego jest spontaniczne występowanie napadów padaczkowych, które mogą być rejestrowane zarówno ze skóry głowy, jak i z miąższu mózgu w celu zlokalizowania obszaru mózgu odpowiedzialnego za napady 5. Co więcej, EEG ma również bardzo ważne implikacje w zaburzeniach neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD). Badania sugerują, że zmienione zapisy EEG i upośledzone sieci oscylacyjne u pacjentów z AD są powszechne. Jednak nasza wiedza na temat patofizjologii oscylacji sieci w chorobach neurodegeneracyjnych jest zaskakująco niekompletna i wymaga dalszych badań 6.

W tym protokole zaprojektowaliśmy prostą elektrodę, za pomocą której można rejestrować EEG, aby zrozumieć komunikację elektryczną zarówno w normalnym, jak i patologicznym mózgu. Chirurgiczne wszczepienie implantów tą metodą jest tańsze niż inne dostępne procedury 7. Co więcej, metoda ta może być stosowana do rejestrowania wysokiej jakości i stabilnych sygnałów EEG przez dłuższy czas (tj. 2-4 godziny codziennie przez 1 tydzień). Ponadto użyliśmy lżejszych elektrod (o wadze około 26 mg), które pozwalają zwierzętom zachowywać się bardziej naturalnie 8. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w badaniu EEG u nowonarodzonych młodych szczurów, które wymaga wzmacniacza i digitizera, powszechnie stosowanych w laboratorium elektrofizjologii i nie wymaga żadnych dodatkowych urządzeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opieka nad zwierzętami, zabiegi chirurgiczne i procedury rejestrowania były zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowego Chin.

1. Przygotowanie elektrody (Rysunek 1A-C)

UWAGA: Komputerowe loci pinów to po prostu styk bolcowy jako część interfejsu sygnałowego w urządzeniach komunikacyjnych. Składa się ze złącza męskiego, które podłącza się do złącza żeńskiego.

  1. Ostrożnie oddziel styki męskie i żeńskie od loci pinów komputera (rysunek 1A) za pomocą szczypiec. Połącz ze sobą styki męskie i żeńskie, aby utworzyć elektrodę i nałóż cyjanoakrylan, aby utworzyć mocne połączenie adhezyjne (rysunek 1C).
  2. Umieścić elektrody w zlewce wypełnionej wodą destylowaną i umieścić w myjce ultradźwiękowej na 10 minut. Przenieść je do suszarki w temperaturze 45 °C na 30 minut. Sterylizować elektrody światłem UV przez 30 minut.

