Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55490

⸱

22 marca 2017

 ,  ,  , 
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

W tym artykule

Podsumowanie

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

Streszczenie

Genetyczne i techniczne atuty sprawiły, że kręgowiec danio pręgowanego stał się kluczowym organizmem modelowym, w którym konsekwencje manipulacji genami można śledzić in vivo przez cały okres szybkiego rozwoju. Można badać wiele procesów, w tym proliferację komórek, ekspresję genów, migrację komórek i morfogenezę. Co ważne, generowanie chimer poprzez przeszczepy może być łatwo wykonane, co pozwala na mozaikowe znakowanie i śledzenie poszczególnych komórek pod wpływem środowiska gospodarza. Na przykład, łącząc funkcjonalne manipulacje genami zarodka gospodarza (np. poprzez mikroiniekcję morfoliny) i obrazowanie na żywo, można ocenić wpływ zewnętrznych, nieautonomicznych sygnałów komórkowych (dostarczanych przez genetycznie zmodyfikowane środowisko) na poszczególne przeszczepione komórki dawcy. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób to podejście jest wykorzystywane do porównywania początku fluorescencyjnej ekspresji transgenu jako wskaźnika zastępczego dla czasu określenia losu komórki w różnych genetycznych środowiskach gospodarza.

W tym artykule przedstawiamy protokół mikroiniekcji zarodków danio pręgowanego w celu oznaczenia komórek dawcy i spowodowania knockdownu genu w embrionach gospodarza, opis techniki transplantacji używanej do generowania chimerycznych zarodków oraz protokół przygotowania i przeprowadzenia in vivo poklatkowego obrazowania konfokalnego wielu zarodków. W szczególności wykonywanie obrazowania wielopozycyjnego ma kluczowe znaczenie przy porównywaniu czasu zdarzeń, takich jak początek ekspresji genów. Wymaga to zbierania danych z wielu zarodków kontrolnych i eksperymentalnych przetwarzanych jednocześnie. Takie podejście można łatwo rozszerzyć na badania wpływów zewnętrznych w dowolnym narządzie lub tkance z wyboru, które można obrazować na żywo, pod warunkiem, że przeszczepy mogą być łatwo ukierunkowane zgodnie z ustalonymi mapami losu zarodka.

Wprowadzenie

Zdolność do wizualizacji ważnych procesów rozwojowych u kręgowców in vivo przyczyniła się do tego, że danio pręgowany stał się kluczowym modelem do badania warunków normalnych i chorobowych (recenzowane w 1,2). W szczególności siatkówka nerwowa jest dostępną częścią ośrodkowego układu nerwowego. Siatkówka nadaje się do łatwego przeprowadzania badań neurogenezy ze względu na jej wysoce zorganizowaną, ale stosunkowo prostą strukturę i wysoce konserwatywne typy neuronów u różnych gatunków kręgowców 3. Dynamika zachowań komórkowych, takich jak proliferacja, wyjście z cyklu komórkowego, asymetryczny podział komórki, specyfikacja losu, różnicowanie i tworzenie obwodów nerwowych, może być śledzona przez cały proces retinogenezy, który kończy się w centralnej siatkówce danio pręgowanego przez 3-dniowe zapłodnienie (dpf) 4,5,6,7.

Ponadto, wymagania funkcjonalne różnych genów w każdym z wyżej wymienionych etapów mogą być jednocześnie oceniane w siatkówce danio pręgowanego, co daje przewagę nad innymi modelami kręgowców, w których fenotypy wynikające z zastosowania technik nokautowania genów mogą być oceniane tylko na podstawie pośmiertnego badania utrwalonych tkanek. W szczególności zastosowanie linii transgenicznych, w których możemy wizualizować i monitorować ekspresję białek fluorescencyjnych jako transgenów reporterowych w siatkówce, pozwala nam uzyskać czasową rozdzielczość ekspresji genów, która leży u podstaw genezy określonego typu komórki neuronalnej. Ze względu na szybki rozwój danio pręgowanego, zdarzenia te można wizualizować przez cały okres rozwojowy, zapewniając w ten sposób głębszy wgląd w czasowe znaczenie ekspresji genów w odniesieniu do nabywania tożsamości komórek neuronalnych i zachowania komórek.

Wreszcie, te podejścia mogą być efektywnie połączone u danio pręgowanego z generowaniem chimer poprzez przeszczepy, co daje wgląd w dwa kluczowe aspekty funkcji genów. Po pierwsze, badanie komórek przeszczepionych z zarodka dawcy, w którym dany gen został powalony podczas ich rozwoju w nieoznakowanym środowisku typu dzikiego, pozwala nam uzyskać istotne informacje na temat funkcji genu w sposób autonomiczny dla komórki. Prowadzi to do ważnych spostrzeżeń na temat funkcji czynników determinujących los siatkówki w komórkach progenitorowych, w których normalnie ulegają ekspresji. Przykładem tego jest badanie losów rozwojowych przodków, którzy nie mogą już wytwarzać funkcjonalnego białka z tych genów 4,6,8,9. Wykorzystując to podejście, wykazaliśmy, że wiele czynników determinujących los (np. Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) działa autonomicznie komórkowo, kierując określonymi losami neuronów siatkówki; Brak ekspresji genów prowadzi przede wszystkim do zamiany losu, tak że komórki z knockdownem genu zachowują żywotność poprzez przyjęcie alternatywnego losu komórki 4,6,7,10. Po drugie, takie chimeryczne eksperymenty można wykorzystać do oceny, jak zachowują się przodkowie typu dzikiego, gdy rozwijają się w różnych środowiskach genetycznych. Na przykład, porównując rozwój komórek WT, które zwykle wyrażają gen będący przedmiotem zainteresowania (i transgen reporterowy) w WT w porównaniu ze zmanipulowanym środowiskiem gospodarza (np. nokaut / knockdown genu), można ocenić wynikający wpływ na ekspresję genów i los komórki. Wykazano na przykład, że brak pewnych typów neuronów w środowisku gospodarza wpływa na zachowanie progenitorów typu dzikiego w sposób nieautonomiczny komórki, skłaniając je do różnicowania się w niedostatecznie reprezentowane lub brakujące typy neuronów 4,7,11,12. Biorąc pod uwagę, że neurony siatkówki rodzą się w konserwatywnej kolejności histogennej przez sekwencyjną ekspresję określonych genów determinujących los neuronów (ekspresja genu losu) (przejrzane w 13), użyliśmy tych metod, aby pokazać, jak wpływa na czas ekspresji genu losu u progenitorów typu dzikiego, gdy takie progenitory rozwijają się w środowisku gospodarza siatkówki z indukowanym nieprawidłowym składem komórkowym. W tym miejscu przedstawiamy te podejścia jako dowód na to, w jaki sposób połączenie stosunkowo standardowych i szeroko stosowanych technik umożliwia badanie czasu ekspresji genów losu w rozwoju komórek progenitorowych siatkówki 8,9.

