Artykuł metodologiczny

Badania mikroskopii sił atomowych rozpoznawania zmian DNA w naprawie przez wycinanie nukleotydów

DOI:

10.3791/55501

⸱

24 maja 2017

 ,  , 
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazano badanie różnych podejść do rozpoznawania zmian DNA za pomocą obrazowania AFM pojedynczej cząsteczki na przykładzie systemu naprawy wycinania nukleotydów. Opisano procedury przygotowania próbek DNA i białek oraz szczegóły doświadczalne i analityczne dla doświadczeń AFM.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie AFM jest potężną techniką do badania interakcji białko-DNA. Ta metoda jednocząsteczkowa pozwala na jednoczesną rozdzielczość różnych cząsteczek i zespołów molekularnych w niejednorodnej próbce. W szczególnym kontekście systemów białkowych oddziałujących z DNA można zatem rozróżnić różne formy kompleksów białkowych i odpowiadające im pozycje wiązania w miejscach docelowych zawierających fragmenty DNA. W artykule przedstawiono zastosowanie AFM do badania rozpoznawania zmian DNA w systemach naprawy DNA z wycinaniem nukleotydów prokariotycznych i eukariotycznych (NER). Opisano procedury przygotowania próbek DNA i białek oraz podano szczegóły eksperymentalne i analityczne eksperymentów. Dane te pozwalają na wyciągnięcie ważnych wniosków na temat strategii, za pomocą których białka NER mogą przeprowadzić weryfikację miejsca docelowego. Co ciekawe, wskazują one na różne podejścia do rozpoznawania i identyfikacji zmian chorobowych dla eukariotycznego układu NER, w zależności od rodzaju zmiany. Co więcej, odmienne właściwości strukturalne dwóch różnych helikaz zaangażowanych w prokariotyczny i eukariotyczny NER skutkują i wyjaśniają różne strategie obserwowane dla tych dwóch układów. Co ważne, te eksperymentalne i analityczne podejścia można zastosować nie tylko do badania naprawy DNA, ale także do innych systemów białkowych oddziałujących z DNA, takich jak te zaangażowane w procesy replikacji lub transkrypcji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia sił atomowych (AFM) to potężna technika analizy interakcji białko-DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9. Wymaga tylko niewielkich ilości materiału próbki, aby bezpośrednio uwidocznić niejednorodne próbki z rozdzielczością na poziomie pojedynczej cząsteczki. Niejednorodność może wynikać z różnych stanów konformacyjnych lub oligomerycznych białka. W szczególności, w kontekście próbek białko-DNA, kompleksy białkowe mogą wykazywać różne stechiometrie i/lub konformacje indukowane przez wiązanie DNA w ogóle lub wiązanie się z określonym miejscem docelowym w DNA. Próbki heterogeniczne mogą również zawierać dwa (lub więcej) różnych rodzajów białek, a różne formy kompleksów białkowych (np. składające się tylko z jednego rodzaju białka w porównaniu z kompleksami heteromerycznymi) mogą w różny sposób oddziaływać z DNA. Omawiane tutaj badania wykorzystują obrazowanie AFM w powietrzu na statycznych, wysuszonych próbkach białek naprawy DNA związanych z długimi (~900 par zasad, bp) fragmentami DNA, które zawierają zmianę, która stanowi cel tych białek. Wysoka, molekularna rozdzielczość AFM pozwala na rozróżnienie różnych typów kompleksów białkowych i określenie pozycji wiązania białek na fragmentach DNA. Co ważne, zmiany są wprowadzane do substratów DNA w ściśle określonych pozycjach. Ponieważ położenie miejsca zmiany w DNA jest znane, rozkłady białek związanych na DNA zapewniają wgląd w (różne) właściwości rozpoznawania zmian (różnych) kompleksów białkowych, np. jak dobrze rozpoznają one określony typ zmiany (w porównaniu z nieuszkodzonym DNA)2,3,4,5,6. Ich położenie w DNA pozwala również na rozróżnienie między kompleksami białkowymi związanymi specyficznie w zmianach chorobowych a kompleksami związanymi niespecyficznie w innym miejscu DNA. Oddzielna charakterystyka tych różnych typów kompleksów (kompleksy związane specyficznie w zmianie w porównaniu z kompleksami niespecyficznymi) może ujawnić potencjalne zmiany konformacyjne w kompleksach wywołane po identyfikacji miejsca docelowego.

