Zapisy całokomórkowe patch-clamp do elektrofizjologicznego oznaczania selektywności jonowej w rodopsynach kanałowych

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje, jak selektywność jonowa rodopsyny kanałowej jest określana za pomocą elektrofizjologicznych zapisów całokomórkowych z użyciem komórek HEK293. W tym miejscu przedstawiono eksperymentalną procedurę badania selektywności chlorkowej selektywnej dla anionów rodopsyny kanałowej. Procedura ta może być jednak przenoszona na inne rodopsyny kanałowe o wyraźnej selektywności.

Streszczenie

W ciągu ostatniej dekady, rodopsyny kanałowe stały się niezbędne w badaniach neuronaukowych, gdzie są używane jako narzędzia do nieinwazyjnego manipulowania procesami elektrycznymi w komórkach docelowych. W tym kontekście szczególne znaczenie ma selektywność jonowa rodopsyny kanałowej. W artykule opisano badanie selektywności chlorkowej dla niedawno zidentyfikowanej rodopsyny kanałowej przewodzącej aniony Proteomonas sulcata za pomocą elektrofizjologicznych zapisów patch-clamp na komórkach HEK293. Eksperymentalna procedura pomiaru fotoprądów bramkowanych światłem wymaga szybko przełączanego – najlepiej monochromatycznego – źródła światła sprzężonego z mikroskopem w konwencjonalnym układzie patch-clamp. Przedstawiono procedury przygotowawcze poprzedzające eksperyment, w tym przygotowanie roztworów buforowych, rozważania na temat potencjałów połączeń cieczy, wysiewanie i transfekcję komórek oraz wyciąganie pipet z plastrami. Właściwy zapis zależności prąd-napięcie w celu wyznaczenia potencjałów odwrócenia dla różnych stężeń chlorków odbywa się od 24 godzin do 48 godzin po transfekcji. Na koniec analizowane są dane elektrofizjologiczne pod kątem teoretycznych rozważań dotyczących przewodnictwa chlorków.

Wprowadzenie

Rodopsyny kanałowe (ChR) to bramkowane światłem kanały jonowe, które występują w plamce oka ruchliwych zielonych alg i służą jako główne fotosensory dla fototaksji i reakcji fobicznych¹. Od czasu ich pierwszego opisu w 2002 roku², ChR utorowały drogę dla rozwijającej się dziedziny optogenetyki i mogą być stosowane w różnych komórkach pobudliwych, np. w mięśniach szkieletowych, sercu lub mózgu^3,4,5. Ekspresja ChR w komórkach docelowych powoduje kontrolowaną przez światło przepuszczalność jonów danej komórki. W kontekście neuronalnym pozwala to na aktywację^6,7,8 lub inhibition^9,10 potencjału czynnościowego (AP) wystrzeliwania – w zależności od przewodzonego jonu – z przestrzenną i czasową precyzją światła, podkreślając, w jaki sposób selektywność jonowa wariantu ChR determinuje jego optogenetyczne zastosowanie.

Pierwsze odkryte ChR z Chlamydomonas reinhardtii i Volvox carteri są przepuszczalne dla protonów, ale także dla kationów jednowartościowych, takich jak sód, potas, i w mniejszym stopniu dla kationów dwuwartościowych, takich jak wapń i magnez^11,12,13. Obecnie ponad 70 naturalnych rodopsyn kanałowych przewodzących kationy (CCR)^14,15,16,17 i kilka zaprojektowanych wariantów^{18,19,20 o różnych właściwościach}, takich jak Dostępne są rozmiary prądów fotologicznych, czułość spektralna, kinetyka i selektywność kationowa. Podczas gdy w neurobiologii CCR są wykorzystywane do aktywacji komórek i wyzwalania AP, napędzane światłem pompy mikrobiologiczne były jedynymi dostępnymi antagonistami do wyciszania neuronów przez lata. W 2014 roku dwie grupy jednocześnie wykazały, że CCR mogą być przekształcane w przewodniki kantylacyjne (ACR) poprzez zmianę polarności wzdłuż przypuszczalnego poru przewodzącego jony za pomocą inżynierii molekularnej^9,21. Następnie naturalne ACR zostały zidentyfikowane w kilku kryptofitowych algach^22,23,24. Co najważniejsze, aktywacja światłem ACR pośredniczy w prądach chlorkowych w dorosłych neuronach, umożliwiając hamowanie aktywności neuronów przy znacznie niższym natężeniu światła niż pompy mikrobiologiczne, które transportują tylko pojedyncze ładunki na pochłonięty foton.

