Protokoły wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów z barwieniem immunologicznym u muszki owocowej Drosophila melanogaster

Summary

Opisujemy protokół preparacji, utrwalania i barwienia immunologicznego organów steroidogennych u larw Drosophila i dorosłych samic w celu zbadania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Oprócz narządów steroidogennych wizualizujemy unerwienie narządów steroidogennych, a także steroidogennych komórek docelowych, takich jak komórki macierzyste linii rozrodczej.

Abstract

W organizmach wielokomórkowych mała grupa komórek jest wyposażona w wyspecjalizowaną funkcję w swojej aktywności biogennej, wywołując ogólnoustrojową odpowiedź na wzrost i rozmnażanie. U owadów larwalny gruczoł przedpiersiowy (PG) i jajnik dorosłej kobiety odgrywają istotną rolę w biosyntezie głównych hormonów steroidowych zwanych ekdysteroidami. Te ekdysteroidogenne narządy są unerwione od układu nerwowego, przez który na czas biosyntezy wpływają sygnały środowiskowe. W tym miejscu opisano protokół wizualizacji narządów ekdysteroidogennych i ich interaktywnych narządów u larw i dorosłych osobników muszki owocowej Drosophila melanogaster, który zapewnia odpowiedni system modelowy do badania biosyntezy hormonów steroidowych i ich mechanizmu regulacyjnego. Umiejętna sekcja pozwala nam utrzymać pozycje narządów ekdysteroidogennych i ich interaktywnych narządów, w tym mózgu, brzusznego rdzenia nerwowego i innych tkanek. Barwienie immunologiczne przeciwciałami przeciwko enzymom ekdysteroidogennym, wraz z transgenicznymi białkami fluorescencyjnymi napędzanymi przez swoiste tkankowo promotory, jest dostępne do znakowania komórek ekdysteroidogennych. Co więcej, unerwienie narządów ekdysteroidogennych może być również znakowane przez specyficzne przeciwciała lub zbiór sterowników GAL4 w różnych typach neuronów. W związku z tym narządy ekdysteroidogenne i ich połączenia neuronalne mogą być wizualizowane jednocześnie za pomocą technik immunostainingu i transgenicznych. Na koniec opisujemy, jak uwidocznić komórki macierzyste linii zarodkowej, których proliferacja i utrzymanie są kontrolowane przez ekdysteroidy. Metoda ta przyczynia się do kompleksowego zrozumienia biosyntezy hormonów steroidowych i ich neuronalnego mechanizmu regulacyjnego.

Introduction

W organizmach wielokomórkowych grupa komórek jest wyposażona w wyspecjalizowaną funkcję w swojej aktywności biogennej, która jest niezbędna dla całego organizmu. Aby spełnić swoje misje, każda tkanka lub narząd wyraża szereg genów związanych z ich funkcjami i komunikuje się z innymi tkankami, aby koordynować ich działania w kontekście rozwoju. Aby scharakteryzować takie wyspecjalizowane funkcje komórkowe i interakcje międzynarządowe, musimy określić grupę komórek wraz z innymi typami komórek, które są nienaruszone w architekturze wielokomórkowej.

Jednym z przykładów takich wyspecjalizowanych organów jest narząd steroidogenny, gdzie wiele en....

Protocol

UWAGA: Ogólny schemat protokołów jest pokazany w Rysunek 1.

1. Rozwarstwienie larwalnego gruczołu pierścieniowego (RG)

UWAGA: W D. melanogaster, który należy do cyklorhaphous Diptera, PG znajduje się w złożonym narządzie endokrynnym zwanym gruczołem pierścieniowym (RG, Ryc. 2D). Ponieważ niewykonalne jest, aby PG został chirurgicznie oddzielony od innych typów komórek (omówionych później), praktycznym celem jest wyizolowanie nienaruszonego, nieuszkodzonego RG przez sekcję.

