Artykuł metodologiczny

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55502

⸱

28 marca 2017

 , 
1Research and Development, British American Tobacco

W tym artykule

Podsumowanie

Kompetencja metaboliczna systemów in vitro jest kluczowym wymogiem dla biotransformacji i dystrybucji leków i substancji toksycznych. W niniejszym protokole opisano zastosowanie referencyjnych sond metabolicznych do oceny metabolizmu fazy I w hodowlach komórkowych.

Streszczenie

Enzymy metabolizujące ksenobiotyki odgrywają kluczową rolę w biotransformacji leków i substancji toksycznych, dodając grupy funkcyjne, które zwiększają rozpuszczalność i ułatwiają wydalanie. W niektórych przypadkach te modyfikacje strukturalne prowadzą do powstawania nowych toksycznych produktów. Aby ograniczyć liczbę testów na zwierzętach, ryzyko chemiczne można ocenić przy użyciu komórek kompetentnych metabolicznie. Ekspresja enzymów metabolicznych nie jest jednak stabilna w czasie w wielu systemach hodowli pierwotnej in vitro i często jest częściowa lub nieobecna w liniach komórkowych. Dlatego badania metabolizmu leków, dodatków i zanieczyszczeń środowiska in vitro powinny być najlepiej prowadzone w układach komórkowych, w których scharakteryzowano aktywność metaboliczną. Wyjaśniamy tutaj podejście do pomiaru aktywności klasy enzymów metabolicznych (faza I u człowieka) w liniach komórkowych 2D i pierwotnych kulturach 3D przy użyciu sond chemicznych i ich produktów metabolicznych kwantyfikowalnych za pomocą spektrometrii mas i luminometrii UPLC. Metoda może być stosowana do badania aktywności metabolicznej w liniach komórkowych i komórkach pierwotnych pochodzących z różnych tkanek.

Wprowadzenie

Metabolizm ksenobiotyków to proces, w którym substancje chemiczne obce dla organizmu są modyfikowane poprzez dodawanie grup hydrofilowych i koniugatów w celu ułatwienia ich wydalania1. Zazwyczaj metabolizm ksenobiotyków jest procesem dwuetapowym, w którym faza I polega głównie na utlenianiu z przyłączeniem jednej lub wielu grup hydroksylowych1,2. W fazie II grupy hydroksylowe służą jako akceptory dla koniugatu hydrofilowego, takiego jak glukuronid lub reszta siarczanowa1,2. Jeśli w cząsteczkach obecna jest już grupa akceptująca, etap koniugacji może zajść niezależnie od metabolizmu w fazie I. Każda reakcja jest przeprowadzana przez specyficzną grupę enzymów, np. CYP (cytochromy P450), które katalizują hydroksylację (Rycina 1) i dealkilację substratów chemicznych3. Koniugacja jest katalizowana przez sulfotransferazy, UDP-glukuronozylotransferazy (Rycina 1), transferazy S-glutationowe i N-acetylotransferazy4. Każda tkanka i organ charakteryzuje się specyficznym profilem ekspresji enzymów metabolicznych, przy czym wątroba wykazuje ekspresję większości tych białek.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przykład metabolizmu fazy I i fazy II kumaryny. CYP2A6/CYP2A13 katalizują 7-hydroksylację kumaryny. 7-hydroksykumaryna jest sprzęgana z resztą glukuronidową przez enzymy fazy II UGTs, przy czym UGT1A6 i UGT1A9 wykazują najwyższą aktywność.

Zrozumienie metabolizmu ksenobiotyków jest kluczowe w ocenie bezpieczeństwa leków oraz w ocenie ryzyka chemicznego z dwóch powodów: kinetyka reakcji określa, jak długo lek lub substancja chemiczna pozostanie w organizmie w formie aktywnej lub nieaktywnej przed wydaleniem; ponadto związek macierzysty może zostać przekształcony przez enzymy metaboliczne w formę bardziej reaktywną, niestabilną i toksyczną. Takie reakcje, znane również jako „bioaktywacja”, są w większości napędzane przez enzymy CYP fazy I, ale rzadziej również przez sprzęganie fazy II5.

W związku z tym zdolność modelu in vitro do dokładnego przewidywania ryzyka związanego z lekiem lub substancją chemiczną jest w dużym stopniu zależna od kompetencji metabolicznej systemu komórkowego. Linie komórkowe pochodzące z tkanek chorobowych lub powstałe w wyniku transformacji komórek prawidłowych często tracą część lub całość profilu enzymów metabolicznych reprezentatywnego dla tkanki, z której pochodzą6. Zachowanie prawidłowego profilu enzymów metabolicznych wydaje się być lepsze w pierwotnych kulturach komórkowych (przynajmniej w kulturach krótkoterminowych) i ulega dalszej poprawie, jeśli tkanka jest hodowana w matrycy pozwalającej na zachowanie jej struktury 3D1. Dlatego też charakterystyka kompetencji metabolicznej systemu komórkowego in vitro jest ważnym krokiem wstępnym, który pomaga w podjęciu decyzji dotyczącej wyboru odpowiedniego modelu komórkowego do przeprowadzenia oceny bezpieczeństwa chemicznego.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół profilowania aktywności i ekspresji enzymów CYP fazy I in vitro na przykładach ich zastosowania w linii komórek wątroby7 oraz w 3D pierwotnych kulturach komórek płuc8. Opisano specyficzne substraty CYP, ich produkty metaboliczne oraz kontrole inhibitorowe, wraz z metodami ilościowymi opartymi na spektrometrii mas i luminogenezie. Ponieważ niektóre CYP są indukowalne, a inne konstytutywne, przedstawione zostaną również przykłady dla obu tych scenariuszy.