Białka naprawy DNA, na których się tutaj skupiamy, to helikazy, które są odpowiedzialne za rozpoznawanie zmian w szlaku naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER). U bakterii NER jest osiągany przez białka UvrA, UvrB i UvrC. UvrA jest odpowiedzialny za początkowe wykrywanie zmian w kompleksie skanowania DNA UvaA2 / UvrB2. Po weryfikacji zmiany przez UvrB kompleks ten przekształca się w monomeryczny UvrB związany w miejscu uszkodzenia, a ten specyficzny kompleks może następnie rekrutować prokariotyczną endonukleazę NER UvrC. UvrC wycina krótki (12-13 nt) odcinek jednoniciowego DNA (ssDNA) zawierającego zmianę. Brakujący odcinek jest następnie uzupełniany przez polimerazę DNA. Na koniec ligaza DNA uszczelnia nowo zsyntetyzowany odcinek za pomocą oryginalnego DNA9,10. U eukariontów większość białek kaskady NER jest częścią dużego, multimerycznego kompleksu czynnika transkrypcyjnego II H (TFIIH). Po wstępnym wykryciu zmiany chorobowej za pomocą trimerycznego kompleksu CEN2-XPC-HR23B, TFIIH jest rekrutowany do miejsca docelowego DNA. Gdy XPD w kompleksie weryfikuje obecność docelowej zmiany NER, eukariotyczne endonukleazy NER XPG i XPF są rekrutowane w celu wycięcia krótkiego (24-32 nt) odcinka ssDNA zawierającego lesion9,10. W szczególności badano helikazy UvrB i XPD odpowiednio z prokariotycznego i eukariotycznego NER. Te helikazy wymagają niesparowanego regionu w DNA (pęcherzyka DNA), aby nawlec się na jedną z dwóch pojedynczych nici DNA, a następnie przemieścić się wzdłuż tej nici napędzanej hydrolizą ATP. Oprócz uszkodzeń DNA, w substratach wprowadzono pęcherzyk DNA, który pełni funkcję miejsca ładowania białek.

Procedura przygotowania specyficznych substratów DNA została opisana wcześniej11. Wymaga kolistego konstruktu DNA (plazmidu) z dwoma blisko rozmieszczonymi miejscami restrykcyjnymi dla nickazy. W kontekście tego badania wykorzystano plazmid pUC19N (2729 pz) (stworzony przez laboratorium S. Wilsona, NIEHS). Ten plazmid zawiera trzy blisko rozmieszczone miejsca restrykcyjne dla nickazy Nt.BstNBI, które otaczają odcinek 48 nukleotydów (nt). Po inkubacji z nickazą, odcinek ssDNA między tymi miejscami może zostać usunięty i zastąpiony oligonukleotydem zawierającym dowolną cechę docelową. Po każdym etapie testuje się pełne trawienie enzymatyczne za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Nacięte koliste DNA można odróżnić ze względu na jego niższą ruchliwość elektroforetyczną w porównaniu z oryginalnym superskręconym plazmidem. Luki w DNA i zastąpienie usuniętego odcinka specyficznym substratem oligonukleotydem można ocenić poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym, który nacina substrat wyłącznie w obszarze między nacięciami. Linearyzacja kolistego plazmidu przez enzym zostanie zatem stłumiona dla DNA z przerwami i przywrócona po wstawieniu określonego oligonukleotydu. Wreszcie, dwa miejsca restrykcyjne endonukleazy (najlepiej pojedyncze frezy) pozwalają na wytworzenie liniowego substratu DNA, o pożądanej długości i z określonym miejscem docelowym w określonej pozycji, a także pęcherzyka DNA w pewnej odległości od zmiany w kierunku 5' lub 3'.

Rozpoznawanie zmian chorobowych przez helikazy NER może być badane za pomocą obrazowania AFM. Zatrzymana translokacja DNA helikaz w miejscu zmiany jest widoczna jako pik w rozkładzie położenia białka w DNA i wskazuje na rozpoznanie zmiany. Ponieważ translokacja DNA tych helikaz jest ponadto kierunkowa, z polaryzacją od 5' do 3', zależność rozpoznania zmiany od położenia miejsca załadunku (pęcherzyk DNA przed lub za zmianą) wskazuje również, czy zmiana jest preferencyjnie rozpoznawana na translokowanej, czy na przeciwnej, nietranslokowanej nici ssDNA5,9. W kolejnych rozdziałach zostaną przedstawione stosowane metody i pokrótce omówione zostaną główne wyniki tych eksperymentów. Co ważne, analogicznie do pokazanej tutaj przykładowej pracy nad naprawą DNA, obrazowanie AFM można zastosować do badania różnych systemów oddziałujących na DNA, takich jak replikacja DNA lub transkrypcja8,12,13,14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