1. Przygotowanie larw w odpowiednich stadiach ....

Results

Wykorzystaliśmy powyższe protokoły do wizualizacji narządów steroidogennych i ich interaktywnych narządów u larw D. melanogaster i dorosłych samic. Ogólny schemat protokołów przedstawiono na rysunku 1.

RG, w tym PG (ryc. 2D), jest mniejszy i bardziej przezroczysty niż mózg i znajduje się po przedniej-grzbietowej stronie mózgu (ryc. 2A-C i 3A-E). Aby oznaczyć komórki PG, kilka grup wygenerowało różne typy przeciwciał przeciwko enzymom ekdysteroidogennym

Discussion

Badaliśmy biosyntezę ekdysteroidów i jej mechanizm regulacyjny u D. melanogaster oraz opracowaliśmy protokół sekcji i barwienia immunologicznego. Na czas biosyntezy ekdysteroidów mają wpływ sygnały środowiskowe poprzez wejścia neuronalne³³, dlatego ważne jest, aby utrzymać unerwienie narządów ekdysteroidogennych wraz z mózgiem, VNC i innymi tkankami podczas sekcji.

Jak opisano powyżej, D. melanogaster PG tworzy złożony narząd endokrynny RG z ciałami bi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
egg collection
naczynie do hodowli tkankowych (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	do talerzy agarowych z sokiem winogronowym
kubek do zbierania	HIKARI KAGAKU
pasta drożdżowa	Drożdże orientalne suszone, Tokio
100% sok winogronowy	Welch Food Inc.
larwy hodowlane
małe fiolki (12 ml, 40 razy; 23,5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
jednorazowa pętelka	AS ONE	6-488-01
standardowy pokarm			muchy  Polecamy nas na stronie internetowej centrum zapasów w Blooington.
preparacyjny
preparacyjny	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
	Leica	S8 AP0
(35 x 10 mm, niepoddane obróbce)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		koarting silikonowy wewnątrz naczyń
Igła Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	"nóż" do cięcia kleszczy tkankowych
, Inox, #5	Dumont, Szwajcaria
szpilka do owadów (średnica 0,18 mm)	Shiga Marka		preparowania filetów
	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
mocne
ultraczyste wody	Merck Sól
(PBS)
Formaldehyd	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyd	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
mikroprobówek (1,5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Inkubacja
Jako jeden mikser swist TM-300 (rocker)	Jako jeden	TM-300	rocker
Albumina surowicy bydlęcej	SIGMA	9048-46-8
przeciwciało pierwotne
anty-Sro (świnka morska), 1:1000
anty-GFP (królik), 1:1000	Sondy molekularne	A6455	Shimada-Niwa i Niwa, 2014
anty-GFP (mysi mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anty-5HT (królik), 1:500	SIGMA	S5545
anty-Hts 1B1 (mysz)	Badania rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anty-DE-kadheryna (szczur), 1:20	DSHB	DCAD2
anty-nc82 (mysz), 1:50	DSHB	nc82
przeciwciało wtórne< / strong>
kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 488	Life Technologies	A-11008
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 488	Technologies	A-11001
Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H+L) Przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 546 sprzężone	Life Technologies	A-11081
Kozie przeciwciało anty-gwinejskie IgG (H+L), koniugat Alexa Fluor 555	Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 falloidyna sprzężona z barwnikiem	Life Technologie	A-22283
Odczynniki montażowe
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind., Ltd.	SS7213
Kwadratowa szklana osłona mikroskopu	Matsunami Glass Ind., Ltd.
Odczynnik FluorSave (Odczynnik montażowy)	Pipeta transferowa Calbiochem	345789
1 ml (jednorazowy zakraplacz)	System laserowego	5660-222-1S
imaging
LSM700	Zeiss		odwrócony obserwator Axio. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN	Carl Zeiss		Jest to specjalny interfejs użytkownika oparty na 64-bitowym systemie operacyjnym Microsoft Windows7
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			z Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS– Dobra praktyka rolnicza; UAS– mCD8::GFP			prezenty od K. Ito, Uniwersytet Tokijski.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			patrz w Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP			z Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			z Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)