Ten protokół opisuje eksperymentalne podejście łączące obrazowanie poklatkowe z łatwością przeprowadzenia przeszczepu w rozwijającym się ex vivo zarodku danio pręgowanego, aby śledzić poszczególne mozaikowo znakowane komórki przez cały okres rozwojowej retinogenezy. Wykonując funkcjonalne manipulacje genami w zarodku gospodarza, zarodku dawcy, obu lub żadnym z nich, można ocenić autonomię funkcji genów w komórkach. Podejście to można w szerokim zakresie zaadaptować do podobnych pytań badawczych w każdym innym systemie, dla którego odpowiednie są poszczególne opisane tutaj komponenty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z postanowieniami kodeksu postępowania Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych w zakresie opieki i użytkowania zwierząt i zostały zatwierdzone przez instytucjonalne komisje etyczne.

1. Przygotowanie danio pręgowanego

  1. Parowanie dorosłych ryb
    1. Dorosłe ryby należy ustawić w parach (lub dwóch parach) w zbiornikach hodowlanych o odpowiedniej wielkości wieczorem przed użyciem.
    2. Aby utrzymać samicę oddzieloną od samca, użyj przegrody, aby ryby widziały, ale nie dotykały się nawzajem.
    3. Rano, po włączeniu światła, zdejmij przegrody i pozwól rybom na spokojne łączenie się w pary.
    4. Po udanym kryciu umieść dorosłe ryby z powrotem w ich pierwotnych zbiornikach.
      UWAGA: Szczepy gospodarza i dawcy mogą być takie same, np. dowolne szczepy typu dzikiego (WT). Na potrzeby tego badania można zobrazować zarodki dawców pochodzące z linii transgenicznych Tg(atoh7:gapRFP), Tg(atoh7:gapGFP) lub Tg(vsx1:GFP), w których można zobrazować odpowiednio ekspresję czynników determinujących los we wczesnej lub późnej fazie neuronalnej 14,15,16. Aby porównać wpływ różnych środowisk genetycznych, zarodki gospodarza mogą być specyficznymi mutantami lub morfantami, jak opisano poniżej.
  2. Pobieranie zarodków
    1. Użyj sitka do herbaty, aby zebrać jaja z pudełka hodowlanego. Sprawdzaj zawartość jaj co 15 minut, aby określić czas narodzin i upewnić się, że zarodki w stadium jednokomórkowym są pobierane do kolejnych etapów.
    2. Opłucz zarodki pożywką E3 (5 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,4 mM CaCl2, 0,9 mM MgCl2 i 2% błękitu metylenowego w wodzie destylowanej) i umieść je na szalkach Petriego zawierających ~ 40 ml E3 17 przy maksymalnej gęstości 50 jaj na płytkę Petriego o średnicy 90 mm.
    3. Oznacz szalki Petriego nazwą szczepu, datą i godziną urodzenia. Użyj pipety transferowej Pasteura, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia podczas oglądania zarodków pod mikroskopem preparacyjnym.
    4. Utrzymuj zarodki w temperaturze 28,5 °C do ~3 godzin po zapłodnieniu (hpf) do przeszczepu lub kontynuuj mikroiniekcje.
      UWAGA: W przypadku przeszczepów należy dążyć do uzyskania zarodków dawcy i gospodarza w podobnym wieku. Dlatego wykorzystaj różne temperatury hodowli w zakresie 25 - 32 °C według Kimmel et al. 18, aby spowolnić lub przyspieszyć jeden lęg zarodków, aby dopasować go do drugiego.
    5. Przechowywać ~20 transgenicznych zarodków dawcy bez wstrzyknięć w temperaturze 32 °C od momentu pobrania do obrazowania poklatkowego (24 - 28 godzin później).
      UWAGA: Będą one rozwijać się szybciej niż kohorta eksperymentalna i wcześniej będą wyrażać markery fluorescencyjne. W ten sposób można je wykorzystać do ustawienia parametrów (moc lasera, wzmocnienie) dla obrazowania. W tym konkretnym przykładzie obrazowanie kohorty eksperymentalnej rozpoczyna się przed ekspresją transgenu (w celu oceny dokładnego czasu tego zdarzenia).