Protokół

UWAGA: Ogólny schemat postępowania dla testu aktywności metabolicznej przedstawiono na Rysunku 2. Każdy krok tego schematu został szczegółowo opisany w następnych akapitach. Szczegółowe tabele odczynników i sprzętu znajdują się w Tabeli Materiałów.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schemat procedury testu z sondą metaboliczną. Komórki są wysiewane i hodowane do osiągnięcia odpowiedniej gęstości. W zależności od badanej aktywności enzymatycznej może być wymagany etap indukcji CYP. Do hodowli komórkowej dodaje się substrat sondy oraz inhibitor. Po okresie inkubacji zbiera się medium do analizy, a komórki poddaje się lizie w celu oznaczania ilości białka. Medium jest przetwarzane w celu analizy produktu metabolicznego substratu sondy za pomocą spektrometrii mas lub luminometrii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Hodowla komórkowa

figure-protocol-2
Rycina 3: Mikrografia w świetle przechodzącym hodowli linii komórek wątrobowych. Linia komórkowa opisana w niniejszym protokole5 zazwyczaj różnicuje się w hodowli w stosunku 50% cholangiocytów do hepatocytów (100x). Pasek skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Kultura linii komórkowej wątroby
    UWAGA: Jako przykład komórek metabolicznie kompetentnych wykorzystano komercyjnie dostępną linię komórkową wątroby. Linia ta została wywodzona z hepatokarcinomy wywołanej infekcją wirusową7. Po osiągnięciu konfluencji linia ta różnicuje się w komórki przypominające cholangiocyty i hepatocyty (Rycina 3), a więcej szczegółów znajduje się w pracy Guillouzo7. Dodatek 2% DMSO do pożywki hodowlanej wspomaga różnicowanie tej linii komórkowej oraz ekspresję różnych CYPs.
    1. Wyjąć fiolki kriogeniczne z komórkami z ciekłego azotu i umieścić na suchym lodzie w celu transportu. Przenieść fiolkę kriogeniczną do łaźni wodnej wstępnie ogrzanej do 37 °C na 1-2 min, a następnie wysterylizować zewnętrzną stronę fiolki 70% etanolem przed umieszczeniem jej w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    2. Pracując w warunkach sterylnych, ostrożnie otworzyć fiolkę kriogeniczną, aby zrównoważyć nadciśnienie, i przepipetować zawartość fiolki do probówki 10 mL wypełnionej 9 mL wstępnie ogrzanej do 37 °C pożywki Williams' E.
    3. Wirować roztwór przez 10 min przy 400 x g w temperaturze pokojowej, odrzucić nadsącz i resuspenderć komórki w 5 mL zastrzeżonej pożywki do rozmrażania wstępnie ogrzanej do 37 °C, uzupełnionej o glutaminę lub suplement glutaminy (stężenie końcowe 2 mM) (Williams' E + suplement glutaminy + suplementy do rozmrażania).
    4. Policzyć żywe komórki, wykorzystując alikwot 500 μL i licznik komórek lub dowolną inną odpowiednią technikę liczenia komórek.
    5. Wysiać komórki na 24-dołkową płytkę pokrytą kolagenem z zagęszczeniem 0.6 x 106 żywych komórek/dołek w końcowej objętości 0.5 mL pożywki do rozmrażania.
    6. Umieścić płytkę(i) w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy atmosferze 5%/95% CO2/powietrze i 100% wilgotności względnej.
    7. 24 h po wysianiu komórek zastąpić pożywkę 0.5 mL wstępnie ogrzanej roboczej pożywki do utrzymania/metabolizmu (Williams' E + suplement glutaminy + suplement metaboliczny (pożywka ta zawiera już DMSO)). Wymieniać pożywkę co dwa dni.
    8. Po kilku dniach hodowli komórki tworzą subkonfluentną strukturę beleczkowatą (Rycina 3). Optymalna aktywność metaboliczna jest zazwyczaj obserwowana między 7. a 10. dniem i jest najniższa w 4. dniu.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Przekrój poprzeczny komórek dróg oddechowych barwionych błękitem Alcianem, hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz8.
Wyraźnie widoczne są komórki rzęsiste, śluzotwórcze i podstawne. Pasek skali = 250 μm.