  1. Przygotowanie substratów DNA11
    1. Generowanie luki ssDNA w plazmidzie
      1. Całkowicie roztrawić próbkę plazmidu (tutaj: zmodyfikowany pUC19, pUC19N) w probówce reakcyjnej z odpowiednią nickazą (tutaj: Nt.BstNBI), a następnie przeprowadzić inaktywację termiczną enzymu, stosując warunki zgodne z protokołem producenta (patrz rysunek 1 w celu schematycznej prezentacji). Zacznij od ~50 μL i ~500 nM plazmidu, aby uzyskać wystarczającą wydajność.
      2. Sprawdź nacinanie plazmidu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym na rozcieńczonych próbkach (~20 nM)15. Nosić rękawice chroniące przed barwnikiem wiążącym DNA używanym do wizualizacji DNA.
        UWAGA: Różne ruchliwości elektroforetyczne pozwalają na rozróżnienie między naciętym (zrelaksowanym) a superskręconym kolistym plazmidowym DNA (ryc. 1).
      3. Usuń nacięty odcinek ssDNA (między miejscami nacięcia) z plazmidu przez inkubację z ~10-krotnym nadmiarem komplementarnego oligonukleotydu (oligonukleotydu 1 w tabeli 1), wytrząsając z prędkością 300 obr./min przez 30 minut w pobliżu temperatury topnienia oligonukleotydu (tutaj: 68 °C dla pUC19N) w bloku cieplnym (ryc. 1).
      4. Oddziel plazmid z przerwami od mniejszych fragmentów DNA za pomocą filtra odcięcia masy cząsteczkowej 50 kDa (MWCO) przez wirowanie przez 10 minut przy 10 000 x g w wirówce stołowej (ryc. 1). Aby wyekstrahować skoncentrowane DNA z filtra, odwróć filtr i włóż do nowej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Wirować przez 3 minuty przy 1 000 x g.
      5. Otrzymaną zagęszczoną próbkę DNA napełnić do 500 μl dejonizowaną, przefiltrowaną wodą, dodać dodatkowy ~5-krotny nadmiar komplementarnego oligonukleotydu i powtórzyć kroki 1.1.1.3 i 1.1.1.4 co najmniej 3 razy.
      6. Przeprowadzić test na całkowite rozdzielenie DNA przez inkubację z odpowiednim enzymem restrykcyjnym (tutaj: XhoI lub BglII) w warunkach zgodnych z opisem producenta. Użyj rozcieńczonych (wyszczerbionych lub z przerwami) próbek DNA (~20 nM). Przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym, aby odróżnić zlinearyzowany plazmid (nie zawierający luki ssDNA) i nienacięty DNA (DNA z przerwami) przy użyciu naciętego DNA jako kontroli pozytywnej (dołącz drabinkę DNA w celach informacyjnych, ryc. 1). Nosić rękawice.
    2. Uzupełnianie luki zmodyfikowanymi oligonukleotydami ssDNA
      1. Wyżarzać plazmid z przerwaną szczeliną poprzez inkubację z ~25-krotnym nadmiarem 5' fosforylowanego oligonukleotydu, który zawiera określone miejsce docelowe z wyboru, inkubując w temperaturze ~ 45 °C przez 4 godziny (Figura 1). W tym przypadku należy użyć 48 nt ssDNA zawierającego zmianę, albo tyminę z adduktem fluoresceinowym, albo dimer pirymidyny cyklobutanu (CPD), a dodatkowo krótką (8 nt) niekomplementarną sekwencję do wytworzenia pęcherzyków DNA (patrz tabela 1).
      2. Kowalencyjnie połączyć wyżarzoną wkładkę z plazmidem przez inkubację z ligazą DNA T4 przez noc w temperaturze pokojowej zgodnie z protokołem producenta (ryc. 1). Do tej reakcji dodać ATP zawierające stężony podstawowy roztwór buforowy, aby uzyskać odpowiednie warunki buforowe dla ligazy (np. użyć buforu reakcyjnego UvrB: 50 mM Tris-HCl pH7,5, 10 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 5 mM DTT, 1 mM ATP).
      3. Przeprowadzić próbę wprowadzenia specyficznego oligonukleotydu do plazmidu z przerwaną szczeliną poprzez trawienie rozcieńczonych próbek odpowiednim enzymem restrykcyjnym (tak samo jak w 1.1.1.6) zgodnie z protokołem producenta, a następnie elektroforezę w żelu agarozowym (jak w 1.1.1.6, rysunek 1).
    3. Przygotowanie liniowego substratu DNA
      1. Zmodyfikowane plazmidowe DNA należy trawić za pomocą enzymów restrykcyjnych (najlepiej z pojedynczym miejscem restrykcyjnym w plazmidzie) w warunkach zalecanych przez producenta (ryc. 1). Na tym etapie powstają fragmenty liniowe zawierające wstawioną modyfikację w określonym położeniu. W tym przypadku należy użyć cięcia SspI i BspQI w pozycjach 613 i 255 pz odpowiednio przed i za wstawką, co daje fragment DNA o długości 916 pz zawierający określone miejsce uszkodzenia na ~30% długości DNA.
        UWAGA: Do eksperymentów obrazowania AFM, jak opisano tutaj, odpowiednie substratami są fragmenty DNA o długości od ~200 pz do ~2,000 pz.
      2. Wyizoluj fragment docelowy za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i ekstrakcji żelu za pomocą zestawu komercyjnego. Dla ochrony nosić rękawice.
      3. Opcjonalnie przeciąć skalpelem żel agarozowy, aby oddzielić drabinkę DNA i rozcieńczone paski próbki (pierwsze dwa pasy) od pasów zawierających skoncentrowane DNA, które mają zostać oczyszczone. Tylko część żelową z pierwszymi dwoma pasami należy wystawić na działanie promieniowania UV, umieszczając tylko tę część żelu na stole UV.
        1. Wytnij skalpelem opaskę odpowiadającą wybranemu fragmentowi. Ponownie połącz dwie części żelu (poza stołem UV). Użyć pozycji wyciętego prążka od rozcieńczonej próbki jako orientacji dla pozycji prążka pożądanego substratu DNA. Wyższe stężenie należy uwzględnić, wycinając nieco szersze plastry niż w przypadku rozcieńczonej kontroli.
          UWAGA: Ponieważ w tym przypadku badano rozpoznawanie zmian UV, w ten sposób starannie uniknięto wprowadzania dodatkowych zmian UV poprzez naświetlanie promieniowaniem UV w substracie DNA.
      4. Obliczyć stężenie DNA c z absorpcji przy 260 nm mierzone spektrofotometrem UV-Vis przy użyciu prawa Lamberta-Beera ze średnim współczynnikiem ekstynkcji molowej dwuniciowego DNA (dsDNA) wynoszącym ε260nm ~6,700 M−1 cm−1 na bp:
        figure-protocol-1
        gdzie L jest długością drogi (długość komory pomiarowej, zwykle 1 cm).
  2. Ekspresja i oczyszczanie białek
    1. Rekombinowana ekspresja UvrB w E. coli i oczyszczanie białka za pomocą standardowego powinowactwa kulek chityny15 i chromatografia wykluczania wielkości15 zgodnie z wcześniejszym opisem16.
      UWAGA: Gen uvrB z Bacillus caldotenax został sklonowany do wektora pTYB1.
    2. Ekspresja XPD w E. coli i oczyść białko za pomocą standardowego powinowactwa do niklu IDA15 i chromatografii wykluczania wielkości15, a następnie chromatografii anionowymiennej15, zgodnie z wcześniejszym opisem17.
      UWAGA: Gen białka grupy D (XPD) Chaetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum został sklonowany do wektora pBADM11. C. thermophilum p44 był miłym prezentem od laboratorium Caroline Kisker, wyrażonym i oczyszczonym zgodnie z opisem17.

