Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55507

⸱

18 kwietnia 2017

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC), 2Neuroscience Graduate Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje metody zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzeniowych zarodków i larw danio pręgowanego. Preparat utrzymuje neurony in situ i często wiąże się z minimalnym rozwarstwieniem. Metody te pozwalają na badanie elektrofizjologiczne różnych neuronów rdzeniowych, od początkowego nabycia pobudliwości elektrycznej do wczesnych stadiów larwalnych.

Streszczenie

Danio pręgowany, po raz pierwszy wprowadzony jako model rozwojowy, zyskał popularność w wielu innych dziedzinach. Łatwość hodowli dużej liczby szybko rozwijających się organizmów, w połączeniu z embrionalną przejrzystością optyczną, posłużyła jako początkowe przekonujące atrybuty tego modelu. W ciągu ostatnich dwóch dekad sukces tego modelu był dodatkowo napędzany przez jego zdolność do badań przesiewowych mutagenezy na dużą skalę oraz łatwość transgenezy. Ostatnio metody edycji genów rozszerzyły możliwości tego modelu.

Dla badań neurorozwojowych, zarodek i larwa danio pręgowanego stanowią model, do którego można zastosować wiele metod. Tutaj skupiamy się na metodach, które pozwalają na badanie podstawowej właściwości neuronów, pobudliwości elektrycznej. Nasze przygotowanie do badania elektrofizjologicznego neuronów rdzeniowych danio pręgowanego polega na zastosowaniu kleju do szwów weterynaryjnych w celu przymocowania preparatu do komory rejestracyjnej. Alternatywne metody rejestracji z zarodków i larw danio pręgowanego polegają na przymocowaniu preparatu do komory za pomocą cienkiego wolframowego pinu1,2,3,4,5. Trzpień wolframowy jest najczęściej używany do mocowania preparatu w orientacji bocznej, chociaż był używany do mocowania larw grzbietowo do góry4. Klej do szwów został użyty do montażu zarodków i larw w obu orientacjach. Za pomocą kleju można przeprowadzić minimalną sekcję, umożliwiając dostęp do neuronów rdzeniowych bez stosowania leczenia enzymatycznego, unikając w ten sposób powstałych uszkodzeń. Jednak w przypadku larw konieczne jest zastosowanie krótkiej terapii enzymatycznej w celu usunięcia tkanki mięśniowej otaczającej rdzeń kręgowy. Opisane tutaj metody zostały wykorzystane do zbadania wewnętrznych właściwości elektrycznych neuronów ruchowych, interneuronów i neuronów czuciowych na kilku etapach rozwoju6,7,8,9.

Wprowadzenie

George Streisinger był pionierem w użyciu Danio rerio, powszechnie znanego jako danio pręgowany, jako modelowego systemu do analizy genetycznej rozwoju kręgowców10. Model oferuje kilka zalet, w tym: (1) stosunkowo prostą i niedrogą hodowlę zwierząt; (2) zapłodnienie zewnętrzne, umożliwiające łatwy dostęp do zarodków od najwcześniejszych stadiów rozwojowych; oraz (3) przezroczysty zarodek, umożliwiający bezpośrednie i wielokrotne obserwacje komórek, tkanek i narządów w trakcie ich formowania.

W ciągu następnych dziesięcioleci, kilka postępów jeszcze bardziej zwiększyło moc modelu danio pręgowanego. W szczególności badania genetyczne i sekwencjonowanie całego genomu odegrały kluczową rolę w identyfikacji mutacji i genów krytycznych dla wielu procesów rozwojowych11,12,13,14,15,16. Metody klonowania bramek pozwoliły na rutynowe stosowanie podejść transgenicznych17,18. Ostatnie postępy w edycji genomu, których przykładem są nukleazy podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN) i zgrupowane w regularnych odstępach krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)-Cas9, pozwalają na ukierunkowane wprowadzanie mutacji, a także podejścia knock-out i knock-in19,20,21,22. Połączenie tych metod sprawia, że danio pręgowany jest potężnym modelem do badania mechanizmów genetycznych leżących u podstaw określonych zachowań i kilku chorób ludzkich23,24,25,26,27.

Ta praca skupia się na regulacji rozwoju i roli aktywności elektrycznej w rozwoju neuronów. Nacisk kładziony jest na rdzeń kręgowy, dla którego model danio pręgowanego ma kilka zalet. Po pierwsze, dostęp do danio pręgowanego w stadium embrionalnym i larwalnym jest stosunkowo łatwy; W związku z tym można badać funkcję rdzenia kręgowego w stadiach rozwojowych, które mają mniej neuronów i prostsze obwody28,29. Co więcej, rdzeń kręgowy danio pręgowanego ma zróżnicowany zestaw neuronów, podobny do innych kręgowców, o czym świadczą charakterystyczne i wyróżniające wzorce czynników transkrypcyjnych30,31,32,33,34,35.

Większość badań nad danio pręgowanymi, które mają na celu odkrycie mechanizmów leżących u podstaw funkcji obwodów rdzenia kręgowego, zwłaszcza tych, które wspierają lokomocję, są, co zrozumiałe, skoncentrowane na stadiach larwalnych36,37,38,39,40,41,42,43. Jednak wiele neuronów tworzących sieci lokomotoryczne rdzenia inicjuje swoje różnicowanie we wczesnych stadiach embrionalnych, ~9-10 godzin po zapłodnieniu (hpf)44,45,46,47,48,49,50,51. W związku z tym zrozumienie, w jaki sposób powstają i zmieniają się właściwości morfologiczne i elektryczne neuronów rdzeniowych między stadiami embrionalnymi i larwalnymi, jest ważne dla ogólnego zrozumienia powstawania i funkcjonowania obwodów lokomotorycznych.

Opisane tutaj metody preparacji pozwalają na rejestrację zatrzasków z neuronów rdzeniowych i zostały z powodzeniem zastosowane w stadiach embrionalnych (~17-48 hpf) i larwalnych (~3-7 dni po zapłodnieniu [dpf]). Takie podejście ogranicza ilość sekcji wymaganej do zapewnienia dostępu do neuronów będących przedmiotem zainteresowania. Protokół różni się od większości innych opublikowanych metod rejestracji neuronów rdzeniowych danio pręgowanego tym, że do przymocowania zarodka lub larwy do komory rejestracyjnej używa się kleju do szwów weterynaryjnych, a nie cienkiej szpilki wolframowej. Dostępność dwóch różnych podejść (tj. kleju do szwów i trzpienia wolframowego) do montażu zarodków lub larw danio pręgowanego do analizy elektrofizjologicznej zapewnia naukowcom alternatywne opcje osiągnięcia konkretnych celów eksperymentalnych.

Po pierwsze, opisane są procedury dostępu i zapisu z populacji pierwotnych neuronów czuciowych, komórek Rohona-Bearda. Ciała komórkowe tych neuronów leżą w grzbietowym rdzeniu kręgowym. Komórki Rohona-Bearda występują u wielu gatunków kręgowców, różnicują się we wczesnym okresie rozwoju i leżą u podstaw embrionalnej reakcji na dotyk6,44,47,48.