  1. Kultury zróżnicowanego nabłonka dróg oddechowych
    UWAGA: Protokół przedstawiono na przykładzie komercyjnie dostępnego, w pełni zróżnicowanego pierwotnego nabłonka dróg oddechowych hodowanego na granicy faz powietrze-ciecz (air-liquid interface) na wkładkach (insertach)8 (Rycina 4). Hodowla tkankowa zachowuje fenotyp śluzorzęskowy i polaryzację komórek8. Komórki mogą być pochodzenia nosowego lub oskrzelowego. W tym przypadku należy użyć ludzkich komórek nosowych. Komórki są dostarczane w formacie płytki hodowlanej z 24 wkładkami na granicy faz powietrze-ciecz. Aby ułatwić transport i zapobiec rozlaniu medium, wkładki są wysyłane z sekcją bazalną zatopioną w matrycy agarozowej zmieszanej z medium hodowlanym.
    1. Po otrzymaniu komórek płytki zawierające 24 wkładki należy wysterylizować 70% roztworem etanolu przed umieszczeniem ich w czystej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    2. Przygotować sterylną płytkę 24-dołkową, dodając podgrzane wcześniej 700 μL zastrzeżonego medium hodowlanego.
    3. Za pomocą sterylnej pęsety przenieść wkładki z komórkami do nowej płytki wypełnionej medium, delikatnie uwalniając wkładkę z matrycy agarozowej.
    4. Umieścić płytkę(i) w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy atmosferze 5% / 95% CO2/powietrze i 100% wilgotności względnej.
    5. Co 2 dni przenosić wkładki do nowej sterylnej płytki 24-dołkowej wypełnionej 700 μL ciepłego, zastrzeżonego medium do hodowli komórek dróg oddechowych.
    6. Ocenić integralność tkanki dróg oddechowych za pomocą metod takich jak pomiar oporu transepithelialnego (TEER) lub częstotliwość uderzeń rzęsek (CBF) przy użyciu mikroskopu wyposażonego w system obrazowania wideo na żywo9. Pomiar TEER i CBF opisano w pracy Kuehn10.

2. Ilościowe oznaczanie aktywności CYP w kulturach komórkowych

UWAGA: Co do zasady, do przygotowania roztworów stokowych dla różnych sond metabolicznych i inhibitorów przedstawionych w niniejszej pracy można stosować rozpuszczalniki takie jak DMSO i metanol. Zaleca się jednak, aby końcowe stężenie DMSO w pożywce hodowlanej było jak najniższe (1% lub mniej), ponieważ wysokie stężenia mogą hamować enzymy metaboliczne. Jeśli to możliwe, podczas inkubacji z sondami metabolicznymi zaleca się również stosowanie pożywek bez czerwieni fenolowej i bez surowicy, ponieważ czerwień fenolowa może zakłócać aktywność CYP-ów i enzymów II fazy, a składniki surowicy, takie jak albumina, mogą zmniejszać dostępność sondy. Nie zawsze jest możliwe ścisłe przestrzeganie tych wytycznych. Na przykład pożywka do hodowli komórek dróg oddechowych jest produktem zastrzeżonym i zawiera czerwień fenolową. Zastrzeżona pożywka do metabolizmu linii komórek wątrobowych7 zawiera już DMSO w stężeniu powyżej 1%, ponieważ jest ono niezbędne do przyjęcia przez komórki fenotypu hepatocytopodobnego.

UWAGA: Na koniec należy zaznaczyć, że w tym miejscu użyto określenia sonda/inhibitor specyficzny, jednak terminologię tę należy rozpatrywać z ostrożnością. W rzeczywistości zdarza się bardzo rzadko, aby sonda metaboliczna była substratem wyłącznym dla jednego enzymu. Opisane tutaj sondy wykazują jednak wysokie powinowactwo do swojego enzymu docelowego, w związku z czym są uznawane za wiarygodne markery aktywności.