Aktywność ChR może być bezpośrednio adresowana przez elektrofizjologiczne zapisy prądów indukowanych światłem w komórkach HEK293. Technika patch-clamp została pierwotnie opracowana pod koniec lat siedemdziesiątych XX wieku²⁵ i dalej ulepszona przez Hamilla i wsp., umożliwiając rejestrację jednostki prądów z małej komórki (tryb całego ogniwa) z wysoką rozdzielczością prądu i bezpośrednią kontrolą napięcia membrany²⁶. Technika ta, zastosowana w hodowli komórkowej, zapewnia dokładną kontrolę warunków zapisu jonowego i elektrycznego oraz umożliwia badanie selektywności jonów wraz ze względnym udziałem jonów w całkowitym prądzie. Tutaj ilustrujemy badanie selektywności jonowej dla przewodzącej anion rodopsyny kanałowej Proteomonas sulcata (PsACR1)^22,23 poprzez rejestrację relacji prąd-napięcie przy różnych zewnątrzkomórkowych stężeniach chlorków w celu udowodnienia wysokiej przewodności chlorków.

Protokół

Rysunek 1: Konfiguracja zacisku krosowego. (1) Źródło światła, (2) światłowód, (3) programowalna migawka, (4) digitizer, (5) sterownik migawki, (6) wzmacniacz, (7) system perfuzyjny, (8) komputer osobisty, (9) monitor, (10) klatka Faradaya, (11) stolik mikroskopowy, (12) wlot perfuzji, (13) wylot perfuzji, (14) komora nagrywająca, (15) czujnik poziomu płynu, (16) elektroda kąpielowa z mostkiem agarowym, (17) uchwyt na pipety, (18) scena główna, (19) mikromanipulator, (20) mikroskop odwrócony, (21) obudowa lampy mikroskopu, (22) zasilacz lampy mikroskopu, (23) rurka w kształcie litery U wypełniona wodą, (24) zawór trójdrogowy, (25) stół antywibracyjny, (26) kamera CCD. (A) Fotografie i (B) schematyczne przedstawienie konfiguracji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Konfiguracja przed nagraniami

szt. szt.

	Wewnątrz.	dodatkowy.1	dodatkowy.2
	Wysoka zawartość chlorków	Wysoka zawartość chlorków	niska zawartość chlorków
	c [mM]	c [mM]	c [mM]
Na-ASP	0	0	140
Zawartość NaCl	Rozdział 110	140	0
Kcl	1	1	1
CsCl	1	1	1
CaCl2	cyfra arabska	cyfra arabska	cyfra arabska
MgCl2	cyfra arabska	cyfra arabska	cyfra arabska
HEPESY	10	10	10
EGTA (EGTA)	10	0	0
ph	7.2	7.2	7.2
osmolarność	290 mOsm	320 mOsm	320 mOsm

Tabela 1: Skład jonowy roztworów buforowanych. Skład wewnątrzkomórkowych (wewnątrzkomórkowych) i zewnątrzkomórkowych (ekstra.) do eksperymentów selektywności chlorkowej w komórkach HEK. Stosowane skróty: kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA), kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) i asparaginian (ASP). Wszystkie stężenia podane są w mM.