2. Przygotowanie do mikroiniekcji

  1. Przygotowanie igły do mikroiniekcji
    1. Za pomocą ściągacza do igieł wyciągnij igły z każdej rurki kapilarnej ze szkła borokrzemianowego (1.0 mm OD / 0.78 mm ID / 100 mm szklana kapilara długa) pośrodku, aby uzyskać dwie igły o równej długości. Celuj w igły, które zwężają się z długimi trzonkami.
      UWAGA: Example ustawienia dla używanego tutaj ściągacza igłowego są dostępne w Lista materiałów.
    2. Przechowuj wyciągnięte igły na szalce Petriego i zabezpiecz, wciskając je w pasek szpachli do formowania lub taśmy klejącej.
    3. Przed wstrzyknięciem należy ustawić ostrość końcówki igły pod mikroskopem preparacyjnym i za pomocą kleszczy rozbić igłę na końcówce. Celuj w ostrą, stożkową końcówkę z małym otworem (Rysunek 1C).
  2. Preparat Morfolino dla zarodków gospodarza
    1. Zamów oligonukleotydy morfolino specjalnie zaprojektowane dla genu będącego przedmiotem zainteresowania, a także standardowy morfolino kontrolny lub odpowiednie niedopasowanie 5 par zasad do kontroli efektów proceduralnych i manipulacyjnych.
      UWAGA: W tym przypadku zastosowano morfolino blokujące translację Ptf1a z sekwencją 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3', która hamuje rozwój pośrednich komórek poziomych i amakrynowych, oraz standardowego kontrolnego morfolina danio pręgowanego ukierunkowanego na ludzką mutację intronu beta-globiny (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3') 7,19.
    2. Przygotować 1 mM roztwór podstawowy morfolino (~8 - 8,5 ng/nL) i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. W dniu wstrzyknięcia podgrzewać podwielokrotność (10 μl) morfolinu w temperaturze 65 °C przez 10 minut, krótko wirować i umieścić na lodzie do ostygnięcia z temperatury 65 °C (po czym można go przechowywać w temperaturze pokojowej podczas użytkowania). Spowoduje to odwrócenie potencjalnej agregacji w roztworze morfolino, co może zmniejszyć skuteczność knockdownu.
      1. Dla morfolina Ptf1a i równoważnego wzorcowego morfolina kontrolnego przygotować roztwór roboczy o stężeniu 6 ng/nl, rozcieńczając roztwór podstawowy morfolina wodą destylowaną. Zachowaj pod adresem RT.
        UWAGA: Użyj 2 nL morfolina na zarodek, ponieważ morfolino Ptf1a wymaga stosunkowo wysokiego stężenia roboczego 12 ng na zarodek, jak określono wcześniej 7. W przypadku większości morfinów skuteczne jest 2 - 5 ng na zarodek, więc rozcieńczyć bulion do 2 - 5 ng / nL i wstrzyknąć 1 nl do każdego zarodka.
  3. Przygotowanie fluorescencyjnych konstruktów reporterowych do fuzji histonów do znakowania zarodków dawcy
    UWAGA: W celu rozróżnienia / wizualizacji komórek dawcy w zarodkach gospodarza, istnieją różne podejścia do oznaczania zarodka dawcy, w tym mikrowstrzyknięcie mRNA H2A-GFP (w przypadku stosowania dawców transgenicznych z czerwonymi reporterami fluorescencyjnymi) lub H2B-RFP (w przypadku stosowania dawców transgenicznych z zielonymi reporterami fluorescencyjnymi) do żółtka zarodka dawcy w stadium jednokomórkowym.
    1. Linearyzować co najmniej 1 μg plazmidu zawierającego reporterowe DNA.
      UWAGA: Tutaj plazmid pCS2 + (wygenerowany i uprzejmie dostarczony przez prof. Davida Turnera z University of Michigan i prof. Ralpha Ruppa z Centrum Biomedycznego w Monachium) zawierający H2A-GFP lub H2B-RFP (wygenerowany przez dr Christophera Wilkinsona, Royal Holloway, University of London) został zlinearyzowany za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnego NotI.
    2. Oczyść DNA za pomocą dostępnych na rynku zestawów zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Transkrybuj mRNA za pomocą dostępnych na rynku zestawów z odpowiednią polimerazą zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku plazmidu pCS2+ należy użyć zestawu polimerazy SP6.
    4. Oczyść mRNA za pomocą komercyjnych zestawów lub ekstrakcji fenolowo-chloroformowej, a następnie wytrącić izopropanol zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć mRNA w ultraczystej wodzie (20 - 30 μl), zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    5. W dniu wstrzyknięcia przygotować roztwór roboczy mRNA w sterylnej wodzie o końcowym stężeniu 100 ng/μl i przechowywać na lodzie. Zwróć niewykorzystany zapas mRNA z powrotem do -80 °C.

3. Mikroiniekcja Morpholinos i/lub mRNA do zarodków jednokomórkowych

UWAGA: Mikroiniekcje są używane do oznaczania wszystkich komórek dawcy i do przygotowania różnych środowisk gospodarza (kontrola i knockdown genu) i obejmują wstrzyknięcia mRNA lub oligonukleotydów antysensownych mRNA lub morfoliny 20,21.