Po drugie, procedury dostępu i rejestracji z rdzeniowych neuronów ruchowych są szczegółowe. Neurony ruchowe rdzenia danio pręgowanego powstają podczas dwóch fal neurogenezy. Wcześniej urodzone pierwotne neurony ruchowe powstają pod koniec gastrulacji (~9-16 hpf), przy czym tylko 3-4 pierwotne neurony ruchowe są obecne na półsegment45,46,49. W przeciwieństwie do tego, później narodzona populacja wtórnych neuronów ruchowych jest liczniejsza i powstaje w dłuższym okresie, zaczynając od ~14 hpf45,50. Geneza wtórnego neuronu ruchowego w środkowych segmentach tułowia jest w większości uzupełniana przez 51 hpf50. Wtórne neurony ruchowe są uważane za odpowiedniki neuronów ruchowych w amniotes46. Co ciekawe, neurony nadrdzeniowe, za pośrednictwem dopaminy, regulują lokomocję u larwy i genezę wtórnych neuronów ruchowych u zarodka i młodej larwy50,51. Pierwotne i wtórne neurony ruchowe składają się z kilku różnych podtypów. Każdy podtyp pierwotnego neuronu ruchowego projektuje akson obwodowy, który unerwia charakterystyczną grupę mięśni, co skutkuje stereotypową, identyfikującą trajektorią aksonalną. Ogólnie rzecz biorąc, wtórne neurony ruchowe podążają ścieżkami aksonalnymi wcześniej ustanowionymi przez pierwotne neurony ruchowe. Tak więc, w odniesieniu do trajektorii aksonalnych, pierwotne i wtórne neurony ruchowe są podobne, z wyjątkiem tego, że grubość aksonów i rozmiar somatów są większe dla pierwotnych neuronów ruchowych45.

Po trzecie, omówiono metody nagrywania z kilku typów interneuronów. Jednak w tych przypadkach wymagane jest ograniczone usunięcie innych komórek rdzenia kręgowego, a zatem rdzeń kręgowy jest mniej nienaruszony niż w przypadku nagrań z komórek Rohon-Beard lub neuronów ruchowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC; Biuro Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych, University of Colorado Anschutz Medical Campus).

1. Hodowla danio pręgowanego

  1. Utrzymuj dorosłe danio pręgowane (Danio rerio) w temperaturze 28,5 °C w cyklu 10 godzin ciemności i 14 godzin światła oraz z odpowiednim leczeniem i wymianą wody52.
  2. Utrzymuj zarodki/larwy danio pręgowanego w temperaturze 28,5 °C w pożywce zarodkowej aż do osiągnięcia pożądanego stadium (n.p. 2 dpf).

2. Przygotowanie materiałów do sekcji

  1. Dozownik kleju do sekcji danio pręgowanego
    UWAGA: W tym protokole do przymocowania przygotowania do komory rejestracyjnej wykorzystuje się lejko chirurgiczne przeznaczone do zwierząt. Skuteczne użycie lejka chirurgicznego wymaga nanoszenia niewielkich ilości lejka w sposób kontrolowany. Lejko zaczyna twardnieć natychmiast po kontaktu ze środowiskiem wodnym. W związku z tym należy nabrać lejko do mikropipety i nanosić niewielkie ilości za pomocą samodzielnie wykonanego „dozownika lejka”, umożliwiającego aplikację ciśnienia ujemnego lub dodatniego ustnie. Centralną częścią dozownika lejka jest szklana rurka, element zawarty w zestawie z cienkościennymi kapilarami borokrzemowymiRycina 1A). Z jednej strony otwór jest połączony za pomocą kawałka elastycznego węża z ustnikiem, a z drugiej strony znajduje się szklana mikropipeta (Rycina 1).
    1. Usuń czarną bańkę z jednego szklanego nasadzenia i zastąp ją białym gumowym adapterem z innego szklanego nasadzenia (Rycina 1B i 1C).
      UWAGA: Ta szklana rurka z podwójnym adapterem umożliwia połączenie z mikropipetą szklaną na jednym końcu, a na drugim końcu – z giętkim wężem za pomocą małego prostego złączka polipropylenowego (Rycina 1B, wstawka).
    2. Odłóż kawałek elastycznego węża o długości około 38 cm. Przymocuj ustnik (np. żółty 200 µL końcówkę mikropipety) do końca elastycznego węża niepołączonego z szklanym kanałem
      UWAGA: Odcinek wężownicy powinien być wystarczająco długi, aby umożliwić manipulację szklaną mikropipetą pod lupą anatomiczną, podczas gdy końcówka żółta mikropipety znajduje się w ustachRycina 1D).

Schemat zestawu do pobierania krwi z linijką dla skali, ilustrujący układ i składniki.
Rycina 1: Dozownik kleju. (A–C) Szklane rurki są połączone z elastycznym wężem z jednej strony i szklaną mikropipetą z drugiej. Gumowe łączniki umożliwiają połączenie za pomocą małego polipropylenowego elementu (B, wstawka) z wężem, a ostatecznie z szklaną mikropipetą z drugiej strony. (D) Ostateczny dozownik kleju posiada ustnik (np. wykonany z plastikowego końcówki pipety) na jednym końcu węża oraz szklaną rurkę z zamocowaną mikropipetą na drugim końcu (grot strzałki).

  1. Komora do sekcji/rejestracji
    UWAGA: Komora do sekcji służy również jako komora do rejestracji elektrofizjologicznej. Komora jest formowana na szkiełku mikroskopowym przy użyciu wstępnie wyciętych kawałków utwardzonego elastomeru silikonowego (Rycina 2A).
    1. Aby przygotować elastomer silikonowy, dodaj podstawę i środek utwardzający do plastikowej probówki stożkowej w stosunku 4:1.
    2. Dokładnie wymieszaj podstawę elastomeru ze środkiem utwardzającym i wlej mieszaninę do dwóch szkiełek Petriego o średnicy 100 mm. Wlej elastomer w grubości <1 mm do jednego szkiełka Petriego i ~2,5 mm do drugiego.
    3. Pozwól elastomerowi silikonowemu utwardzić się poprzez ekspozycję na powietrze przez ~4–5 dni. Jeśli utwardzony elastomer jest potrzebny szybciej, inkubuj go w temperaturze 60 °C.
    4. Wytnij kawałki utwardzonego elastomeru silikonowego w następujących rozmiarach:
      1. Z utwardzonego elastomeru o grubości ~1 mm wytnij prostokąt o wymiarach ~3,8 x 6,3 cm; ten element stanowi dno komory (Rycina 2A). Z utwardzonego silikonu o grubości ~2,5 mm wytnij prostokąt o wymiarach ~3,8 x 6,3 cm. Z tego ostatniego prostokąta wytnij wewnętrzny prostokąt o wymiarach ~2,5 x 5 cm; uzyskana ramka stanowi górną część komory (Rycina 2A).
    5. Aby wykonać komorę do sekcji/rejestracji, połóż cienki prostokąt silikonowy bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym (5 x 7,6 cm), upewniając się, że usunięto wszelkie pęcherzyki powietrza pomiędzy silikonem a szkiełkiem (Rycina 2A). Umieść ramkę z silikonowego prostokąta, wyciętą z grubszej warstwy elastomeru, na wierzchu cienkiej dolnej warstwy silikonu.
    6. Sprawdź, czy warstwy silikonowe dobrze przylegają do siebie i czy nie ma pęcherzyków powietrza pomiędzy nimi (Rycina 2A).
    7. Po użyciu rozmontuj komorę, usuwając grubą ramkę silikonową z dolnej warstwy silikonu przylegającej do szkiełka mikroskopowego. Przed użyciem i po każdej sesji rejestracji przepłucz powierzchnie silikonowe wodą ddH2O i osusz włóknistymi ściereczkami o niskim poziomie zanieczyszczeń.
    8. Przechowuj komorę w stanie suchym, aby zapobiec wzrostowi grzybów pomiędzy dwoma elementami silikonowymi.
      UWAGA: Jeśli stosowane są toksyny lub czynniki farmakologiczne, które mogą nie być łatwo usuwalne z silikonu, przeznaczaj specjalne komory do tych celów.

