Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55510

⸱

12 sierpnia 2017

 ,  , 
1Centre de Recherche en Transplantation et Immunologie UMR 1064, INSERM, Université de Nantes, 2Institut de Transplantation Urologie Néphrologie (ITUN), CHU Nantes

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Streszczenie

Głównym problemem w transplantacji jest osiągnięcie specyficznej tolerancji poprzez indukcję komórek regulatorowych. Zrozumienie mechanizmów tolerancji wymaga wiarygodnych modeli. W tym miejscu opisano modele tolerancji na alloprzeszczep serca u szczurów, indukowany przez blokadę sygnałów kostymulacji lub przez regulację w górę cząsteczek immunoregulacyjnych poprzez transfer genów. Każdy z tych modeli pozwolił na generowanie in vivo komórek regulatorowych, takich jak limfocyty T regulatorowe (Treg), limfocyty B regulatorowe (Bregs) lub komórki szpiku regulatorowego (RegMCs). W tym manuskrypcie opisujemy dwa uzupełniające się protokoły, które zostały wykorzystane do identyfikacji i zdefiniowania aktywności komórek regulatorowych in vitro i in vivo w celu określenia ich odpowiedzialności za indukcję i utrzymanie tolerancji. Po pierwsze, test supresyjny in vitro umożliwił szybką identyfikację komórek o zdolności supresyjnej w efektorowej odpowiedzi immunologicznej w sposób zależny od dawki i może być wykorzystany do dalszych analiz, takich jak pomiar cytokin lub cytotoksyczności. Po drugie, adoptywny transfer komórek od tolerancyjnie leczonego biorcy do nowo napromieniowanego biorcy przeszczepionego podkreślił tolerogenne właściwości tych komórek w kontrolowaniu odpowiedzi immunologicznej kierowanej przeszczepem i / lub przekształcaniu nowych komórek regulatorowych (określanych jako tolerancja zakaźna). Metody te nie są ograniczone do komórek ze znanymi markerami fenotypowymi i mogą być rozszerzone na dowolną populację komórek. Ponadto allospecyficzność komórek regulatorowych kierowana przez dawcę (ważny cel w tej dziedzinie) może być oceniana przy użyciu komórek dawcy od osób trzecich lub przeszczepu in vitro lub in vivo. Wreszcie, aby określić specyficzną zdolność tolerogenną tych komórek regulatorowych, udostępniamy protokoły oceny humoralnej odpowiedzi przeciwciał anty-dawcy oraz zdolności biorcy do rozwinięcia odpowiedzi humoralnej przeciwko nowym lub dawniej znanym antygenom. Opisane modele tolerancji mogą być wykorzystane do dalszej charakterystyki komórek regulatorowych, identyfikacji nowych biomarkerów i cząsteczek immunoregulacyjnych, a także można je dostosować do innych modeli przeszczepów lub chorób autoimmunologicznych u gryzoni lub ludzi.

Wprowadzenie

Przeszczep serca u szczura jest wiarygodnym modelem przeszczepu narządów do oceny leczenia indukcji tolerancji, do rozszyfrowania mechanizmów indukcji i utrzymania tolerancji, a także ma potencjał do indukowania funkcjonalnie kompetentnych i dominujących komórek regulatorowych. Poniższe protokoły opisują w pełni niezgodny heterotopowy przeszczep serca od szczura dawcy Lewisa 1W (LEW.1W, RT1u) do szczura biorcy Lewisa 1A (LEW.1A, RT1a). W tej kombinacji przeszczepów ostre odrzucenie następuje szybko (w ciągu około 7 dni) i można je łatwo ocenić za pomocą pomiaru bicia przeszczepu poprzez badanie palpacyjne jamy brzusznej. Tutaj proponujemy trzy protokoły indukujące tolerancję na alloprzeszczep serca u szczurów. W tych modelach tolerancja jest indukowana i/lub utrzymywana przez różne typy komórek regulatorowych. Po pierwsze, blokowanie interakcji CD40-CD40L z adenowirusem kodującym CD40Ig (AdCD40Ig) indukowało wytwarzanie limfocytów Treg CD8 + zdolnych do indukowania tolerancji po adoptywnym przeniesieniu do wtórnie przeszczepionych biorców1. Co więcej, wyczerpanie komórek CD8 + (z przeciwciałami anty-CD8α) u biorców leczonych AdCD40Ig generowało Bregs i RegMCs2. Dogłębna analiza właściwości limfocytów Treg CD8+ podkreśliła kluczową rolę kilku cząsteczek immunoregulacyjnych zdefiniowanych jako interleukina-34 (IL-34) i fibroleukina-2 (FGL-2)3,4,5,6. Podczas gdy nadekspresja IL-34 (z wektorem AAV) indukowała Treg poprzez wytwarzanie RegMCs, nadekspresja FGL-2 indukowała Bregs, leżące u podstaw złożonej sieci komórek regulatorowych.

Ponieważ przewlekłe odrzucenie rozwija się powoli i jest długotrwałe, konieczna jest dogłębna analiza, aby odróżnić tolerancję od chronicznego odrzucenia. Przeszczep jest zwykle oceniany pod kątem naciekania komórek, zwłóknienia, pogrubienia ściany naczyniowej i odkładania się C4d dopełniacza za pomocą immunohistologii7. Podczas gdy metody histologiczne wymagają uśmiercenia zwierzęcia lub biopsji przeszczepu, tutaj opisujemy prostą metodę oceny różnych cech tolerowanego przeszczepu allogenicznego: pojawienia się i funkcji komórek regulatorowych oraz odpowiedzi przeciwciał swoistych dla dawcy z próbki krwi za pomocą cytometrii przepływowej (tutaj zastosowaliśmy sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)).