  1. Sondy metaboliczne, induktory i inhibitory
    1. Sondy wykorzystujące metody oparte na spektrometrii mas
      UWAGA: Sondy i inhibitory opisane w tej sekcji nadają się do badania aktywności CYP2As11, CYP1A212,13, CYP2B67,14, CYP2F115,16 oraz CYP2E117 przy użyciu UPLC-spektrometrii mas. Sondy, inhibitory i odpowiadające im CYP opisano w Tabeli 1 wraz z odpowiednimi referencjami. Tabela 1 wymienia również produkt metaboliczny aktywności CYP, który jest ilościowo oznaczany za pomocą spektrometrii mas. Wszystkie prace obejmujące hodowlę tkankową i roztwory do stosowania w hodowli tkankowej należy przeprowadzać w sterylnym dygestorium do hodowli tkankowych. Roztwór zapasowy dla wszystkich substratów sond może zostać przygotowany w DMSO.
      1. Przed eksperymentem przygotuj dwie serie wkładów komórkowych lub dołków; jedną serię wykorzystaj do eksperymentu z inhibicją, a drugą wyłącznie dla sondy metabolicznej. Przygotuj trzecią serię komórek jako kontrolę ujemną (medium). Mogą one znajdować się na oddzielnych płytkach lub na tych samych płytkach, z minimum trzema powtórzeniami. Przykład układu płytki przedstawiono na Rysunku 5.
      2. W dniu eksperymentu wymień pożywkę do hodowli komórkowej na 450 μL świeżej pożywki.
      3. W sterylnym dygestorium przygotuj roztwory o stężeniu 10x, korzystając z pożywki do hodowli komórkowej. Przygotuj 10x sondę CYP, 10x inhibitor CYP oraz mieszaninę 10x inhibitora CYP i 10x sondy.
        UWAGA: Główne roztwory zapasowe inhibitora i sondy można przygotować w 100% DMSO (np. stoki 1 000x), a następnie rozcieńczyć w pożywkach do uzyskania roztworu 10x, aby uniknąć końcowego stężenia DMSO przekraczającego 1% w hodowli komórkowej. Końcowe stężenia 1x, dążone do osiągnięcia podczas inkubacji z komórkami, podano w Tabeli 1.
      4. Przefiltruj poszczególne roztwory sondy 10x za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm.
      5. Dodaj 50 μL pożywki zawierającej 10x inhibitor CYP do serii komórek przygotowanych do eksperymentu z inhibicją i inkubuj wstępnie przez 30 min.
      6. Wymień pożywkę komórek w serii z inhibicją na 450 μL świeżej pożywki i dodaj 50 μL pożywki zawierającej zarówno 10x inhibitor CYP, jak i 10x substrat sondy.
      7. Do pozostałych komórek dodaj 50 μL pożywki z 10x substratem sondy, a do kontrolnych komórek pustych dodaj równoważną ilość rozpuszczalnika rozcieńczonego w pożywce (np. DMSO), jak pokazano na Rysunku 5.
      8. Inkubuj komórki przez 0 - 5 min (czas 0, kontrola tła) oraz 16 h w inkubatorze komórkowym.
        UWAGA: Ten czas inkubacji był stosowany z sukcesem w przypadku komórek dróg oddechowych i linii komórkowej wątrobowej; jednak świeże hepatocyty pierwotne wykazują wysoką sprawność metaboliczną, zależnie od jakości preparatu komórkowego i genetyki dawcy, zatem odpowiedniejsze mogą być krótsze czasy (np. 2-4 h). Przy testowaniu różnych linii komórkowych lub typów komórek zawsze zaleca się przeprowadzenie eksperymentu z przebiegiem czasowym.
      9. Po zakończeniu okresu inkubacji zbierz pożywkę do osobnych, oznakowanych probówek w celu ilościowego oznaczenia produktu metabolicznego sond. Zamroź pożywkę do dalszego przetwarzania.
      10. Zlizuj komórki w celu ilościowego oznaczenia białka.
        UWAGA: Do tego kroku nadaje się każdy standardowy zestaw i protokół ilościowego oznaczania białka. Odpowiednią opcją jest metoda BCA. Krok ten jest opcjonalny, jeśli komórki mają zostać wykorzystane w innym badaniu.
    2. Obróbka pożywki
      UWAGA: Pożywka zebrana na etapie inkubacji zawiera substancję wyjściową sondy oraz jej produkty metaboliczne. Aby zmierzyć aktywność konkretnego CYP, należy oznaczyć ilościowo tylko produkt reakcji katalizowanej przez interesujący nas CYP. Produkty metabolizmu fazy I są często przetwarzane równolegle w metabolizmie fazy II (sprzęganie), w związku z czym nie mogą być wykrywane w formie pierwotnej. Aby zatem uzyskać najdokładniejsze ilościowe oznaczenie aktywności CYP, wymagany jest etap odsprzęgania w celu usunięcia modyfikacji metabolizmu fazy II. Ponieważ sprzęganie metabolitów fazy I często obejmuje glukuronidację lub siarkowanie, odsprzęganie osiąga się poprzez traktowanie próbek glukuronidazami i sulfatazami18. Aktywność glukuronidazy i sulfatazy jest zależna od pH, przy czym najwyższą aktywność glukuronidazy osiąga się przy pH 4,5-5,0, a najwyższą aktywność sulfatazy przy pH 6,0-6,5. Dlatego krok ten wymaga regulacji pH. W metodzie opisanej tutaj mierzymy pH za pomocą pasków wskaźnikowych z powodów praktycznych, ponieważ większość sond pH-metrów nie mieści się w probówce mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Dostępne w handlu paski pH mogą mieć rozdzielczość od 0,3 do 0,2 jednostek pH.
      1. Przenieś 250 μL pożywki z inkubacji do mikropprobówki 1,5 mL i dodaj roztwór zapasowy standardu wewnętrznego 4-metylumberyferonu, aby osiągnąć końcowe stężenie 100 nM.
      2. Dostosuj pH pożywki do 4,5-5,0, dodając 1 M HCl. Dodawaj 1 μL HCl na raz i weryfikuj pH, nakrapiając 2 μL pożywki na pasek pH. Osiągnięcie pH 5,0 zazwyczaj wymaga nie więcej niż 5-10 μL 1 M HCl.
      3. Dodaj 150 jednostek (1,8 μL stoku 85 000 jednostek/mL) β-glukuronidazy/arylsulfatazy z Helix pomatia i inkubuj przez 1 h w 37 °C. Zatrzymaj reakcję, dodając 250 μL zimnego metanolu (-20 °C). Przechowuj próbki w -20 °C lub przetwarzaj dalej.