Układ mikroskopowy z mikrodostrzawnikiem do analizy komórkowej; zawiera mikroskop, dostrzawnik, kapilary.
Rycina 2: Komora do elektrofizjologii i narzędzia do preparacji. (A) Komora używana do preparacji i rejestracji elektrofizjologicznych składa się ze szklanej płytki, na której umieszczone są dwa kawałki utwardzonego silikonowego elastomeru ułożone jeden na drugim, tworząc ramek i dno dołka. Wielkość dołka, około 2,5 × 5 cm, pozwala na stosowanie małych objętości (2–2,5 mL) roztworu zewnątrzkomórkowego do rejestracji. Dolna warstwa silikonowa umożliwia trwałe umocowanie embrionu danio pręgowanego za pomocą kleju tkankowego, który nie przylega do szkła. (B) Szklana mikropipeta (u góry) służy do aplikacji kleju podczas preparacji. Cienkościenną szklaną rurkę ciągnie się, aby uzyskać długi, zwężający się koniec, który następnie przycina się, tworząc końcówkę o średnicy około 75 µm. Zwężoną szklaną mikropipetę mocuje się do swobodnego końca dozownika kleju (Rycina 1D, grot strzałki) i wypełnia klejem od strony końcówki poprzez zastosowanie ssania. Druga mikropipeta (dolna), przygotowana tak jak ta używana do rejestracji metodą patch-clamp, służy do przecięcia mózgu tylnego i usunięcia skóry. (C) Pod mikroskopem od góry, mikromanipulator służy do precyzyjnego przemieszczania mikropipety podczas końcowych etapów preparacji. Szklaną mikropipetę, taką jak na rycinie B, dolną, mocuje się do uchwytu elektrody (strzałka). Usunięcie mięśni uzyskuje się poprzez zastosowanie ssania przez rurkę podłączoną do otworu wentylacyjnego (grot strzałki). Z drugiej strony rurka łączy się z kurkiem trójdrożnym (czarny grot strzałki), który z drugiej strony (gwiazdka) ma rurkę podłączoną do ustnika.