  1. Wkładanie i kalibracja igły iniekcyjnej
    1. Ponownie obciążyć igłę iniekcyjną 3 μl roztworu mRNA morfolino i/lub termofluorescencyjnego roztworu fuzyjnego za pomocą końcówek do pipet z mikroładowarką.
    2. Potrząsać roztworem w kierunku końcówki igły do wstrzykiwań, aż nie pozostaną pęcherzyki. Używać igieł iniekcyjnych z wewnętrzną szklaną wkładką w taki sposób, aby roztwór był przede wszystkim przyciągany do końcówki przez działanie kapilarne.
    3. Przymocować igłę do iniekcji do uchwytu zamontowanego w mikromanipulatorze (mikromanipulator ręczny 3D) i zapewnić szczelne uszczelnienie w obudowie rurki.
    4. Włączyć zasilanie i dopływ gazu do mikrowtryskiwacza regulowanego ciśnieniem.
    5. Zanurz końcówkę igły w kropli oleju mineralnego w naczyniu (jeśli używasz okularu z siatką) lub zawieś końcówką igły bezpośrednio na szkiełko mikrometryczne, aby skalibrować objętość kropli. Zmierzyć objętość wtrysku, naciskając pedał nożny i wyregulować ciśnienie gazu i/lub czas działania, aż objętość wstrzykniętego gazu będzie równa 1 nL (średnica 125 μm).
      UWAGA: Zaletą szkiełka mikrometrycznego jest to, że pomiary są niezależne od powiększenia używanego w mikroskopie, jednak dzięki zastosowaniu siatki okularowej, kropla iniekcji i skala mogą być jednocześnie ostre.
  2. Mikroiniekcja zarodka
    1. Umieścić szkiełko mikroskopowe na szalce Petriego i za pomocą pipety transferowej umieścić zarodki jednokomórkowe wzdłuż krawędzi szkiełka. Wyrównaj w jedną kolumnę za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki z odciętą połową cienkiej końcówki. Usunąć jak najwięcej płynu za pomocą cienkiej pipety do przenoszenia, aby zapobiec ruchom podczas wstrzyknięć (Rysunek 1A).
    2. Opuść igłę w kierunku każdego zarodka i wbij się w kosmówkę i żółtko jednym płynnym ruchem (ryc. 1B).
    3. Gdy końcówka igły zostanie wyśrodkowana w żółtku, należy wykonać mikroiniekcję, naciskając pedał nożny. Wstrzyknąć 1 nl mRNA H2A-GFP lub H2B-RFP do żółtka zarodka dawcy w stadium jednokomórkowym (transgenicznego). Wstrzyknąć 2 nL standardowego MO lub Ptf1a MO do żółtka jednokomórkowego zarodka gospodarza typu dzikiego, naciskając dwukrotnie pedał nożny. Udane iniekcje można uwidocznić po niewielkiej deformacji przestrzennej żółtka.
    4. Wyjąć igłę do wstrzykiwań, przesunąć szalkę zawierającą zarodki, aby ustawić następny zarodek na miejscu i kontynuować wstrzykiwanie, aż do wstrzyknięcia całej kolumny zarodków (50 - 60 zarodków).
    5. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków należy podnieść naczynie pod kątem 30 - 45° i za pomocą delikatnego strumienia pożywki E3 (butelka do wyciśnięcia) przenieść wstrzyknięte zarodki na nową, czystą szalkę Petriego.
    6. Umieścić szalkę z zarodkami w inkubatorze (w temperaturze 28,5 °C lub innej w celu upewnienia się, że zarodki dawcy i gospodarza są w tym samym wieku).
    7. Powtórz kroki 3.2.1 - 3.2.6 w razie potrzeby, aby uzyskać ~100 zarodków dawcy lub ~200 - 250 zarodków gospodarza.
    8. Przy 1 - 2 hpf sprawdź zarodki pod mikroskopem preparacyjnym i usuń wszelkie niezapłodnione jaja, które nie przeszły do stadium 2- lub 4-komórkowego, za pomocą pipety transferowej Pasteura.

4. Przygotowanie do przeszczepów

UWAGA: Przeszczepy są używane do generowania chimerycznych embrionów, co pozwala na ocenę efektów różnych środowisk genetycznych gospodarza w równoważnych przodkach dawców WT 9,22,23.