1. Przygotować roztwory rejestrujące o stężeniach jonów, jak wskazano w tabeli 1.
   1. Przygotować 15 ml 2 M roztworów podstawowych w wodzie ultraczystej dla MgCl₂, CaCl₂, KCl i CsCl.
   2. Zważyć składniki stałe dla 100 ml roztworów buforowych wewnątrzkomórkowych i 500 ml roztworów buforowych zewnątrzkomórkowych zgodnie z tabelą 1 do oddzielnych zlewek, a następnie dodać odpowiednią ilość przygotowanych roztworów podstawowych. Na przykład jako bufor wewnątrzkomórkowy użyj 0,3803 g (10 mM) EGTA, 0,2383 g (10 mM) HEPES i 0,6428 g (110 mM) NaCl i dodaj 100 μl 2 M MgCl₂ i CaCl₂ oraz 50 μl 2 M roztworów podstawowych KCl i CsCl.
   3. Dodaj ultraczystą wodę i ostrożnie dostosuj pH za pomocą kwasów i zasad, które nie zakłócają pomiaru, tj. nie są prowadzone przez ChR, takich jak kwas cytrynowy i N-metylo-D-glukamina (NMG⁺).
   4. Dostosuj osmolarność do 290 mOsm dla roztworów wewnątrzkomórkowych i do 320 mOsm dla roztworów zewnątrzkomórkowych z glukozą.
      Uwaga: Lekko hiposmotyczne roztwory wewnątrzkomórkowe zwiększają wskaźnik powodzenia łatania²⁶.
   5. Sterylne przefiltruj wszystkie roztwory przez filtry 0,22 μm. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez dwa tygodnie lub zamrażać w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania.
2. Obliczanie potencjałów złączy cieczy i przygotowywanie protokołów zapisu.
   UWAGA: Zmiana stężenia chlorku zewnątrzkomórkowego po ustaleniu konfiguracji całej komórki powoduje znaczny potencjał złącza cieczy (LJP), który należy skorygować^27,28. LJP można bezpośrednio mierzyć lub obliczać, tutaj używana jest ta druga opcja. W tym protokole będzie stosowana korekcja on-line, wymagająca jednego protokołu zapisu dla każdego bufora zewnętrznego. Jednak w przypadku większego zestawu rozwiązań zewnętrznych zaleca się korektę po LJP, aby uniknąć fałszywej korekty.
   1. Otwórz kalkulator potencjału złącza (JPC)²⁷ i otwórz okno dialogowe 'Nowy eksperyment'. Następnie wybierz "Pomiary zacisku krosowego". Wybierz "pomiary całej komórki", "Standardowa elektroda solowo-roztworowa" i wprowadź temperaturę 25 °C. Pomiędzy każdym krokiem idź dalej, akceptując wybór, naciskając przycisk "dalej".
      UWAGA: Eksperymenty wykonywane są w temperaturze pokojowej 25 °C w klimatyzowanym laboratorium. Upewnij się, że roztwory buforowe mają temperaturę pokojową przed rozpoczęciem eksperymentów. Aby zmienić temperaturę próbki, można użyć stopnia inkubacji lub komory. Temperaturę kąpieli można często mierzyć za pomocą termometru.
   2. Dodać wszystkie indywidualne stężenia anionów i kationów w odpipetowanym roztworze i buforze o wysokiej zawartości chlorków zgodnie ze stężeniami podanymi w tabeli 1.
      UWAGA: JPC obliczy LJP -0,5 mV dla warunków początkowych.
   3. Kliknij "Nowy roztwór do kąpieli", aby wprowadzić anionowy i kationowy skład buforu o niskiej zawartości chlorków.
      UWAGA: JPC obliczy teraz nowy LJP na poziomie +12,6 mV zgodnie ze zmienionym rozwiązaniem do nagrywania zewnątrzkomórkowego.
   4. Przygotuj dwa protokoły z korektą LJP dla dwóch warunków pomiaru, odejmując obliczoną LJP od zastosowanego potencjału utrzymywania; -0,5 mV dla roztworów zewnętrznych o wysokiej zawartości chlorków i +12,6 mV dla roztworów zewnętrznych o niskiej zawartości chlorków. W związku z tym protokoły zaczynają się odpowiednio od -79,5 mV (wysoka zawartość chlorku) i -92,6 mV (niska chlorkowa), aby uzyskać skorygowany o LJP początkowy potencjał podtrzymania -80 mV w obu przypadkach.