3. Sekcja zarodków i larw w celu rejestracji metodą patch-clamp z neuronów rdzeniowych

Schemat mikroskopowy stosowania mikropipety w badaniach nerwowych; celowanie w komórki, nerwy wzrokowe u ryby danio
Rycina 3: Rozwiązanie grzbietowe rdzenia kręgowego u danio pręgowanego. (A-A') Po przekrojeniu mózgu tylnego (a) embrionu w wieku 2 dpf, skórę przycina się po lewej i prawej stronie embrionu (b). Następnie wykonuje się drugie cięcie, prostopadłe do pierwszego (c). Następnie skórę podnosi się za pomocą mikropipety, umożliwiając pincetom uchwycenie i odsunięcie skóry. (BUsunięcie skóry odsłania grzbietowy odcinek rdzenia kręgowego. Przed linią czarną, skóra została usunięta, a powierzchnia rdzenia kręgowego (gwiazdka), zawarte w oponach mózgowo-rdzeniowych, jest odsłonięte. Skóra pozostaje nieuszkodzona w kierunku ogonowym względem czarnej linii (strzałka). (C–C'Wierzchołek szklanej mikropipety jest dociskany do opon mózgowo-rdzeniowych, a następnie wykonywane są szybkie, boczne, krótkie ruchy w celu przebicia opon.D-D' i E-E') Gdy opony mózgowe zostaną przebite (D-D'), mikropipetę przesuwa się do przodu i (E-E') przesunięto w kierunku rostralnym, aby rozerwać opony mózgowe na dwa odcinki. Ciała komórkowe neuronów Rohona-Bearda zazwyczaj ujawniają się po usunięciu opon mózgowychstrzałka). (F-G') U larwy w wieku 7 dnf warstwy mięśniowe pokrywają powierzchnię grzbietową rdzenia przedłużonego, co utrudnia dostęp do neuronów Rohona-Bearda. Po usunięciu skóry larwę traktuje się kolagenazą w stężeniu 0,05%. (F5-minutowa inkubacja z kolagenazą w stężeniu 0,05% jest zbyt intensywna i prowadzi do nadmiernego uszkodzenia mięśnia, o czym świadczy strzępienie się tkanki mięśniowej (strzałka i wstawka). (F'Nadmierna obróbka kolagenazą może również uszkadzać neurony Rohona-Beardastrzałka), ujawnionych poprzez ich ekspresję białka GFP w Tg(islet2b:gfp) linia. WTg(islet2b:gfp) linia, neurony zwojów korzeni grzbietowych również wyrażają białko GFP (grot strzały). Krótsze 1-minutowe inkubowanie w 0,05% kolagenazie wystarczająco poluzowuje mięsień (G) zachowując jednocześnie morfologię miotomu (strzałka i wstawka). (G'Komórki pigmentowe znajdują się na powierzchni najbardziej grzbietowej warstwy mięśniowej (grot strzały). (H i I) W Tg(islet2b:gfp) linia, neurony Rohona-Bearda (strzałki) oraz ganlion korzeni tylnej (grot strzały) nadal wyrażają białko GFP w 7 dpf. Widoki grzbietowe Tg(islet2b:gfp) zarodki danio pręgowanego w wieku 2 dpf (H) i 7 dpf (I). Na panelu A skala = 500 µm; B-E (pokazane w panelu B) Skala = 80 µm; F' i G' (pokazane w panelu F) Skala = 200 µm; H i I (pokazane na panelu H) Skala = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Dyssekcja embrionów w celu rejestracji z komórek Rohona-Bearda
    1. Umieść zarodek w komorze do dystalizacji zawierającej około 2–3 mL roztworu Ringera (Rycina 2A). Unieruchomienie embrionu poprzez dodanie ~100 µL 0,4% roztworu tricainy do komory.
    2. Wyciągaj cienkościenną szklaną mikropipetę na wyciągarkę mikropipet z wykorzystaniem włókna typu box, aby uzyskać długi, cienki wierzchołek, podobny do mikropipety do iniekcji (Rycina 2B, góra)53.
    3. Przymocuj pociągniętą szklaną mikropipetę do szklanego otworu dozownika kleju. Pod mikroskopem anatomicznym użyj pinsety, aby złamać czubek szklanej mikropipety tak, aby jej koniec miał długość około ~75 µm (Rycina 2B, górny panel).
      UWAGA: Wielkość końcówki powinna być wystarczająco duża, aby umożliwić skuteczne załadowanie kleju do końcówki poprzez zastosowanie ciśnienia ujemnego (ssanie ustami) w celu wypełnienia mikropipety od przodu, lecz wystarczająco mała, aby umożliwić precyzyjne naniesienie kleju przy użyciu ciśnienia dodatniego.
    4. Wypełnij mikropipetę szklaną objętością około 3–5 µL kleju, stosując ssanie przez ustnik. Przenieś wypełniony klejem wtyk do komory do sekcji.
      UWAGA: Wypełnienie mikropipety klejem wymaga silnego ssania. Jeśli mikropipeta szybko się wypełnia przy słabym ssaniu, to znaczy, że jej końcówka jest zbyt duża.
    5. Umieścić zarodek w komorze do rejestracji (Rycina 3A i 3A'); w przypadku rejestracji z embrionów i młodych larw (≤72 hpf) nie ma potrzeby usuwania tkanki mięśniowej.
    6. Przybliż czubek mikropipety napełnionej klejem do głowy zarodka/larwy, utrzymując lekki nadciśnienie w mikropipecie za pomocą rurki do ust (aby zapobiec dostaniu się roztworu wodnego). Gdy czubek znajdzie się w pobliżu głowy zarodka, zastosuj wystarczające nadciśnienie, aby wydobyć niewielką kroplę kleju na dno komory.
      UWAGA: Klej utwardza się po kontaktu z roztworem wodnym, dlatego ważne jest, aby podczas umieszczania go w roztworze do mikrodysekcji stosować i utrzymywać łagodne ciśnienie dodatnie.
    7. Użyj szpilki anatomicznej, aby przesunąć zarodek/larwę w kierunku kropli kleju, tak aby głowa zetknęła się z klejem. Ułóż zarodek stroną grzbietową do góry i naciśnij na głowę, aby zapewnić dobre przyłożenie do kleju.
    8. W miarę powolnego twardnienia kleju użyj szpilki do preparatów, aby ponownie ustawić embrion/larwę tak, by leżał stroną brzuszną do dołu, a stroną grzbietową do góry. Zanurz narzędzie w postaci szpilki do preparatów w kropli kleju i naciągnij nitki kleju nad głową embrionu, przeciągając je przez nią, aby dodatkowo ustabilizować jego położenie.
      UWAGA: Tricaina przyspiesza tempo wiązania kleju. Aby uzyskać więcej czasu na pracę z klejem, należy używać minimalnej ilości tricainy potrzebnej do unieruchomienia embrionu/larwy. Dodatkowo tempo wiązania kleju może się różnić w zależności od partii. W związku z tym przed użyciem nowej partii kleju do sekcji należy najpierw ustalić jego szybkość wiązania.
    9. Gdy głowa zostanie bezpiecznie przymocowana do silikonu i klej stwardnieje, poświęć embrion/larwę przez przecięcie na poziomie tyłomózgowia za pomocą innej szklanej mikropipety (Rycina 3A-a i 4A-a).
      UWAGA: Przecięcie mózgowia tylnego jest metodą stosowaną w tym przypadku do humanitarnego uśmiercania zwierząt. Jednak w zależności od celów eksperymentalnych (np. badanie pływania fiktywnego), może być potrzebna inna metoda.
    10. Przed przymocowaniem ogona do komory należy usunąć skórę z tułowia.
      1. Użyj świeżej szklanej mikropipetyRycina 2B, dół) aby kilkakrotnie powierzchownie przyciąć skórę w pozycji ogonowej względem przedłużenia mózgu (Rycina 3A-b i 4A-b). Prowadzić pipetą prostopadle do osi rzęskowo-tęczowej po obu stronach tułowia, wykonując powierzchowne nakłucie skóry dla preparatów zamontowanych grzbietem do góry (Rysunek 3A-b) próbki lub na odkrytej stronie pnia dla próbek zamocowanych bocznie (Rycina 4A-b).
    11. Aby utworzyć skórną płatek uchwytu dla szczypiec, przesuń kilkakrotnie mikropipetą po skórze na poziomie i prostopadle do pierwotnego cięcia z punktu 3.1.10.1.Rysunek 3A-c i 4A-c).
    12. Za pomocą pęsety stopniowo unieść płat skóry i przesunąć skórę w kierunku ogonowym.
      UWAGA: Często prowadzi to do całkowitego usunięcia skóry z tułowia. Jednak czasami konieczne jest usunięcie skóry w kilku odcinkach poprzez wielokrotne skrobanie i odciąganie skóry. W niektórych przypadkach częściowe usunięcie skóry może zapewnić wystarczający dostęp do interesujących odcinków rdzenia kręgowegoRycina 3B i 4B).
    13. Wprowadź niewielką kroplę kleju w pobliżu ogona zarodka/larwy. Użyj tego kleju, aby przyczepić ogon do dna komory do preparacji. W trakcie twardnienia kleju, reguluj położenie tułowia za pomocą szpilki mikrochirurgicznej, aby zapewnić, że tułów pozostaje zwrócony grzbietem do góry i jest solidnie przymocowany do komory.
    14. Po wstępnym przeprowadzeniu sekcji dokładnie przepłucz preparat roztworem Ringera, aby usunąć tricainę i pozostałe zanieczyszczenia. Pozwól preparatowi odpocząć przez około 5 minut.
    15. Zamień roztwór do sekcji na roztwór pozakomórkowy do rejestracji. W razie potrzeby dodaj środek unieruchamiający do przygotowanianp.., α-bungarotoksyna [końcowe stężenie 1 µM]).
      UWAGA: 1 µM α-bungarotoksyna unieruchamia zarodki w wieku 1–2 dni po zapłodnieniu (dpz) w ciągu około 30 minut. W przypadku starszych larw może być konieczne zastosowanie wyższego stężenia α-bungarotoksyny. α-Bungarotoksyna jest utrzymywana w roztworze kąpieli podczas rejestracji, które zazwyczaj przeprowadza się w ciągu 1 godziny. Roztwory rejestrowe zawierające kationy dwuwartościowe, takie jak kobalt, nie wymagają dodawania środka unieruchamiającego. W eksperymentach wymagających dłuższych okresów rejestracji (powyżej 1 godziny) preparat jest przepływany roztworem kąpieli w tempie 0,5–1 mL/min.
    16. Przenieś komorę do sekcji z zamocowanym zarodkiem na stolik mikroskopu złożonego prostego wyposażonego w 40-krotne powiększenie z zanurzeniem wodnym i długą długością roboczą.
      UWAGA: Ten mikroskop jest częścią zestawu, w którym będą wykonywane rejestracje. Zestaw powinien również być wyposażony w głowicę pomiarową, wzmacniacz patch-clamp, mikromanipulator oraz system akwizycji danych/komputerowyRycina 2C).
    17. Umieść pustą, grubościeniową szklaną mikropipetę z borokrzemianu na trzymanku elektrody głowicyRycina 2B, dół i 2C, strzałka). Przymocuj wężyk (średnica wewnętrzna: 0,16 cm, średnica zewnętrzna: 0,32 cm, długość: ok. 90 cm) jednym końcem do otworu wylotowego powietrza uchwytu do elektrody (grot strzały) oraz z drugiej strony do trójdrożnego kurka (Rycina 2C, czarna strzałka).
      1. Umieść ustnik na jednym końcu kolejnego odcinka węża (~60–70 cm długości) i podłącz go do trójnikowego zaworu na drugim końcuRycina 2C, czarna gwiazdka).
        UWAGA: Ten system rurek umożliwia aplikowanie ciśnienia dodatniego i ujemnego do wnętrza pipety rejestracyjnej podczas tworzenia uszczelnienia.
    18. Przenieś końcówkę mikropipety do najbardziej grzbietowej części rdzenia przedłużonego i delikatnie przebij opony mózgowe. Następnie wykonaj szybkie, krótkie ruchy w bok, aby poluzować opony mózgowe (Rycina 3C i 3C').
    19. Po przejściu końcówki mikropipety przez opony mózgowe, przesuń naprzód i unieś mikropipetę, aby oddzielić opony od rdzenia kręgowego (Rycina 3D i 3D).
    20. Przesuń mikropipetę w kierunku rostralnym, posuwając się o 1 do 2 półsegmentów, aby odsłonić komórki Rohona-Bearda (Rycina 3E i 3E').
      UWAGA: Odtwórz minimalną ilość opon mózgowo-rdzeniowych niezbędną jedynie do odsłonięcia kilku komórek Rohona-Bearda. Po każdym zapisie wykonuje się dodatkową dissekcję w celu odsłonięcia większej liczby komórek Rohona-Bearda. U zarodków i larw neurony Rohona-Bearda mogą okazjonalnie wykazywać wyładowania po kontakcie z mikropipetą patch. Inne neurony rdzenia kręgowego nie wykazują takiego zachowania, co sugeruje, że może to odzwierciedlać unikalne cechy komórek Rohona-Bearda, takie jak ich wrażliwość mechaniczna. Wsparciem dla tej hipotezy są różne składniki roztworów (np. składniki jonowe i osmolarność) zostały przetestowane, a żadna z nich nie zapobiegła temu zachowaniu komórek Rohona-Bearda.
  2. Dyssekcja larw w celu rejestracji z komórek Rohona-Bearda
    UWAGA: U larwi w wieku 7 dpf należy usunąć mięśnie otaczające grzbietową część rdzenia kręgowego. Wykonaj kroki 3.1.1–3.1.15 (zastępując embrion larwą) przed obróbką enzymem.
    1. Aby usunąć mięsień, inkubuj larwę z kolagenazą w stężeniu 0,05% przez 1 min.
    2. Usunąć kolagenazę, przemywając preparat około 5 razy roztworem Ringera. Następnie przeprowadzić około 5 przemyczeń roztworem pozakomórkowym w celu całkowitego usunięcia kolagenazy.
    3. Wykonaj pozostałą część dissekcji po zamontowaniu komory do rejestracji na stoliku mikroskopu układu do rejestracji. Przymocuj borokrzemianową mikropipetę patch o grubych ściankach (Rycina 2B, dółdo uchwytu elektrody i złamać czubek mikropipety, delikatnie ocierając go o dno komory silikonowej.
    4. Użyj nieco uszkodzonej mikropipety, aby ostrożnie oddzielić mięsień i odsłonić grzbietowy rdzeń kręgowy. Aby usunąć włókna mięśniowe z preparatu, zastosuj ssanie poprzez rurkę podłączoną do wyjścia uchwytu elektrody. Posługując się mikromanipulatorem, przesuwaj mikropipetę wzdłuż włókna mięśniowego, stosując jednocześnie ssanie.
      UWAGA: Celem jest najpierw mechaniczne poluzowanie mięśnia za pomocą mikropipety, a następnie ods sucking i usunięcie pojedynczych włókien mięśniowych. Czasami podczas usuwania mięśnia mikropipeta zatyka się ssanym materiałem tkankowym.
      1. Aby oczyścić mikropipetę z zatkania, przetrzyj jej końcówkę o dno komory, lekko niszcząc czubek, jednocześnie dmuchając powietrzem przez rurkę, aby wypchnąć zawartość.
        UWAGA: Jeśli rozmiar końcówki mikropipety staje się zbyt duży, może być konieczna wymiana na nową mikropipetę. Rozmiar końcówki mikropipety ma szczególne znaczenie podczas usuwania warstw mięśniowych położonych najbliżej błon otaczających rdzeń kręgowy, czyli opon mózgowych (małe końcówki mikropipet umożliwiają bardziej precyzyjną pracę).
    5. Usunąć opony mózgowe, jak opisano w krokach 3.1.18–3.1.20, używając nowej mikropipetyRycina 2B, dół).

