Method Article

Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55519

⸱

April 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół preparacji, utrwalania i barwienia immunologicznego organów steroidogennych u larw Drosophila i dorosłych samic w celu zbadania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Oprócz narządów steroidogennych wizualizujemy unerwienie narządów steroidogennych, a także steroidogennych komórek docelowych, takich jak komórki macierzyste linii rozrodczej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W organizmach wielokomórkowych mała grupa komórek jest wyposażona w wyspecjalizowaną funkcję w swojej aktywności biogennej, wywołując ogólnoustrojową odpowiedź na wzrost i rozmnażanie. U owadów larwalny gruczoł przedpiersiowy (PG) i jajnik dorosłej kobiety odgrywają istotną rolę w biosyntezie głównych hormonów steroidowych zwanych ekdysteroidami. Te ekdysteroidogenne narządy są unerwione od układu nerwowego, przez który na czas biosyntezy wpływają sygnały środowiskowe. W tym miejscu opisano protokół wizualizacji narządów ekdysteroidogennych i ich interaktywnych narządów u larw i dorosłych osobników muszki owocowej Drosophila melanogaster, który zapewnia odpowiedni system modelowy do badania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Umiejętna sekcja pozwala nam utrzymać pozycje narządów ekdysteroidogennych i ich interaktywnych narządów, w tym mózgu, brzusznego rdzenia nerwowego i innych tkanek. Barwienie immunologiczne przeciwciałami przeciwko enzymom ekdysteroidogennym, wraz z transgenicznymi białkami fluorescencyjnymi napędzanymi przez swoiste tkankowo promotory, jest dostępne do znakowania komórek ekdysteroidogennych. Co więcej, unerwienie narządów ekdysteroidogennych może być również znakowane przez specyficzne przeciwciała lub zbiór sterowników GAL4 w różnych typach neuronów. W związku z tym narządy ekdysteroidogenne i ich połączenia neuronalne mogą być wizualizowane jednocześnie za pomocą technik immunostainingu i transgenicznych. Na koniec opisujemy, jak uwidocznić komórki macierzyste linii zarodkowej, których proliferacja i utrzymanie są kontrolowane przez ekdysteroidy. Metoda ta przyczynia się do kompleksowego zrozumienia biosyntezy hormonów steroidowych i ich neuronalnego mechanizmu regulacyjnego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W organizmach wielokomórkowych grupa komórek jest wyposażona w wyspecjalizowaną funkcję w swojej aktywności biogennej, która jest niezbędna dla całego organizmu. Aby spełnić swoje misje, każda tkanka lub narząd wyraża szereg genów związanych z ich funkcjami i komunikuje się z innymi tkankami, aby koordynować ich działania w kontekście rozwoju. Aby scharakteryzować takie wyspecjalizowane funkcje komórkowe i interakcje międzynarządowe, musimy określić grupę komórek wraz z innymi typami komórek, które są nienaruszone w architekturze wielokomórkowej.

Jednym z przykładów takich wyspecjalizowanych organów jest narząd steroidogenny, gdzie wiele enzymów biosyntetycznych pośredniczy w etapach konwersji z cholesterolu na aktywne hormony steroidowe1. Większość z tych genów enzymatycznych ulega specyficznej ekspresji w narządach steroidogennych, a szlak biosyntezy jest ściśle regulowany przez wiele bodźców zewnętrznych za pośrednictwem wejść humoralnych i neuronalnych. Po zsyntetyzowaniu hormony steroidowe są wydzielane do hemolimfy i są skierowane do wielu tkanek i narządów w celu regulacji ekspresji różnych genów2. Dlatego działanie hormonu steroidowego indukuje odpowiedź ogólnoustrojową w celu utrzymania homeostazy, wzrostu i reprodukcji.

