Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

CAPRRESI: Składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego

11.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55526

⸱

25 czerwca 2017

 ,  , 
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Oncomedic Incorporation, Ciudad de México, 3Laboratorio Internacional de Investigación sobre el Genoma Humano, Universidad Nacional Autónoma de México

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI), protokół oparty na wstawianiu miejsc enzymów restrykcyjnych do sekwencji synonimów DNA i funkcjonalnym odzyskiwaniu plazmidu. Protokół ten jest szybką i tanią metodą fuzji genów kodujących białka.

Streszczenie

Tutaj prezentujemy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI). CAPRRESI korzysta z wielu zalet oryginalnej metody odzyskiwania plazmidu i wprowadza trawienie enzymem restrykcyjnym w celu ułatwienia reakcji ligacji DNA (wymaganej do składania chimer). W przypadku tego protokołu użytkownicy klonują geny typu dzikiego do tego samego plazmidu (pUC18 lub pUC19). Po selekcji in silico regionów sekwencji aminokwasów, w których chimery powinny być złożone, użytkownicy uzyskują wszystkie synonimiczne sekwencje DNA, które je kodują. ad hoc Skrypty Perla umożliwiają użytkownikom określenie wszystkich synonimów sekwencji DNA. Po tym kroku inny skrypt Perla wyszukuje miejsca enzymów restrykcyjnych we wszystkich sekwencjach DNA synonimów. Ta analiza in silico jest również przeprowadzana przy użyciu genu oporności na ampicylinę (ampR) znajdującego się w plazmidach pUC18/19. Użytkownicy projektują oligonukleotydy w regionach synonimów, aby zakłócić geny typu dzikiego i ampR za pomocą PCR. Po uzyskaniu i oczyszczeniu komplementarnych fragmentów DNA następuje trawienie enzymem restrykcyjnym. Składanie chimery uzyskuje się poprzez ligację odpowiednich komplementarnych fragmentów DNA. Wektory pUC18/19 zostały wybrane do CAPRRESI, ponieważ oferują zalety techniczne, takie jak mały rozmiar (2 686 par zasad), wysoka liczba kopii, korzystne cechy reakcji sekwencjonowania i dostępność komercyjna. Zastosowanie enzymów restrykcyjnych do składania chimer eliminuje potrzebę polimeraz DNA dających produkty o końcach. CAPRRESI to szybka i tania metoda fuzji genów kodujących białka.

Wprowadzenie

Chimeryczny zespół genów był szeroko stosowany w biologii molekularnej do wyjaśniania funkcji białek i/lub do celów biotechnologicznych. Istnieją różne metody fuzji genów, takie jak nakładająca się amplifikacja produktu PCR1, odzyskiwanie plazmidu2, rekombinacja homologiczna3, systemy CRISPR-Cas94, site-directed recombination5 i Gibson assembly6. Każdy z nich oferuje inne zalety techniczne; na przykład elastyczność nakładającego się projektowania PCR, wybór konstrukcji in vivo podczas odzyskiwania plazmidu lub wysoka wydajność systemów CRISPR-Cas9 i Gibsona. Z drugiej strony mogą pojawić się pewne trudności podczas wykonywania niektórych z tych metod; na przykład pierwsze dwa podejścia opierają się na końcach fragmentów DNA, a ligacja tego typu produktów może być technicznie trudna w porównaniu z ligacją z lepkimi końcami. Rekombinacja ukierunkowana na miejsce może pozostawić ślady dodatkowych sekwencji DNA (blizn) na oryginale, jak w systemie Cre-loxP5. CRISPR-Cas9 może czasami modyfikować inne regiony genomu oprócz miejsca docelowego4.