2. Zabieg chirurgiczny (Rysunek 1D-F)

  1. Przygotuj wysterylizowane narzędzia chirurgiczne i aparaturę stereotaktyczną. Znieczulić nowonarodzone szczenię szczura za pomocą znieczulenia izofluranem (2,5%) z powietrzem. Gdy szczenię jest głęboko znieczulone, należy dostosować dawkę izofluranu do 1,0%. Przed zabiegiem należy uszczypnąć ogon lub palec u nogi, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia.
  2. Zamocuj głowę szczeniaka w aparacie stereotaktycznym, umieszczając paski douszne w kanałach słuchowych i lekko je zaciskając.
    UWAGA: Nie należy nadmiernie dokręcać nauszników, ponieważ czaszka noworodka jest bardzo miękka.
  3. Utrzymuj sterylne pole operacyjne, spryskując cały sprzęt 70% etanolem. Wykonaj 15-milimetrowe nacięcie na głowie za pomocą skalpela. Za pomocą kleszczy delikatnie odciągnij skórę głowy od linii środkowej w czterech rogach. Umieść pod skórą trochę bawełny nasączonej solą fizjologiczną, aby nacięcie było szeroko otwarte (ryc. 1D).
  4. Znajdź punkty bregma i lambda na czaszce i zaznacz je ołówkiem. Użyj igły strzykawkowej (26 G), aby zrobić dwa otwory w korze przedczołowej (PFC) i hipokampie.
    UWAGA: PFC znajduje się na poziomie +1,8 mm za bregmą i -0,5 mm z boku do linii środkowej, podczas gdy hipokamp znajduje się pod kątem -2,0 mm przed bregmą i ±0,5 mm z boku do linii środkowej (ryc. 1D i E). Głębokość elektrody nie powinna być większa niż 2 mm poniżej powierzchni kory mózgowej, aby zminimalizować uszkodzenie mózgu.
  5. Użyj kleszczy do przytrzymania elektrod i włóż elektrody referencyjne i rejestrujące odpowiednio do PFC i hipokampa. Nałóż maść z erytromycyną wokół elektrody, aby uniknąć ewentualnej infekcji. Zamocuj elektrodę za pomocą cyjanoakrylanu.
  6. Przygotuj dentystyczny cement akrylowy tak, aby miał lepką i lepką konsystencję. Nałóż cement dentystyczny, aby pokryć elektrody i resztę czaszki.
    UWAGA: Dokładnie osusz czaszkę przed nałożeniem cementu dentystycznego.
  7. Nałóż 5% kwasu pikrynowego na elektrody, aby je chronić.
    UWAGA: Cała procedura powinna być wykonywana w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylne warunki.
  8. Wyjąć zwierzę z ramki stereotaktycznej i wstrzyknąć podskórnie 300 μl 10 % glukozy. Połóż go na podgrzewanym kocu, aby się zregenerować. Upewnij się, że zwierzę jest ciepłe (37 °C) i porusza się w ruchu (tj. jest całkowicie wyleczone). Buprenorfinę podawać dootrzewnowo (0,05 mg/kg) w przypadku bólu pooperacyjnego.
    UWAGA: Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności (tj. normalnego zachowania i ruchu).
  9. Przywróć szczeniaka do jego domowej klatki z matką po odzyskaniu przytomności. Poczekaj dwa dni, aż zwierzę w pełni wyzdrowieje.

3. Zapis EEG

  1. Po pełnym wyzdrowieniu podłącz elektrody wszczepione na czaszce szczeniaka do wzmacniacza we własnej klatce. Podłącz amplifier do przetwornika analogowo-cyfrowego i podłącz konwerter do komputera; Przewody łączące należy traktować ostrożnie, aby się nie zaplątały.
  2. Wybierz częstotliwość próbkowania co najmniej 10 000 Hz w jednostce akwizycji danych do nagrywania (szerokość pasma nadajnika wynosi 1-100 Hz). Upewnij się, że dane są prawidłowo próbkowane.
  3. Po uzyskaniu zapisu wyjściowego należy wstrzyknąć młodemu dootrzewnowo kwas kainowy (KA) (2 mg/kg) w celu wywołania napadów padaczkowych. 15 minut po wstrzyknięciu KA obserwować i rejestrować wyładowania padaczkowe. Napady wywołane przez KA są zwykle fizyczne.
    UWAGA: Czas trwania ictal-tonic wynosi około 15,2 ±0,9 s, czas trwania napadu wynosi około 62±5 s. Napadom drgawkowym u nowonarodzonych szczurów można zapobiec, podając IP we wstrzyknięciu hydratu chloralu (400 mg/kg).
  4. Zapisz zdigitalizowane dane i analizuj je za pomocą pakietów oprogramowania do przetwarzania sygnałów, takich jak spike2. Ujawnij poziom mocy różnych składowych częstotliwości w sygnale EEG noworodka, wykonując analizę widma mocy. Oblicz moc w 1-minutowym przedziale czasowym, znajdując amplitudę średniej kwadratowej od 1 do 100 Hz (pasmo EEG) 9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jeśli powyższe procedury chirurgiczne zostaną przeprowadzone prawidłowo, rejestracja EEG noworodka szczura w jednym kanale zostanie pomyślnie wykonana. 10 min po wstrzyknięciu KA pojawił się regularny wzorzec objawów behawioralnych w postaci nieregularnych ruchów i drapania, drżeń oraz utraty równowagi. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne surowe zapisy EEG oraz powiększone zapisy interiktalne, iktalno-toniczne i iktalno-kloniczne. Nawracające wzorce wyładowań EEG interiktalnych i iktalny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy zabiegi chirurgiczne i rejestracyjne w celu uzyskania EEG u swobodnie poruszających się noworodków szczurów metodą przewodową (ryc. 3). Sugeruje się, że szczenię szczura P7-P12 jest w wieku rozwojowym odpowiadającym donoszonemu ludzkiemu noworodkowi 10,11. Uzyskanie wysokiej jakości danych zapisu EEG podczas pracy ze szczeniętami szczurów w tej grupie wiekowej jest technicznie trudne. Ponadto wymaga specjalistycznego obcho...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (31171355) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych w Guangdong (S2011010003403, 2014A030313440).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pin
PincerDELI Group Co., Ltd.
502 super klejDELI Group Co., Ltd.7144
SuszarkaBoxunGZX-9140MBE
IzofluoranRWD Life Science902-0000-522
Aparatura stereotaktycznaRWD Life Science900-0068-507
Aparatura anestezjologicznaRWD Life Science902-0000-510
Homeotermiczne urządzenie grzewczeAparatura HarvardaK 024509
Model wzmacniacza 3000 A-M Systems61558
Micro1401 Przetwornik analogowo-cyfrowyCambridge Electronic Design Ltd.4383Jednostka akwizycji danych
Spike2Cambridge Electronic Design Ltd.
komputerowy

