Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

18.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55504

⸱

26 maja 2017

 ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Streszczenie

Kinazy białkowe są w stanie zarządzać zmianami komórkowymi na dużą skalę w odpowiedzi na złożone zestawy bodźców, a wiele wysiłku włożono w odkrycie allosterycznych szczegółów ich regulacji. Kinazy składają się z sieci sygnałowych, których defekty są często cechami charakterystycznymi wielu form raka i chorób pokrewnych, co sprawia, że platforma testowa jest podatna na manipulację czynnikami regulacyjnymi i walidację wymagań dotyczących reakcji, co ma kluczowe znaczenie w poszukiwaniu ulepszonych środków terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy podstawowy test kinazy, który można łatwo dostosować do konkretnych pytań eksperymentalnych, w tym między innymi do testowania działania czynników biochemicznych i farmakologicznych, manipulacji genetycznych, takich jak mutacja i delecja, a także warunków hodowli komórkowej i zabiegów w celu zbadania mechanizmów sygnalizacji komórkowej. Test ten wykorzystuje znakowane radioaktywnie [γ-32P] ATP, co pozwala na porównania ilościowe i przejrzystą wizualizację wyników, a także może być modyfikowane do stosowania z immunoprecypitowaną lub rekombinowaną kinazą, specyficznymi lub typowymi substratami, w szerokim zakresie warunków reakcji.

Wprowadzenie

Kinazy białkowe to zaawansowane enzymy niezbędne do przekazywania sygnałów komórkowych do odpowiednich odpowiedzi1. Biorąc pod uwagę ich rolę w utrzymaniu homeostazy i zapobieganiu lub promowaniu stanów chorobowych2, biochemiczne metody oceny aktywności kinaz nadal są potężnymi narzędziami do określania szczegółów sygnalizacji eukariotycznej3. Chociaż strategie wykorzystujące przeciwciała specyficzne dla fosfony były bardzo pouczające pod względem pomiaru wpływu różnych warunków leczenia na stan sygnalizacji komórkowej4, test kinazy pozwala na pomiar skutków różnych warunków leczenia bezpośrednio pod względem aktywności enzymatycznej kinazy będącej przedmiotem zainteresowania. Chociaż istnieje kilka opcji podobnych testów, które nie wykorzystują materiałów radioaktywnych5, nadal polegamy na tej metodzie w celu uzyskania solidnej oceny ilościowej wyników. Istnieją dwa typowe zastosowania tego testu, oba cenne z różnych powodów: test kinazy immunoprecypitowanej (IP) (ryc. 1) i test rekombinowanej kinazy białkowej (ryc. 2).

Test kinazy IP jest niezwykle przydatny do identyfikacji czynników zdolnych do aktywacji określonych kinaz białkowych, jak również do oceny warunków leczenia hamującego. Krótko mówiąc, kinaza znakowana epitopem, będąca przedmiotem zainteresowania, jest transfekowana do hodowanych komórek eukariotycznych, poddawana różnorodnym zabiegom, immunoprecypitowana i testowana pod kątem zdolności do włączenia znakowanego radioaktywnie fosforanu do modelowego substratu (np. zasadowego białka mieliny (MBP)). Test kinazy IP można również przeprowadzić bez uciekania się do nadekspresji, zarówno poprzez immunoprecypitację endogennego białka, jak i dowolną liczbę technik edycji genomu. Ponieważ zabiegi są podawane w hodowli, metoda ta może wykrywać stymulacje przenoszone przez wiele czynników poprzedzających lub równoległe ścieżki poprzez odczyt in vitro. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że nie wymaga ona wcześniejszej wiedzy na temat bezpośrednich czynników poprzedzających lub następujących po niej lub znajdujących się w nich miejsc fosforylacji. Ponadto, po zidentyfikowaniu określonych substratów dla kinazy będącej przedmiotem zainteresowania, ten sam protokół oznaczania kinaz może być stosowany ze składnikami rekombinowanymi do pomiaru specyficznej aktywności w stosunku do naturalnych substratów i identyfikacji określonych miejsc fosforylacji w połączeniu z analizą spektrometrii mas. Miejsca zidentyfikowane w ten sposób mogą być dalej weryfikowane za pomocą testów kinaz wykorzystujących mutanty substratów. Wreszcie, metoda ta może być również stosowana do wykrywania i pomiaru autofosforylacji.