2. Eksperyment AFM

  1. Przygotowanie próbki
    1. Opcjonalnie należy wstępnie inkubować substrat DNA w temperaturze 65 °C przez 10 minut w bloku grzewczym, aby usunąć potencjalne kryształy mikrosoli, które mogły powstać podczas przechowywania w lodówce.
    2. Przygotować bufor(-y) reakcyjny(-e) o 10-krotnym stężeniu (10x).
      UWAGA: Bufor reakcyjny XPD o stężeniu 1x zawierał 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 2 mM ATP; 1x bufor reakcyjny UvrB zawierał 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT i 1 mM ATP.
    3. Wstępna inkubacja białek w wyższym stężeniu w odpowiednich warunkach inkubacji, aby usprawnić tworzenie kompleksu. Wstępnie rozcieńczyć niewielką objętość (np. 1 μl) poszczególnych białek w buforze reakcyjnym 1x białkowym do pożądanego stężenia i wymieszać małe objętości (np. 1 μl) poszczególnych roztworów białkowych w probówce reakcyjnej o pojemności 0,5 ml.
      1. Umieść probówkę w bloku grzewczym, aby temperatura inkubacji była wyższa niż temperatura pokojowa. Wybierz stosunek stężeń w zależności od oczekiwanej złożonej stechiometrii, równomolowej lub odpowiadających jej stężeń. Tutaj inkubować 1 μL XPD (20 μM w 1 x bufor reakcyjny XPD) i 1 μL p44 (20 μM w 1x bufor reakcyjny XPD) w 10 μM każdy przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Inkubować próbki o odpowiednich stężeniach białka i DNA w białkowym buforze reakcyjnym w probówce reakcyjnej o pojemności 0,5 ml. Tutaj użyj 500 nM UvrB lub 1 μM XPD + 1 μM p44 i 100 nM DNA. Pipetować małe objętości, aby zaoszczędzić materiał, np. 0,25-0,5 μl białka (wstępnie rozcieńczonego do 10-krotnego stężenia inkubacyjnego) i DNA w całkowitej objętości 2,5-5 μL 1x białkowego buforu reakcyjnego. Tutaj inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym. Odwirować na krótko w probówce reakcyjnej (~1 s) w wirówce stołowej, aby zapewnić wymieszanie małych objętości.
  2. Osadzanie próbki
    1. Przygotuj podłoże z miki: za pomocą skalpela odetnij około 1 x 1 cm2 kawałek miki z większych pasków. Zdejmij górne warstwy wielowarstwowego kawałka mineralnego miki za pomocą taśmy samoprzylepnej, aby odsłonić czystą, płaską i atomowo gładką powierzchnię podłoża.
      UWAGA: Kawałek miki może być ponownie wykorzystany do wielu eksperymentów, usuwając kolejne warstwy.
    2. Przygotować bufor do osadzania AFM z dejonizowaną, przefiltrowaną wodą, np. 25 mM HEPES pH 7,5, 25 mM Na-octanu, 10 mM Mg-octanu. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,02 μm.
      UWAGA: Kationy dwuwartościowe w buforze do osadzania służą do chelatowania ujemnie naładowanych cząsteczek DNA do powierzchni miki, która również jest naładowana ujemnie przy neutralnym pH. Jeśli stosunkowo wysokie stężenie jonów Mg2+ w buforze do osadzania stanowi problem dla określonego układu białko-DNA, alternatywnie, powierzchnię miki można wstępnie obciążyć grupami aminowymi przy użyciu chemii na bazie silatranu, aby zapewnić dodatnie ładunki powierzchniowe do zakotwiczenia18. Osadzanie próbki można następnie przeprowadzić w buforze, który nie zawiera żadnych kationów dwuwartościowych lub zawiera je tylko w niewielkiej ilości.
    3. Rozcieńczyć próbkę (patrz 2.1) w celu natychmiastowego osadzenia na mice w buforze do osadzania. Zdeponuj niewielką objętość (tutaj: 20 μL).
      UWAGA: Współczynniki rozcieńczenia zależą od stężenia próbki. W tym przypadku próbki należy rozcieńczyć 50-100 razy. Z reguły ~1 nM DNA daje dobre pokrycie powierzchni dla ~1,000 pz.
    4. Natychmiast spłucz próbkę trzy do czterech razy kilkoma mililitrami przefiltrowanej, zdejonizowanej wody, zetrzyj nadmiar płynu i wysusz suszarką w delikatnym strumieniu azotu. Cały proces od osadzenia próbki do wysuszenia próbek można przeprowadzić w czasie krótszym niż 30 sekund.
    5. Przymocuj kawałek miki do szkiełka mikroskopowego za pomocą taśmy klejącej na jego krawędziach.
      UWAGA: Różne systemy AFM mają różne wymagania dotyczące mocowania próbki do stolika. Inne AFM posiadają stoliki magnetyczne, a kawałki miki są mocowane na dyskach magnetycznych, np. za pomocą kleju termicznego. Szczegółowe informacje na temat zastosowanego tutaj systemu AFM można znaleźć w Tabeli Materiałów.
  3. Obrazowanie AFM
    1. Umieścić próbkę (patrz ppkt 2.2.5) centralnie na stoliku AFM i przymocować szkiełko mikroskopowe do stolika za pomocą podkładek magnetycznych.