      UWAGA: Poniższe kroki dotyczą oprogramowania do akwizycji danych wymienionego w wykazie materiałów.
   5. Otwórz edytor protokołów w oprogramowaniu do akwizycji. Przełącz się na menu "Tryb", wybierz "Stymulacja epizodyczna" i dołącz 7 przeciągnięć.
   6. Przełącz się na menu "Przebieg" w edytorze i uwzględnij okres 200 ms z potencjałem podtrzymania 0 mV, a następnie okres 2 s ze zmiennym potencjałem utrzymywania, zaczynając od -79,5 mV dla wysokiego chlorku. Uwzględnij "poziom delta" wynoszący 20 mV dla drugiego okresu, aby zwiększyć potencjał utrzymywania o 20 mV w każdym przebiegu.
   7. W krokach napięcia edytora przebiegów zastosuj 500 ms okresu oświetlenia światłem 540 nm (3,10 mW/mm²). W tym celu należy zmienić "cyfrowy wzorzec bitowy" podłączonej migawki, który steruje aktywnym źródłem światła 500 ms po drugim okresie opisanym powyżej (patrz 1.2.6).
      UWAGA: Natężenie światła może wpływać na właściwości biofizyczne prądów kanałowych, takie jak amplituda lub inaktywacja. W związku z tym należy zawsze podawać gęstości mocy światła. Aby zmierzyć moc światła po przejściu przez wszystkie układy optyczne i szkiełko nakrywkowe, należy użyć skalibrowanego optometru. Aby obliczyć gęstość mocy, należy określić oświetlone pole obiektywu za pomocą mikrometru obiektowego i podzielić zmierzoną moc światła przez wyznaczone oświetlone pole.
   8. Zachowaj protokół dla roztworu zewnątrzkomórkowego o wysokiej zawartości chlorków. Zmodyfikuj protokół i zastąp potencjał utrzymywania pierwszego poziomu przez -92,6 mV (niski poziom chlorku zewnętrznego). Zapisz ten drugi protokół, aby zmierzyć stan zewnątrzkomórkowy o niskim poziomie chlorków.
3. Powłoka lizynowa szkiełek nakrywkowych szkła zgodnie z dostosowanym protokołem²⁹.
   1. Umieścić kilka 100 szkiełek nakrywkowych na szklanej szalce Petriego i dodać 250 ml HCl (1 N).
   2. Umieść szalkę Petriego z szkiełkami nakrywkowymi na wytrząsarce liniowej i potrząsaj z prędkością 120 obr./min przez 72 godziny, aby wyczyścić szkiełka nakrywkowe, a następnie spłucz ultraczystą wodą, aby zneutralizować pH.
   3. Namocz je w niewielkiej objętości 95% etanolu w celu dalszego czyszczenia.
      UWAGA: Czyste szkiełka nakrywkowe można przechowywać w 70% etanolu przed kontynuowaniem. Pracuj pod okapem z przepływem laminarnym, aby wykonać następujące kroki.
   4. Za pomocą palnika Bunsena i pęsety podpal każdą szkiełko nakrywkowe i przenieś ją na nową szalkę Petriego.
   5. Inkubować szkiełka nakrywkowe w sterylnym roztworze poli-D-lizyny o stężeniu 50 μg/ml przez co najmniej 1 godzinę (lub przez noc) w temperaturze pokojowej, wytrząsając wytrząsarką liniową z prędkością 150 obr./min.
   6. Umyj szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą, aby usunąć nadmiar poli-D-lizyny.
   7. Rozłóż szkiełka nakrywkowe na sterylnym papierze do wyschnięcia na 10 minut i wystaw je na działanie światła UV w celu sterylizacji (co najmniej 20 minut).
   8. Zbierz szkiełka pokrywy na sterylną szalkę Petriego pokrytą folią aluminiową do czasu użycia.
4. Przygotuj DNA genu PsACR1 połączonego z mCherry przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej.
   1. Sklonuj sekwencję genu zoptymalizowaną pod kątem ludzkiego kodonu kodującą PsACR1 do plazmidu peGFP-C1 (promotor CMV, oporność na kanamycynę) w ramce z fluoroforem mCherry przy użyciu enzymów restrykcyjnych lub innych ustalonych metod klonowania.