      4. Odparuj rozpuszczalnik w wirówce próżniowej w 45 °C. Rekonstytuuj próbki w 500 μL roztworu 30% acetonitrylu:wody. Próbki są gotowe do analizy spektrometrią mas i mogą być przechowywane w -20 °C w bursztynowych fiolkach szklanych.
    3. Ilościowe oznaczanie oparte na spektrometrii mas
      UWAGA: Wszystkie ustawienia UPLC i spektrometru mas szczegółowo opisano w dedykowanej Uzupełniającej Tabeli 1. Dla analizy ilościowej wymagane jest sporządzenie krzywej kalibracyjnej. Krzywą kalibracyjną uzyskuje się poprzez analizę znanego zakresu rozcieńczeń związku podlegającego oznaczeniu. W tym przypadku krzywe kalibracyjne wygenerowano dla 10 różnych stężeń (Tabela 2), z których co najmniej 6 powinno mieścić się w 20% zakresu liniowego19. Najniższy poziom detekcji określa się jako najniższe stężenie, które daje sygnał większy niż lub równy 3-krotności średniego sygnału tła. Najniższy poziom oznaczania ilościowego określa się jako próbkę o najniższym stężeniu, która daje sygnał większy niż lub równy 10-krotności średniego sygnału tła; oba parametry są wyznaczane w co najmniej 3 niezależnych pomiarach z próbkami w trzech powtórzeniach.
      1. Przygotuj rozcieńczenia seryjne syntetycznego metabolitu w pożywce do hodowli tkankowej zgodnie z Tabelą 2, wliczając standard wewnętrzny. Wystarczająca jest końcowa objętość 250 μL na każde rozcieńczenie standardu.
      2. Odparuj rozcieńczenia seryjne standardu zgodnie z opisem w kroku 2.1.2.4 i resuspenduj w objętości 30% acetonitrylu:wody równoważnej objętości pożywki przed odparowaniem (np. 250 μL 30% acetonitrylu:wody, jeśli początkowy roztwór standardu wynosił 250 μL pożywki).
      3. Dodaj 250 μL każdego standardu z rozcieńczenia seryjnego do bursztynowej szklanej fiolki UPLC w celu wstrzyknięcia do autosamplera UPLC-MS.
      4. Dodaj próbki testowe (250 μL) do bursztynowych fiolek UPLC i umieść je w autosamplerze UPLC.
      5. Zrandomizuj wszystkie fiolki.
        UWAGA: Konfiguracja spektrometru mas, której użyliśmy, to hybrydowy spektrometr mas potrójny kwadrupol/liniowa pułapka jonowa sprzężony z UPLC, opisany w Uzupełniającej Tabeli 1. Inne platformy będą miały inne oprogramowanie i konfigurację, ale będą postępować według podobnych kroków w celu wykonania ilościowego oznaczania.
      6. Uruchom UPLC-MS, korzystając z ustawień szczegółowo opisanych w Uzupełniającej Tabeli 1, w zależności od konkretnej sondy do oznaczania.
      7. Użyj narzędzia „Quantitate - Build Quantitation method” w narzędziach do ilościowego oznaczania spektrometru mas (Tabela Materiałów), aby wygenerować krzywą kalibracyjną z pozyskanego standardu syntetycznego i standardu wewnętrznego.
      8. Użyj „Quantitation Wizard”, aby wybrać partię próbek i próbki do oznaczenia ilościowego, a następnie wykonaj „Quantitation Method”. Oprogramowanie do ilościowego oznaczania spektrometru mas wyświetla arkusz z wartościami ilościowymi docelowego związku w każdej próbce testowej.
    4. Sondy wykorzystujące metody oparte na luminescencji
      UWAGA: W handlu dostępne są sondy luminogenne do pomiaru zakresu aktywności CYP; jednak nie wszystkie nadają się do testów komórkowych. Przedstawiono tutaj protokół pomiaru aktywności CYP1A1/CYP1B1. CYP1A1/1B1 wybrano, aby zilustrować sposób badania aktywności indukowalnych CYP oraz podać przykład wykorzystania sond luminogennych jako alternatywy dla metod opartych na spektrometrii mas. Tabela 3 podsumowuje stężenia i czas inkubacji, których użyliśmy dla komórek dróg oddechowych i linii komórkowej wątrobowej; mogą one jednak wymagać dostosowania do innych typów komórek. Inne sondy luminogenne są dostępne w handlu i mogą być stosowane jako substraty dla różnych CYP.
      1. Przygotuj wystarczającą liczbę komórek, aby objąć kontrolę nieindukowaną, test indukowany oraz test indukowany + inhibitor. Przykład układu płytki pokazano na Rysunku 5B.
      2. Aby indukować CYP1A1/1B1, inkubuj komórki z końcowym stężeniem 10 nM TCDD w pożywce przez okres 72 h (odpowiednie mogą być również krótsze okresy od 24 do 48 h).
        OSTROŻNIE: TCDD jest kancerogenem i teratogenem. Stosuj odpowiedni sprzęt ochronny, zapoznaj się z kartą charakterystyki (MSDS) dostawcy i przeprowadź ocenę ryzyka przed użyciem.
      3. Po tym okresie usuń pożywkę, wypłucz dołki PBS-em 3 razy i dodaj świeżą pożywkę.
      4. Przed inkubacją komórek z luminogenną sondą reporterową, inkubuj wstępnie wyznaczoną podgrupę indukowanych komórek przez 30 min z końcowym stężeniem 10 μM inhibitora CYP1A1/1B1, α-naftoflavonu, w pożywce.
      5. Dodaj sondę luminogenną LUC-CEE (Luciferin 6'-chloroethyl ether) w końcowym stężeniu 50 μM do komórek nieindukowanych, indukowanych oraz indukowanych + inhibitor.
      6. Inkubuj przez 4 h w inkubatorze do hodowli komórkowej. Po zakończeniu czasu inkubacji zbierz pożywkę do ilościowego oznaczenia sondy luminogennej.
      7. Przenieś 25 μL pożywki hodowlanej do białej nieprzezroczystej płytki 96-dołkowej i dodaj 25 μL odczynnika do detekcji lucyferyny dostarczonego przez producenta. Inkubuj przez 20 min w temperaturze pokojowej. Odczytaj płytkę natychmiast za pomocą luminometru.
      8. Wypłucz komórki PBS-em i zlizuj je w celu całkowitego ilościowego oznaczenia białka.
        UWAGA: Krok ten jest opcjonalny, jeśli żywe komórki są zachowane do przyszłych eksperymentów. Należy jednak zauważyć, że induktory takie jak TCDD są toksyczne i uszkodzą komórki.