Protokół tutaj przedstawiony zakłada albo zoptymalizowany schemat oczyszczania białka, albo metodę transfekcji do wyrażania kinazy o powinowactwie w hodowanych komórkach. Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat protokołów transfekcji, lizy, immunoprecypitacji i oczyszczania białek, sugerujemy zapoznanie się z Cold Spring Harbor Protocols6. Więcej informacji na temat opracowywania i modyfikacji testów można znaleźć w artykule Fosforylacja białek: wybrane metody w enzymologii7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zasoby do oczyszczania kinaz i ogólny rurociąg immunoprecypitacji

UWAGA: Kinazy do użycia z tym testem mogą być pozyskiwane z immunoprecypitatów hodowanych komórek lub za pomocą środków rekombinowanych, takich jak oczyszczanie z tagiem powinowactwa6. Poniżej znajduje się ogólny protokół immunoprecypitacji oznaczonej flagą, który może wymagać modyfikacji w zależności od kinazy będącej przedmiotem zainteresowania. Jeśli to możliwe, wszystko powinno być trzymane na lodzie.

  1. Dodać 2 μl przeciwciała 1 mg/ml do 200 μl lizatów komórkowych (zwykle ~1 mg/ml całkowitego stężenia białka) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę podczas kołysania.
  2. Przemyć kulki sefarozy białka A 2-3 razy buforem do lizy (patrz poniżej), krótko wirując w temperaturze 4 °C przez 30 s do 1 minuty przy 5 000 x g ("wirowanie dotykowe"), usuwając supernatant pipetą i ponownie umieszczając kulki w buforze.
    1. Przygotuj bufor do lizy: 50 mM HEPES pH 7,7, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% glicerol, 0,2 mM ortowanadan sodu, 100 mM fluorek sodu, 50 mM β-glicerofosforan, 0,1% Triton X 100 lub 0,1% NP-40.
  3. Dodać 30 μl 50% zawiesiny białka A sefarozy w buforze do lizy do lizaty; inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę podczas kołysania.
  4. Odwirować w temperaturze 4 °C, aby obrać granulki i usunąć supernatant.
  5. Przemyć 3 razy 1 ml buforu do płukania kulek (1 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,4).
  6. Przemyć raz 1x buforem reakcyjnym kinazy (10 mM HEPES pH 8,0, 10 mM MgCl2). Usuń jak najwięcej bufora bez usuwania koralików.

2. Inicjalizacja reakcji kinazy

UWAGA: Dla testów kinazy IP, ~15 μL niezawieszonych kulek to typowa próbka wyjściowa. W przypadku testów rekombinowanej kinazy białkowej typowe ilości wyjściowe wahają się od 0,1-1,0 μg w 1-10 dla 25-50 μl końcowych objętości reakcji. Dostosuj objętość rekombinowanych próbek białek tak, aby była równa buforowi, w którym są przechowywane, przed inicjalizacją testu. W przypadku stosowania dużych ilości kinazy należy dołączyć białko nośnikowe, takie jak BSA, aby pomóc w utrzymaniu stabilności białka przez cały czas trwania testu.

  1. Przygotuj 5-krotny bufor reakcyjny kinazy podany poniżej:
    50 mM HEPES pH 8,0
    50 mM MgCl2
    50 mM Benzamidyna (inhibitor proteazy)
    50 mM DTT (środek redukcyjny)
    250 μM ATP (nieoznakowane lub "zimne")
  2. Próbki kinaz należy przechowywać na lodzie w probówkach o pojemności 1,5 ml. Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną w oddzielnych, schłodzonych probówkach o pojemności 1,5 ml:
    21 μL H2O
    6 μL 5x bufor reakcyjny kinazy
    1 μl znakowanego radioizotopowo ("gorącego") ATP
    2 μL substratu (~5 mg/mL)
    UWAGA: W przypadku testów kinaz rekombinowanych objętość można dostosować, aby pomieścić oczyszczone białko. Obliczyć tak, aby końcowa objętość reakcji wynosiła 30 μl. Użyj tego przepisu, aby przygotować mieszankę wzorcową. Po otrzymaniu znakowanego ATP rozcieńczyć materiał wH2Odo określonej aktywności 0,01 mCi/μL przed dodaniem do mieszaniny reakcyjnej.
  3. Aby zainicjować test, dodać całą mieszaninę reakcyjną do próbki kinazy i inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 5 minut do 1 godziny, w zależności od aktywności oznaczanej kinazy.
    UWAGA: Podczas pracy z kinazą, której aktywność nie została wcześniej oznaczona, należy wykonać przebieg czasowy aktywności kinazy z 5-minutowymi przerwami między punktami czasowymi.