      Uwaga: Można również użyć innych fluoroforów, ale upewnij się, że masz dostępne odpowiednie zestawy filtrów, aby obserwować ich fluorescencję pod mikroskopem w konfiguracji.
   2. Przekształć plazmidowe DNA w chemokompetentne komórki XL1Blue E. coli poprzez szok termiczny zgodnie ze standardowym protokołem i umieść je na płytkach agarowych (30 μg / ml kanamycyny)30. Wyhodować platerowane bakterie przez noc w temperaturze 37 °C.
   3. Następnego dnia zaszczepić 4 ml pożywki bulionowej lizogenicznej uzupełnionej 30 μg/ml kanamycyny komórkami z pojedynczych kolonii i inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C i 180 obr./min w inkubatorze.
   4. Po całonocnej inkubacji należy oczyścić plazmidowe DNA z kultur za pomocą dostępnego w handlu zestawu (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Zasiej komórki
   UWAGA: Wykonaj czynności pod okapem z przepływem laminarnym.
   1. Umieść do trzech szkiełek nakrywkowych pokrytych lizyną obok siebie na szalce Petriego o średnicy 35 mm.
      UWAGA: Delikatnie dociśnij je do dna naczynia, aby zapobiec ślizganiu się na siebie.
   2. Wysiew 1,5 x 10⁵ komórek HEK w 2 ml standardowego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w każdym naczyniu.
   3. Uzupełnij retinal all-trans w końcowym stężeniu 1 μM. Hoduj komórki przez co najmniej jeden dzień przed przystąpieniem do kroku 1.6.
6. Przejściowo transfekuj komórki za pomocą lipofekcji³¹.
   1. Dla każdej płytki z komórkami przygotować roztwór 2 μg plazmidowego DNA (jak przygotowano w kroku 1.4) w 250 μl DMEM bez FBS i 6 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów).
   2. Po 15 minutach inkubacji delikatnie (kroplami) dodaj roztwór do komórek.
7. Przygotuj mostki agarowe
   1. Dodać 0,75 g agarozy do 50 ml sterylnego roztworu chlorku sodu (140 mM) i rozpuścić przez podgrzanie w kuchence mikrofalowej.
      UWAGA: 2 - 3 M KCl do przygotowania mostka agarowego dodatkowo zmniejsza LJP ze względu na wyższe stężenie (np. stała dyfuzja z mostka) i równą ruchliwość jonów K⁺ i Cl^-, ale uniknięto go, aby zminimalizować wyciek jonów (zwłaszcza Cl^-) do roztworu kąpieli³².
   2. Napełnij 10 μl końcówek pipet (lub węża o małej średnicy) płynnym roztworem agarozy za pomocą strzykawki.
      UWAGA: Unikaj pęcherzyków powietrza na moście.
   3. Po schłodzeniu i zestaleniu mostków agarowych należy je przechowywać w sterylnym roztworze chlorku sodu o stężeniu 140 mM.
8. Przygotuj elektrody rejestrujące i do kąpieli.
   1. Usuń srebrne druty z wanny i elektrody nagrywającej z zestawu zacisku krosowego.
   2. Wypoleruj druty papierem ściernym, aby usunąć chlorek srebra z poprzednich eksperymentów. Zanurz czysty srebrny drut w 3 M KCl i podłącz go do dodatniego bieguna akumulatora 1,5 V w celu powlekania elektrolitycznego chlorkiem srebra.
      UWAGA: Zamiast baterii można użyć zasilacza laboratoryjnego.
9. Wyciągnij pipety krosowe o niskiej rezystancji (1,5-3,0 MΩ) ze szklanych kapilar za pomocą ściągacza do mikropipet i wypoleruj je ogniowo zgodnie z opisem Brown et al³³. Pipety należy przechowywać w miejscu wolnym od kurzu w dniu pomiaru.
10. Włącz wszystkie elementy konfiguracji, aby nagrzać się do temperatury roboczej 30 minut przed nagraniami. Upewnij się, że mają temperaturę pokojową.