figure-protocol-4
Tabela 1: Lista sond metabolicznych, produktów i inhibitorów wraz z odpowiadającymi im enzymami. Wskazano również masę cząsteczkową oraz zalecane stężenia stosowane w komórkach dróg oddechowych i komórkach wątroby. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Sugerowany układ płytki 24-dołkowej do przeprowadzenia testu CYP. (A) Zalecany układ dla CYP wykazujących ekspresję konstytutywną obejmuje serię dołków na medium kontrolne (blank), sondę metaboliczną oraz sondę metaboliczną z inhibitorem. Układ ten można powielić zgodnie z liczbą testowanych punktów czasowych. (B) Przykładowy układ dla indukowalnych CYP obejmuje serię dołków na medium kontrolne, kontrolę z samą sondą metaboliczną, komórki indukowane (np. TCDD) inkubowane z sondami oraz komórki inkubowane z sondami i inhibitorem.

figure-protocol-6
Tabela 2: Rozcieńczenia standardów syntetycznych wykorzystanych do krzywych kalibracyjnych oraz odpowiadające im LOD i LOQ. Zakres rozcieńczeń może się różnić w zależności od platformy spektrometrii mas i jej czułości. W tym przypadku zastosowano hybrydowy spektrometr mas z potrójnym kwadrupolem i liniową pułapką jonową połączony z systemem UPLC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-protocol-7
Tabela 3: Sonda luminogenna, induktor i inhibitor dla testu CYP1A1/1B1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

Przykłady aktywności metabolicznej mierzonej dla dwóch par CYP (CYP1A1/1B1 i CYP2A6/2A13) w kulturach komórek dróg oddechowych od trzech różnych dawców (drogi oddechowe M360, M370, M417) oraz w linii komórek wątroby (Hep line) przedstawiono na Ryc. 620.

Aktywność CYP mierzona metodą luminometrii
Rycina 6A przedstawia względną luminescencję generowaną przez aktywność O-dealkilacji Luc-CEE (Luciferin 6'-chloroethyl ether) przez CYP1A1/1B1 w komórkach dróg oddechowych (3 dawcy) oraz komórkach wątrobowych z indukcją TCDD i bez niej. CYP1A1/1B1 są enzymami silnie indukowalnymi i zazwyczaj nie wykazują ekspresji konstytutywnej w większości tkanek. Jak widać na Rycini 6A, w przypadku braku indukcji komórek nie wykryto sygnału luminogenicznego. Po preinkubacji obu typów komórek z TCDD, silnym induktorem CYP1A1/1B1, stwierdzono wyraźny sygnał luminogeniczny w porównaniu z kontrolą (Rycina 6A). Wskazuje to na zmetabolizowanie sondy Luc-CEE, co prowadzi do uwolnienia frakcji lucyferyny, która jest następnie ilościowo oznaczana. Ogólnie aktywność linii komórek wątrobowych traktowanych TCDD jest niższa niż w przypadku komórek dróg oddechowych, nawet po normalizacji całkowitej ilości białka. Nie jest to zjawisko nietypowe, ponieważ linie komórkowe wykazują tendencję do niższej aktywności metabolicznej niż komórki pierwotne. Dodanie α-naphthoflavone wykazuje wyraźny efekt hamujący aktywność CYP1A1/1B1 we wszystkich typach komórek, co dodatkowo potwierdza zależność metabolizmu Luc-CEE od CYP.

Ilościowe oznaczanie metabolitów CYP450 przy użyciu UPLC-MS
Rysunek 6B przedstawia ilościowe oznaczanie aktywności CYP2A6/2A13 w komórkach dróg oddechowych od 3 dawców (Airway M343, M345, M347) oraz w komórkach wątrobowych (linia Hep) po inkubacji z kumaryną w obecności i w nieobecności inhibitora 8-metoksypsoralenu. Dane zostały znormalizowane względem całkowitej ilości białka. W kontroli z inkubacją kumaryny przez 0 min nie wykryto 7-hydroksykumaryny (Rysunek 6B). CYP2A6/2A13 są wyrażane konstytutywnie w niektórych tkankach, dlatego po 16 h inkubacji z kumaryną tworzenie 7-hydroksykumaryny jest wykrywalne w różnych badanych typach komórek, nawet bez indukcji. Po dodaniu 8-metoksypsoralenu, inhibitora CYP2A (Rysunek 6B), tworzenie 7-hydroksykumaryny jest znacznie zredukowane.