Aby zbadać funkcje biosyntezy hormonów steroidowych i plejotropowe działanie hormonów steroidowych, Drosophila melanogaster może być wykorzystana jako odpowiedni system modelowy. W stadiach larwalnych hormon steroidowy owada, ekdysteroid, jest biosyntetyzowany w wyspecjalizowanym narządzie endokrynnym zwanym gruczołem przedpiersiowym (PG)3. W PG kilka enzymów ekdysteroidogennych specyficznie katalizuje wiele etapów konwersji z cholesterolu do ekdyzonu, który kontroluje linienie i metamorfozę na odpowiednich etapach rozwoju4. Dlatego dynamiczna zmiana miana ekdysteroidów jest regulowana przez wiele szlaków sygnałowych w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Z drugiej strony, w stadium dorosłym ekdysteroid odgrywa istotną rolę w fizjologii, w tym w reprodukcji, śnie, pamięci i długości życia5,6,7,8. Wiadomo, że ekdysteroid jest aktywnie biosyntetyzowany w jajniku, regulując postęp oogenezy6,7,8,9,10,11. Ostatnio informowaliśmy, że na liczbę komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) wpływa sygnalizacja ekdysteroidów i peptydów płciowych w odpowiedzi na bodźce godowe12.

Potężne narzędzia genetyki i biologii komórki D. melanogaster, w tym dobrze opisane informacje o genomie, binarne systemy ekspresji genów i techniki transgenicznego RNAi, umożliwiły nam zidentyfikowanie genów niezbędnych do biosyntezy ekdysteroidów w PG i jajniku13,14,15. Po zidentyfikowaniu genów ekdysteroidogennych, regulacja transkrypcji tych genów i dynamiczne lokalizacje produktów genów mogą być badane w szlaku biosyntezy16. W tym celu przeprowadza się ilościowo-odwrotną transkrypcję-PCR, hybrydyzację RNA in situ i analizę immunohistologiczną. Zastosowanie tych technik wiąże się z trudnym zadaniem; skomplikowane rozwarstwienie PG lub jajnika. W szczególności, PG muszki owocowej jest relatywnie mniejsza niż u innych owadów (np. jedwabnika i muchy muchowej), dlatego trzeba ćwiczyć istotną umiejętność preparowania muszek owocowych w celu pobrania próbek. Ponadto oba narządy ekdysteroidogenne otrzymują unerwienie z ośrodkowego układu nerwowego (OUN)17,18,19,20. Tak więc, aby uzyskać dokładne analizy anatomiczne, narządy ecdysteroidogenne powinny być nienaruszone wraz z OUN i innymi narządami, aby nie zakłócać ich połączeń neuronalnych.

Tutaj udostępniamy protokoły do preparowania i wizualizacji narządów steroidogennych w D. Melanogaster. Poznanie techniki preparacji jest kluczowym punktem wyjścia dla tych eksperymentów. Ponadto można z powodzeniem oznaczać narządy steroidogenne, a także ich narządy interaktywne kilkoma przeciwciałami i liniami napędowymi GAL4. Korzystając z tych technik, materiałów i genetyki, można badać kompleksowe mechanizmy biosyntezy hormonów steroidowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ogólny schemat protokołów jest pokazany w Rysunek 1.

1. Rozwarstwienie larwalnego gruczołu pierścieniowego (RG)

UWAGA: W D. melanogaster, który należy do cyklorhaphous Diptera, PG znajduje się w złożonym narządzie endokrynnym zwanym gruczołem pierścieniowym (RG, Ryc. 2D). Ponieważ niewykonalne jest, aby PG został chirurgicznie oddzielony od innych typów komórek (omówionych później), praktycznym celem jest wyizolowanie nienaruszonego, nieuszkodzonego RG przez sekcję.