Bibliografia

  1. Pereda, A. E. Electrical synapses and their functional interactions with chemical synapses. Nat Rev Neurosci. 15 (4), 250-263 (2014).
  2. Chorev, E., Epsztein, J., Houweling, A. R., Lee, A. K., Brecht, M. Electrophysiological recordings from behaving animals--going beyond spikes. Curr Opin Neurobiol. 19 (5), 513-519 (2009).
  3. Freeborn, D. L., McDaniel, K. L., Moser, V. C., Herr, D. W. Use of electroencephalography (EEG) to assess CNS changes produced by pesticides with different modes of action: effects of permethrin, deltamethrin, fipronil, imidacloprid, carbaryl, and triadimefon. Toxicol Appl Pharmacol. 282 (2), 184-194 (2015).
  4. Werhahn, K. J., Hartl, E., Hamann, K., Breimhorst, M., Noachtar, S. Latency of interictal epileptiform discharges in long-term EEG recordings in epilepsy patients. Seizure. 29, 20-25 (2015).
  5. Staba, R. J., Stead, M., Worrell, G. A. Electrophysiological biomarkers of epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 334-346 (2014).
  6. Nimmrich, V., Draguhn, A., Axmacher, N. Neuronal Network Oscillations in Neurodegenerative Diseases. Neuromolecular Med. 17 (3), 270-284 (2015).
  7. Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term Continuous EEG Monitoring in Small Rodent Models of Human Disease Using the Epoch Wireless Transmitter System. J Vis Exp. (101), e52554(2015).
  8. Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Fisher, J. H., Ekstrand, J. J., Dudek, F. E. Recording EEG in immature rats with a novel miniature telemetry system. J Neurophysiol. 109 (3), 900-911 (2013).
  9. Dzhala, V. I., et al. NKCC1 transporter facilitates seizures in the developing brain. Nat Med. 11 (11), 1205-1213 (2005).
  10. Tucker, A. M., Aquilina, K., Chakkarapani, E., Hobbs, C. E., Thoresen, M. Development of amplitude-integrated electroencephalography and interburst interval in the rat. Pediatr Res. 65 (1), 62-66 (2009).
  11. Savard, A., et al. Involvement of neuronal IL-1beta in acquired brain lesions in a rat model of neonatal encephalopathy. J Neuroinflammation. 10, 110(2013).
  12. Cuaycong, M., et al. A novel approach to the study of hypoxia-ischemia-induced clinical and subclinical seizures in the neonatal rat. Dev Neurosci. 33 (3-4), 241-250 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

EEG noworodka szczurametoda zapisu EEGimplantacja elektrodchirurgia stereotaktycznanapady wywo ane kwasem kainowymanaliza widma mocyfiksacja cementem dentystycznymelektroda z pinem komputerowymszczury swobodnie poruszaj ce simodel epilepsji noworodkowej

Powiązane artykuły