Należy zauważyć, że w obecności inhibitora CYP normalne jest wykrycie pewnej aktywności resztkowej, ponieważ inhibicja rzadko jest całkowita, a inne enzymy CYP mogą również rozpoznawać substrat, choć przetwarzać go znacznie mniej efektywnie. Można również zaobserwować, że zarejestrowana aktywność metaboliczna może różnić się w zależności od dawcy przy użyciu komórek pierwotnych, co jest widoczne w przypadku CYP2A6 w komórkach dróg oddechowych (Ryc. 6B). Jest to zjawisko oczekiwane, ponieważ aktywność CYP zależy od genotypu i polimorfizmów każdego dawcy.

figure-results-1
Rycina 6: Wyniki testu aktywności dla CYP1A1/1B1 (A) oraz aktywności CYP2A6/2A13 (B) w linii komórek wątrobowych oraz u trzech dawców komórek dróg oddechowych (M360, M370, M417). (A) Aktywność dealkilacji Luc-CEE przedstawiono z indukcją i bez indukcji CYP1A1/1B1 za pomocą TCDD. Jako inhibitor CYP1A1/1B1 zastosowano α-naftoflavon. Aktywność wyrażono w relatywnych jednostkach luminescencji (RLU) znormalizowanych względem czasu inkubacji w minutach (min) i całkowitej ilości białka (mg). (B) CYP2A6/2A13 nie wymagają indukcji, ponieważ są one ekspresjonowane konstytutywnie. Aktywność 7-hydroksylacji kumaryny w pmol/min/mg białek przedstawiono w różnych punktach czasowych z inhibitorem 8-metoksypsoralenem i bez niego. Wszystkie wyniki przedstawiono jako wartość średnią z trzech niezależnych pomiarów wraz z odchyleniem standardowym średniej. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Baxter20.

Tabela uzupełniająca 1: Ustawienia UPLC i spektrometru mas. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Obecnie wiele znormalizowanych systemów badań toksykologicznych wykorzystuje zmodyfikowane bakterie, linie komórkowe lub komórki embrionalne, które nie są reprezentatywne dla normalnego metabolizmu człowieka1. Może to prowadzić do niedokładnych przewidywań potencjalnej toksycznej aktywności substancji chemicznej lub leku. Innowacyjne modele in vitro, takie jak hodowle komórkowe 3D i narządy na chipie, są opracowywane w celu lepszego odtworzenia normalnej morfologii i aktywności metabolicznej tkanek ludzkich 21,22,23. Kompetencja metaboliczna jest jednym z kryteriów, które można wykorzystać do rozszyfrowania, które modele najlepiej nadają się do oceny toksykologicznej i badań nad biotransformacją leków.

Protokół, który przedstawiliśmy w tym artykule, ma na celu pomiar aktywności enzymów CYP przy użyciu żywych komórek. Jest elastyczny i może być stosowany w różnych systemach komórkowych w hodowlach 2D lub 3D i oferuje możliwość zastosowania podejścia opartego na sondzie luminogenicznej lub spektrometrii mas. Obie metody są wystarczająco czułe, aby wykryć nanogramowe ilości materiałów i wymagają jedynie niewielkiej liczby komórek hodowanych w formacie wielodołkowym. Mogą być również stosowane do komórek sferoidalnych lub hodowanych w złożonych matrycach. Wybór podłoża sondy jest oczywiście krytycznym elementem protokołu. Specyficzność testu opiera się na tym, że sonda jest selektywna w stosunku do enzymu CYP, a kolejną warstwę pewności można uzyskać poprzez zastosowanie selektywnego inhibitora CYP. Substraty i inhibitory wymienione w tej pracy to tylko kilka przykładów, ale inne można znaleźć w literaturze.

Ważne jest, aby wziąć pod uwagę wielokrotne czasy inkubacji podczas pracy z nowym typem komórki, ponieważ ujemny wynik aktywności CYP może być spowodowany ekspresją enzymu na niskim poziomie. Dodanie typu ogniwa, które może być użyte jako kontrola pozytywna, jest wskazane, aby upewnić się, że wynik ujemny nie jest związany z problemem technicznym i pomóc w rozwiązywaniu problemów. Pierwotne komórki wątroby są metabolicznie kompetentne i mogą być stosowane jako kontrola, na przykład pierwotne hepatocyty w zawiesinie są bardzo łatwe w użyciu, ale ich żywotność jest ograniczona w czasie. Linie komórkowe wątroby są możliwą alternatywą, która jest stosunkowo łatwa w użyciu, jak opisano w niniejszym protokole, ale niektóre są lepsze od innych pod względem aktywności metabolicznej 6,21.

Ponieważ test jest nieniszczący, o ile białko całkowite nie zostanie określone ilościowo, możliwe jest śledzenie aktywności CYP w czasie w badaniach podłużnych20. Jest to ważny punkt, ponieważ niektóre komórki będą miały zmienną aktywność CYP w czasie w hodowli. Wynik ujemny może być związany z brakiem zbieżności, postępem w różnicowaniu lub odróżnicowaniu in vitro. W takim przypadku podejście jest półilościowe, ponieważ dane nie są normalizowane przez całkowitą ilość białka w każdej kulturze komórkowej. Nie zawsze jest możliwe lub zalecane ponowne wykorzystanie tkanki po zmierzeniu aktywności CYP, ponieważ narażenie na sondy, inhibitory lub induktory może mieć toksyczny wpływ na tkankę, jak ma to miejsce w przypadku TCDD.

Frakcje komórkowe, takie jak mikrosomy, mogą być również wykorzystane do scharakteryzowania aktywności CYP danego typu komórki. Preparaty mikrosomowe wymagają jednak dużej ilości materiału komórkowego, dodania odpowiednich kofaktorów i buforu, aby enzymy pozostały aktywne. Korzystanie z żywych komórek eliminuje skomplikowany etap przygotowania mikrosomów i ustalenia, które i kofaktory działają najlepiej.