Obrazy mikroskopowe i diagramy etapów rozwoju embrionalnego, podkreślające cechy strukturalne.
Rycina 4: Przecięcie boczne rdzenia kręgowego u danio pręgowanego. Montowanie embrionów danio pręgowanego w orientacji bocznej ułatwia dostęp do neuronów ruchowych. Usunięcie mięśni oraz przecięcie opon mózgowych w celu odsłonięcia neuronów ruchowych przeprowadza się pod mikroskopem odgórskim wyposażonym w obiektyw zanurzeniowy 40X (zobacz Rycina 2). (A) Ciała komórkowe neuronów ruchowych znajdują się w położeniu brzusznym i bocznym w obrębie rdzenia kręgowego. Embriony są przymocowane do komory tak, aby ich strona grzbietowa była skierowana w stronę uchwytu elektrody. Zwróć uwagę, że klej chirurgiczny staje się biały po stwardnieniu (gwiazdki). Gdy tylko mózgowie tylne zostanie przecięte (a), skórę przycina się kilkakrotnie powierzchownie w miejscu (b) położonym kaudalnie do mózgowia tylnego, używając szklanej mikropipety. Dodatkowe powierzchowne nacięcia (c), prostopadłe do pierwszego zestawu (b), tworzą skórzany język, który można chwycić pincetą w celu usunięcia skóry. (B–G) Pusta szklana mikropipeta, wyciągnięta do krótkiego, stożkowego końca (Rycina 2B, dół), jest zamocowana w uchwycie elektrody. Mikropipetą manipuluje się za pomocą mikromanipulatora w celu dokładnego przecinania i usuwania tkanki mięśniowej. (B) Koniec szklanej mikropipety najpierw lekko się pofragmentowuje, delikatnie ocierając go o dno komory, tworząc nierówny koniec i większy otwór wylotowy. Mikropipetę przesuwa się wzdłuż włókien mięśniowych podczas przyłożenia ssania. Włókna mięśniowe usuwa się warstwa po warstwie, aby nie uszkodzić leżących poniżej opon mózgowych. U embrionów najbardziej grzbietowe warstwy mięśni usuwa się najpierw, ponieważ są one zazwyczaj cieńsze. Skóra nie jest usuwana z bardziej kaudalnych półsegmentów (strzałka). (C) Górna połowa mięśnia w jednym półsegmencie została usunięta (strzałka). (D) Czarne linie wyznaczają półsegment pozbawiony włókien mięśniowych, z zachowanymi oponami mózgowymi pokrywającymi rdzeń kręgowy (gwiazdka). (E–E') Za pomocą mikropipety wywiera się nacisk na opony mózgowe w miejscu nieco grzbietowo względem ciał komórkowych neuronów ruchowych. Szybkie, krótkie ruchy boczne mikropipety prowadzą do przebicia opon mózgowych. (F–F') Mikropipetę przesuwa się w kierunku brzusznym, w stronę brzusznej części półsegmentu, a następnie unosi, aby oddzielić opony mózgowe od tkanki nerwowej. (G–G') Opony mózgowe są przecinane przez przesuwanie mikropipety w kierunku rostralnym wzdłuż półsegmentu. Neurony natychmiast wychodzą na wierzch z odsłoniętego rdzenia kręgowego i stają się dostępne dla elektrod patch (strzałka). Sztaby skali = 500 µm w (A); Sztaby skali = 100 µm w B–G (pokazane w panelu B).