Tutaj wprowadzamy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI), protokół fuzji genów kodujących białka, który łączy metodę odzyskiwania plazmidu (PRM) z wstawianiem miejsc enzymów restrykcyjnych na sekwencje synonimów DNA, zwiększając efektywność ligacji. Aby zapewnić integralność sekwencji aminokwasów, miejsca enzymów restrykcyjnych są wstawiane do odcinków sekwencji synonimów DNA. Jedną z zalet CAPPRESI jest to, że można go wykonać przy użyciu zwykłych odczynników/narzędzi laboratoryjnych (np. enzymów, kompetentnych komórek, roztworów i termocyklera) oraz że może dać szybkie wyniki (gdy stosuje się odpowiednie enzymy). Poleganie na miejscach enzymów restrykcyjnych, które wyłaniają się z synonimów sekwencji DNA, może ograniczyć wybór dokładnych punktów fuzji wewnątrz interesujących białek. W takich przypadkach geny docelowe powinny być połączone za pomocą nakładających się oligonukleotydów, a miejsca enzymów restrykcyjnych powinny zostać wstawione do genu oporności wektora.

CAPRRESI składa się z siedmiu prostych kroków (Rysunek 1): 1) wybór wektora klonowania, pUC18 lub pUC196; 2) analiza in silico sekwencji typu dzikiego, które mają być połączone; 3) wybór regionów łamania do składania chimer i rozerwania plazmidu; 4) wytwarzanie in silico sekwencji synonimów DNA zawierających miejsca enzymów restrykcyjnych; 5) samodzielne klonowanie genów typu dzikiego do wybranego plazmidu; 6) rozerwanie plazmidu metodą PCR, a następnie trawienie enzymem restrykcyjnym; oraz 7) odzyskiwanie plazmidu za pomocą ligacji DNA i transformacji bakteryjnej. Geny chimeryczne wytworzone tą techniką powinny być weryfikowane za pomocą sekwencjonowania.

Wektory pUC18/19 oferują techniczne korzyści do klonowania i składania chimer, takie jak mały rozmiar (tj. 2,686 par zasad), wysoka liczba kopii, korzystne cechy reakcji sekwencjonowania i dostępność komercyjna7. W tym przypadku żywiciel Escherichia coli został użyty do złożenia i obsługi chimer, ponieważ kultury bakteryjne są tanie i szybko rosną. Biorąc to pod uwagę, konieczne będzie późniejsze klonowanie fragmentów fuzji do końcowych plazmidów docelowych (np. wektorów ekspresyjnych jako pRK415 w bakteriach lub pCMV w komórkach ssaków).

CAPRRESI zostało przetestowane pod kątem fuzji dwóch głównych genów czynnika sigma: E. colirpoD i Rhizobium etlisigA. Pierwszorzędowymi czynnikami sigma są podjednostki polimerazy RNA odpowiedzialne za inicjację transkrypcji i składają się z czterech domen (tj. σ1, σ2, σ3 i σ4)8. Długość sekwencji aminokwasów białek kodowanych przez rpoD i sigA wynosi odpowiednio 613 i 685. RpoD i SigA mają 48% wspólnego tożsamości (98% pokrycia). Te pierwotne czynniki sigma zostały podzielone na dwa komplementarne fragmenty między regionami σ2 i σ3. Zgodnie z tym projektem zestawiono dwa chimeryczne geny: chimerę 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) i chimerę 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Produkty fuzji DNA zweryfikowano za pomocą sekwencjonowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Protokół CAPRRESI

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia ogólny protokół CAPRRESI. Technika ta opiera się na projektowaniu in silico i późniejszej budowie pożądanych chimer.