Utrzymanie tolerancji na przeszczep allogeniczny po zatrzymaniu leczenia jest zazwyczaj związane z indukcją komórek regulatorowych8. W ostatnich dziesięcioleciach badania skoncentrowane na limfocytach Treg CD4+ jednogłośnie scharakteryzowały je za pomocą kluczowych markerów Foxp3+, CD25high i CD127-9,10,11. Podobnie, kilka markerów przypisano limfokomórkom Treg CD8+, takich jak CD122+, CD28-, CD45RClow, PD1+ i Helios+1,12,13,14,15,16,17. Z biegiem lat ekspresja GITR, CTLA4 i cytokin (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) była dodatkowo związana z profilem Treg3,4,6,13,18,19,20,21. Jednak pojawiające się populacje komórek regulatorowych, takie jak Bregs, RegMC lub NKTregs, nie mają odpowiednich specyficznych markerów. Rzeczywiście, Bregs są najczęściej zgłaszane jako niedojrzałe komórki CD24 +, z niejednoznaczną ekspresją CD27 i czasami produkcją IL-10, TGFβ lub granzyme B22,23,24. Złożoność linii komórek szpikowych wymaga kombinacji kilku markerów w celu zdefiniowania ich profilu regulacyjnego lub prozapalnego, takich jak CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a lub CD16325,26. Wreszcie, niektóre markery zostały zgłoszone w celu identyfikacji NKTregs, takich jak CD11b+, CD27+, TGFβ+, ale potrzebne są dalsze badania, aby dokładniej opisać je fenotypowo27,28,29,30,31,32. W związku z tym dowody na aktywność supresyjną są niezbędne do legitymizacji dalszego opisu fenotypowego w celu identyfikacji nowych biomarkerów, nowych mediatorów immunoregulacyjnych i rozszerzenia zakresu na nowe terapie komórkowe.

Proponujemy dwie uzupełniające się metody oceny aktywności tłumiącej komórek. Po pierwsze, metoda in vitro polega na hodowli komórek supresyjnych za pomocą znakowanych efektorowych limfocytów T stymulowanych przez allogeniczne komórki prezentujące antygen dawcy (APC) w różnych proporcjach przez 6 dni oraz analizie proliferacji efektorowych limfocytów T, która odzwierciedla supresję immunologiczną kierowaną przez dawcę. Komórki szczurów leczonych mogą być bezpośrednio porównane z komórkami szczurów nieleczonych i szczurów szczepionych nieleczonych pod kątem aktywności supresyjnej (lub z dowolną inną populacją komórek regulatorowych), w zakresie proporcji supresor:efektor. Co więcej, metoda ta nie wymaga przeszczepu, a wyniki uzyskuje się w ciągu 6 dni. Po drugie, metoda in vivo polega na przeniesieniu zamierzonych komórek regulatorowych z leczonego szczura do nowo napromienionego, przeszczepionego biorcy. Podczas gdy limfocyty B, komórki szpikowe lub limfocyty T od nieleczonych wcześniej szczurów zwykle nie są w stanie zahamować ostrego odrzucenia przeszczepu i przedłużyć przeżycia przeszczepu po transferze adoptywnym, komórki o wzmocnionej aktywności supresyjnej od leczonych biorców mają następujące atrybuty1,2,3,4,33. Limfopenia wywołana napromienianiem biorcy jest zalecana, aby umożliwić komórkom przenoszonym adoptywnie zachowanie obojętności homeostazy krwi i łatwiejsze opanowanie odpowiedzi immunologicznej przeciwko dawcy. W przypadku obu metod, wykorzystanie in vitro allogenicznych APC stron trzecich lub adoptywny transfer komórek supresyjnych in vivo do biorców przeszczepionych sercem strony trzeciej umożliwia analizę swoistości anty-dawcy. Podczas gdy metoda in vivo wymaga znacznej liczby komórek, słabo reprezentowane subpopulacje komórek mogą być łatwiej ocenione pod kątem aktywności supresyjnej in vitro33.

Odpowiedzi humoralne mogą być również mierzone w celu oceny stanu tolerancji i kontroli ukierunkowanych odpowiedzi przeciwciał na antygeny dawcy. Rzeczywiście, tolerancja może charakteryzować się brakiem odpowiedzi humoralnej wobec dawcy, ale zachowaniem zdolności biorców do rozwinięcia odpowiedzi humoralnej na nowe antygeny i zachowaniem odpowiedzi pamięciowych. Po pierwsze, zasada wykrywania alloprzeciwciał opiera się na rozpoznawaniu komórek dawcy przez przeciwciała biorcy po inkubacji typu komórki dawcy z surowicą od przeszczepionego biorcy. Po drugie, odpowiedzi humoralne skierowane na antygeny egzogenne można ocenić po stymulacji długotrwale tolerancyjnych biorców hemocyjaniną przez dziurkę od klucza (KLH) emulgowaną pełnym adiuwantem Freunda. Obecność swoistych przeciwciał IgM i IgG przeciwko antygenom można wykryć odpowiednio 4 i 13 dni po immunizacji za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)34. Po trzecie, zachowanie odpowiedzi pamięci immunologicznej można ocenić poprzez wstrzyknięcie ksenogenicznych krwinek czerwonych (RBC) w dniach -7 i +3 przeszczepu oraz barwienie krwinek czerwonych surowicą biorcy pobraną w dniach +8 i +17 po przeszczepie. Wszystkie te metody pozwalają na identyfikację podtypów immunoglobulin przy użyciu specyficznych przeciwciał drugorzędowych i szybkie uzyskanie wyników w czasie krótszym niż 1,5 godziny przez barwienie FACS lub kilka godzin przez ELISA.

Na koniec, te protokoły są przeznaczone do charakterystyki modeli transplantacyjnych i mogą być do pewnego stopnia stosowane do modeli chorób autoimmunologicznych. Zasady metody można przenieść na wszystkie gatunki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Wszystkie protokoły tutaj zostały zatwierdzone przez komisję etyki i powinny być wykonywane w sterylny sposób.