  1. Przygotowanie larw w odpowiednich stadiach rozwojowych
    UWAGA: Aby zsynchronizować etapy rozwojowe larw D. melanogaster, konieczne jest zbieranie jaj w wąskim oknie czasowym i zbieranie larw w odpowiednim czasie.
    1. Zbieraj jajka przez 2 godziny na talerzu agarowym z sokiem winogronowym w temperaturze 25 °C.
    2. Zebrać nowo wyklute larwy 1st instar pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą kleszczy i przenieść je do małej fiolki zawierającej puree z drożdży standardowych/mąki kukurydzianej na muchy.
      UWAGA: Wiek larw jest reprezentowany przez "godziny po złożeniu jaj (hAEL)", "godziny po wykluciu (hAH)" lub "godziny po ekdyzie L3 (hAL3E)".
    3. W odpowiednim momencie zbierz zainscenizowane larwy za pomocą jednorazowej plastikowej pętli, aby uniknąć niepożądanych obrażeń. Aby zminimalizować różnicę w postępie rozwojowym larw w 3.stadium rozwojowym, należy zebrać larwy 2. stadium w wieku 70 hAEL (48 hAH) i pozwolić im linieć w odstępach 2-godzinnych. Następnie zbierz larwy 3.stadium rozwojowe w ciągu 2 godzin po ekdyzie L3; ta procedura daje 0-2 larwy hAL3E.
    4. Przenieść stadia larwy do naczynia wypełnionego solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    5. Opłucz larwy PBS, aby usunąć resztki pokarmu z organizmu.
  2. Zgrubna sekcja larw pod mikroskopem preparacyjnym
    1. Przytrzymaj haczyk na usta larwy za pomocą kleszczy. Odetnij ciało larwy w przedniej jednej trzeciej długości ciała za pomocą mikronożyczek.
    2. Przytrzymaj odcięty koniec przedniego ciała larwy jedną parą kleszczy. Używając drugiej pary kleszczy, delikatnie popchnij czubek głowy w kierunku wnętrza ciała; Ta procedura wywraca ciało larwy na lewą stronę.
      UWAGA: Ten krok można pominąć w przypadku sekcji larw 1st instadium.
    3. Powtórz kroki 1.2.1-1.2.2 z dodatkowymi larwami przez 5-10 min.
      UWAGA: Liczba larw powinna być równa lub mniejsza niż 20, aby zaoszczędzić czas na rozebranie.
  3. Preparacja filetów larw<br /> UWAGA: Ta metoda pozwala na utrzymanie pozycji tkanek w stanie nienaruszonym.
    1. Pozostaw larwy w wodzie tylko na 1 godzinę. Larwy są unieruchomione z powodu uduszenia.
    2. Umieść larwę grzbietową stroną do góry w kropli PBS na naczyniu pokrytym silikonem, grzbietem do góry.
      UWAGA: Po stronie grzbietowej znajdują się 2 rurki tchawicy biegnące wzdłużnie.
    3. Pod mikroskopem preparacyjnym wbij szpilkę do owada w przedni koniec larwy za pomocą kleszczy. Rozciągnij ciało larwy na tylną stronę i wbij drugą szpilkę w tylny koniec larwy.
      UWAGA: Oprócz szpilek przeciw owadom przydatna może być igła wykonana z drutu wolframowego21. Igła może być osadzona w końcówce pipety poprzez ogrzewanie w celu użycia jako igła preparacyjna.
    4. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj małe nacięcie w pobliżu ogona mikronożyczkami. Od nacięcia odetnij naskórek grzbietowy wzdłuż grzbietowej linii środkowej w kierunku głowy. Uważaj, aby nie uszkodzić tkanek pod naskórkiem.
    5. Rozciągnij naskórek bodywall z każdej strony i umieść 4 szpilki w każdym rogu rozciętej ściany ciała.
    6. Usuń część przedniej części ciała tłuszczowego za pomocą kleszczy, aby odsłonić kompleks mózg-RG na powierzchni. W razie potrzeby usuń parę gruczołów ślinowych.
  4. Utrwalanie i barwienie tkanek za pomocą immunohistochemii
    1. Umieścić przednią jedną trzecią ciał larw (krok 1.2.2) do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 500 μl roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu w PBS). Jednorazowo należy ustalić mniej niż 20 próbek, w przeciwnym razie PBS dołączony do utrwalonych próbek może spowodować niekorzystne rozcieńczenie utrwalacza. W celu rozbioru filetów usuń kroplę PBS, a następnie dodaj kroplę roztworu utrwalającego.
      UWAGA: Do roztworu utrwalającego można użyć 3,7% formaldehydu lub 4% paraformaldehydu.