3. Zakończenie reakcji i SDS-PAGE

  1. Zatrzymaj reakcję, umieszczając ją na lodzie i dodając 7,5 μl 5x bufor próbki Laemmli 6.
  2. Podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 30 s do 2 minut w bloku grzewczym.
  3. Odwiruj dotykowo i załaduj 20 μl na studzienkę 10-15% żelu SDS-PAGE. Uruchom żel wystarczająco długo, aby oddzielić kinazę i substrat (zwykle 1 godzinę przy stałej mocy 5 W) Upewnij się, że aparat żelowy jest ekranowany, aby ograniczyć ekspozycję do 32P.
    1. Tutaj użyj domowych aparatów żelowych, ale standardowe dostępne na rynku mini-żele są doskonale odpowiednie. Użyj wymiarów w następujący sposób:
      Żele: 8 cm szerokości, 5,5 cm długości (rozdzielcze), grubość 1,5 mm.
      Grzebienie: 15 dołków, grubość 1,5 mm, szerokość 2,9 mm, głębokość 16 mm

4. Barwienie i suszenie żelu

Uwaga: Dla wszystkich kroków upewnij się, że zmniejszysz osobiste narażenie na 32P poprzez użycie radioaktywnego ekranu i noszenie osobistego sprzętu ochronnego. Aby uzyskać więcej informacji na temat konkretnych kroków, dołączono kilka pomocnych odniesień.

  1. Usuń żel ze szklanych płytek / tlenku glinu i umieść w 50 ml barwnika Coomassie (10% lodowatego kwasu octowego, 50% metanolu, 0,25% barwnika R-250) na 1 godzinę na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 50 obr./min. Do tego kroku użyj pojemnika, który jest nieco większy niż sam żel. 8
  2. Przenieś żel z plamy do roztworu utrwalającego (10% lodowatego kwasu octowego, 20% metanolu) w celu odbarwienia. Ubijaj żel w 600-700 ml roztworu utrwalającego przez noc na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min. Umieść kawałki pianki lub zawiązanych chusteczek laboratoryjnych w pojemniku z żelem, aby wchłonąć barwnik Coomassie 8,9.
  3. Usuń żel z roztworu utrwalającego i moczyć w 200 ml metanolu przez 1-2 minuty, delikatnie mieszając, aż żel zmieni kolor na mlecznobiały. Pomoże to zapobiec pękaniu na etapie suszenia.
  4. Zwilż kawałek wysokiej jakości bibuły filtracyjnej o wymiarach 14 cm x 14 cm metanolem i umieść na suszarce próżniowej z żelem do płyt. Połóż żel na bibule filtracyjnej z przodu skierowaną do góry.
  5. Ostrożnie przykryj żel folią, aby uniknąć zmarszczek i pęcherzyków powietrza. Uruchom suszarkę na 1,5 godziny w temperaturze 80 °C. Po osiągnięciu próżni otwórz pokrywę i w razie potrzeby rozwałkuj wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą miękkiej gumowej ściernicy.