2. Pomiary selektywności

1. Zapisy należy rozpocząć od 24 do 48 godzin po przejściowym transfekcji komórek opisanych w ppkt 1.6.
2. Umieść jedno szkiełko nakrywkowe w komorze pomiarowej i uszczelnij je silikonem, aby zapobiec wyciekowi zewnętrznego bufora. Przechowywać szalkę Petriego wraz z innymi szkiełkami nakrywkowymi w inkubatorze do następnego zestawu eksperymentów.
3. Ostrożnie napełnij komorę buforem zewnątrzkomórkowym (wysoki [Cl^-]), aby zapobiec odłączaniu się komórek, a następnie umieść go pod mikroskopem i użyj obiektywu 40X do wizualizacji komórek.
4. Umieść mostek agarowy na elektrodzie kąpieli i umieść go w komorze razem z czujnikiem poziomu płynu i wylotem perfuzji osoby do obsługi wanny.
5. Roztwór zewnątrzkomórkowy należy wymienić dwukrotnie z 1 ml świeżego roztworu zewnętrznego (o wysokiej zawartości [Cl^-]) w celu usunięcia pozostałej pożywki hodowlanej i oderwanych komórek.
6. Ustaw ostrość komórek i poszukaj transfekowanej (fluorescencyjnej) komórki, którą należy wyizolować od innych komórek. Użyj trzypasmowego zestawu filtrów i pomarańczowego światła (590 nm; szerokość pasma 15 nm; 100% intensywności), aby wzbudzić i uwidocznić mCherry.
   UWAGA: Ogniwa HEK mogą być elektrycznie sprzężone ze swoimi sąsiadami za pomocą złączy szczelinowych³⁴, co skutkuje niską rezystancją membrany w konfiguracji całego ogniwa.
7. Napełnij jedną z wyciągniętych pipet roztworem wewnątrzkomórkowym i usuń pęcherzyki powietrza, kilkakrotnie obracając pipetę.
8. Zamontuj pipetę na uchwycie pipety i zastosuj pewne nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu końcówki.
9. Umieść końcówkę pipety z plastrem pod mikroskopem i przesuń ją blisko kuwety za pomocą mikromanipulatora.
   UWAGA: Poniższe kroki dotyczą amplifier, oprogramowanie do akwizycji i oceny danych wymienione w liście materiałów.
10. Uruchom "test membranowy" w oprogramowaniu do akwizycji danych i zastosuj krok napięcia (impuls testowy; np. 5 mV przez 10 ms, linia bazowa przy 0 mV), ręcznie lub automatycznie za pomocą określonego oprogramowania w trybie "kąpielowym" podczas uruchamiania "testu membranowego" w oprogramowaniu do akwizycji danych.
11. Sprawdź, czy rezystancja pipety mieści się w żądanym zakresie (1,5-3,0 MΩ).
12. Zerowanie prądów przesunięcia poprzez regulację potencjału pipety poprzez przekręcenie pokrętła przesunięcia pipety na wzmacniaczu podczas pracy w "trybie kąpielowym" "testu membranowego".
13. Utwórz łatkę w konfiguracji całej komórki²⁶.
    UWAGA: Poniższe kroki wymagają zastosowania nadciśnienia i podciśnienia doprowadzonego do bocznego portu używanego uchwytu na pipety. Można to zrobić za pomocą strzykawki, ustnika lub elektronicznie sterowanego regulatora ciśnienia. W tym protokole nadciśnienie i podciśnienie jest przykładane za pomocą ustnika.
    1. Powoli zbliżaj się do celi z pipetą plastrową od góry i zmniejsz dodatnie ciśnienie tuż przed jej dotknięciem.
       UWAGA: Gdy końcówka znajdzie się blisko ogniwa, opór nieznacznie wzrośnie; Wskazuje na to zmniejszony rozmiar impulsu testowego.
    2. Zmień "test membranowy" z "trybu kąpieli" na "tryb łatowy", a tym samym potencjał utrzymywania do oczekiwanego potencjału spoczynkowego komórek (od -30 do -40 mV).
    3. W niektórych przypadkach konfiguracja przyłączona do ogniwa tworzy się sama po zwolnieniu nadciśnienia (2.13.1), jeśli nie, delikatnie należy zastosować podciśnienie, aby wspomóc tworzenie gigaseal.
       UWAGA: Konfiguracja podłączona do ogniwa jest ustalana, gdy impuls testowy jest zredukowany do dwóch małych pików pojemnościowych na początku i na końcu impulsu, a rezystancja membrany mieści się w zakresie GΩ; Ujemne napięcia do -60 mV mogą ułatwiać tworzenie gigaseal
    .
    4. Skompensuj pojemność pipety, obracając pokrętła "kompensacja pojemności pipety", aby uzyskać płaską odpowiedź impulsu testowego.
    5. Zerwij łatkę bez niszczenia uszczelki, stosując krótkie impulsy podciśnienia lub podciśnienia o rosnącej sile, aby uzyskać konformację całych komórek.
       UWAGA: Pomyślne przejście z konfiguracji podłączonej do ogniwa do konfiguracji całego ogniwa jest wskazywane przez wzrost pików pojemnościowych.
    6. Zastosuj szeregową kompensację rezystancji, ustawiając parametry całego ogniwa i regulacje kompensacji zastosowanego wzmacniacza w celu dokładnego zaciśnięcia potencjału membrany do żądanego napięcia podtrzymania.
       1. Przełącz "test membranowy" w tryb "całego ogniwa", w panelu "Kompensacja rezystancji szeregowej" włącz "predykcję" i "korekcję" do 90% unikając przekroczeń i oscylacji odpowiedzi pojemnościowej, włącz przełącznik kompensacji całego ogniwa i wyreguluj parametry całego ogniwa za pomocą odpowiednich pokręteł na panelu przednim ("pojemność całego ogniwa" i "rezystancja szeregowa") wzmacniacza w sposób iteracyjny, aby uzyskać idealnie Reakcja na uszczelkę testu płaskiego.
          UWAGA: Szczegółowy opis kompensacji i korekcji rezystancji szeregowej można znaleźć w instrukcji lub wytycznych amplifier, ponieważ ta procedura różni się w zależności od producenta.
    7. Po ustaleniu konfiguracji całej komórki odczekaj co najmniej 2 minuty przed zapisem, aby zapewnić wystarczającą wymianę roztworu wewnątrzkomórkowego przez pipetę krosową³⁵.
14. Rejestruj prądy indukowane światłem o różnych potencjałach utrzymywania, korzystając z protokołów, które zostały wcześniej skonfigurowane (w 1.2).
15. Wymienić bufor zewnątrzkomórkowy na niski poziom [Cl^-] w komorze co najmniej pięć razy bez niszczenia łaty i zapisać inną zależność prąd-napięcie (patrz krok 1.2) przy nowym stężeniu chlorków.
    UWAGA: System perfuzyjny do automatycznej wymiany ułatwia ten proces, ale nie jest konieczny.
16. Powtórzyć ppkt 2.15 dla każdego badanego stanu jonowego, ale wielokrotnie sprawdzać jakość łaty między pomiarami za pomocą "testu membranowego" opisanego powyżej.
    UWAGA: Aby zagwarantować dokładne napięcie błony i stabilny wewnątrzkomórkowy skład jonowy, rezystancja błony powinna wynosić powyżej 500 MΩ, natomiast rezystancja dostępu nie powinna przekraczać 10 MΩ, patrz 2.12.6). Nie zapomnij wyłączyć kompensacji parametrów całej komórki dla testu membranowego.
17. Powtórzyć czynności opisane w ppkt 2.2-2.15 dla kilku komórek, ale w celu zapewnienia zdrowotności komórek należy pobrać nowy szkiełko nakrywkowe.