  1. Wybór plazmidu klonującego, pUC18 lub pUC19.
    1. Wybierz wektor pUC, który najlepiej odpowiada wymaganiom technicznym.
      UWAGA: Oba wektory mają tę samą sekwencję, z wyjątkiem orientacji miejsca klonowania wielokrotnego. Jest to ważne dla projektowania oligonukleotydów i rozerwania plazmidu PCR.
  2. Analiza in silico genów typu dzikiego i sekwencji pUC18/19.
    1. Uzyskaj sekwencje DNA genów typu dzikiego i zapisz je w pliku w formacie FASTA (np. genes.fas).
      UWAGA: Sekwencje wektorów pUC18/19 są zawarte w pliku pUC.fas (Rysunek 1, krok 1).
    2. Określ, które enzymy restrykcyjne nie przecinają genów typu dzikiego i sekwencji pUC18/19, uruchamiając skrypt REsearch.pl. Alternatywnie, przeprowadź wyszukiwanie w witrynie enzymów restrykcyjnych za pomocą narzędzia online (Rysunek 1, krok 2).
      1. Wpisz w terminalu następujące polecenie:
        perl REsearch.pl genes.fas
        perl REsearch.pl pUC.fas
        UWAGA: Te polecenia utworzą następujące pliki wyjściowe: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas i pUC_re.fas.
      2. Wybierz odpowiednie enzymy restrykcyjne do klonowania genów typu dzikiego do miejsca wielokrotnego klonowania wybranego wektora pUC18/19, porównując pliki genes_re.fas i pUC.fas. Należy wybrać orientację wkładki względem genu oporności na ampicylinę (ampR) wektora pUC18/19.
    3. Zaprojektuj oligonukleotydy do przodu i do tyłu, aby amplifikować region kodujący genów typu dzikiego (oligonukleotydy zewnętrzne). Uwzględnij odpowiednie miejsce enzymu restrykcyjnego na każdym końcu oligonukleotydów o długości 5 stóp; Spowoduje to zdefiniowanie orientacji wstawiania.
      1. Uwzględnij funkcjonalne miejsce wiązania rybosomów w przodujących oligonukleotydach.
      2. Wstaw oba geny typu dzikiego w tej samej orientacji wewnątrz wektora.
  3. Wybór obszarów łamania do składania chimer i rozerwania plazmidu.
    1. Uzyskaj sekwencję aminokwasów genów typu dzikiego i ampR, uruchamiając skrypt translate.pl (Rysunek 1, krok 3).
      1. Wpisz w terminalu następujące polecenie:
        perl translate.pl genes.fas
        perl translate.pl ampR.fas
        UWAGA: Ten skrypt utworzy następujące pliki wyjściowe: genes_aa.fas i ampR_aa.fas.
    2. Globalnie wyrównaj dwie sekwencje aminokwasów typu dzikiego za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. MUSCLE)9.
    3. Wybierz żądane obszary przerwania (3-6 aminokwasów) do złożenia chimery na podstawie wyrównania sekwencji. Zapisz je do pliku w formacie FASTA (np. regions.fas).
    4. Zlokalizuj sekwencje DNA, które kodują wybrany aminokwas, rozciągają się na obu genach typu dzikiego.
  4. Generowanie in silico sekwencji synonimów DNA zawierających miejsca enzymów restrykcyjnych.
    1. Uzyskaj wszystkie sekwencje synonimów DNA, które kodują każdy odcinek sekwencji aminokwasów wybrany jako regiony łamania (Rysunek 1, krok 4); sekwencje te były przechowywane w pliku regions.fas.
      1. Wpisz w terminalu następujące polecenie:
        perl synonym.pl regions.fas
        UWAGA: Ten skrypt utworzy plik wyjściowy regions_syn.fas.
    2. Szukaj miejsc enzymów restrykcyjnych znalezionych w sekwencjach synonimów DNA.
      1. Wpisz do terminala następujące polecenie: perl REsynonym.pl regions_syn.fas