  1. Wydzielenie embrionów w celu rejestrowania aktywności neuronów ruchowych i interneuronów
    1. Umieść embrion w komorze do sekcji zawierającej roztwór Ringer’a i unieruchom embrion za pomocą tricaine, jak w kroku 3.1.1.
    2. Umocuj embrion bocznie, tak aby jego strona grzbietowa była skierowana w stronę ścianki komory optymalnej dla użytkownika (zazwyczaj zależy to od dominującej ręki). Wykonaj kroki 3.1.2–3.1.17, upewniając się, że embrion pozostaje płasko przylegający do silikonu (Rycina 4A i 4A').
    3. Użyj grubej borokrzemianowej mikropipety o pękniętym końcu o średnicy około 25 µm, aby zdjąć i odsączyć mięśnie, odsłaniając opony mózgowe, zgodnie z opisem w krokach 3.2.4–3.2.4.1 (Rycina 4B–4D).
    4. Po usunięciu warstw mięśniowych z interesującego półsegmentu (półsegmentów) (Rycina 4D), wymień szklaną mikropipetę na nową, o nieuszkodzonym końcu (Rycina 2B, dół). Przebij opony mózgowe w miejscu położonym grzbietowo względem docelowych neuronów. Za pomocą mikromanipulatora wciskaj mikropipetę w dół na opony, a następnie szybko przesuń ją w bok, aby rozerwać i przejść przez opony (Rycina 4E i 4E').
    5. Po rozerwaniu opon mózgowych, przesuń mikropipetę do przodu i unieś ją, aby podnieść opony z rdzenia kręgowego (Rycina 4F i 4F'). Przesuń mikropipetę w kierunku głowy, aby rozerwać błonę wzdłuż całej długości półsegmentu (Rycina 4G i 4G').
      UWAGA: W przypadku rejestrowania aktywności komórek Rohona-Bearda i neuronów ruchowych pierwotnych, sekcja ogranicza się do odsłonięcia opon mózgowych w bezpośrednim obszarze celu. Natomiast w przypadku rejestrowania z interneuronów i neuronów ruchowych wtórnych, konieczne jest usunięcie neuronów w obrębie rdzenia kręgowego, które utrudniają dostęp do interesującej komórki. W tym drugim przypadku, z powodu znacznego zakłócenia obwodów rdzenia kręgowego, badania ograniczają się do analizy wewnętrznych właściwości elektrycznych błony komórkowej.