3. Ocena danych

1. Dostosuj linię bazową każdej ścieżki prądu, odejmując średni prąd przed oświetleniem.
2. Oblicz średni stacjonarny prąd fotoprądowy I_s (rysunek 2A), uśredniając prąd z ostatnich 40 ms oświetlenia.
   UWAGA: Analizuj szczytowe prądy fotologiczne lub zmieniaj długość uśredniania, aby określić stacjonarny prąd fotoelektryczny w zależności od protokołu lub pytania naukowego.
3. Powtórz kroki 3.1) i 3.2) dla wszystkich badanych warunków i różnych komórek.
4. Wykreśl wyznaczone prądy fotologiczne w funkcji odpowiedniego potencjału utrzymywania.
   UWAGA: Jeśli uśrednia się wiele pomiarów, poszczególne zapisy można znormalizować do określonego stanu lub pojemności ogniwa.
5. Przecięcie zależności prąd-napięcie z osią napięcia reprezentuje potencjał odwrócenia (prąd netto wynosi zero). Określ go przez interpolację liniową między dwoma sąsiednimi punktami danych.
   UWAGA: Jeśli nie ma odwrócenia polaryzacji prądów fotoelektrycznych, ekstrapoluj liniowo od dwóch ostatnich punktów bliskich zeru, aby uzyskać przybliżenie punktu przecięcia.
6. Uśrednić wyznaczone potencjały odwrócenia dla tych samych warunków i wykreślić je w stosunku do stężenia chlorków w zewnętrznych roztworach buforowych (patrz rysunek 2B).

Wyniki

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne wyniki uzyskane z pomiarów przeprowadzonych zgodnie z opisanym protokołem. Podczas świecenia zielonym światłem, PsACR1 charakteryzuje się szybkim prądem przejściowym, który szybko zanika do stacjonarnego poziomu prądu. Po wyłączeniu światła fotoprądy zanikają do zera w ciągu milisekund (rysunek 2A). Zamiana zewnątrzkomórkowego stężenia chlorku powoduje przesunięcie potencjału odwrócenia, który można bezpośrednio...

Dyskusja

Wyznaczanie potencjałów odwrócenia w określonych warunkach jonowych i elektrycznych dostarcza informacji o formach jonów transportowanych po aktywacji światłem ChR. Jeśli tylko jeden rodzaj jonów jest zmieniany w złożonym ośrodku fizjologicznym, a uzyskany potencjał odwrócenia zmienia się zgodnie z teoretycznym potencjałem Nernsta, ten rodzaj jonu jest jedynym transportowanym.