  1. Selekcja zarodków dawcy
    1. Przy 3 hpf sprawdź zarodki dawcy w powiększeniu 2 - 5X w celu znakowania sygnału pod mikroskopem fluorescencyjnym. Wybierz dobrze rozwinięte (symetryczna masa komórkowa z komórkami o równej wielkości) zarodki o silnym sygnale fluorescencyjnym za pomocą filtra GFP plus (wzbudzenie 460-500 nm, emisja długoprzepustowa 510 nm) lub filtra Texas Red (wzbudzenie 540 - 580 nm, emisja długoprzepustowa 610 nm) (ryc. 1D). Transgeniczni reporterzy nie są jeszcze wyrażeni.
  2. Płytka iniekcyjna z agarozą i przygotowanie szalki Petriego
    1. Wlej stopioną 2% agarozę rozcieńczoną w pożywce E3 do szalki Petriego o średnicy 90 mm i pozwól jej ostygnąć, aż naczynie będzie bezpieczne w dotyku. Gorąca agaroza może w przeciwnym razie zdeformować formę.
    2. Umieść plastikową formę z wypukłymi elementami w kształcie klina (6 x 25 / pleśń) na agarozie (Rysunek 2D, E). Unikaj pęcherzyków powietrza, umieszczając jedną stronę formy na agarozie i powoli opuszczając drugą stronę. Upewnij się, że forma jest wyśrodkowana w naczyniu lub w kierunku boku najgłębszego punktu występów w kształcie klina, aby zapewnić wystarczającą ilość miejsca na igłę do przeszczepu.
    3. Pozwól, aby agaroza całkowicie zastygła w temperaturze pokojowej.
    4. Umieść naczynie z agarozą w temperaturze 4 °C na 30 minut i wyjmij foremki, delikatnie podnosząc je z jednego rogu (np. kleszczami). Na dzień przed eksperymentem należy przygotować płytki do wstrzykiwań z agarozy i przechowywać w temperaturze 4 °C z niewielką ilością podłoża E3 i uszczelnieniem z folii parafinowej, aby zapobiec ich wysychaniu.
    5. Przed przeszczepem należy napełnić płytkę do wstrzykiwań agarozy pożywką E3 i umieścić w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C na co najmniej 30 minut.
    6. Ponieważ zarodki z odkorekcją przyklejają się do plastiku, należy użyć szklanych naczyń lub pokryć wnętrze szalek Petriego (o średnicy 90 mm) cienką warstwą 2% agarozy w E3. Przygotuj jedno naczynie dla zarodków gospodarza ze zdekorionowaną naskórką, jedno naczynie dla zarodków dawcy ze zdekorionowaną naskórkowością i jedno naczynie na każde 40 przeszczepionych zarodków. Przechowywać zgodnie z opisem dla płytki iniekcyjnej (4.2.4).
  3. Przygotowanie pipety transferowej
    1. Przyciąć końcówkę długiej, drobno wyciągniętej szklanej pipety Pasteura (objętość 2 ml, długość 230 mm, końcówka o długości 100 mm) na długość umożliwiającą wygodne manewrowanie (opcjonalnie) poprzez drapanie nożem diamentowym podczas obracania, aż końcówka odpadnie (Rysunek 1F).
    2. Upewnij się, że cięcie jest proste. Wypoleruj szklaną pipetę transferową, obracając powierzchnię cięcia w palniku Bunsena, aby uzyskać gładkie końce, aby nie uszkodzić zdekorionowanych zarodków (Rysunek 1F).
      UWAGA: Zbyt długie trzymanie końcówki pipety w płomieniu spowoduje, że otwór zostanie uszczelniony lub stanie się zbyt mały dla zarodków.
  4. Zarodki dawcy i gospodarza w stadium dechorionacji blastuli
    1. Dekorionuj zarodki albo ręcznie za pomocą dwóch cienkich kleszczy, rozdzierając każdą kosmówkę bez dotykania zarodka, albo enzymatycznie za pomocą proteazy, aby umożliwić jednoczesną szybką dechorionację dużej liczby zarodków 9.
      1. Przygotować 100-krotny roztwór podstawowy mieszaniny proteazy o stężeniu 50 mg/ml, przygotować 100 μl porcji i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
      2. Dodać 100 μl proteazy podstawowej do 10 ml pożywki E3 (końcowe stężenie 0,5 mg/ml proteazy).
      3. Umieścić dobrze rozwinięte zarodki gospodarza i dawcy w dwóch oddzielnych małych szklanych zlewkach Erlenmeyera (10 ml) i usunąć jak najwięcej płynu.
      4. Dodać 5 ml roztworu proteazy 0,5 mg/ml do każdej zlewki i delikatnie obracać zarodki, patrząc na nie pod mikroskopem preparacyjnym. Uważaj na wszelkie oznaki deformacji kosmówki.
      5. Wiruj dalej. Jak tylko pierwszy zarodek znajdzie się poza kosmówką (ryc. 1D, gwiazdki), wykonaj trzy szybkie płukania pożywką E3, aby usunąć roztwór proteazy, wylewając większość płynu i ponownie napełniając kolbę, delikatnie wlewając E3 wzdłuż boku. Nie należy dopuścić do tego, aby zarodki z odkorionowaną naskórkowością miały kontakt z powietrzem w żadnym z kolejnych etapów, aż do zakończenia przeszczepiania (punkt 5), ponieważ mogą one pęknąć. Pozostawić odpowiedni roztwór w kolbie między płukaniami.
      6. Za pomocą pipety transferowej z polerowanego ogniowo szkła przenieś zarodki ze zlewki Erlenmeyera do szklanych szalek Petriego lub plastikowych szalek pokrytych agarozą (2% w pożywce E3). Podczas przenoszenia delikatnie odpipetuj pipetę, aby usunąć pozostałą osłabioną kosmówkę.
  5. Przygotowanie igły do przeszczepu
    1. Użyj ściągacza do igieł, aby wyciągnąć dwie igły z każdej cienkościennej rurki ze szkła borokrzemianowego (1,0 mm OD / 0,78 mm ID / 100 mm długości) z takimi samymi ustawieniami jak pipety do mikroiniekcji.
      UWAGA: Przykładowe ustawienia dla używanego tutaj ściągacza igłowego znajdują się na liście materiałów. Igły do przeszczepów nie posiadają szklanej wkładki, ponieważ uszkadza to komórki zassane do igły.
    2. Wyciągnij igły z wyprzedzeniem, przechowuj na szalce Petriego i zabezpiecz, wciskając w pasek szpachli do formowania lub taśmy klejącej.
    3. Przed przeszczepem należy ustawić ostrość końcówki igły pod mikroskopem preparacyjnym i za pomocą kleszczy rozbić igłę na końcówce. Użyj cienkich kleszczyków, aby dostosować kształt igły, aby dążyć do kształtu fletu (Rysunek 2G), lub użyj alternatywnych metod opisanych, aby wygenerować kształt końcówki 23.