4. Rejestracja zapisów elektrofizjologicznych z neuronów rdzenia kręgowego

  1. Do rejestrowania z komórek Rohona-Bearda i neuronów ruchowych używaj grubościennych kapilar ze szkła borokrzemowego, wykonywanych z opornością wynoszącą około 3 MΩ po wypełnieniu roztworem pipety (Rysunek 2B, dół).
    1. Przed zanurzeniem mikropipety w łaźni zastosuj ciśnienie dodatnie, delikatnie dmuchając przez wężyk podłączony do uchwytu elektrody.
      UWAGA: Ciśnienie dodatnie zapobiega zatykaniu się końcówki mikropipety i jest utrzymywane poprzez ustawienie trójdrożnego zaworu zamkowego w pozycji „off”. Gdy mikropipeta znajdzie się blisko docelowej komórki, ciśnienie to spowoduje charakterystyczne wgniecenie błony komórkowej, co stanowi pomocny wskaźnik, że mikropipeta jest wystarczająco blisko, aby rozpocząć tworzenie zatrzasku.
    2. Zwolnij ciśnienie dodatnie, obracając zawór zamkowy w pozycję otwartą, jednocześnie przykładając delikatne ssanie przez ustnik.
    3. Po utworzeniu zatrzasku o oporności GΩ między błoną komórkową a końcówką mikropipety, zastosuj krótkie impulsy ssania, aby rozerwać błonę i uzyskać konfigurację typu „whole-cell”.
    4. Po uzyskaniu stabilnej konfiguracji typu „whole-cell”, przy oporności wejściowej 500 MΩ i oporności dostępu 10 MΩ, przeprowadź rejestracje w trybie potencjałoszczelnym lub prądoszczelnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślnie zarejestrowaliśmy aktywność neuronów Rohona-Bearda w embrionach w 17 hpf oraz w larwach w 7 dpf (Ryc. 5A i 5B). Podczas rejestracji z komórek Rohona-Bearda preparat montowano stroną grzbietową do góry. Taki sposób montażu pozwala na jednoznaczną identyfikację komórek Rohona-Bearda na podstawie ich powierzchownego położenia grzbietowego oraz dużych rozmiarów somy. Identyfikację dodatkowo potwierdza stereotypowy hiperpolaryzowany spoczynkowy poten...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tu metody pozwalają na elektryczną i morfologiczną charakterystykę neuronów czuciowych i ruchowych zarodków danio pręgowanego po minimalnym rozwarstwieniu rdzenia kręgowego. Neurony pozostają zdrowe przez co najmniej 1 godzinę, czyli limit czasu nałożony na te nagrania. Neurony zostały zarejestrowane przy użyciu standardowej konfiguracji całych komórek, a także z jądrzastych plam; Ta ostatnia metoda minimalizuje problemy z zaciskami przestrzennymi, które mogą uniemożliwić szczegółowe badanie biofizyczne prądów jo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z NIH (F32 NS059120 dla RLM oraz R01NS25217 i P30NS048154 dla ABR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr próżniowy/Butelka do przechowywania, pory 0,22 mmCorning431096
Filtr strzykawkowy 0,2 mmWhatman6780-2502
TricaineSigmaA-5040Sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu 
&alfa;-bugarotoksynaTocris11032-79-4
TetrodotoksynaTocris4368-28-9
Alexa-549 sól hydrazynySondy molekularneA-10438barwnik fluorescencyjny
Filtr probówkowy wirówki Spin-XCorning8161
Szklane szkiełko mikroskopoweFisher12-550C
Silikon Sylgard zestaw elastomerówDow Corning184elastomer silikonowy
szalki PetriegoFalcon351029
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoAparat Harvarda30-0038średnice wewnętrzne i zewnętrzne 0,78 i 1,0 mm (cienkościenne kapilary szklane)
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoDrummond Scientific1-000-1000-100średnice wewnętrzne i zewnętrzne 1,13 i 1,55 mm (grubościenne kapilary szklane)
Miniaturowa armatura z kolczastego tworzywa polipropylenowego Cole-Palmer6365-90
Klej do tkanek Vetbond 3M1469SB
Collagenase XISigmaC7657
Ściągacz mikroelektrodSutter Instruments  Wzór P-97 
WzmacniaczUrządzenia molekularneAxopatch 200B
Stopień głównyUrządzenia molekularneCV203BU
Mikromanipulator z napędem   Sutter InstrumentsMP-285
Rurka TygonFisher14-169-1BID 1/16 CALA, OD 1/8 CALA i ŚCIANKA 1/32 CALA (elastyczne rurki laboratoryjne)
Uchwyt elektrodyUrządzenia molekularne1-HC-U
Pharmaseal Trójdrogowe zawory odcinające BaxterK75
DigitizerAxon InstrumentsDigidata 1440A
Mikroskop odwrócony Obiektyw ZeissAxioskop2 FS plus
40X/0,80 W AchroplanOprogramowanie do
 Axon InstrumentsPClamp 10 - Clampex i Clampfit 
Ściągacz do mikropipetSutter InstrumentsModel P-97
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwory do sekcji i nagrywania (w mM)
Wszystkie roztwory, z wyjątkiem wewnątrzkomórkowych, są stabilne przez ~2-3 miesiące po przefiltrowaniu (kubki filtracyjne 0,22 mm) i przechowywaniu w temperaturze pokojowej (RT).
Roztwór wewnątrzkomórkowy jest filtrowany (filtry strzykawkowe 0,2 mm) i przechowywany w stanie zamrożonym (-20 ° C) w małych porcjach, które są indywidualnie rozmrażane w dniu użycia. 
Sekcja zwłok/Dzwonek' s roztwór145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2,2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (z NaOH)
Pipeta (wewnątrzkomórkowa) roztwór135 KCl, 10 kwasów EGTA, 10 HEPES; pH 7,4 (z KOH).
Kąpielowy (zewnątrzkomórkowy) roztwór rejestrujący/cęgi125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2,2H2O, 5 HEPES; pH 7,4 (z NaOH).
Alexa-594 roztwór podstawowy soli hydrazyny. Przygotuj zapas 13,2 mM w ddH2O, podwielokrotność (~100 &mikro; l) i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Przed użyciem rozcieńczyć roztwór podstawowy 132-krotnie roztworem pipety do końcowego stężenia 100 mM. Po rozcieńczeniu przefiltrować roztwór pipety Alexa-594 zawierający  z filtrem probówkowym wirówkowym.
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
Środki unieruchamiające
0,4% sól metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (Trikaina)Przygotować 0,4% roztwór podstawowy w 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g Trikaina/100 ml 0,2 M Tris
Dostosuj pH do 7 za pomocą NaOH i przechowuj w temperaturze -20 stopni Celsjusza.
Do użycia, rozcieńczyć roztwór podstawowy ~25 razy w pożywce dla zarodków
250 mM &alfa-bungarotoksynaPrzygotuj 250 mM zapasu w ddH2O (1 mg/500 mL), przygotuj 100 &mikro; L podwielokrotności i sotre przy -20 °C.
Do użycia, rozcieńczyć 2,500-krotnie roztworem zewnątrzkomórkowym do końcowego stężenia 100 nM.
1 mM tetrodotoksynyPrzygotować 1 mM zapas w ddH2O (1 mg/3 ml), przygotować 100 &mikro; L podwielokrotności i sotre przy -20 °C.
Do użycia, rozcieńczyć 2000-krotnie roztworem zewnątrzkomórkowym do końcowego stężenia 500 nM.
akwizycji i analizy danych Zeiss zapisujący napięciowe i prądowe