5. Autoradiogram i zliczenia scyntylacyjne

  1. Usuń zaschnięty żel i przymocuj marker autorad, fosforyzującą linijkę lub kropki do bibuły filtracyjnej z boku żelu. Jeśli używasz kropek, upewnij się, że są one w asymetrycznym wzorze. Spowoduje to wyrównanie żelu z filmem po naświetleniu i wywołaniu.
  2. Użyj licznika Geigera, aby sprawdzić intensywność sygnału. W przypadku słabszych sygnałów ekspozycja w temperaturze od -70 °C do -80 °C z ekranem intensyfikującym zwiększy gęstość pasma filmu.
  3. W ciemnym pomieszczeniu umieść wysuszony żel w kasecie filmowej z folią i ekranem intensyfikującym w następującej kolejności od góry do dołu: żel, folia, ekran intensyfikujący.
  4. Przymocuj sitko intensyfikujące do pokrywy kasety i przyklej żel taśmą, aby ułatwić ten krok. Ekran intensyfikujący emituje światło, gdy jest naświetlany przez cząstki beta z 32P. Te emisje światła wnikają w folię skuteczniej niż cząstki beta.
    1. Upewnij się, że długość fali emitowanej z ekranu intensyfikującego odpowiada długości fali, na którą film jest najbardziej wrażliwy.
    2. Użyj licznika Geigera, aby określić, na jak długo należy pozostawić ekspozycję: jeśli liczba cpm wynosi ~100 lub mniej, spróbuj przez noc w temperaturze -70 °C. Jeśli liczba wynosi ~10 000, zacznij od 1-godzinnej ekspozycji i od tego momentu optymalizuj.
  5. Po zakończeniu naświetlania usuń film i wywołaj w procesorze filmów medycznych/rentgenowskich. Jeśli naświetlanie przeprowadzono w temperaturze od -70 do -80 °C, pozwól kasecie ogrzać się do temperatury pokojowej, aby zminimalizować kondensację na kliszy, lub usuń film bezpośrednio przed utworzeniem kondensacji10.
  6. Połóż folię na wysuszonym żelu/bibule filtracyjnej i wyrównaj obraz markera/kropek z markerami/kropkami na wysuszonym żelu. Zaznacz na folii prążki odpowiadające wzorcom białka. Oznacz wzorce białek i pasy, w których występują reakcje, aby móc z nich skorzystać w przyszłości.
  7. Usunąć z żelu pasma odpowiadające pasmom będącym przedmiotem zainteresowania na folii i umieścić je w fiolkach scyntylacyjnych o pojemności 7 ml. Dodaj 4 ml płynu scyntylacyjnego i policz za pomocą licznika scyntylacji cieczy. Upewnij się, że licznik jest ustawiony na monitorowanie prawidłowego okna widma energii dla 32P.
    UWAGA: Pamiętaj również, aby wyciąć pasmo odpowiadające substratowi z pasa kontroli bez kinazy. Zostanie to wykorzystane do obliczenia promieniowania tła, które zostanie odjęte od wszystkich zliczeń scyntylacyjnych próbki.

6. Analiza wyników

UWAGA: Autoradiogram dostarcza jakościowej wizualizacji wyników. W celu dokładnego określenia ilościowego można zmierzyć inkorporację 32P za pomocą licznika scyntylacyjnego. Dane są zwykle wyrażane w kategoriach względnej aktywności, jak pokazano na rysunku 1B. Tak długo, jak utrzymywane są jednolite warunki dla wszystkich próbek, względne pomiary specyficznej aktywności są wystarczające do porównania zabiegów.

  1. Obliczając bezwzględne wartości aktywności właściwej, należy przeprowadzić rygorystyczną optymalizację wszystkich warunków reakcji, w tym stężeń kinazy, substratu i zimnego ATP, w celu zapewnienia liniowego zakresu aktywności w czasie (np. 2 x [kinaza] = 2 x aktywność właściwa). W przypadku kinaz o wysokiej aktywności właściwej należy wykonać testy ze zwiększonym stężeniem substratu w przypadku, gdy aktywność kinazy jest ograniczona przez ilość substratu.
  2. Obliczyć aktywność właściwą kinazy będącej przedmiotem zainteresowania w jednostkach nanomoli fosforanu przenoszonego na minutę na kinazę mg.
    1. Odejmij puste miejsca od cpm w zliczonych pasmach.
    2. Oblicz rozpad gorącego ATP: [(1/2)^(t / t1/2)] x 0,95 gdzie t to liczba dni od daty referencyjnej (powinna być podana przez dostawcę), t1/2 to okres półtrwania 32P, który wynosi 14,3 dnia, a 0,95 odzwierciedla wydajność licznika scyntylacyjnego. Przykład: jeśli używasz gorącego ATP, który ma 28 dni, wartość rozpadu powinna wynosić 0,245.
    3. Obliczyć pikole (pmol) całkowitego ATP w teście (zwykle jest to równe ilości zimnego ATP w reakcji): objętość testu (μL) x [zimne ATP] (μM) = całkowite ATP (pmols). Przykład: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol
    4. Obliczać cpm/pmol ATP: [μL gorącego ATP x (2,2 x 107) x współczynnik rozpadu]/ pmol zimnego ATP.
      UWAGA: Wartość 2,2 x 107 konwertuje 0,01 mCi/μL ATP na cpm.
    5. Obliczyć ilość kinazy w teście w mg. Zarówno w przypadku kinazy rekombinowanej, jak i kinaz immunoprecypitowanych, do określenia stężeń wyjściowych odpowiednie są standardowe metody, takie jak testy BCA. Przykład: wtERK2 0,0002 μg/μL w reakcji kinazy 50 μL wynosi 0,01 μg, czyli 1 x 10-5 mg.
    6. Oblicz całkowitą cpm w teście. Zebrać 30 μl reakcji i przeprowadzić 20 μl z każdej reakcji na żelu. Pomnóż zliczoną wartość cpm (po odjęciu ślepej próby) przez współczynnik całkowitej objętości testu/objętości załadowanego testu. Kontynuując powyższy przykład, pomnóż wszystkie liczby przez 1,5 lub 30/20.
    7. Obliczyć aktywność specyficzną badanej kinazy:
      Całkowity cpm w teście)/(cpm/pmol ATP)/(czas testu w minutach)/(ilość kinazy w mg)
      UWAGA: Podzielenie powyższej wartości przez 1,000 daje aktywność właściwą w nanomolach/minutę/mg
  3. Oblicz, ile moli fosforanu jest włączonych do substratu (o ile znana jest jego masa cząsteczkowa). Służy to do określenia liczby fosfozytów w danym białku po zakończeniu reakcji.
    Całkowita cpm w teście)/(cpm/pmol ATP)]/(ilość substratu w pmols)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analizy kinazy WNK1 po immunoprecypitacji