1.Generowanie tolerancji w modelu alloprzeszczepu serca u szczura

  1. Procedura przeszczepu allogennego LEW.1W do LEW.1A
    1. Znieczulić samca szczura LEW.1W dawcą za pomocą inhalacji izofluranu-O2, uzupełnionej 1%N2Opo 5 minutach. Umieścić zwierzę w odleżynie grzbietowej i zdezynfekować brzuch betadyną w celu wykonania torakotomii (tj. nacięcia w jamie opłucnej klatki piersiowej).
      1. Zacisnąć żyły główne dolne i górne, związać je i przeciąć. Następnie przetnij tętnicę płucną i aortę i zachowaj przeszczep w zimnym 0,9% NaCl.
    2. Znieczulić 250 g samca szczura biorcy LEW.1A (w wieku 8-12 tygodni) za pomocą inhalacji izofluranu-O2, uzupełnionej 1%N2Opo 5 minutach. Umieścić zwierzę w odleżynie grzbietowej i zdezynfekować jamę brzuszną betadyną w celu wykonania laparotomii ksylonowej (tj. dużego nacięcia od wyrostka mieczykowatego do spojenia łonowego).
      1. Uzewnętrznić jelita, zacisnąć naczynia krwionośne w jamie brzusznej, wykonać zespolenie terminowo-boczne (tj. połączenie między końcem jednego kanału a ścianą drugiego) między aortą przeszczepu a aortą brzuszną oraz między tętnicą płucną a żyłą główną jamy brzusznej i usunąć zaciski.
    3. Zszyj płaszczyznę mięśniową i skórę, a następnie zdezynfekuj betadyną.
    4. Wstrzyknąć podskórnie (podskórnie) nalbufinę (środek przeciwbólowy) w dawce 6 mg/kg mc. i oksytetracyklinę (antybiotyk) domięśniowo (domięśniowo) i umieścić zwierzę pod lampą grzewczą, aż zwierzę się obudzi. Buprenorfinę (opioidy) (50 μg/kg) domięśniowo i meloksykam (niesteroidowy lek przeciwzapalny) (0,3 mg/kg) wstrzykuje się domięśniowo w dniu przeszczepu i jeden dzień po nim.
  2. Indukcja tolerancji przez blokadę oddziaływań kostymulujących
    1. Wykonaj kroki od 1.1.1. do 1.1.2.
    2. W sklasyfikowanym obszarze A2 w pomieszczeniu dla zwierząt rozcieńczyć 2 x10 10 zakaźnych cząstek AdCD40Ig (adenowirusa kodującego CD40Ig, chimeryczną cząsteczkę, która blokuje interakcje CD40-CD40L) w roztworze mleczanu Ringera, aby osiągnąć końcową objętość 150 μl i wstrzyknąć w 3 punkty (3 x 50 μl) w ścianę komory wierzchołka przeszczepu.
    3. Wykonaj kroki od 1.1.3 do 1.1.4.
      UWAGA: Leczenie AdCD40Ig może być związane z wstrzyknięciami przeciwciał anty-CD8α, anty-ICOS lub anty-CD282,35,36.
  3. Indukcja tolerancji przez nadekspresję białka rekombinowanego
    1. Rozcieńczyć 1 x10 12 genom wirusa szczura IL34-rekombinowanego AAV w roztworze mleczanu Ringera, aby osiągnąć końcową objętość 100 μl. Znieczulić 150 g szczura LEW.1A inhalacją izofluranu-O2 i wstrzyknąć dożylnie (dożylnie) do żyły prącia.
    2. Miesiąc po wstrzyknięciu AAV-IL34 należy wykonać przeszczep LEW.1W na biorcy LEW.1A zgodnie z protokołem 1.1.

2. Ocena in vitro aktywności supresyjnej komórek przez mieszane reakcje limfocytów (MLR)

Uwaga: Aktywność supresyjna komórek od leczonych tolerancyjnych szczurów powinna być porównana z równoważną populacją od syngenicznie przeszczepionych biorców lub nieleczonych szczurów.