        UWAGA: Ten skrypt utworzy plik wyjściowy regions_syn-re.fas.
    3. Wybierz jeden enzym restrykcyjny, który jest wspólny dla sekwencji synonimów obu genów typu dzikiego; to miejsce zostanie wykorzystane do składania chimer poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym. Sprawdź, czy wybrany enzym restrykcyjny nie przeciął ani genów typu dzikiego, ani sekwencji wektorów pUC18/19.
      1. Porównaj enzymy restrykcyjne znajdujące się w plikach genes_re.fas, pUC_re.fas i regions_syn-re.fas.
    4. In silico zastąpić oryginały ich synonimicznymi sekwencjami DNA w odpowiednich loci na obu genach typu dzikiego. Dołącz synonimiczne sekwencje DNA do pliku sekwencji typu dzikiego (genes.fas).
    5. Pobierz sekwencję aminokwasów genów zawartych w pliku genes.fas (perl translate.pl genes.fas).
    6. Dopasuj sekwencje aminokwasów przetłumaczone z sekwencji DNA typu dzikiego i synonimów. Sprawdź, czy obie sekwencje są takie same.
    7. Powtórz wszystkie kroki tej sekcji z genem ampR obecnym na wektorze pUC18/19.
      UWAGA: Celem jest rozbicie genu ampR (file ampR.fas) na dwie uzupełniające się części. Enzym restrykcyjny wybrany do zakłócenia genu ampR powinien być inny niż ten używany do składania chimer.
  5. Niezależne klonowanie dwóch genów typu dzikiego do wybranego wektora pUC18/19 (Figura 1, krok 3).
    1. Oczyść wybrane plazmidowe DNA pUC18/19 za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA.
      1. Na przykład przekształć E. coli DH5α za pomocą plazmidu pUC18 i hoduj transformanty przez noc w temperaturze 37 °C na stałej ampicylinie LB-0,3 mg / ml (Amp). Wybierz kolonię transformacyjną, zaszczep nową płytkę LB-0,3 mg/ml Amp i hoduj ją przez noc w temperaturze 37 °C.
      2. Weź część poprzedniej kultury i hoduj ją w płynie LB-0,3 mg/mL Amp przez 6-8 godzin w temperaturze 37 °C. Ekstrahuj plazmidowe DNA za pomocą zestawu.
    2. PCR amplifikuje geny typu dzikiego z całkowitego genomowego DNA przy użyciu odpowiednich zewnętrznych oligonukleotydów. Jeśli to możliwe, użyj polimerazy DNA o wysokiej wierności. Wybierz polimerazę DNA, która maksymalizuje wydajność. Wykonaj PCR zgodnie z wytycznymi producenta i temperaturą topnienia oligonukleotydów.
      1. Uruchom cykle PCR, w zależności od użytej polimerazy DNA, wielkości amplikonu, matrycy i oligonukleotydów. Na przykład, aby amplifikować DNA rpoD, przygotuj reakcję 50 μL: 5 μL 10x buforu, 2 μL 50 mM MgSO4, 1 μL 10 mM mieszaniny dNTP, 2 μL każdego oligonukleotydu 10 μM (Tabela 2), 2 μL matrycowego DNA (E. coli DH5α całkowite DNA), 35,8 μl ultraczystej wody i 0,2 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności. Uruchom następujące cykle PCR: 1 min w temperaturze 94 °C dla początkowej denaturacji, a następnie 30 cykli amplifikacji (30 s w temperaturze 94 °C w celu denaturacji, 30 s w temperaturze 60 °C w celu wyżarzania oligonukleotydów i 2 min w temperaturze 68 °C w celu przedłużenia).
      2. Rozpuść 1,2 g agarozy w 100 ml podwójnie destylowanej wody, podgrzewając je w kuchence mikrofalowej. Zamontuj tackę na żel i grzebień i włóż je do poziomego kółka żelowego. Napełnij tackę na żel stopionym roztworem agarozy i pozwól mu zastygnąć. Wyjmij grzebień.