    2. Wypreparowane tkanki inkubować w roztworze utrwalającym przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) lub alternatywnie przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    3. Zastąp roztwór utrwalający 500 μl PBS i szybko przepłucz próbki 3 razy. Przemyć próbki 500 μl 0,3% PBT (PBS + 0,3% etoksylowany oktylofenol) przez 15 minut na bujaku w temperaturze pokojowej. W celu rozbioru filetów należy usunąć szpilki owadów i przenieść próbki do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: W celu zwiększenia przepuszczalności przeciwciał w tkankach, próbki poddaje się działaniu 500 μl 2,0% PBT przez 1-2 godziny na kołysce w temperaturze pokojowej.
    4. Zastąp PBT 500 μl roztworu blokującego (2% albuminy surowicy bydlęcej w PBT). Próbki należy inkubować przez 1,5 godziny na kołysce w temperaturze pokojowej.
    5. Zastąp roztwór blokujący 50 μl roztworem przeciwciał pierwszorzędowych, tj. przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze blokującym.
    6. Próbki należy inkubować przez noc na bujaku w temperaturze 4 °C.
    7. Zastąp pierwszorzędowy roztwór przeciwciała 500 μl 0,3% PBT i szybko przepłucz próbki 5 razy. Przemyj próbki 3 razy 500 μl 0,3% PBT przez 15 minut każda na bujaczku w temperaturze pokojowej.
    8. Zastąp 0,3% PBT 50 μl roztworem przeciwciała drugorzędowego (przeciwciała sprzężone z barwnikiem rozcieńczone w roztworze blokującym). Do barwienia jądrowego 0,5 μl 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI, 0,1 mg/ml roztworu podstawowego) dodaje się do 50 μl roztworu. Próbki inkubować na bujaku przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub alternatywnie w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Próbki należy przechowywać w ciemności.
    9. Zastąp roztwór przeciwciała 500 μl 0,3% PBT i spłucz 5 razy. Przemyć próbki 3 razy 500 μl 0,3% PBT przez 15 minut każda w temperaturze pokojowej.
  5. Dokładna sekcja kompleksu mózg-RG zawierającego PG i montaż
    1. Użyj jednorazowej pipety, aby przenieść próbki wybarwione immunologicznie do naczynia wypełnionego 0,3% PBT.
      UWAGA: Aby uniknąć niewygodnych pęcherzyków powietrza podczas preparowania i montażu, 0,3% PBT można zastąpić PBS.
    2. Pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj naskórek lub haczyk do ust jedną parą kleszczy. Używając igły 27 G dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml jako "noża", odetnij przedni koniec przełyku i krążki oka, aby usunąć kompleks dysk mózg-RG-oko z naskórka ciała.
    3. Oddziel przełyk i jelito od kompleksu mózg-RG-dysk oko za pomocą kleszczy. Ponieważ przełyk przechodzi przez mózg powyżej brzusznego rdzenia nerwowego (VNC), wyciągnij jelito na tylną stronę.
      UWAGA: Aby usunąć dodatkowe wyimaginowane dyski z próbek, przetnij połączenia między mózgiem, dyskami oczu i dyskami nóg za pomocą noża do igieł.
    4. Powtórz kroki 1.5.1-1.5.4 dla innych próbek.
      UWAGA: Aby zapobiec przywieraniu resztek tkanek do próbek, każdą ukończoną próbkę należy przenieść do innego czystego naczynia wypełnionego 0.3% PBT lub PBS.
    5. Przenieść próbki do środka czystego szkiełka za pomocą mikropipety.
      UWAGA: W przypadku larw w 2. lub 3. stadium rozwojowym koniec końcówki mikropipety należy obciąć żyletką.
    6. Pod mikroskopem preparacyjnym wyrównaj poszczególne próbki grzbietową stroną do góry za pomocą kleszczy.
      UWAGA: RG znajduje się po grzbietowej stronie mózgu (Ryc. 2A). To wyrównanie ułatwia specyfikację poszczególnych próbek podczas obrazowania.
    7. Przechyl szklane szkiełko i zetrzyj jak najwięcej nadmiaru PBT. Umieść kroplę odczynnika montażowego z boku szkiełka. Umieść krawędź szkiełka nakrywkowego z drugiej strony kropli i powoli nakładaj szkiełko nakrywkowe na próbki za pomocą kleszczyków.
      UWAGA: Ta procedura zapobiega przemieszczaniu się próbek poza szkiełko nakrywkowe.
    8. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C. Przechowywać próbki w ciemności.