5. Wytwarzanie chimery poprzez przeszczep blastuli

  1. Konfiguracja przeszczepu
    UWAGA: W tym przypadku użyto samodzielnie zmontowanego aparatu do przeszczepu (ryc. 2A).
    1. Zamontuj igłę do przeszczepu w tym samym uchwycie igły, który jest używany do mikroiniekcji powyżej (zamontowany na mikromanipulatorze, krok 3.1.3) (Rysunek 2A).
    2. Odłączyć rurkę iniekcyjną, która łączy koniec uchwytu mikropipety z mikrowstrzykiwaczem o regulowanym ciśnieniu używanym do mikroiniekcji. Podłączyć rurkę do wstrzykiwań, która jest podłączona do strzykawki o pojemności 1 ml (Rysunek 2A, B), która reprezentuje zestaw do przeszczepów.
      1. Upewnij się, że wszystkie połączenia są szczelnie uszczelnione za pomocą folii parafinowej lub szpachli do formowania. Zapobiegaj kontaktowi zarodków z powietrzem, upewniając się, że w samej igle do przeszczepu zawsze znajduje się trochę podłoża E3. Uruchomić strzykawkę ręcznie, aby zassać komórki/płyn do i z igły do przeszczepu.
  2. Wyrównanie zarodka
    1. Przenieś zarodki dawcy za pomocą szklanej pipety do pierwszej kolumny formy agarozowej. Przenieś zarodki gospodarza do kolumn od 2 do 6 pleśni agarozy (ryc. 2F). Umieść zarodki za pomocą pipety tak, aby strona blastomerowa była skierowana do góry.
  3. transplantacja
    1. Delikatnie przyłóż igłę do przeszczepu na komórce blastomeru zarodka dawcy i powoli zassaj około 20-50 komórek do igły transplantacyjnej (ryc. 2H). Unikaj zasysania żółtka.
    2. Podnieść igłę do przeszczepu z zarodka dawcy za pomocą mikromanipulatora. Przesuń naczynie z formą agarozową w lewo i włóż końcówkę igły do przeszczepu przez bok masy komórkowej do bieguna zwierzęcego pierwszego zarodka gospodarza. Zdeponuj 5 - 10 komórek w pobliżu powierzchni zgodnie z mapą losu pokazującą, że obszar ten powoduje powstanie pola przodomózgowia / oka 24 (Rysunek 2I). Końcówkę igły należy trzymać zanurzoną w podłożu E3 przez cały czas trwania zabiegu.
  4. Opieka nad przeszczepionymi zarodkami
    1. Usunąć zarodki dawcy i pozostawić zarodki gospodarza w formie agarozowej na 1 - 2 godziny w temperaturze 28,5 °C. Napełnij szklane lub plastikowe (pokryte 2% agarozą) szalki Petriego pożywką E3 zawierającą 0,003% N-fenylotiomocznika (PTU), aby zapobiec tworzeniu się pigmentu, ponieważ będzie to zakłócać obrazowanie. Przenieść zarodki gospodarza do tych naczyń za pomocą pipety z polerowanego szkła i inkubować w temperaturze 28,5 °C O/N.
      UWAGA: Podczas obchodzenia się z PTU należy nosić rękawice.

6. Ustawienia obrazowania na żywo

UWAGA: Mały rozmiar i przezroczystość optyczna danio pręgowanego w połączeniu z szybkim rozwojem pozwoliły mu stać się kluczowym modelem kręgowców do obrazowania in vivo różnych komórek i narządów. Obrazowanie można wykonać na różnych mikroskopach, które będą różnić się ustawieniem i parametrami. Poniżej opisano odpowiednią konfokalną koncentrację obrazowania rozwoju siatkówki 5,8.