      3. Umieść żel w komorze do elektroforezy. Napełnij komorę 1x buforem Tris-acetate-EDTA. Załaduj 50 μl produktów PCR do studzienek żelowych. Próbki należy poddać elektroforezie (np. pod napięciem 110 V przez 1 godzinę).
      4. Po elektroforezie wybarwić żel w 100 ml podwójnie destylowanej wody zawierającej 100 μl roztworu bromku etydyny o stężeniu 1 mg/ml przez 10 minut, powoli wstrząsając. Umyj żel w podwójnie destylowanej wodzie przez kolejne 10 minut, powoli wstrząsając; Użyj wytrząsarki poziomej.
        Uwaga: Bromek etydyny jest związkiem toksycznym; Nosić rękawice ochronne i bawełniany fartuch laboratoryjny.
      5. Oczyść DNA genu typu dzikiego z odpowiednich prążków żelu za pomocą zestawu. Uwidocznij pasma, umieszczając zabarwiony żel w komorze UV (zalecana długość fali: 300 nm). Ogranicz ekspozycję żelu do minimum. Użyj zestawu do oczyszczania DNA i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
        Uwaga: promieniowanie UV jest niebezpieczne; Noś tarczę ochronną, okulary i bawełniany fartuch laboratoryjny.
    3. Trawić oczyszczone geny typu dzikiego i plazmidowe DNA pUC18/19 za pomocą enzymów restrykcyjnych zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli to możliwe, używaj enzymów szybkiego trawienia. Na przykład strawić 6 μl DNA pUC18 (300 ng/μl) w 10 μl ultraczystej wody, 2 μl buforu 10X, 1 μl enzymu restrykcyjnego KpnI i 1 μl enzymu restrykcyjnego XbaI. Pozostawić reakcję w temperaturze 37 °C na 30 minut.
      1. Dezaktywuj enzymy restrykcyjne zgodnie z wytycznymi producenta. Na przykład dezaktywować reakcję podwójnego wytrawiania Kpn I-XbaI w temperaturze 80 °C przez 5 minut.
    4. Wymieszaj wkładkę: wektor DNA w stosunku objętościowym 3:1. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi reakcji podwiązania. Jeśli to możliwe, należy stosować szybkie enzymy ligacyjne (pozostawić reakcję w temperaturze 25 °C na 10 minut).
      UWAGA: Zazwyczaj stężenie DNA po oczyszczeniu przy użyciu zestawów jest wystarczająco dobre do reakcji trawienia i ligacji. Na przykład dodaj 6 μL DNA rpoD (Kpn I-XbaI, 150 ng/μL), 3 μL DNA pUC18 (Kpn I-XbaI, 150 ng/μL), 10 μL buforu 2x, 1 μL ultraczystej wody i 1 μL ligazy DNA T4. Pozostawić reakcję podwiązania w temperaturze 25 °C na 10 minut.
    5. Przekształć E. coli DH5α w 2-4 μl reakcji ligacji, jak opisano w materiałach uzupełniających. Umieść przekształcone komórki na stałych płytkach LB / Amp / X-gal / IPTG. Pozostaw płytki na noc w temperaturze 37 °C.
    6. Wybierz białe kolonie transformacyjne E. coli i umieść je na nowej płytce LB/Amp. Pozostaw płytki na noc w temperaturze 37 °C.
    7. Przeprowadzić PCR kolonii, aby wybrać kandydatów do sekwencjonowania reakcji, zgodnie z opisem w materiałach uzupełniających. Wyodrębnij plazmidowe DNA od kandydatów. Alternatywnie, trawić kandydujące plazmidowe DNA za pomocą tych samych enzymów restrykcyjnych, które są używane do klonowania wstawień.
    8. Sekwencjonowanie konstrukcji kandydujących za pomocą dostawcy usług sekwencjonowania10. Złóż sekwencję in silico za pomocą asemblera DNA11(Rysunek 1, krok 5).
  6. Zakłócenie plazmidu przez PCR, a następnie trawienie enzymem restrykcyjnym.