2. Rozwarstwienie jajnika u dorosłych kobiet

  1. Przygotowanie dorosłych samic
    1. Karm samice much standardowym pokarmem na muchy drożdżowe/kukurydzianym przez 3-4 dni, aby utuczyć jajnik. Przechowywać w temperaturze 25 °C.
  2. Rozwarstwienie jajnika dorosłej kobiety
    1. Znieczulij samice much gazem CO2 i odetnij im głowy.
    2. Przenieś ciała much do 3 cm naczynia wypełnionego PBS.
    3. Pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj klatkę piersiową po stronie grzbietowej za pomocą kleszczy. Chwyć segment brzuszny A5 lub A6 innymi kleszczami i oderwij naskórek brzucha w kierunku tylnej strony. Zetrzyj lepki naskórek z końcówki kleszczy.
    4. Uszczypnij jajowód i wyjmij jajnik z ciała.
    5. Rozczesz i rozprowadź końcówki jajnika za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Ta operacja poprawia skuteczność barwienia immunologicznego.
  3. Preparacja mózgu dorosłej kobiety, VNC i narządów rozrodczych.
    UWAGA: Ta metoda pozwala na utrzymanie unerwienia jajnika w stanie nienaruszonym.
    1. Znieczulij samice much gazem CO2 i przenieś je do naczynia pokrytego silikonem wypełnionego PBS.
    2. Pod mikroskopem preparacyjnym przytrzymaj trąbkę i oderwij naskórek głowy, aby odsłonić mózg za pomocą kleszczy. Usuń tchawicę przyczepioną do mózgu.
      UWAGA: Mózg jest białą i zaokrągloną strukturą. Mózg łączy się z VNC w klatce piersiowej.
    3. Przytrzymaj klatkę piersiową po stronie grzbietowej i odetnij nogi i skrzydła jedną parą kleszczy. Za pomocą drugiej pary kleszczy oderwij naskórek brzuszny klatki piersiowej od podstawy nóg. Po odsłonięciu VNC usuń resztki naskórka grzbietowego i mięśnie przyczepione do VNC za pomocą kleszczy. Uważaj, aby nie uszkodzić połączenia między mózgiem a VNC.
    4. Użyj kleszczy, aby oderwać naskórek brzucha i odsłonić jajnik oraz ich interaktywne narządy, w tym neurony, plon, jelita, jajowód, macicę i gruczoł dodatkowy.
    5. Usuń resztki tkanek, w tym tchawicę i ciało tłuszczowe, za pomocą kleszczy.
  4. Utrwalanie i barwienie tkanek za pomocą immunohistochemii
    1. Przenieść około 8-10 par jajników do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 250 μl roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu w PBS) i inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Zastąp roztwór utrwalający 500 μl PBS i szybko przepłucz próbki 3 razy.
    3. Przemyć próbki 2 razy 500 μl 0,1% PBT przez 5 minut każda w temperaturze pokojowej.
    4. Zastąp PBT 50 μl roztworu blokującego. Próbki należy inkubować przez 1 godzinę na bujaku w temperaturze pokojowej.
    5. Zastąp roztwór blokujący 50 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego.
    6. Próbki należy inkubować przez noc na bujaku w temperaturze 4 °C.
    7. Zastąp pierwszorzędowy roztwór przeciwciała 500 μl 0,1% PBT. Przemyj próbki 3 razy 500 μl 0,1% PBT przez 15 minut każda na bujaku w temperaturze pokojowej.
    8. Zastąp 0,1% PBT 50 μl roztworem przeciwciał drugorzędowych. W przypadku barwienia jądrowego dodać 0,5 μl DAPI do 50 μl roztworu. Inkubować próbki przez 2 godziny na wahaczu w temperaturze pokojowej.
    9. Zastąp drugorzędowy roztwór przeciwciała 500 μl 0,1% PBT. Przemyć próbki 3 razy 500 μl 0,1% PBT przez 15 minut każda na bujaku w temperaturze RT.
      UWAGA: Procedurę prania można wykonać w temperaturze 4 °C przez noc. Próbki należy przechowywać w ciemności.
  5. Mocowanie próbek na szkiełkach podstawowych
    1. Przenieść próbki do szkiełka podstawowego z 0,1% PBT za pomocą mikropipety.
      UWAGA: Aby uniknąć niewygodnych pęcherzyków podczas sekcji i montażu, 0,1% PBT można zastąpić PBS.
    2. W przypadku jajnika oddziel sznurki jajników od siebie kleszczami pod mikroskopem preparacyjnym. Nie uszkadzać końcówek jajników zawierających germaria. W przypadku kompleksu mózg-VNC-narząd rozrodczy usuń resztki naskórka i ułóż pozycję na szkiełku podstawowym.
    3. Zetrzyj jak najwięcej nadmiaru PBT i umieść kroplę odczynnika montażowego na środku próbek. Powoli nakładaj szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczy.
    4. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C. Przechowywać próbki w ciemności.