Ogólnie rzecz biorąc, najlepszą praktyką jest dalsze scharakteryzowanie profilu ekspresji CYP w hodowlach komórkowych w celu sprawdzenia, czy odpowiada on aktywności enzymatycznej. Ten dodatkowy poziom weryfikacji jest zalecany, biorąc pod uwagę, że sondy metaboliczne nie są całkowicie specyficzne dla pojedynczego CYP i daje to większą pewność, że zmierzona aktywność metaboliczna jest dopasowana do odpowiedniej ekspresji enzymu. Ponieważ CYP są białkami błonowymi, stosunkowo trudno jest je przygotować do zachodnich plam, dlatego preferowanym podejściem do profilowania tych enzymów jest ilościowy RT-PCR20.

Należy zauważyć, że protokół ten opisuje metodę oznaczania aktywności enzymu CYP, która reprezentuje tylko jedną rodzinę enzymów metabolicznych, aczkolwiek ważną. Elastyczność podejścia opartego na spektrometrii mas pozwala na opracowanie metod akwizycji dla innych przemian metabolicznych substratów sondy. Muszą one być jednak opracowywane pojedynczo, a obecnie znanych jest mniej specyficznych sond i selektywnych inhibitorów dla innych rodzin enzymów metabolicznych. Luka ta powinna zostać wypełniona, aby umożliwić kompleksową ocenę kompetencji metabolicznych systemów komórkowych in vitro .

Oświadczenia

A.B. i E.M. byli pracownikami British American Tobacco w czasie, gdy ten rękopis został napisany. Praca opisana w tym manuskrypcie została sfinansowana przez British American Tobacco, a opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez British American Tobacco.

Podziękowania

Autorzy dziękują Epithelix Sarl i Biopredic International za dostarczenie mikrofotografii komórek dróg oddechowych i komórek wątroby oraz Neilowi Smithowi za rysunek ilustrujący procedurę eksperymentalną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik & Komórki
2 μ m filtr strzykawkowyWhatmanUN203NPEORG
24-dołkowa płytkaCorning3524
4-metylolumbelliferonSigma AldrichM1381
5-fenylopentynSigma AldrichCD5001437
6-hydroksybupropionSigma AldrichH3167
6-hydroksychloroksazamidSigma AldrichUC148
7-etoksykumarynaSigma Aldrich195642
7-hydroksykumarynaSigma AldrichH24003
8-metoksypsoralenSigma AldrichM3501
kwas octowySigma Aldrich695092
acetonitrylFisherA/0626/17
&alfa;-naftoflawonSigma Zestaw BCA AldrichN5757
Thermo Scientific23227
b-glukuronidaza/arylosulfatazaSigmaAldrich G0876
BupropionSigma AldrichB102
KarbamazepinaSigma AldrichC4024
chlorzoksazonSigma AldrichC4397
kolagenCell Systems5005-B
kumarynaSigma AldrichC4261
disulfiramSigma Aldrich86720
fluwoksaminaSigma AldrichF2802
Glutamax (suplement glutaminy)Fisher35050061
Suplement metabolizmu HepaRGMerckMMAD621
Rozmrażanie HepaRG suplement dietyMerckMMADD671
HepaRGMerckMMHPR116
Luciferin-CEEPromegaV8751
metanolFisherM/4056/17
Komórki dróg oddechowych MucilAirNabłonekEP01
Pożywka do konserwacji komórek dróg oddechowych MucilAirNabłonekEP04MM
Phenomenex Kinetex 2.6 μ m, PFP 100APhenomenex00B-4477-AN
TCDDSigma Aldrich48599
thioTEPASigma AldrichT6069
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µ m 2,1 x 50 mmWody86003538
Williamsa E mediaFisher17704-024
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Equipment
UPLCWaters Acquity
QTRAP MSSciex Oprogramowanie ABI Sciex 4000
QTRAP MSSciex Analityk 1.4.2
luminometrUrządzenia molekularneSpectraMax M3
Urządzenia molekularneLicznik komórek SpectraMax M3
Beckman CoulterVi-Cell XR
EppendorfEppendorf-5301
Spektrofotometr Wyparka obrotowa

Bibliografia

  1. Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , 1-31 (2016).
  2. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  3. Lewis, D. F. 57 varieties: the human cytochromes P450. Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).
  4. Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. Phase II drug metabolizing enzymes. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).
  5. Dekant, W. The role of biotransformation and bioactivation in toxicity. EXS. 99, 57-86 (2009).
  6. Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies. Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).
  7. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).
  8. Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers. Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).
  9. Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
  10. Kuehn, D., et al. Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke. J. Vis. Exp. , (2015).
  11. Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).
  12. Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2. Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).
  13. Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).
  14. Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico. Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).
  15. Kartha, J. S., Yost, G. S. Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes. Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).
  16. Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).
  17. Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1. Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).
  18. Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli. Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).
  19. Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf (2013).
  20. Baxter, A., et al. Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia. Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).
  21. Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs. Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).
  22. Li, Z., et al. Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip. Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).
  23. Takahashi, Y., et al. Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Biosci. Rep. , (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metabolizm fazy Iaktywno enzym w CYPspektrometria mas UPLCluminogenna sonda raportuj cahodowle linii kom rkowychpierwotne hodowle 3Dsubstraty w postaci sond chemicznychtest inhibicji enzymatycznejilo ciowe oznaczanie produkt w metabolicznychtesty cytochromu P450

Powiązane artykuły