  1. Izolacja allogenicznych APC: plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC)
    1. Znieczulić samca szczura dawcy nieposiadającego LEW.1W za pomocą inhalacji izofluranu-O2 uzupełnionej 1%N2Opo 5 minutach. Umieścić zwierzę w odleżynach grzbietowych i zdezynfekować brzuch betadyną w celu wykonania splenektomii. Usuń śledzionę, przechodząc przez naczynia, zachowaj śledzionę w zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami 1X (PBS) i zszyj zwierzę.
    2. Przenieś śledzionę do naczynia, usuń 1X PBS i przelej 5 ml 0,2% kolagenazy D. Aby poprawić trawienie enzymatyczne, należy pokroić śledzionę na małe kawałki i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Dodać 500 μl 0,1 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), przenieść kawałki śledziony na sito i rozdrobnić śledzionę tłokiem strzykawki w celu dysocjacji komórek. Przenieś do probówki i umyj komórki 15 ml 1X PBS. Wirować 10 min przy 430 x g. Odrzucić supernatant.
    4. Aby wyeliminować erytrocyty i płytki krwi, ponownie zawieś osad splenocytów w 10 ml roztworu hipotonicznego i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Umyć 1X PBS i odwirować 10 minut przy 190 x g. Odrzucić supernatant.
    5. Usuń włókna kolagenowe, filtrując na filtrze tkankowym 100 μm. Policz komórki, aby dostosować stężenie komórek do 5 x 107 komórek/ml w 1X PBS/2% płodowa surowica cielęca (FCS)/0,5 mM EDTA.
      Uwaga: Liczba splenocytów powinna wynosić od 4 x 108 do 7 x 108 komórek.
    6. Wzbogać dla interesujących komórek przez selekcję ujemną przed sortowaniem komórek. Inkubować 15 minut w temperaturze 4 °C z oczyszczonymi przeciwciałami 2 μg/ml specyficznymi dla limfocytów T (anty-TCRαβ, klon R7/3 i klon anty-TCRγδ, klon V65), komórek B (klon anty-CD45RA, OX33) i komórek NK (anty CD161, klon 3.2.3), przemyć 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA i odwirować 10 minut przy 430 x g. Odrzucić supernatant.
    7. Umyj kulkami magnetycznymi 3 razy za pomocą 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA. Użyj 3,5 μl kulek/106 splenocytów, przemyj dodając 30 ml 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, umieść na 1 minutę na magnesie i wyrzuć supernatant. Powtórz dwa razy. Ponownie zawiesić kulki w 10 objętościach 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA (na przykład 35 μL kulek rozcieńcza się w 350 μL 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA).
    8. Usunąć niechciane komórki, mieszając splenocyty z kulkami magnetycznymi przez 10 minut w temperaturze 4 °C pod wpływem mieszania, umieścić probówkę na magnesie na 1 minutę i przenieść supernatant do nowej probówki. Powtórz dwa razy. Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do 5 x 107 komórek/ml w 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      UWAGA: Liczba wzbogaconych splenocytów powinna mieścić się w przedziale od 5 x 107 do 9 x 107.
    9. Wybarwić komórki za pomocą znakowanych przeciwciał do dalszego sortowania pDC: wykluczyć pozostałe limfocyty T (anty-TCRαβ, klon R7/3) lub komórki B (klon anty-CD45RA, OX33) i posortować komórki CD4 + (klon anty-CD4, OX35) CD45R + (anty-CD45R, klon His24). Oznacz koraliki każdym Ab, aby ustalić macierz kompensacji na FACS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przemyć 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
    10. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 5 x 107 komórek/ml, przefiltrować na filtrze tkankowym 60 μm i oznaczyć martwe komórki, dodając DAPI w końcowym stężeniu 0,1 μg/ml. Sortuj komórki za pomocą sortera komórek z dyszą 70 μm, bramkując na DAPI-TCR-CD45RA-CD4+CD45R+, jak pokazano na Rysunek 1.
  2. Izolacja efektorowych limfocytów T odpowiedzi (CD4 + CD25 - limfocyty T)
    1. Zbierz śledzionę od nieleczonego, nieszczepionego, naiwnego szczura LEW.1A i zachowaj ją w zimnym 1X PBS.
    2. Przenieś śledzionę na sito umieszczonym w naczyniu i dodaj 10 ml 1X PBS. Zmiażdż śledzionę tłokiem strzykawki, aby oddzielić komórki. Przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml, przemyć 1X PBS i odwirować 10 minut przy 430 x g. Odrzucić supernatant.
    3. Aby wyeliminować erytrocyty i płytki krwi, ponownie zawiesić osad splenocytu w 10 ml roztworu hipotonicznego na 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć w 1X PBS i odwirować po 10 minutach 190 x g. Wyrzucić supernatant.
    4. Usuń włókna kolagenowe, filtrując na filtrze tkankowym 100 μm. Policz komórki, aby dostosować stężenie komórek do 5 x 107 komórek/ml w 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      UWAGA: Liczba splenocytów powinna wynosić od 3 x 108 do 5 x 108 komórek.
    5. Wzbogać interesujące komórki przed sortowaniem. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C z oczyszczonymi przeciwciałami o stężeniu 2 μg/ml specyficznymi dla komórek CD8 (anty-CD8α, klon OX8), komórek B (klon anty-CD45RA, OX33), komórek NK (anty CD161, klon 3.2.3), komórek szpikowych (anty-CD11b/c, klon OX42), limfocytów T gamma delta (anty-TCRγδ, klon V65). Następnie przemyć 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA i odwirować 10 minut przy 430 x g. Odrzucić supernatant.
      UWAGA: Aby odsortować naturalne limfocyty M³ CD8 + od naiwnych szczurów w tym samym czasie, co limfocyty T efektorowe CD4 +, nie należy dodawać anty-CD8α Ab podczas wyczerpania.
    6. Umyj kulki magnetyczne 3 razy za pomocą 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, jak opisano w kroku 2.1.7.
    7. Usunąć niechciane komórki, mieszając splenocyty z kulkami magnetycznymi przez 10 minut w temperaturze 4 °C pod wpływem mieszania, następnie umieścić probówkę na magnesie na 1 minutę i przenieść supernatant do nowej probówki. Powtórz dwa razy. Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do 5 x 107 komórek/ml w 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      UWAGA: Liczba splenocytów powinna mieścić się w przedziale od 5 x 107 do 8 x 107 komórek.
    8. Dodać znakowane przeciwciała do sortowania limfocytów T CD4 + CD25: anty-TCRαβ (klon R7/3), anty CD4 (klon OX35), anty-CD25 (klon OX39) i inkubować 15 minut w temperaturze 4 °C. Aby jednocześnie sortowaćniskie limfocyty Treg CD8+CD45RC, dodaj anty-CD45RC Ab (klon OX22). Oznacz koraliki każdym Ab, aby ustawić matrycę kompensacyjną do dalszego przetwarzania w cytometrii przepływowej. Przemyć komórki 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA i wyrzucić supernatant.
    9. Ponownie zawiesić komórki do 5 x 107 komórek/ml, przefiltrować na filtrze tkankowym 60 μm i oznaczyć martwe komórki, dodając DAPI w końcowym stężeniu 0,1 μg/ml. Posortuj komórki za pomocą sortera komórek z dyszą 70 μm, bramkując na komórkach DAPI -TCR+CD4+CD25- jako komórkach odpowiadających (i, jeśli to konieczne, DAPI -TCR+CD4-CD45RC nisko jak komórki tłumiące CD8+ Treg), jak pokazano na Rysunek 2.
  3. Izolacja komórek supresyjnych
    Uwaga: Podziel śledzionę na dwie podwielokrotności: posortuj jedną na limfocyty B, komórki szpikowe i komórki NK, a drugą na limfocyty T CD4 + i CD8 + CD45RC, aby ocenić ich funkcję supresyjną.
    UWAGA: W przypadku adoptywnego transferu komórek zachowaj 1 x 108 splenocytów, aby w razie potrzeby służyły jako pozytywna kontrola tolerancji przez transfer adoptywny.
    1. Sortowanie limfocytów B, komórek szpikowych i komórek NK
      1. Postępuj zgodnie z protokołami od 2.1.1 do 2.1.5.
      2. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C z nieznakowanymi przeciwciałami specyficznymi dla limfocytów T o stężeniu 2 μg/ml (klon anty-TCRαβ, R7/3 i klon anty-TCRγδ, V65), przemyć 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA i odwirować 10 minut przy 430 x g. Odrzucić supernatant.