3. Obrazowanie za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego

  1. Obserwuj próbki pod mikroskopem i umieść narządy steroidogenne w polu widzenia. Po ustaleniu widoku przełącz system obrazowania w tryb akwizycji obrazu.
    UWAGA: Soczewki obiektywowe 10-20X służą do uzyskiwania obrazów kompleksu mózg-RG lub całego jajnika. Alternatywnie, soczewki obiektywowe 40-63X (zanurzenie w wodzie lub oleju) są używane do wizualizacji subkomórkowej lokalizacji białek w GSC lub unerwienia neuronów PG i jajnika.
  2. Ustaw parametry akwizycji obrazu na podłączonym oprogramowaniu. Wybierz kombinację fluorescencji (np. GFP i RFP). Dzięki szybkiej procedurze skanowania dostosuj moc lasera, czułość detektorów (wzmocnienie/przesunięcie) oraz rozmiar otworka.
    UWAGA: Aby uzyskać obrazy w wysokiej jakości, moc lasera skanującego i czułość detektora (wzmocnienie) powinny być zoptymalizowane dla każdej próbki. Aby nakreślić kształt tkanek, oprócz obrazu fluorescencyjnego można wykonać obraz w świetle przechodzącym.
  3. Zrób stosy Z obrazów. Podczas ciągłego szybkiego skanowania przesuń płaszczyznę ogniskowej z napędem ostrości mikroskopu i ustaw pozycję początkową i pozycję końcową. Liczba wycinków i odstęp między plasterkami są odpowiednio dostosowywane.
  4. Wybierz szybkość skanowania, metodę skanowania i tryb skanowania dwukierunkowego.
  5. "Rozpocznij prawdziwe skanowanie" w celu uzyskania obrazu.
  6. Zapisz obraz w formacie dołączonego oprogramowania.
    UWAGA: Oryginalne pliki obrazów zawierają informacje o parametrach akwizycji obrazu i skalach. Wyeksportowane obrazy można przetwarzać za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów na komputerze22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystaliśmy powyższe protokoły do wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów u larw D. melanogaster i dorosłych samic. Ogólny schemat protokołów przedstawiono na rysunku 1.

RG, w tym PG (ryc. 2D), jest mniejszy i bardziej przezroczysty niż mózg i znajduje się po przedniej-grzbietowej stronie mózgu (ryc. 2A-C i 3A-E). Aby oznaczyć komórki PG, kilka grup wygenerowało różne typy przeciwciał przeciwko enzymom ekdysteroidogennym

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badaliśmy biosyntezę ekdysteroidów i jej mechanizm regulacyjny u D. melanogaster oraz opracowaliśmy protokół sekcji i barwienia immunologicznego. Na czas biosyntezy ekdysteroidów mają wpływ sygnały środowiskowe poprzez wejścia neuronalne33, dlatego ważne jest, aby utrzymać unerwienie narządów ekdysteroidogennych wraz z mózgiem, VNC i innymi tkankami podczas sekcji.