WNK1 z tagiem Myc przetransfekowano do komórek HEK293 i wyprecypitowano immunologicznie za pomocą przeciwciała anty-Myc1. Immunoprecypitat wykazał aktywność kinazową wobec substratu modelowego MBP, a także autokinazę (Rysunek 1A). Następnie w ten sam sposób przetestowano aktywność kinazową mutantów WNK1 wobec MBP, wykorzystując tym razem konstrukty z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kinazy to zróżnicowana rodzina białek, które rozwinęły rozległą funkcjonalność w wielu kontekstach, a testy kinaz były niezwykle przydatne w badaniu kilku białek sygnałowych i znacznie przyczyniły się do naszego obecnego zrozumienia komunikacji komórkowej. Warto zauważyć, że ten sam podstawowy test został użyty do scharakteryzowania dwóch różnych kinaz pomimo dużych różnic w strukturze i aktywności. Kinaza WNK1 zawiera nietypową kieszeń katalityczną, w której krytyczna lizyna przesunęła się do unikalnej pozycji i wiadomo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują wszystkim obecnym i byłym członkom laboratorium Cobba za cenną pracę i dyskusje, a Dionne Ware za pomoc administracyjną. Badania te były wspierane przez National Institutes of Health Grant R37 DK34128 oraz Welch Foundation Grant I1243 dla M.H.C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Białko A Sefaroza CL-4BGE Healthcare Life Sciences17-0963-03
Znakowane radioaktywnie [γ-32P] ATPPerkin ElmerNEG035C010MC
Laemmli BufferBio-Rad#1610737
Ekranowanie radioaktywneProdukty MiędzynarodoweBR-006
Barwnik R-250 (Coomassie)Thermo Fisher20278
Jakościowa bibuła filtracyjna Whatman Grade 3Whatman1003-917
Suszarka próżniowa z żelem do płytBio-RadModel 583 Suszarka żelowa #1651745 
Marker AutoradAgilent Technologies420201
Linijka fosforyzującaSigma AldrichR8133
Kropki fosforyzująceSigma AldrichL5149
Licznik GeigeraLudlumModel 3 z detektorem
BioMax Kaseta 8 x 10"Carestream Health107 2263
BioMax Folia MS 8" x 10"Carestream Health829 4985
Ekran wzmacniający BioMax MS 8" x 10"Carestream Health851 8706
Procesor filmów medycznych/rentgenowskichKonica MinoltaSRX-101A
Fiolki scyntylacyjneResearch Products International125500
Płyn scyntylacyjnyMP Biomedicals188245305
Beckman LS 6500 Licznik scyntylacyjnyBeckmanLS 6500
44-9

Bibliografia

  1. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
  2. Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33(2016).
  3. Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
  4. Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
  5. Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
  6. Cold Spring Harbor Protocols. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2016).
  7. Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215(1999).
  8. Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. , Available from: http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html (2007).
  9. Autoradiography. , Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011).
  10. Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. , 3 edn, Humana Press. (2009).
  11. Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
  12. McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).
  13. Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11(2011).
  14. Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669(2013).
  15. Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza kinazy bia kowejimmunoprecypitacjael SDS PAGEautoradiografialiczenie scyntylacyjnepomiar aktywno ci kinazysubstraty ERK2detekcja radiacyjnasygnalizacja kom rkowa
Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.