  1. Chimeryczna selekcja zarodków
    1. W temperaturze 24 - 26 hpf przebadaj przeszczepione zarodki pod fluorescencyjnym zakresem preparacyjnym, aby wybrać zdrowe, dobrze rozwinięte zarodki, które pokazują przeszczepione komórki dawcy (znakowane H2A-GFP lub H2B-RFP) w rozwijającym się zawiązku oka.
    2. Odłożyć na bok do 40 zarodków do zamontowania przez pipetowanie w nowym naczyniu i dodać 0,4 mg/ml metanosiarczanu trikainy (MS222) w celu znieczulenia zarodków.
      UWAGA: Podczas obsługi MS222 należy nosić rękawice.
  2. Montowanie zarodków
    UWAGA: Użyj odpowiedniej czaszy montażowej, w zależności od tego, czy obrazowanie będzie wykonywane na mikroskopie odwróconym 8 czy pionowym (opisanym tutaj).
    1. Przygotuj kilka plastikowych probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 1 ml 1% niskotopliwej agarozy w 0,4 mg/ml MS222 w pożywce E3 i utrzymuj stopioną w stanie stopionym w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C.
    2. Zassaj 5 zarodków do plastikowej pipety transferowej i pozwól zarodkom gromadzić się w końcówce pod wpływem grawitacji. Przyłóż pipetę transferową do powierzchni jednej z przygotowanych plastikowych probówek zawierających 1% niskotopliwej agarozy i 0,4 mg/ml MS222, umożliwiając zarodkom zanurzenie się w probówce, jednocześnie ograniczając ilość transferu E3.
    3. Zamontuj zarodki na szalce Petriego o średnicy 90 mm do obrazowania w mikroskopie pionowym i na szalce Petriego ze szklanym dnem (dowolny rozmiar) do obrazowania w mikroskopie odwróconym. Użyj markera permanentnego, aby wizualnie podzielić dowolną potrawę na dwie połowy, aby zobrazować dawców w gospodarzach WT (po jednej stronie) lub morfantach (po drugiej stronie) w tym samym eksperymencie.
    4. Przenieś pięć zarodków z plastikowej probówki z agarozy na dowolną szalkę Petriego z 0,5 - 1 ml agarozy. Usuń nadmiar agarozy za pomocą pipety transferowej, tak aby pozostała tylko niewielka kropla (~200 - 300 μL). W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopii pionowej należy unikać umieszczania zarodków w odległości nie większej niż 1 cm od obwodu szalki Petriego. Soczewka zanurzeniowa używana do obrazowania może nie być w stanie wyśrodkować się w tym obszarze ze względu na ściankę szalki Petriego (ryc. 3A).
    5. Użyj pipety do mikroładowania (z odłamaną końcówką), aby wyrównać zarodki na boki, aż agaroza zastygnie. W przypadku obu rodzajów szalek zarodki są prawidłowo ustawione pod kątem bocznym, jeśli dwoje oczu po obu stronach głowy całkowicie zachodzi na siebie (wyrównane w wymiarze X-Y) (ryc. 3B). W przypadku mikroskopii odwróconej, oko w pobliżu szkiełka nakrywkowego musi być przysunięte jak najbliżej szkiełka nakrywkowego, aby umożliwić obrazowanie przez wymiar Z w ramach ograniczeń możliwych poziomów ostrości.
    6. Kontynuuj montowanie pięciu zarodków na raz w pojedynczych kroplach agarozy. Użyj więcej 1% agarozy o niskiej stopie, aby połączyć krople agarozy ze sobą i z boku naczynia, aby zapobiec przemieszczaniu się i ruchom bocznym podczas obrazowania (ryc. 3A).
    7. Po całkowitym zestaleniu przykryj naczynie pożywką E3 (zawierającą 0,003% PTU, 0,4 mg/ml MS222) podgrzaną do 28,5 °C.
    8. Stosując to samo podejście, które opisano w krokach 6.2.2 - 6.2.8, umieść ~20 transgenicznych zarodków wyhodowanych w temperaturze 32 °C (krok 1.2.5) w oddzielnym naczyniu.
  3. Parametry obrazowania
    UWAGA: Obrazowanie w celu analizy początku transgenów fluorescencyjnych nie wymaga wysokiej rozdzielczości przestrzennej wewnątrzkomórkowej. Można to wykonać za pomocą obiektywu W Plan-Apochromat 20X / 1.0 DIC M27 70 mm przy 1,5 zoomie.
    1. Ustaw moc lasera i czas ekspozycji w oparciu o intensywność transgenu dla ~20 transgenicznych zarodków o przyspieszonym rozwoju (tj. podniesionych w temperaturze 32 °C; krok 6.2.8).
      UWAGA: W przypadku badań nad początkiem ekspresji transgenu, eksperymentalne zarodki nie wykazują fluorescencji w momencie ustawienia filmu poklatkowego, a zatem te przyspieszone zarodki mają kluczowe znaczenie dla określenia parametrów obrazowania.
    2. W przypadku naczynia eksperymentalnego zwizualizuj każdy zarodek i zapisz pozycję i poziomy ostrości zarodków.
      1. Wybieraj zarodki, które mają prawidłowy kąt montażu (tj. z boczną stroną oka tak poziomą, jak to możliwe) i silne bicie serca (wskaźnik zdrowia). Wybierz zarodki z kilkoma przeszczepionymi komórkami dawcy (zidentyfikowanymi za pomocą znakowania H2A-GFP lub H2B-RFP) głównie w przednim brzusznym kwadrancie rozwijającej się siatkówki (gdzie zaczyna się fala ekspresji genów) (Figura 3C).
        UWAGA: W zarodkach danio pręgowanego średnie tętno wynosi 120 - 180 uderzeń/minutę 25. W znieczulonych zarodkach zdrowe bicie serca może mieścić się w zakresie 60 - 120 uderzeń na minutę. Wolniejsze bicie serca może wskazywać na zmniejszoną żywotność i te zarodki powinny zostać wykluczone z badania.
    3. Ustaw stosy z-warstw optycznych w odstępach co 2 μm przez siatkówkę do 15 zarodków.
      UWAGA: Całkowita liczba zarodków, które można zobrazować w danym eksperymencie, będzie zależeć od indywidualnych parametrów (czas ekspozycji i rozmiar stosu z). Czas potrzebny do zobrazowania 1 punktu czasowego dla wszystkich wybranych zarodków musi być krótszy niż odstęp między punktami czasowymi. Poświęcając pewną rozdzielczość głębi, można zobrazować więcej zarodków w odstępach czasu. Granice stosu z są wybierane jako boczne i przyśrodkowe krańce zamontowanego oka zarodka, a 30 μm dodaje się do bocznej strony w pionowym ustawieniu mikroskopowym, ponieważ oczy rozwijających się zarodków w tym układzie przesuwają się w kierunku z, gdy zarodki rosną z dnia na dzień. Daje to stosy o grubości 100 - 170 μm (50 - 85 obrazów/oko).
    4. Rób zdjęcia co 24 minuty w temperaturze 32 °C (co odpowiada odstępom 0,5 hpf) przy użyciu lasera/kanału odpowiedniego dla transgenu.
      UWAGA: Zarodki pozostają na scenie przez cały czas trwania filmu poklatkowego w ogrzewanej komorze obejmującej cały mikroskop. Podczas gdy eksperyment można przeprowadzić w temperaturze 28 °C, wyższe temperatury są wykorzystywane do przyspieszenia rozwoju i zapewnienia, że odpowiednie punkty czasowe w eksperymencie zostaną zobrazowane w okresie poklatkowym 16 - 24 godzin.
    5. Kanały obrazu reprezentujące etykietę dawcy (H2A-GFP lub H2B-RFP - opcjonalnie) i transgenu (Atoh7:RFP lub Vsx1:GFP) przy użyciu skanowania sekwencyjnego. Do analizy należy wykorzystać etykietę dawcy tylko w celu wybrania odpowiednich zarodków zgodnie z opisem (należy pobrać jeden stos z na początku obrazowania), a następnie wykonać film poklatkowy tylko na kanale, aby uchwycić ekspresję transgenu.