    1. Projektowanie in silico oligonukleotydów do przodu i do tyłu w regionach przerwania odpowiednio dla genów typu dzikiego i ampR. Zastąp in silico fragment typu dzikiego odpowiadającą mu sekwencję synonimu DNA (otrzymaną w kroku 1.4).
      UWAGA: Ta synonimiczna sekwencja DNA zawiera miejsce enzymu restrykcyjnego. Oligonukleotydy do przodu i do tyłu nakładają się na siebie w miejscu enzymu restrykcyjnego. Oligonukleotydy powinny mieć od 21 do 27 nukleotydów, kończyć się cytozyną lub guaniną i zawierać miejsce enzymu restrykcyjnego. Oligonukleotyd forward ma taką samą sekwencję jak jego region docelowy na matrycy DNA. Odwrócony oligonukleotyd to odwrotna komplementarna sekwencja regionu docelowego na matrycy DNA.
    2. Użyj dwóch konstrukcji genów typu dzikiego jako matrycy DNA dla reakcji PCR (np. pUC18rpoD i pUC18sigA). Uzyskaj dwie komplementarne części każdej konstrukcji (pUC18rpoDσ1-σ2, pUC18rpoDσ3-σ4, pUC18sigAσ1-σ2 i pUC18sigAσ3-σ4) (Rysunek 1, krok 6).
    3. Załaduj próbki DNA do żelu agarozowego 1-1,2% [w/v]. Oddzielić produkty PCR od matrycy DNA za pomocą elektroforezy (np. 110 V przez 1 godzinę). Alternatywnie, trawić reakcje PCR z DpnI, aby rozbić matrycę DNA.
      UWAGA: Enzym DpnI rozpoznaje tylko metylowane sekwencje DNA (5'-GATC-3').
      1. Oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania DNA. Postępuj zgodnie z wytycznymi producenta.
    4. Podwójnie trawić wszystkie komplementarne fragmenty DNA za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych zgodnie ze wskazówkami producenta. Jeśli to możliwe, używaj szybko trawionych enzymów restrykcyjnych. Na przykład podwójnie trawij fragment DNA pUC18rpoDσ1-σ2 za pomocą AflII i SpeI, korzystając z protokołu producenta. Pozostawić reakcję trawienia w temperaturze 37 °C na 15 minut.
    5. Dezaktywuj enzymy restrykcyjne zgodnie z wytycznymi producenta. Na przykład dezaktywować Afl II-SpeI w temperaturze 80 °C przez 20 minut.
  7. Odzyskiwanie plazmidu za pomocą ligacji DNA i transformacji bakteryjnej.
    1. Wymieszaj odpowiednie fragmenty DNA w stosunku wolumetrycznym 1:1, aby złożyć pożądany gen chimeryczny (Rysunek 1, krok 7).
      UWAGA: W ten sposób przywracana jest integralność genu ampR, wytwarzającego funkcjonalne białko.
      1. Na przykład zmieszaj 4 μl DNA pUC18rpoDσ1-σ2 (trawionego przez Afl II-SpeI, 150 ng/μL), 4 μL DNA pUC18sigAσ3-σ4 (Afl II-SpeI, 150 ng/μL), 10 μL buforu 2x, 2 μl ultraczystej wody i 1 μl ligazy DNA T4; stężenie DNA po oczyszczeniu zestawu jest wystarczająco dobre do trawienia i Kolejne podwiązanie. Pozostawić reakcję podwiązania w temperaturze 25 °C na 10 minut.
    2. Przekształć E. coli DH5α za pomocą 3-5 μl reakcji ligacji zespołu chimery (materiały uzupełniające). Hoduj ogniwa transformacyjne na płytkach LB/Amp/X-gal/IPTG przez noc w temperaturze 37 °C przez noc.
    3. Wybierz białe kolonie transformacyjne E. coli i umieść je na nowej płytce LB/Amp. Pozostaw płytki na noc w temperaturze 37 °C.
    4. Wykonaj PCR kolonii, aby wybrać kandydatów do reakcji sekwencjonowania, zgodnie z opisem w materiałach uzupełniających. Uwidocznij pasma w żelu agarozowym 1-1,2% (w/v), wykonując elektroforezę (opisaną w kroku 2.3.2.1).
    5. Rozwijaj kultury z pozytywnych kandydatów. Wyodrębnij z nich plazmidowe DNA za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA.