      3. Umyj kulkami magnetycznymi 3 razy za pomocą 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, jak opisano w kroku 2.1.7.
      4. Wymieszaj splenocyty z kulkami magnetycznymi, aby usunąć niechciane komórki i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 4 °C pod wpływem mieszania, a następnie umieść probówkę na magnesie na 1 minutę i przenieś supernatant do nowej probówki. Powtórz dwa razy. Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do 5 x 107 komórek/ml w 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Dodaj znakowane przeciwciała do splenocytów, aby posortować komórki o podejrzewanej aktywności supresyjnej, takie jak komórki szpikowe (anty-CD11b / c, klon OX42), limfocyty B (klon anty-CD45RA, OX33) lub komórki NK (klon anty-CD161, 3.2.3). Oznacz koraliki każdym Ab, aby ustalić macierz kompensacji na FACS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przemyć 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 5 x 107 komórek/ml, przefiltrować na filtrze tkankowym 60 μm i oznaczyć martwe komórki, dodając DAPI w końcowym stężeniu 0,1 μg/ml. Posortuj komórki za pomocą sortera komórek z dyszą 70 μm, bramkując DAPI-CD11b / c + dla komórek szpikowych, CD45RA+ dla komórek B i CD161 + dla komórek NK, jak pokazano na Rysunek 3.
    2. Sortowanie limfocytów T CD4 + CD8 + CD45RC
      1. Postępować zgodnie z protokołami od 2.2.1 do 2.2.4.
      2. W przypadku selekcji negatywnej na kolumnie magnetycznej inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C z oczyszczonymi przeciwciałami o stężeniu 2 μg/ml specyficznymi dla komórek B (klon anty-CD45RA, OX33), komórek NK (klon anty CD161, 3.2.3), komórek szpikowych (klon anty-CD11b/c, OX42), limfocytów T gamma delta (anty-TCRγδ, klon V65), przemyć je 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA i odwirować 10 minut przy 430 x g. Odrzucić supernatant.
      3. Umyj kulki magnetyczne 3 razy za pomocą 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA, jak opisano w kroku 2.1.7.
      4. Usunąć niechciane komórki, mieszając splenocyty z kulkami magnetycznymi przez 10 minut w temperaturze 4 °C pod mieszaniem, a następnie umieścić probówkę na magnesie na 1 minutę i przenieść supernatant do nowej probówki. Powtórz dwa razy. Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do 5 x 107 komórek/ml w 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      5. Dodaj znakowane przeciwciała do komórek, aby posortować Tregi: anty-TCRαβ (klon R7/3), anty-CD4 (klon OX35), anty-CD45RC (klon OX22). Oznacz koraliki każdym Ab, aby ustalić macierz kompensacji na FACS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przemyć 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA.
      6. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 5 x 107 komórek/ml, przefiltrować na tkance 60 μm i oznaczyć martwe komórki, dodając DAPI w końcowym stężeniu 0,1 μg/ml. Sortuj komórki za pomocą sortera komórek z dyszą 70 μm, bramkując na DAPI -TCR+CD4+CD45RCnisko jak CD4+ Tregs i DAPI -TCR+CD4-CD45RCnisko jak CD8+ Tregs ( Rysunek 4).
        UWAGA: Anty-CD8α Ab (klon OX8) może być stosowany zamiast anty-CD4 Ab, jeśli limfocyty T są odróżniane od komórek nie-T CD4 + przez znakowanie anty-TCR. Nadmiar limfocytów Treg CD4 + należy sortować w oczekiwaniu na śmierć komórki z powodu znakowania barwnikiem proliferacji komórek (CPD).
  4. Znakowanie estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) komórek reagujących w celu pomiaru proliferacji
    1. Po posortowaniu komórek odpowiadających umyj komórki dwukrotnie 1X PBS.
    2. Zawiesić komórki w stężeniu 1 x 107 komórek/ml w 1X PBS i inkubować z 0,5 μM CFSE przez 5 minut w RT w ciemności. Zatrzymać reakcję, dodając FCS w stężeniu 1,5 razy większym niż objętość i odwirować przez 10 minut przy 430 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    3. Umyj dwukrotnie komórki kompletnym podłożem i policz komórki.
      Uwaga: Na tym etapie spodziewaj się 30% śmierci komórek.
  5. Znakowanie CPD CD4 + Treg do testu supresyjnego na komórkach efektorowych CD4 +
    UWAGA: Ten krok jest wymagany do odróżnienia Treg CFSE-CD4 + od proliferujących CFSE limfocytów T CD4 + proliferujących odpowiedź w 6 dniu kokultury poprzez bramkowanie na komórkach CPD.
    1. Po posortowaniu komórek CD4 + Tregs umyj komórki dwukrotnie 1X PBS.
    2. Zawiesić komórki w stężeniu 1 x 107 komórek/ml w 1X PBS i inkubować z 10 μM CPD V450 przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    3. Umyj dwukrotnie komórki kompletnym podłożem i policz komórki.
      UWAGA: Na tym etapie spodziewaj się śmierci 30% komórek.
  6. Porady dotyczące kokultury
    1. Stosować hodowlę w pożywce zawierającej: pożywkę RPMI 1640 uzupełnioną beta-merkaptoetanolem (5 x 10-5 M), penicyliną (100 U/ml), streptomycyną (0,1 mg/ml), pirogronianem sodu (1 mM), glutaminą (2 mM), buforem HEPES (1 mM), aminokwasami endogennymi (1X), FCS (10%).
    2. Komórki hodowlane w 96-dołkowych płytkach dolnych w kształcie litery U.
    3. Dodaj komórki w następującej kolejności: komórki supresyjne, komórki odpowiadające i komórki allogeniczne.
    4. Utrzymuj stałą liczbę reagujących limfocytów T i allogenicznych APC i testuj zakres liczby limfocytów Treg. Na przykład stosunek 4:4:1, 5 x 104 komórki supresyjne, 5 x 104 komórki odpowiadające i 1,25 x 104 komórki allogeniczne oraz stosunek 2:4:1, 2,5 x 104 komórki supresyjne, 5 x 104 komórki odpowiadające i 1,25 x 104 komórki allogeniczne.
    5. Utrzymuj proporcję 5 x 104 komórek odpowiadających na 200 μl pożywki/dołka.
    6. W przypadku kontroli należy uwzględnić kilka studzienek z reagującymi limfocytami T bez allogenicznych APC (kontrola ujemna) i reagującymi limfocytami T z allogenicznymi APC bez komórek regulatorowych (kontrola pozytywna) do bramkowania CFSE w dniu 6 (patrz krok 2.7.6.).
  7. Barwienie i analiza FACS po 6 dniach coculture
    UWAGA: Proliferację komórek efektorowych można ocenić w kilku punktach czasowych. Należy zauważyć, że proliferacja jest wykładnicza: wraz ze wzrostem podziału komórek można zaobserwować więcej różnic między warunkami supresyjnymi a kontrolą negatywną.
    1. Przenieść komórki z 96-dołkowych płytek dolnych U do 96-dołkowych płytek dolnych V i odwirować 1 minutę przy 1 200 x g w temperaturze 4 °C.
    2. Przechowywać supernatant w nowej płytce w temperaturze -20 °C w celu zmierzenia poziomu cytokin, jeśli jest to konieczne.
    3. Przemyć komórki 200 μl 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA na studzienkę i odwirować przez 1 minutę przy 1 200 x g w temperaturze 4 °C.
    4. Dodaj przeciwciała do komórek, aby dalej atakować reagujące limfocyty T: anty-TCRab (klon R7/3) i anty-CD4 (klon OX35). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C i przemyć dwukrotnie 200 μl 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA na studzienkę. Odrzucić supernatant.
    5. Dodać 100 μl DAPI rozcieńczonego w 0,1 μg/ml w 1X PBS i odczytać płytkę za pomocą analizatora FACS.
    6. Przeanalizuj profil CFSE, bramkując na ujemnych DAPI (żywe komórki), ujemnych CPD (Tregi inne niż CD4 +) TCR + CD4 +. Niestymulowane komórki reagujące mają maksymalną jasność CFSE, jak pokazano na histogramie Rysunek 5 w lewym dolnym rogu. W obecności allogenicznych APC komórki reagujące mają maksymalną proliferację i minimalną jasność CFSE (na dole, w środku). W obecności allogenicznych APC i komórek regulatorowych, komórki efektorowe mają średnią proliferację i jasność CFSE (na dole, po prawej).