Jednak w przypadku ChR przesunięcia potencjału odwrócenia są zwykle mniej wyraźne niż oczekiwano na podstawie równania...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki HEK293	Sigma Aldrich	85120602	Ludzkie embrionalne komórki nerkowe
Retinal	Sigma Aldrich	R2500	all-trans retinal
FuGENE HD	Promega	E2312	Odczynnik do transfekcji
DMEM	Biochrom	FG 0445	Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agaroza	Roth	3810	Mostki agarowe
CaCl2	Roth	5239	CaCl2 2H2O
CsCl	Biomol	2452
EGTA	Roth	3054
FBS	Biochrome	S0615	Hodowla komórkowa
Glukoza	Roth	HN06	D(+)-Glukoza
KCl	Roth	6781
MgCl2	Roth	2189	MgCl2 6H2O
NaCl	Roth	3957
NMG	Sigma Aldrich	M2004	N-metylo-D-glukamina
Na-asparaginian	Sigma	Aldrich A6683	Kwas L-asparaginowy sól sodowa jednowodna
Kwas cytrynowy	Roth	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	Enzym restrykcyjny
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	Enzym restrykcyjny
NheI	ThermoFischerScientific	ER0975	Enzym restrykcyjny
XL1Blue E. coli	Agilent Technologies	200249	Chemocompetent E. coli
Kanamycyna	Roth	T832
Pożywka bulionowa lizogenna	Roth	X964
Agar-Agar	Roth	6494	Płytki agarowe
Zestaw do oczyszczania plazmidu	Marchery-Nagel	740727.25
Penicyna/Streptomycyna	Biochrom	A 2213	Hodowla komórkowa
Bromowodorek poli-D-lizyny	Sigma Aldrich	P6407-5MG	Powłoka szkiełkowa nakrywkowa
Microforge	Wykonane		Polerowanie ogniowe
Pipety serologiczne	TPP		Różne rozmiary
Czysta ławka	Kojair	Biowizard SL130
Mieszadło	IKA	RCT klasyczne
Srebrny drut	Science Products	AG-T25; AG-T10	Elektrody, 0,64 mm (kąpiel); 0,25 mm (elektroda)
pH-metr	Osmometr kalimetryczny		765 Mikroskop
	Vogel	OM 815
	Carl Zeiss	ID03	Polerowanie ogniowe
Inkubator CO2	Binder	CB150
Naczynia do hodowli komórkowych	TPP	93040	34 mm wewnętrzne średnica
Szkiełka nakrywkowe	Roth	P232	Termometr o średnicy 15 mm
R	ö ssel Messtechnik	MTM12
Beamsplitter	Chroma	21011	90/10 transmisja
Uchwyt na pipety	ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
	Headstage Molecular Devices	CV203BU
Amplifier	Urządzenia molekularne	AxoPatch200B
Digitizer	Urządzenia molekularne	DigiData1400	Przetwornik cyfrowo-analogowy
Źródło światła	TILL Photonics	Polychrome V	Zestaw na pełną intensywność 540 nm
	Carl Zeiss	Axiovert 100
Shutter	Vincent Associates	VS25
Shutter Vincent	Associates	VCM-D1
Szklane kapsle	Warner Instruments	G150F-3	Kapilary borokrzemianowe z ogniowo polerowanymi końcami OD 1,5 mm ID  0,86 mm
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instruments	P1000
Manipulator wannowy	Lorenz Messgerä tebau	MPCU
Trzypasmowy zestaw filtrów	Chroma	69008	Filtr fluorescencyjny  ECFP/EYFP/mWiśnia
Kamera CCD	Watec	Wat-221SCCD
Optometr	Gigahertz Optik	P9710	Pomiar natężenia światła
Obiektyw	Carl Zeiss	421462-9900-000	W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Mikromanipulator	Scientifica	PatchStar
Komora nagraniowa	Zasilacz
	Manson	HCS-3202	Unika szumów elektrycznych z mikroskopu Wbudowany zasilacz
Stół z izolacją drgań	Newport	M-VW-3636-OPT-01
Klatka Faradaya	Wykonany na zamówienie lub dowolny komercyjny stół
Węże	Dowolna komercjalność; np. Roth		Różne rozmiary i materiały do kąpieli i stosowania ciśnienia w pipetach; mostki agarowe
Liniowy Wytrząsarka	Sunlab Instruments	SU 1000
Kalkulator potencjału złącza cieczowego	Urządzenia molekularne lub bezpośrednio od Petera H. Barry'ego		Program jest zawarty w oprogramowaniu akwizycyjnym Clampex lub można go uzyskać z  p.barry@unsw.edu.au Oprogramowanie
akwizycji danych	Urządzenia molekularne	Clampex 10.X
Oprogramowanie do oceny danych	Urządzenia molekularne	Clampfit 10.X
PsACR1	GenBank lub Addgene	KF992074.1 lub plazmid Addgene #85465	Kodowanie genów dla PsACR1
Przewodnik po	wzmacniaczu Urządzenia molekularne	Przewodnik