2. Sekwencja kandydująca do budowy chimerycznej

  1. Upewnij się, że jakość plazmidowego DNA jest wystarczająco dobra dla reakcji sekwencjonowania, postępując zgodnie z wytycznymi dostawcy usług sekwencjonowania. Ekstrakcja DNA za pomocą zestawów do oczyszczania. Na przykład na stronie internetowej dostawcy usług sekwencyjnych należy zwrócić szczególną uwagę na zalecane stężenie DNA dla próbek. Uzyskać stężenie próbek za pomocą przyrządu do oznaczania ilościowego DNA.
  2. Sekwencja kandydatów na konstrukcje chimeryczne z dostawcą usług sekwencjonowania10.
  3. Sekwencjonowanie składa się z odczytów za pomocą asemblera DNA in silico11.
  4. Wyrównywanie sekwencji chimerycznych zaprojektowanych przez simerykę w porównaniu z sekwencjami zaprojektowanymi za pomocą narzędzi do wyrównywania sekwencji9,12. Sprawdź, czy gen chimeryczny został pomyślnie połączony.

3. Przygotowania

UWAGA: Wszystkie czynności dotyczące żywych komórek należy wykonywać w czystym okapie z przepływem laminarnym przy włączonym palniku Bunsena.

  1. Wytwarzanie komórek E. coli kompetentnych do DH5α.
    1. Aby wyprodukować komórki kompetentne dla E. coli, postępuj zgodnie z opublikowanymi protokołami13 lub zapoznaj się z materiałami uzupełniającymi. Alternatywnie można użyć dostępnych na rynku kompetentnych komórek.
  2. Transformacja komórek E. coli kompetentnych DH5α.
    1. Aby uzyskać informacje na temat przemiany chemicznej kultur E. coli, postępuj zgodnie z opublikowanymi protokołami13 lub zobacz Materiały dodatkowe. Alternatywnie użyj elektroporacji do transformacji bakteryjnej. Jeśli używane są dostępne na rynku kompetentne ogniwa, postępuj zgodnie z wytycznymi producenta.
  3. Oczyszczanie genomowego i plazmidowego DNA z E. coli DH5α.
    1. Wykonaj ekstrakcję kwasów nukleinowych, jak określono w materiałach uzupełniających, przy użyciu dostępnych na rynku zestawów lub zgodnie z opublikowanymi protokołami13.
  4. Wykonaj PCR kolonii.
    1. Użyj tej techniki, aby zidentyfikować potencjalne kolonie transformujące do późniejszej reakcji sekwencjonowania.
      UWAGA: Metoda ta nie stanowi ostatecznej weryfikacji integralności sekwencji. Szczegółowy opis tej techniki dostępny jest w Materiałach Uzupełniających.
  5. Przygotowanie roztworów.
    1. Więcej informacji na temat przygotowania roztworu znajduje się w Tabeli 1.
  6. Pobierz skrypty i pliki sekwencji wymagane dla protokołu CAPRRESI.
    1. Pobierz pliki banku genów zawierające pełną sekwencję genomu pożądanego gatunku, wyodrębnij sekwencję DNA wybranego genu za pomocą przeglądarki genomów i zapisz ją w formacie pliku fasta. Pobierz skrypty Perla wymagane dla protokołu CAPRRESI. Skrypty i pliki sekwencji należy przechowywać w tym samym katalogu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia metodę CAPRRESI. Z wykorzystaniem tej metody zmontowano dwa geny chimeryczne poprzez wymianę domen dwóch bakteryjnych głównych czynników sigma (t.j. E. coli RpoD i R. etli SigA). Sekwencje DNA genów rpoD i sigA pozyskano za pomocą przeglądarki genomów Artemis14 z plików genomów GenBank NC_000913 oraz NC_007761, odpowiednio. Sekwencję DNA wektora pUC18 pobrano z bazy nukleotydowej serwera NCB...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