3. Ocena in vivo aktywności supresyjnej komórek przez adoptywny transfer komórek u biorcy przeszczepionego sercem

UWAGA: Napromienianie jest potrzebne do eliminacji komórek gospodarza i sprzyjania do wszczepienia i proliferacji komórek dawcy.

  1. Naświetlić biorców przeszczepu wcześnie w dniu poprzedzającym przeszczep, aby przygotować biorcę. Znieczulić szczury domięśniowo wstrzyknięciem ksylazyny (8 mg/kg)-ketaminy (80 mg/kg) i napromieniować je promieniami rentgenowskimi w dawce 4,5 Gy.
  2. Postępuj zgodnie z protokołem 2.3, aby wyizolować interesujące komórki.
    UWAGA: W razie potrzeby zachowaj 1 x 108 splenocytów, aby służyły jako pozytywna kontrola tolerancji przez transfer adopcyjny.
  3. 12 godzin po napromienianiu (dzień przed przeszczepem, wieczorem) znieczulić szczury przez inhalację 4% izofluranu-O2 i podać komórki (5,0 x 107 limfocytów T, 3,0 x 107 komórek B, 3,0 x 107 komórek szpikowych lub 1,50 x 108 splenocytów jako pozytywna kontrola tolerancji przez transfer adoptywny) dożylnie do żyły prącia.
    UWAGA: Liczba komórek wymagana do tolerancji przez transfer adoptywny zależy od aktywności supresyjnej komórek.
  4. Następnego dnia postępuj zgodnie z protokołem 1.1, aby wykonać przeszczep allogeniczny. Śledź ewolucję przeszczepu przez badanie palpacyjne przez jamę brzuszną.

4. Wykrywanie przeciwciał specyficznych dla dawcy

UWAGA: Odpowiedzi IgG skierowane do dawcy przeszczepu są mierzone poprzez inkubację komórek dawcy z surowicą biorcy. Odejmij tło wywołane bezpośrednim barwieniem komórek B LEW.1W poprzez inkubację komórek z syngeniczną surowicą LEW.1W.

  1. Pobrać krew od szczurów i odwirować przez 15 minut w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C. Zachowaj surowicę. Surowica może być przechowywana w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyta. Dezaktywować dopełniacz w surowicy przez inkubację przez 30 minut w temperaturze 56 °C.
  2. Zbierz śledzionę od dawcy szczura LEW.1W i zachowaj ją w zimnym 1X PBS. Wykonaj kroki 2.2.1. zgodnie z pkt 2.2.4. Dodaj 2 x 105 komórek/studzienkę do 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V. Odwirować przez 1 minutę przy 1,200 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
  3. Rozcieńczyć surowicę seryjnie od 1/10 do 1/270 w 1X PBS (4 rozcieńczenia/próbkę). Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z 25 μl rozcieńczonej surowicy/basenika. Przewiduj liczbę podtypów IgG specyficznych dla dawcy (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) do analizy na próbkę (1 surowica x 4 rozcieńczenia x 4 podtypy IgG). Przemyć komórki 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA i wyrzucić supernatant.
  4. Inkubować komórki z każdym mysim przeciwciałem IgG podtypu Ab znakowanym fluorochromem przez 30 minut w temperaturze 4 °C, jeden podtyp/basenik.
    Uwaga: Jeśli znakowane fluorochromem anty-szczurze Ig Ab są niedostępne, możliwe jest użycie oczyszczonego, nieznakowanego mysiego podtypu IgG przeciw szczurom Ab i znakowanego fluorochromem wtórnego anty-mysiego Ab. W zależności od dostępnych fluorochromów i konfiguracji cytometru, kilka podtypów anty-szczurzych IgG można przetestować w jednym dołku z odpowiednimi ustawieniami.
  5. Przemyć komórki dwukrotnie 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA i wyrzucić supernatant.
  6. Dodać 100 μl DAPI rozcieńczonego w stężeniu 0,1 μg/ml w PBS i odczytać płytkę za pomocą analizatora FACS.
  7. Odczytaj średnią intensywność fluorescencji (MFI) antyszczurzej podtypu IgG Ab znakowanej fluorochromem na wszystkich komórkach DAPI. Odejmij MFI uzyskany z naiwną surowicą LEW.1A na komórkach LEW.1W (barwienie tła, na dole po lewej) od MFI uzyskanego z surowicą od każdego biorcy na komórkach LEW.1W w odpowiednim rozcieńczeniu (dolny środkowy dla biorców odrzucających bez leczenia, którzy wykazują maksymalny MFI i prawy dolny róg dla leczonych tolerancyjnych biorców, którzy wykazują pośredni MFI) (Rycina 6).

5. Ocena reakcji humoralnych na antygeny egzogenne (naiwne i pamięciowe)

UWAGA: Surowica od szczurów przed transplantacją, leczeniem i szczepieniem powinna być używana jako negatywna kontrola reakcji humoralnych. W przeciwnym razie można użyć nieuodpornionych naiwnych szczurów. Surowica od biorców immunokompetentnych, tj. biorców immunizowanych egzoantygenem i odrzucających, jest stosowana jako pozytywna kontrola odpowiedzi humoralnej.