Bibliografia

  1. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88 (1), 1-13 (1999).
  2. Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  3. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Whole cell patch-clamp recordings from identified spinal neurons in the zebrafish embryo. Methods Cell Sci. 25, 59-64 (2003).
  4. Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive Swimming Motor Patterns in Wild Type and Mutant Larval Zebrafish. J Neurophysiol. 93 (6), 3177-3188 (2005).
  5. Wen, H., Brehm, P. Paired motor neuron-muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J Neurosci. 25 (35), 8104-8111 (2005).
  6. Ribera, A. B., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish Touch-Insensitive Mutants Reveal an Essential Role for the Developmental Regulation of Sodium Current. J Neurosci. 18, 9181-9191 (1998).
  7. Pineda, R. H., Heiser, R. A., Ribera, A. B. Developmental, molecular, and genetic dissection of INa in vivo in embryonic zebrafish sensory neurons. J Neurophysiol. 93, 3582-3593 (2005).
  8. Moreno, R. L., Ribera, A. B. Zebrafish motor neuron subtypes differ electrically prior to axonal outgrowth. J Neurophysiol. 102, 2477-2484 (2009).
  9. Moreno, R. L., Ribera, A. B. Spinal neurons require Islet1 for subtype-specific differentiation of electrical excitability. Neural Dev. 9 (1), 19(2014).
  10. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
  13. Vogel, G. Genomics: Sanger will sequence zebrafish genome. Science. 290 (5497), 1671(2000).
  14. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
  15. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21 (1), 48-64 (2011).
  16. Yates, A., et al. Ensembl. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D710-D716 (2016).
  17. Kawakami, K. Transgenesis and gene trap methods in zebrafish by using the Tol2 transposable element. Methods Cell Biol. 77, 201-222 (2004).
  18. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  19. Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29, 699-700 (2011).
  20. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  21. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  22. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  23. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  24. Levin, E. D., Cerutti, D. T. Behavioral neuroscience of zebrafish. Methods of behavior analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
  25. Stewart, A., Gaikwad, S., Kyzar, E., Green, J., Roth, A., Kalueff, A. Modeling anxiety using adult zebrafish: A conceptual review. Neuropharmacology. 62, 135-143 (2012).
  26. Mushtaq, M. Y., Verpoorte, R., Kim, H. K. Zebrafish as a model for systems biology. Biotechnol Genet Eng Rev. 29 (2), 187-205 (2013).
  27. Phillips, J. B., Westerfield, M. Zebrafish models in translational research: tipping the scales toward advancements in human health. Dis Model Mech. 7 (7), 739-743 (2014).
  28. Weis, J. S. Analysis of the development of nervous system of the zebrafish, Brachydanio rerio. I. The normal morphology and development of the spinal cord and ganglia of the zebrafish. J Embryol Exp Morphol. 19 (2), 109-119 (1968).
  29. Bernhardt, R. R., Chitnis, A. B., Lindamer, L., Kuwada, J. Y. Identification of spinal neurons in the embryonic and larval zebrafish. J Comp Neurol. 302 (3), 603-616 (1990).
  30. Tsuchida, T., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
  31. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
  32. Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: Moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
  33. Fetcho, J. R., McLean, D. L. Some principles of organization of spinal neurons underlying locomotion in zebrafish and their implications. Ann N Y Acad Sci. 1198, 94-104 (2010).
  34. Del Barrio, M. G., et al. A transcription factor code defines nine sensory interneuron subtypes in the mechanosensory area of the spinal cord. PLoS One. 8 (11), (2013).
  35. Satou, C., Kimura, Y., Hirata, H., Suster, M. L., Kawakami, K., Higashijima, S. Transgenic tools to characterize neuronal properties of discrete populations of zebrafish neurons. Development. 140 (18), 3927-3931 (2013).
  36. McLean, D. L., Fan, J., Higashijima, S., Hale, M. E., Fetcho, J. R. A topographic map of recruitment in spinal cord. Nature. 446, 71-75 (2007).
  37. McLean, D. L., Masino, M. A., Koh, I. Y., Lindquist, W. B., Fetcho, J. R. Continuous shifts in the active set of spinal interneurons during changes in locomotor speed. Nat. Neurosci. 11, 1419-1429 (2008).
  38. McLean, D. L., Fetcho, J. R. Spinal interneurons differentiate sequentially from those driving the fastest swimming movements in larval zebrafish to those driving the slowest ones. J. Neurosci. 29, 13566-13577 (2009).
  39. Ampatzis, K., Song, J., Ausborn, J., El Manira, A. Separate microcircuit modules of distinct V2a interneurons and motoneurons control the speed of locomotion. Neuron. 83, 934-943 (2014).
  40. Ljunggren, E. E., Haupt, S., Ausborn, J., Ampatzis, K., El Manira, A. Optogenetic activation of excitatory premotor interneurons is sufficient to generate coordinated locomotor activity in larval zebrafish. J. Neurosci. 34, 134-139 (2014).
  41. Menelaou, E., VanDunk, C., McLean, D. L. Differences in the morphology of spinal V2a neurons reflect their recruitment order during swimming in larval zebrafish. J Comp Neurol. 522, 1232-1248 (2014).
  42. Hubbard, J. M., et al. Intraspinal Sensory Neurons Provide Powerful Inhibition to Motor Circuits Ensuring Postural Control during Locomotion. Curr Biol. 26 (21), 2841-2853 (2016).
  43. Song, J., Ampatzis, K., Björnfors, E. R., El Manira, A. Motor neurons control locomotor circuit function retrogradely via gap junctions. Nature. 529 (7586), 399-402 (2016).
  44. Lamborghini, J. E. Rohon-beard cells and other large neurons in Xenopus embryos originate during gastrulation. J. Comp. Neurol. 189, 323-333 (1980).
  45. Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6, 2278-2289 (1986).
  46. Kimmel, C. B., Westerfield, M. Primary neurons of the zebrafish. Signals and Sense: Local and Global Order in Perceptual Maps. Edelman, G. M., Gall, W. E., Cowan, W. M. , Wiley-Liss. New York. 561-588 (1990).
  47. Metcalfe, W. K., Myers, P. Z., Trevarrow, B., Bass, M. B., Kimmel, C. B. Primary neurons that express the L2/HNK-1 carbohydrate during early development in the zebrafish. Development. 110 (2), 491-504 (1990).
  48. Rossi, C. C., Kaji, T., Artinger, K. B. Transcriptional control of Rohon-Beard sensory neuron development at the neural plate border. Dev Dyn. 238, 931-943 (2009).
  49. Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Progress in Neurobiology. 69 (6), 419-449 (2003).
  50. Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Dev Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
  51. Lambert, A. M., Bonkowsky, J. L., Masino, M. A. The conserved dopaminergic diencephalospinal tract mediates vertebrate locomotor development in zebrafish larvae. J Neurosci. 32 (39), 13488-13500 (2012).
  52. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
  53. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette pullers. , Sutter Instrument. (2015).
  54. Spitzer, N. C. The ionic basis of the resting potential and a slow depolarizing response in Rohon-Beard neurons of Xenopus tadpoles. J Physiol. 255 (1), 105-135 (1976).
  55. Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20, 206-218 (2000).
  56. Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
  57. Palanca, A. M., et al. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev Neurobiol. 73, 152-167 (2013).
  58. Flanagan-Street, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132, 4471-4481 (2005).
  59. Arkhipova, V., Wendik, B., Devos, N., Ek, O., Peers, B., Meyer, D. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365, 290-302 (2012).
  60. Balciunas, D., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Hermanson, S. B., Welle, Z., Ekker, S. C. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62(2004).
  61. Meng, A., Tang, H., Ong, B. A., Farrell, M. J., Lin, S. Promoter analysis in living zebrafish embryos identifies a cis-acting motif required for neuronal expression of GATA-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 6267-6272 (1997).
  62. Menelaou, E., McLean, D. L. A gradient in endogenous rhythmicity and oscillatory drive matches recruitment order in an axial motor pool. J Neurosci. 32, 10925-10939 (2012).
  63. Rohrbough, J., Pinto, S., Mihalek, R. M., Tully, T., Broadie, K. latheo, a Drosophila gene involved in learning, regulates functional synaptic plasticity. Neuron. 23 (1), 55-70 (1999).
  64. McKeown, K. A., Moreno, R., Hall, V. L., Ribera, A. B., Downes, G. B. Disruption of Eaat2b, a glutamate transporter, results in abnormal motor behaviors in developing zebrafish. Dev Biol. 362 (2), 162-171 (2012).
  65. Carmean, V., et al. pigk mutation underlies macho behavior and affects Rohon-Beard cell excitability. J Neurophysiol. 114 (2), 1146-1157 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rdze kr gowy danio pr gowanegordzeniowe neurony sensorycznerdzeniowe neurony ruchowepreparat in situweterynaryjny klej chirurgicznymonta na szpilkach wolframowychkomora z elastomeru silikonowegounieruchomienie w roztworze Ringeraszklana mikropipeta
Przygotowanie rdzenia kręgowego danio pręgowanego in situ do zapisów elektrofizjologicznych z rdzeniowych neuronów czuciowych i ruchowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.