Jak opisano powyżej, D. melanogaster PG tworzy złożony narząd endokrynny RG z ciałami bi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Reiko Kise i Tomotsune Ameku za ich wsparcie techniczne dla tej pracy. Jesteśmy również wdzięczni Kei Ito, Oldze Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stock Center, KYOTO Stock Center (DGRC) oraz Developmental Studies Hybridoma Bank za zapasy i odczynniki. Praca ta została wsparta grantami dla Y.S.N. z JSPS KAKENHI Grant Number 16K20945, The Naito Foundation i Inoue Science Research Award; oraz poprzez dotację na rzecz R.N. z MEXT KAKENHI Grant Number 16H04792.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
egg collection
naczynie do hodowli tkankowych (55 mm)AS ONE1-8549-02  do talerzy agarowych z sokiem winogronowym
kubek do zbieraniaHIKARI KAGAKU
pasta drożdżowaDrożdże orientalne suszone, Tokio
100% sok winogronowyWelch Food Inc.
larwy hodowlane
małe fiolki (12 ml, 40 razy; 23,5 mm, PS)SARSTEDT58.487
jednorazowa pętelkaAS ONE6-488-01
standardowy pokarmmuchy  Polecamy nas na stronie internetowej centrum zapasów w Blooington.
preparacyjny
preparacyjnyCarl ZeissStemi 2000-C
LeicaS8 AP0
(35 x 10 mm, niepoddane obróbce)IWAKI1000-035
SylgardTORAYkoarting silikonowy wewnątrz naczyń
Igła Terumo (27G, 0,40 x 19 mm) TERUMONN-2719S"nóż" do cięcia kleszczy tkankowych
, Inox, #5Dumont, Szwajcaria
szpilka do owadów (średnica 0,18 mm)Shiga Markapreparowania filetów
NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. MB-50-10
mocne
ultraczyste wodyMerck Sól
(PBS)
FormaldehydNacalai tesque16222-65
ParaformaldehydNacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
mikroprobówek (1,5 ml)INA OPTIKACF-0150
Inkubacja
Jako jeden mikser swist TM-300 (rocker)Jako jedenTM-300rocker
Albumina surowicy bydlęcejSIGMA9048-46-8
przeciwciało pierwotne
anty-Sro (świnka morska), 1:1000
anty-GFP (królik), 1:1000Sondy molekularneA6455Shimada-Niwa i Niwa, 2014
anty-GFP (mysi mAb, GF200), 1:100Nakarai tesque04363-66
anty-5HT (królik), 1:500SIGMAS5545
anty-Hts 1B1 (mysz)Badania rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB)1B1
anty-DE-kadheryna (szczur), 1:20DSHBDCAD2
anty-nc82 (mysz), 1:50DSHBnc82
przeciwciało wtórne< / strong>
kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-11008
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 488TechnologiesA-11001
Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 546 sprzężoneLife TechnologiesA-11081
Kozie przeciwciało anty-gwinejskie IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 555TechnologiesA-21435
Alexa Fluor 546 falloidyna sprzężona z barwnikiemLife TechnologieA-22283
Odczynniki montażowe
Micro slide glassMatsunami Glass Ind., Ltd.SS7213
Kwadratowa szklana osłona mikroskopuMatsunami Glass Ind., Ltd.
Odczynnik FluorSave (Odczynnik montażowy)Pipeta transferowa Calbiochem345789
1 ml (jednorazowy zakraplacz)System laserowego5660-222-1S
imaging
LSM700Zeissodwrócony obserwator Axio. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZENCarl ZeissJest to specjalny interfejs użytkownika oparty na 64-bitowym systemie operacyjnym Microsoft Windows7
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  z Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS– Dobra praktyka rolnicza; UAS– mCD8::GFPprezenty od K. Ito, Uniwersytet Tokijski.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4patrz w Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  z Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  z Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)
na mikroskop Naczynie do hodowli tkankowych do mikronożyczek do fizjologiczna buforowana fosforanem miliporowym Life Life C218181 mikroskopu skaningowego WATSON Carl

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32(2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123(2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778(2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806(2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712(2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila MelanogasterSteroidogenic OrgansImmunostaining ProtocolLarval DissectionOvary VisualizationBrain Ring GlandEcdysteroid BiosynthesisGermline Stem CellsNeuronal InnervationFluorescent Labeling

Related Articles