    2. Włóż końcówkę AFM do uchwytu końcówki. Używaj wsporników z ostrą (<10 nm) sondą AFM odpowiednią do oscylacyjnego, przerywanego obrazowania w trybie kontaktu w powietrzu. Używaj sond AFM, na przykładample, zgodnie z podaniem w tabeli materiałów. Tutaj (w zależności od AFM) zamocuj końcówkę w uchwycie pod zaciskiem, dokręcając zaciskową (dokręcając palcami). Włóż uchwyt końcówki do głowicy pomiarowej AFM. Oprzyj głowę na plecach, aby wykonać ten krok.
    3. Umieść głowicę pomiarową AFM na górze próbki. Szczegóły zależą od modelu AFM. Tutaj upewnij się, że głowa stoi stabilnie z nogami wewnątrz wgłębień sceny. Upewnij się, że mika znajduje się na scenie, w której końcówka AFM będzie unosić się bezpośrednio nad nią. mikrometryczne po prawej stronie stolika umożliwiają precyzyjne ustawienie próbki.
    4. Ustaw laser AFM z tyłu wspornika, aby uzyskać optymalną siłę sygnału z fotodetektora czułego na położenie, na który odbija się laser. Szczegóły zależą od modelu AFM.
      1. W tym miejscu należy obrócić koła po prawej stronie i z tyłu głowicy pomiarowej AFM, aby wyregulować pozycje x i y lasera AFM, aby skierować go centralnie na koniec wspornika. Obejrzyj sygnał odbicia w oknie wideo AFM (jeśli jest dostępny, tutaj: naciśnij ikonę kamery i wybierz wejście: Svideo).
      2. Po wstępnym ustawieniu zoptymalizuj sygnał sumy detektora (okno Sum in Sum i miernika ugięcia w oprogramowaniu AFM), dostrajając pozycję lasera za pomocą dwóch kół (pozostań na końcu wspornika, sygnał sumy zależy od AFM i typu wspornika, tutaj: celuj w sumę >5).
    5. Wyzeruj sygnał różnicowy z górnej i dolnej diody matrycy detektora (tutaj: Sygnał ugięcia w oknie Sum i miernika ugięcia), kierując odbicie lasera AFM na środek detektora (tutaj: obrócić koło po lewej stronie głowicy pomiarowej AFM).
      UWAGA: Odchylenia od zera wskazują następnie ugięcie wspornika spowodowane interakcjami powierzchni, które są przekształcane przez AFM w informacje o wysokości.
    6. Określ częstotliwość rezonansową wspornika za pomocą strojenia częstotliwości zaimplementowanego w oprogramowaniu AFM (tutaj: polecenie auto tune w oknie Master Panel/Tune). Wybierz amplitudę odpowiadającą wejściu 1 V dla piezoelektrycznego, który napędza oscylację wspornika. Ustaw częstotliwość oscylacji na nieco (5%) niższą niż częstotliwość rezonansowa i wyzeruj fazę oscylacji.
    7. Zbliżyć końcówkę do powierzchni próbki za pomocą prymitywnego trybu włączania (tutaj: polecenie Włącz w oknie panelu głównego), aż do osiągnięcia ustawienia ochronnego (wartości zadanej). Jako wartość zadaną należy użyć ~2% odcięcia amplitudy oscylacji swobodnego poziomu (tutaj wprowadź wartość zadaną 980 mV w panelu głównym).
    8. Dokładnie sprzęgnij końcówkę AFM z powierzchnią próbki, obniżając nastawę za pomocą oprogramowania AFM. Celuj w obrazowanie w trybie odpychania z fazą oscylacji wspornika (okno Phase in Sum and Deflection Meter) tuż poniżej fazy swobodnego poziomu (przed włączeniem, tutaj zwykle ~70). W tym przypadku należy zastosować typowe nastawy końcowe rzędu 70-80% amplitudy poziomu swobodnego (1 V).
    9. Przed skanowaniem wybierz sygnały do nagrywania w panelu kanału głównego. Wybierz wysokość (Ht) i amplitudę (Am).
    10. Rozpocznij skanowanie próbki (tutaj: polecenie Wykonaj skanowanie w oknie Master Panel). Użyj prędkości skanowania, np. 2,5 μm/s (polecenie Szybkość skanowania w Panelu głównym), aby zobrazować obszary powierzchni 4 μm x 4 μm lub 8 μm x 8 μm (wprowadź Rozmiar skanowania w Panelu głównym) z rozdzielczością pikseli 2 048 lub 4 096 (Punkty skanowania i Linie skanowania w Panelu głównym), odpowiednio.
    11. Zapisz plik obrazu (polecenie Zapisz obraz w panelu głównym) bez modyfikacji dopasowania (wybierz Brak w panelu kanału głównego/Zapisz dopasowanie płaszczyzny).
    12. W celu dalszej analizy przetwórz zapisany obraz. Załaduj obraz (polecenie Przeglądaj zapisane dane w menu Analiza AFM). Otwórz panel Modyfikuj (naciśnij M w górnej części obrazu). Zastosuj dopasowanie płaszczyzny w wymiarach x i y do obrazu wysokości (rozszerzenie HtR) (polecenie XY w oknie Dopasowanie płaszczyzny w Panelu Modyfikuj, wybierz Kolejność dopasowania płaszczyzny 3). Następnie spłaszcz obraz (polecenie Spłaszcz w oknie Spłaszcz w Panelu Modyfikacji), wybierając opcję Spłaszcz porządek 3.
    13. Wyeksportuj obraz jako plik TIFF (naciśnij Polecenia w górnej części obrazu, wybierz Eksport TIFF 2x odpowiadający rozdzielczości 2 048 pikseli) do dalszej analizy.