CAPRRESI został zaprojektowany jako alternatywa dla PRM2. Oryginalny PRM to potężna technika; pozwala na fuzję sekwencji DNA wzdłuż dowolnej części wybranych genów. W przypadku PRM geny typu dzikiego powinny być klonowane do tego samego plazmidu. Następnie oligonukleotydy są projektowane wewnątrz genów oporności na antybiotyki typu dzikiego i antybiotyków znajdujących się w plazmidzie. Rozerwanie plazmidu uzyskuje się za pomocą PCR przy użyciu tępo zakończonych, polimeraz DNA o wysokiej wierności ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (grant numer 154833) i Universidad Nacional Autónoma de México. Autorzy pragną podziękować Víctorowi Gonzálezowi, Rosie I. Santamaríi, Patricii Bustos i Soledad Juárez za ich porady administracyjne i techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polimeraza DNA Platinum Taq High FidelityThermo Fisher11304011Wytwarza mieszankę / 3'-A zakończonych zwisem produktów PCR
Zestaw do izolacji plazmidu o wysokiej czystościRoche11754785001Stosowany we wszystkich reakcjach oczyszczania plazmidu Zestaw
oczyszczania produktu PCR o wysokiej czystościRoche11732676001Stosowany we wszystkich reakcjach oczyszczania PCR z żeli agarozowych
Enzym restrykcyjny AflIINew England BiolabsR0520LRozpoznaje sekwencję 5'-CTTAAG-3' i tnie pod kątem 37 & stopni;
Enzym restrykcyjny C KpnI-HFNew England BiolabsR3142LRozpoznaje sekwencję 5'-GGTACC-3' i tnie pod kątem 37 & stopni;
Enzym restrykcyjny C SpeI-HF NewEngland BiolabsR3133LRozpoznaje sekwencję 5'-ACTAGT-3' i tnie pod kątem 37 & stopni; C
Enzym restrykcyjny XbaINew England BiolabsR0145LRozpoznaje sekwencję 5'-TCTAGA-3' i tnie pod kątem 37 & stopni; C
Sól sodowa ampicylinySigma AldrichA0166-5GAntybiotyki
Kwas nalidyksowySigma AldrichN8878-5GAntybiotyki
EkstraktSigma AldrichY1625-1KGHodowla komórek bakteryjnych
Pepton kazeinowySigma Aldrich70171-500GHodowla komórek bakteryjnych
NaClSigma AldrichS9888-1KGchlorek sodu
AgarSigma Aldrich05040-1KGdo hodowli komórek bakteryjnych
XbaIThermo FisherFD0684Enzym szybkiego trawienia XbaI
KpnIenzym Thermo FisherFD0524ligowania KpnI enzym
New England BiolabsM2200SZestaw do szybkiej ligacji DNA
AflII enzym restrykcyjnyThermo FisherFD0834< > AflII
>SpeI enzym restrykcyjnyThermo FisherFD1253Szybko trawiony SpeI enzym
do drożdżowy Enzym restrykcyjny Zestaw do szybkiego Enzym restrykcyjny

Bibliografia

  1. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
  2. Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
  3. Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
  5. Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
  6. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  7. Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
  8. Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
  9. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  10. Macrogen Inc. , Seoul, Rep. Of Korea. Available from: http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp (2016).
  11. Chevreux, B. MIRA: an automated genome and EST assembler. , Available from: http://www.chevreux.org/thesis/index.html 1-161 (2005).
  12. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 2 (Unit 2.3) 1-22 (2002).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
  14. Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synonimiczne sekwencje DNAanaliza skryptem Perlprojektowanie oligonukleotydówamplifikacja PCRoczyszczanie w żeluligacja DNA
CAPRRESI: Składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.