  1. Zdolność do rozwijania odpowiedzi humoralnej na nowy antygen (Rysunek 7)
    UWAGA: Ta metoda jest względną kwantyfikacją odpowiedzi humoralnych, ponieważ nie zawiera wzorca. Bezwzględna kwantyfikacja Ig byłaby możliwa przez dodanie zakresu rozcieńczeń szczurzych IgG lub IgM anty-KLH Ab o znanym stężeniu w kroku 5.1.6.
    1. Emulgować 50 μg KLH w 200 μl kompletnego adiuwantu Freunda i wstrzykiwać w ogon długo żyjących / tolerancyjnych biorców, kontrolujących nieleczonych biorców odrzucających lub naiwnych szczurów jako pozytywną kontrolę odpowiedzi humoralnych.
    2. Próbki krwi pobiera się po 4 i 13 dniach od szczepienia i odwirowuje przez 15 minut w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 4 °C. Z wyjątkiem górnej fazy, którą jest surowica. Zbierz surowicę od nieuodpornionych szczurów w celu kontroli negatywnej. Surowicę można zamrozić w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia testu ELISA.
    3. Pokryj płytki ELISA (płaskie dno) 50 μl/basenik KLH rozcieńczony w 10 μg/ml w 1X PBS przez noc w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że roztwór powlekający pokrywa wszystkie studzienki.
    4. Nadmiar niepowlekanego KLH usunąć przez pranie. Aby umyć, dodaj 150 μl/studzienkę buforu do płukania (1X PBS zawierający 0,1% Tween) i strzepnąć.
    5. Zablokować niespecyficzne wiązanie Ig biorcy przez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C ze 100 μl/studzienkę buforu płuczącego zawierającego 10% FCS. Umyj raz.
    6. Seryjnie rozcieńczyć surowicę biorczą w buforze do przemywania począwszy od 1/40 do 1/512, dodać 50 μl/basenik w powtórzeniach seryjnego rozcieńczenia do powlekanej płytki i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Utrzymywać niektóre studzienki wolne od surowicy w celu kontroli ujemnej. Umyć dwukrotnie.
    7. Dodać 50 μl z 1 μg/ml anty-szczurzej IgM Ab sprzężonej z biotyną do studzienek zawierających surowicę zebraną w 4 dniu u biorców lub 50 μl anty-szczurzej IgG sprzężonej z biotyną do studzienek zawierających surowicę zebraną w dniu 13 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Przemyć dwukrotnie.
    8. Dodać 50 μl/basenik streptawidyny sprzężonej z HRP w stężeniu 1 μg/ml przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć 3 razy.
    9. Dodać 50 μl substratu 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB) przez < 30 min w temperaturze pokojowej i zatrzymać reakcję z 25 μl 2 M kwasu siarkowego, gdy kontrole pozytywne są nasycone.
    10. Odczytać absorbancję przy 405 nm. Porównaj gęstość optyczną uzyskaną za pomocą surowicy biorcy z tą uzyskaną za pomocą naiwnej surowicy kontrolnej szczura.
  2. Ocena zdolności pamięci do odpowiedzi humoralnej (Rysunek 8)
    1. Na 7 dni przed przeszczepem należy wstrzyknąć dożylnie 109 ksenogenicznych krwinek czerwonych rozcieńczonych w 800 μl 1X PBS nieleczonym szczurom. Erytrocyty mogą pochodzić od owiec, koni lub innych gatunków.
    2. Wykonaj przeszczep i zastosuj leczenie tolerogenne.
    3. 3 dni po przeszczepie ponownie wstrzyknąć i.v.109 RBC rozcieńczony w 800 μl 1X PBS biorcom przeszczepu i szczurom nieszczepionym.
    4. Próbki krwi pobiera się 5 i 14 dni po drugim uodparnianiu i odwirowuje przez 15 minut przy 1 200 x g w temperaturze 4 °C w celu odzyskania górnej fazy surowicy. Surowica może być przechowywana w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyta. Dezaktywować dopełniacz w surowicach szczurzych przez inkubację trwającą 30 minut w temperaturze 56 °C przed użyciem.
    5. Dodać 2 x 105 RBC/studzienkę z 96-dołkowej płytki dolnej w kształcie litery V. Odwirować przez 1 minuty przy 1 200 x g w temperaturze 4 °C i ostrożnie odrzucić supernatant przez aspirację.
    6. Seryjnie rozcieńczyć surowicę 2-krotnie od 1/10 do 1/1280 w 1X PBS (8 rozcieńczeń/próbkę). Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z 25 μl rozcieńczonej surowicy/basenika. Przemyć komórki 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA i wyrzucić supernatant.
    7. Inkubować komórki z adsorbowanymi przez gatunki RBC podtypami IgG lub IgM przeciw szczurom, znakowanymi fluorochromem przez 30 minut w temperaturze 4 °C, jeden podtyp/basenik. Oceń szczurze IgM i IgG anty-RBC w surowicy pobranej odpowiednio 5 i 14 dni po immunizacji. Przemyć komórki dwukrotnie 1X PBS/2% FCS/0,5 mM EDTA i wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Jeśli znakowane fluorochromem przeciwciała Ig Ab są niedostępne, możliwe jest użycie oczyszczonego, nieznakowanego mysiego podtypu IgG przeciw szczurom i znakowanego fluorochromem wtórnego anty-mysiego Ab.
    8. Dodaj 100 μl DAPI rozcieńczonego w 0,1 μg/ml w 1X PBS i przeanalizuj komórki za pomocą analizatora FACS.
    9. Przedstawia MIF jako funkcję rozwodnienia dla każdej grupy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena aktywności supresyjnej po sortowaniu komórek APC (Rycina 1), komórki efektorowe oraz limfocyty Treg jednocześnie (Rycina 2), lub pojedynczo (Rycina 4), oraz wszelkie inne domniemane komórki regulacyjne (Rycina 3), można przeprowadzić in vivo poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie komórek regulacyjnych i in vitro poprzez pomiar jasności barwnika CFSE (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Adoptywny transfer całkowitych splenocytów do nowo przeszczepionego biorcy jest skutecznym sposobem wykrywania obecności komórek regulatorowych indukowanych lub wzmacnianych przez leczenie. Przemijająca limfopenia wywołana promieniowaniem gospodarza sprzyja przeżyciu komórek po przeniesieniu i ustaleniu tolerancji. Co więcej, subletalne napromieniowanie pozostawia komórkom o właściwościach tolerogennych czas na przekształcenie się w nowe komórki regulatorowe podczas rekonstytucji immunologicznej, zjawisko zwane tolerancj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została zrealizowana w kontekście projektu Labex IGO (n°ANR-11-LABX-0016-01), który jest częścią programu rządu francuskiego "Investissements d'Avenir" zarządzanego przez ANR (ANR-11-LABX-0016-01) oraz projektu IHU-Cesti finansowanego również przez program rządu francuskiego "Investissements d'Avenir", zarządzany przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Projekt IHU-Cesti jest również wspierany przez Nantes Métropole i Région Pays de la Loire.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
animals
LEW.1W i LEW.1A szczuryJanvier Labs, Francja8 tygodni, 