3. Analiza AFM

  1. Objętość kompleksu białkowego
    1. Wstępnie wybierz odpowiednie kompleksy białko-DNA poprzez bezpośrednią kontrolę wzrokową obrazów w oprogramowaniu AFM, używając odpowiedniego schematu kolorów, aby zmaksymalizować różne wyglądy kompleksów o różnych rozmiarach (patrz różne kolory i rozmiary różnych kompleksów na rysunku 2; tutaj: schemat kolorów SeaLandAndFire w oprogramowaniu AFM). W przypadku próbek XPD możliwe kompleksy obejmowały XPD/p44-DNA, a także XPD-DNA i p44-DNA, o wyraźnie różnych rozmiarach ze względu na stosunkowo duże, różne masy cząsteczkowe XPD (~95 kDa) i p44 (~40 kDa).
    2. Zmierz objętość poszczególnych pików białkowych w DNA, aby zweryfikować typ kompleksu. Można to osiągnąć za pomocą różnych programów do obrazowania (tutaj: narzędzie przekrojowe w oprogramowaniu AFM).
      1. Zmierz wysokość (h) i średnicę (d) odcinków pików białkowych za pomocą kursorów w oknie sekcji. Zmierz średnicę blisko podstawy sekcji cząstek.
      2. Określ objętość (V) pików za pomocą prostych modeli matematycznych, np. za pomocą następującego wzoru, który jest oparty na modelu czapeczki sferycznej:
        figure-protocol-2
    3. Przelicz zmierzone objętości na przybliżoną masę cząsteczkową białka.
      1. Początkowo należy skalibrować system AFM pod kątem konwersji objętości na masę cząsteczkową (MW) przy użyciu szeregu białek o znanej masie cząsteczkowej (tutaj: łącznie przeprowadzono 12 eksperymentów z od 25 do 851 punktami danych każdy na 5 różnych białkach w stanie monomerycznym, dimerycznym, trimerycznym lub tetramerycznym) 4,19,20. Zdeponować i zobrazować białka (jak opisano powyżej, w 2.2 i 2.3) i zmierzyć ich objętość zgodnie z powyższym opisem (3.1.2). Wykreśl objętości na podstawie ich znanych mas cząsteczkowych. Otrzymany wykres pokaże liniową zależność między V i MW, dla której równanie można uzyskać za pomocą linii dopasowanej do danych. Dla użytego tutaj systemu AFM uzyskano następującą zależność19:
        figure-protocol-3
        UWAGA: Ten krok nie musi być powtarzany przed każdym pomiarem, ale jest wykonywany tylko raz. Kalibracja objętości do MW może być stosowana do obrazów uzyskanych w podobnych warunkach obrazowania przy użyciu sond AFM o nieznacznie różniących się średnicach.
      2. Na podstawie zmierzonych objętości (3.1.2) i kalibracji V-to-MW (3.1.3.1) określ przybliżoną wartość MW kompleksów białkowych20, co dostarcza informacji o jego zawartości molekularnej. Np. dla próbek XPD/p44 uzyskano odpowiednio ~50 kDa, ~100 kDa i ~140 kDa, zgodne z kompleksami p44-DNA (lub pikami spowodowanymi przez samą nadbudowę DNA), pikami tylko XPD i pikami XPD/p44.
  2. Pozycje kompleksów białkowych w DNA
    1. Określ długości fragmentów DNA.
      1. Śledź fragmenty DNA na obrazach AFM, np. za pomocą funkcji linii odręcznej w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu (patrz na przykład Tabela materiałów) i zmierz długość linii.
        UWAGA: Wyklucz agregaty DNA, a także fragmenty odcięte przez marginesy obrazu.
      2. Umieść w koszu i wykreśl długości DNA z całego eksperymentu na histogramie, używając odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (np. patrz Tabela materiałów).
      3. Dopasuj rozkłady długości do krzywej Gaussa w oprogramowaniu do analizy danych i tworzenia wykresów, aby określić długość fragmentów DNA. Aby poznać położenie wstawionego miejsca docelowego DNA (patrz 1.1), w dalszych analizach należy uwzględnić tylko fragmenty DNA o prawidłowej długości w granicach dwóch odchyleń standardowych od środka krzywej Gaussa (y = y0 + z exp(-2(x-xc)2/w2), gdzie z jest czynnikiem normowym, a xc i w są środkiem i pełną maksymalną połową szerokości Gaussa) w dalszych analizach.