      UWAGA: Alternatywnie, użyj etykiety dawcy tylko do wyboru odpowiednich zarodków (tj. tych z potwierdzonymi przeszczepionymi komórkami w przednim kwadrancie brzusznym) i zobrazuj tylko kanał transgenowy, skracając mniej więcej o połowę czas obrazowania i prawie podwajając liczbę zarodków, które można zobrazować i przeanalizować w jednym eksperymencie (Figura 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsza praca przedstawia protokół eksperymentalny służący do oceny zmian w czasie ekspresji genów podczas rozwoju retinalnych progenitorów typu dzikiego w embrionie gospodarza będącym morfantem. Eksperymentalne embriony gospodarzy to morfanty Ptf1a, którym brakuje powstających w fazie pośredniej horyzontalnych i amakrynowych neuronów pośrednich siatkówki 7,26. Zostały one porównane z kontrolnymi embrionami gospodarzy, którym ws...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zrozumienie, w jakim stopniu sąsiednie komórki wpływają na czas ekspresji kluczowych czynników determinujących los komórki, jest niezbędne, jeśli chodzi o skuteczne instruowanie embrionalnych lub indukowanych multipotencjalnych komórek macierzystych, aby różnicowały się w określony postmitotyczny typ komórek lub nawet wzorzystą tkankę. Co więcej, badanie tych zdarzeń molekularnych w rozwijających się komórkach żywego zwierzęcia dodatkowo dostarcza istotnych dynamicznych (czasowych i przestrzennych) informacji na temat po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez ARC DECRA dla PRJ (DE120101311) oraz przez grant badawczy Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dla LP (PO 1440/1-1). Australijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej jest wspierany przez fundusze rządu stanowego Wiktorii i rządu federalnego Australii. Składamy wyrazy uznania dr Jeremy'emu Ng Chi Kei, który przeprowadził opisane tutaj eksperymenty, opublikowane w Kei et al., 2016. Jesteśmy wdzięczni za dostarczenie ryb transgenicznych od prof. Higashijima i dziękujemy prof. Turner i Rupp za dostarczenie plazmidu pCS2+ oraz dr Wilkinson za generowanie konstruktów H2B-RFP i H2A-GFP. Dziękujemy personelowi placówki FishCore (Monash University) za opiekę nad naszymi zwierzętami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarozaBiolineBIO-41025Naczynia pokryte agarozą można przygotować kilka dni wcześniej, uszczelnić parafilmem, aby zapobiec wysuszeniu i przechowywać w temperaturze 4 ° C
Agaroza niskotopliwaSigmaA9414-100GMożna przygotować w większej objętości, podtrzymać w kuchence mikrofalowej w celu upłynnienia, a następnie przechowywać w stanie stopionym w 40 ° C Łaźnia wodna. Można przygotować 1 ml podwielokrotności (po jednej dla każdej grupy zamontowanych zarodków).
Można zastosować rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego bez filamentuSDR Scientfic30-0035alternatywy o podobnej średnicy 
Można zastosować rurkę kapilarną ze szkła borokrzemianowego z żarnikiemSDR Scientfic30-0038alternatywy o podobnej średnicy 
Szklane szalki Petriego (średnica 60 mm)Science Supply1070506dowolną szklaną alternatywę o dowolnym rozmiarze
Rurka iniekcyjna (2 m)Eppendorf524616004Łączy to uchwyt igły ze strzykawką podczas przeszczepu
Forma do mikroiniekcji (plastikowa forma z wypukłościami w kształcie klina)Adaptacyjne narzędzia naukowePT-1alternatywy o podobnym kształcie mogą być używane
mikroigłowe uchwytNarishigeM-152można zastosować dowolną alternatywę, która pasuje do zewnętrznej średnicy igieł iniekcyjnych
mikrowtryskiwaczNarishige lub Eppendorf FemtojetWtryskiwacz pneumatyczny wykorzystujący
mikromanipulatorCoherent ScientificM330IRmożna zastosować podobne alternatywy:
końcówka do mikroładowarekEppendorf5242956003
Olej mineralnySigmaM5904-500ML
ściągacz igłowySutter InstrumentsModel P-2000Ustawienia używane dla tego ściągacza to: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Można użyć dowolnego ściągacza igłowego, jeśli skutkuje to odpowiednim wymiarem końcówki
ParafilmInterpathPM996dowolna folia parafinowa
Pipeta Pasteura plastikowaSamco Scientific202
Szkło do pipet PasteuraHirschmann Laborgeraete9260101
PronaseSigmaP5942-25MG  Proteaza typu XIV
N-fenylotiomocznikSigmaP7629-25GPTU jest toksyczna i może być przygotowana jako roztwór podstawowy, aby uniknąć częstego narażenia na proszek, przed zakupem/użyciem należy skonsultować się z MSDS.
Ekstrakcja żelem QiaquickQiagen28704można zastosować wszelkie alternatywy do oczyszczania DNA
Zestaw Rneasy MiniQiagen74104można użyć wszelkich alternatyw do oczyszczania RNA
Zestaw mMessage SP6QiagenAM1340wszelkie alternatywy dla transkrypcji DNA za pomocą SP6
: ciśnienia gazu

Bibliografia

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23(2013).
  3. Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
  4. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
  5. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
  6. Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
  7. Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
  8. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  9. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  10. Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14(2009).
  11. Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
  12. Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
  13. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
  14. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2(2006).
  15. Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
  16. Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  19. Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
  20. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
  21. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
  22. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
  23. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
  24. Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
  25. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898(2014).
  26. Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
  27. Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
  28. La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
  29. Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
  30. Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
  31. Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zarodki chimerycznetransplantacja kom rekkonfokalna analiza time lapsemikroiniekcja morfolinoreporter fluorescencyjny
In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.