BN szczury dawcy zewnętrznegoJanvier Labs, Francja8 tygodni, 
nazwacompanynumer katalogowycomments
reagents
AdCD40IgViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francjadomowe plazmidy
IL34-AAVWirus Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francjadomowe plazmidy
FGL2-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francjadomowe plazmidy
anty-TCRabHybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka BrytaniaKlon R7/3Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów
anty-CD25Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka BrytaniaKlonOX39Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów
anty-CD8Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka BrytaniaKlon OX8Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów
anty-CD45RAHybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka BrytaniaKlon OX33Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów
anty-CD161Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka Brytania3.2.3 klonDomowej roboty hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów
anty-CD11b/cHybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka BrytaniaKlon OX42Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów
anty-TCRgdHybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka Brytania KlonV65Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów
anty-CD45RCHybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka BrytaniaKlon OX22Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów
anty-CD4Hybridoma z Europejskiej Kolekcji Hodowli Komórkowych, Salisbury, Wielka BrytaniaKlon OX35Domowa hodowla, oczyszczanie i sprzęganie fluororoforów
anty-CD45RBD Biosciences, Mountain View, CA#554881, His24 klon
anty-szczurzy IgG-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#112-096-071
antyszczurzy IgG1Serotec#MCA 194
antyszczurzy IgG2aSerotec#MCA 278
przeciwszczurzy IgG2bSerotec#MCA 195
antyszczurzy IgM-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#115-095-164
streptawidyna HRPBD Biosciences, Mountain View, CA#554066
KLHSigma Aldrich, St. Louis,USA#9013-72-3
PBS 1XThermo Fisher  Scientific Inc, USAFosforanowy roztwór buforowy bez wapnia i magnezu, 
Tween 20Sigma, Saint-Louis, USA#9005-64-5
Zestaw odczynników do substratów TMBBD Biosciences, Mountain View, CA#555214
Zestaw do proliferacji komórek CellTraceTM ThermoFisher  Scientific Inc, Stany Zjednoczone
RPMI 1640 średni 1XThermo Fisher  Scientific Inc, USA#31870-025
penicylina streptomycynaThermo Fisher  Scientific Inc, USA#15140-122
Bufor HepesThermo Fisher  Scientific Inc, USA#15630-056
aminokwasy endogenneThermo Fisher  Scientific Inc, USA#11140-035
Pirogronian soduThermo Fisher  Scientific Inc, USA#11360-039
2 beta merkaptoetanolSigma, Saint-Louis, USA
Barwnik proliferacji komórek eFluor® 450 CellThermo Fisher  Scientific Inc, Stany Zjednoczone#65-0842-85
GlutaminaSigma, Saint-Louis, Stany Zjednoczone
DAPIThermo Fisher  Scientific Inc, USA
Collagenase DRoche Diagnostics, Niemcy#11088882001
EDTASigma, Saint-Louis, USA
NaCl 0,9%Fresenius Kabi#B230561
Magnetyczne koraliki dynabeadsDynal, Invitrogen#11033Kozia anty-mysia IgG
One Comp eBeadsEbiosciences, San Diego, USA#01-1111-42
BetadineZapoznaj się z wytycznymi
IzofluranZapoznaj się z wytycznymi
NaplbufinaZapoznaj się z wytycznymi
TerramycynaZapoznaj się z wytycznymi
BuprenorfinaZapoznaj się z instytucjonalnymi Wytyczne
MeloksykamZapoznaj się z wytycznymi
Kompletny adiuwant
RompunZapoznaj się z wytycznymi
Mleczan pierścienia Zapoznajsię z wytycznymi
KetaminaZapoznaj się z wytycznymiinstytucjonalnymi
do lizy krwinek czerwonychRozcieńczyć 8,29 g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1 g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) i 37,2 mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) w 800 ml H2O. Dostosuj pH do 7,2-7,4 i uzupełnij do 1 l H2O.
Kolagenaza DRozcieńczyć 1 g kolagenazy w 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0,5%)Dodaj5 ml EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) i 20 ml FCS do 1 ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)Rozcieńczyć 50&mikro; g (= 1 fiolka) CFDA SE (składnik A) w 90μ l Roztwór DMSO (składnik B) w celu uzyskania roztworu podstawowego 10 mM. Następnie rozcieńczyć roztwór podstawowy w stosunku 1/20 000 w PBS 1X, aby uzyskać 0,5μ
Kompletna pożywka roztworu M do kokultury500 ml kompletna pożywka RPMI-1640 z 5 ml penicyliny (80 jednostek/ml) -steptomycyny (80 mg / ml), 5 ml L-glutaminy, 5 ml aminokwasów endogennych (100X), 5 ml pirogronianu sodu (100 mM), 5 ml buforu HEPES (1 M), 2,5 ml b merkaptoetanolu (7 ml bulionu 2-bmerkaptoetylu rozcieńczonego w 10 ml RPMI), 10% FCS
strong>name<strong>companynumer katalogowycomments
>equipments
falcon 50mlBD Biosciences, Mountain View, CA#227261
falcon 15mlBD Biosciences, Mountain View, CA#188271
sito
Corning plastikowe naczynia hodowlaneVWR, Pessac#391-0439
100&mikro; m oraz 60&mikro; m filtry tkankoweSefar NITEX, Heiden, Szwajcaria#03-100/44 i #03-60/35
96 dołków U płyty denne do kokultury  Płytka do hodowli tkankowej Falcon U-bottom, sterylna, Corning#353077
96 dołków V dolne płytki do barwienia FACSThermoScientifique, Dania#249570
96 dołków płaskie płytki ELISANunc Maxisorb
seringue do zmiażdżenia śledzionyBD Biosciences, Mountain View, CA#309649
Czytnik ELISASPARK 10M, Tecan, SzwajcariaSPARK 10M, Tecan, Szwajcaria
Wirówka
bain marie 
Promiennik promieni rentgenowskichLincolshire, AngliaFaxitron CP160
mieszadło
FACS Canto IIBD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria IIBD Biosciences, Mountain View, CA
magnesThermo Fisher  Scientific Inc, Stany Zjednoczone12302D
#C34554#M3148 #G3126 #D1306 #E5134 instytucjonalnymiinstytucjonalnymiinstytucjonalnymiinstytucjonalnymiinstytucjonalnymiFreundainstytucjonalnymiinstytucjonalnymiRoztwór <słoneczne

Bibliografia

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686(2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088(2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315(2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, É, Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regulacyjne limfocyty Tregulacyjne limfocyty Bregulacyjne komórki mieloidalnein vitro test supresyjnyadoptywny transfer komórekhumoralne przeciwciała przeciwko dawcyblokada kostymulacjinadekspresja indukowana transferem genówanaliza cytometrycznaprotokół sortowania komórek
Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.