        UWAGA: Długość DNA w środku krzywej Gaussa musi być zbliżona do teoretycznej długości fragmentu DNA (obliczonej przy użyciu 0,34 nm/bp). Długości do 10% krótsze od wartości teoretycznej są typowe i prawdopodobnie są spowodowane ograniczeniami rozdzielczości AFM.
    2. Określ położenie pików białkowych na substratach DNA.
      1. Zmierzyć odległość pików białka od bliższego końca fragmentu DNA, jak opisano w ppkt 3.2.1.1 i podzielić przez całkowitą długość DNA, aby uzyskać odległości w jednostkach ułamka długości DNA.
      2. Umieść zmierzone odległości w koszu i wykreśl je na histogramie, korzystając z odpowiedniego oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (patrz np. rysunek 3). Z reguły należy wybrać rozmiar pojemnika, który daje około √n pojemników dla n punktów danych.
        UWAGA: Ponieważ nie można tutaj rozróżnić końców DNA, wykreśl tylko do ułamka długości DNA 0,5 (środek fragmentu DNA). Ponieważ wiązanie końcówek DNA nie jest przedmiotem badania, należy wykluczyć końce DNA z analiz, zaczynając umieszczać dane o pozycji nieco po pozycji 0 (np. tutaj: binowanie z frakcji długości DNA wynoszącej 0,02).
    3. Określ swoistość miejsca docelowego na podstawie rozkładów położenia kompleksu białkowego.
      1. Dopasuj maksimum (wzmocnione wystąpienia wiązania) w rozkładzie pozycji za pomocą krzywej Gaussa, jak w 3.2.1.3, ale stopą na wysokości wiązania tła (patrz rysunek 3).
      2. Oblicz swoistość S dla określonego miejsca w porównaniu z niespecyficznym tłem DNA (cząsteczki białka związane z niespecyficznymi miejscami DNA) za pomocą następującego wzoru21
        figure-protocol-4
        Asp: Liczba kompleksów specyficznych (obszar pod krzywą Gaussa)
        Ansp: Liczba kompleksów niespecyficznych (obszar tła, tj. (długość frakcji DNA) x (średnia wysokość tła y0); ułamek długości DNA objęty tutaj wynosi 0,48 dla histogramu rozpoczynającego się od 0,02 długości DNA)
        N: liczba możliwych miejsc wiązania DNA (tutaj: N = 914 z wyłączeniem końców DNA)
  3. Kąty zgięcia DNA
    1. Korzystając z narzędzia kąta w odpowiednim oprogramowaniu do analizy obrazu, zmierz kąt β między dwiema liniami umieszczonymi centralnie wzdłuż szkieletu DNA i wyśrodkowanymi na piku białka (patrz np. wstawka na rysunku 4). Zmierz kąty dla statystycznie istotnej liczby kompleksów białko-DNA (>50, najlepiej >100)2,3,5.
      UWAGA: Kąt zgięcia DNA jest zdefiniowany jako 180°-β2,3,5.
    2. Korzystając z oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów (patrz tabela materiałów), utwórz histogram rozkładu kąta zgięcia, grupując kąty zgięcia DNA.
    3. Dopasuj rozkład kąta zgięcia do krzywej Gaussa. Jeśli w rozkładzie widoczny jest więcej niż jeden maksimum, wybierz pasowanie Gaussa na wiele szczytów. Środek(i) krzywej(-ych) Gaussa (krzywych) daje średni stan kąta zgięcia danego gatunku.
    4. Jeśli przesunięcie kąta (kątów) zgięcia (maksima dopasowań Gaussa)) jest widoczne dla rozkładów, na przykład, różnych wariantów białek lub różnych gatunków kompleksów białkowych, należy zastosować test t-Studenta w celu oceny poziomu istotności zmian.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozróżnianie różnych typów kompleksów na podstawie objętości kompleksów białkowych

Aktywność helikazy prokariotycznej helikazy NER UvrB jest stymulowana przez wiązanie DNA22,23. UvrB wymaga niesparowanego regionu w DNA (pęcherzyka DNA) w celu prawidłowego załadowania na jedną z dwóch pojedynczych nici ssDNA. In vivo ta struktura DNA jest zapewniana przez interakcje...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analizy statystyczne AFM pozycji wiązania białek na długich fragmentach DNA, które zawierają określone miejsca docelowe, mogą ujawnić interesujące szczegóły dotyczące konkretnych strategii stosowanych przez białko w celu rozpoznania tych miejsc 2,3,4,5,6. Aby zinterpretować wynikowe rozkłady pozycji, pozycje celów w DNA muszą być dokładnie znane. Osiąga się to...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PUC19N, oligonukleotydy zawierające CPD, oraz p44 zostały uprzejmie dostarczone odpowiednio przez Samuela Wilsona, Korbinian Heila i Thomasa Carella oraz Gudrun Michels i Caroline Kisker. Prace te były wspierane przez dotacje z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 i TE-671/4 dla IT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sonda siły molekularnej (MFP) 3DAsylum ResearchN/A mikroskopsił atomowych (AFM)
Precision 390DELLN/Akomputerowy
ThermoMixer i blok 1,5 mlEppendorf5382000015blok grzewczy do przygotowania DNA
Rotilabo Block-Heater H 250 i bloki do probówek 0,5 mLCarl Roth GmbHY264.1 & Blok grzewczy Y267.1do inkubacji białek-DNA
Mini-Sub Cell GTBio-Rad Laboratories GmbH1704467komora do elektroforezy z odlewem żelowym i zasilaczem
Power Pac BasicBio-Rad Laboratories GmbHZasilacz doelektroforezy
Centifuge 5415 D z wirnikiemEppendorf2262120-3stołowa
Ultra-Lum elektroniczna UV transillumonator MEB-15Ultralum900-1322-02Stół do naświetlania UV
NanoDrop ND-1000VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbHN/ASpektrofotometr
UV TKAX-CAD z 0,2 μ m filtr kapsułkowyUnity Lab ServicesN/Ajednostka dejonizacyjno-filtrująca wodę
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Software
MFP na Igor ProAsylum ResearchN/AAFM oprogramowanie
ImageJ (przetwarzanie obrazów Java o otwartym kodzie źródłowym)NIH ImageN/AOprogramowanie do analizy obrazu
Excel (Microsoft Office)Microsoft CorporationN/Aoprogramowanie do analizy danych
Origin9 / Origin2016OriginLab CorporationN/Aoprogramowanie do analizy danych statystycznych i wykresów
NazwaCompanyNumer katalogowyUwagi
Materiał
OMCL-AC240TSOlympusOMCL-AC240TSWsporniki AFM
klasa V-5 moskiewskieSPI Supplies1805arkuszy miki
Amicon Ultra 0,5 ml 50k Ultracell MilliporeIreland Ltd.UFC505096filtry wirówkowe
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH740 609.250Zestaw do ekstrakcji żelu agarozowego
Papier celulozowy Rotilabo typ 111ACarl Roth GmbHAP59.1Bibuła do osadzania AFM
Anatop 25 (0,02 μ m)Whatman GmbH6809-2102filtr strzykawkowy
SSpI, BspQINew England Biolabs (NEB)R0132, R0712enzymy restrykcyjne do przygotowania substratu DNA
XhoI, BglIIR0146, R0144enzymy restrykcyjne do przygotowania DNA kontrolują
enzym ograniczający nacinanie Nt.BstNBINew England Biolabs (NEB)R0607ligaza
DNA nickazy T4New England Biolabs (NEB)M0202SLigase
Tris, HEPESCarl Roth GmbH4855, 9105chemikalia buforowe
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetateCarl Roth GmbH3957, HN03, HN02, P026chemikalia solne
NaAcSigma-Aldrich Chemie GmbH32318chemikalia solne
DTT, TCEP, EDTA6908, HN95, 8040chemikalia/
odczynniki agaroza, kwas octowy, HClCarl Roth GmbH2267, 3738, odczynniki K025
ATPCarl Roth GmbHK054nukleotydy
oligonukleotyd #1 w tabeli 1Biomeryniestandardowekomplementarne oligonukleotydy oligonukleotydowe DNA
#2, #3 i #6 w tabeli 1Zintegrowane technologie DNA (IDT)niestandardowefluoresceiny zawierające oligonukleotydy
oligonukleotydy #4  i #5 w Tabeli 1prywatne (dostępne np. w TriLink lub GlenResearch)CPD zawierające oligonukleotydy
Probówka reakcyjna SafeSeal 0,5 ml i 1,5 mlProbówki inkubacyjneSarstedt72.704 i 72.706
GeneRuler 1 kbThermo ScientificSM0311drabinka DNA
6x koncentrat żel ładowanie barwnikfioletowy Nowość England Biolabs (NEB)51406Barwnik ładujący DNA
Midori Green Nippon Genetics Europe GmbH999MG28055Barwienie DNA
1645050 wirówka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
  3. Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
  4. Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
  5. Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
  6. Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
  7. Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
  8. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
  9. Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
  10. Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
  11. Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
  12. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625(2015).
  13. Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001(2012).
  14. Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  16. Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
  17. Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954(2014).
  18. Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
  19. Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
  20. Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
  21. Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
  22. Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
  23. Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
  24. Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
  25. Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
  26. Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
  27. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
  28. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
  29. Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interakcje bia ko DNAobrazowanie AFMprzygotowanie pod o a DNAkompleks XPD p44aktywacja helikazypozycja wi zania zmianyanaliza danych AFM

Powiązane artykuły