Artykuł metodologiczny

Protokoły badania rozmieszczenia tkanki gospodarza, trybu transmisji i wpływu na kondycję gospodarza densowirusa w robaku bawełnianym

DOI:

10.3791/55534

⸱

12 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3Crop and Environment Sciences, Harper Adams University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do zbadania rozkładu tkanki gospodarza, sposobu transmisji i wpływu na dopasowanie gospodarza densowirusa w obrębie gatunku lepidoptera, robaka bawełnianego. Protokół ten może być również wykorzystany do badania interakcji między innymi wirusami przenoszonymi drogą pokarmową a ich owadzimi gospodarzami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele nowych wirusów zostało odkrytych u zwierzęcych gospodarzy przy użyciu technologii sekwencjonowania nowej generacji. Wcześniej informowaliśmy o wirusie mutualistycznym, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), u gatunku lepidoptera, robaka bawełnianego, Helicoverpa armigera (Hübner). W tym miejscu opisujemy protokoły, które są obecnie używane do badania wpływu HaDV2 na jego gospodarza. Po pierwsze, zakładamy kolonię bawełnianych robaków bawełnianych wolnych od HaDV2 z jednej pary hodowlanej. Następnie zaszczepiamy doustnie niektóre potomstwo larw noworodków przefiltrowanym płynem zawierającym HaDV2, aby wytworzyć dwie kolonie o tym samym tle genetycznym: jedną zakażoną HaDV2, drugą niezainfekowaną. Przedstawiono również protokół porównywania parametrów tablicy życia (np. okresy larwalne, poczwarkowe i dorosłe oraz płodność) między osobnikami zakażonymi i niezakażonymi HaDV2, a także protokoły określania rozmieszczenia tkanki gospodarza i wydajności transmisji HaDV2. Protokoły te byłyby również odpowiednie do badania wpływu innych wirusów przenoszonych drogą pokarmową na ich owadzich gospodarzy, w szczególności gospodarzy z rzędu Lepidoptera.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku dekad rozwój technologii sekwencjonowania, takich jak sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), ułatwił odkrycie wielu nowych wirusów DNA i RNA, zwłaszcza wirusów niepatogennych, ale także nowych izolatów wcześniej znanych wirusów1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. W organizmie modelowym Drosophila melanogaster wykryto ponad 20 nowych częściowych genomów wirusa przy użyciu technik metagenomicznych13. Wiele sekwencji wirusowych, w tym nowe wirusy, zidentyfikowano również u innych owadów, takich jak pszczoły miodne, komary, azjatyckie psyllidy cytrusowe, ważki i wiele gatunków Lepidoptera14,15,16,17,18,19,20,21.

W przyszłości można się spodziewać, że więcej nowych wirusów zostanie odkrytych u owadów przy użyciu tych zaawansowanych technologii; stąd nasze rozumienie interakcji wirus-gospodarz może się odpowiednio zmienić6,9. Na przykład interakcje wirus-gospodarz są uważane za bardziej skomplikowane niż wcześniej sądzono, ponieważ wiele nowych wirusów jest definiowanych jako wzajemni partnerzy, a nie ścisłe patogeny22. Na przykład mutualistyczny densowirus DplDNV u Dysaphis plantaginea indukuje skrzydlatą przemianę i zwiększa mobilność, ułatwiając rozprzestrzenianie się zarówno gospodarza, jak i wirusa23. Ponadto opisano wirusy mutualistyczne w odniesieniu do zdrowia ssaków, tolerancji roślin na suszę i zimno oraz wpływu infekcji bakteryjnych24. Wykazano, że wirus Seneca valley-001 pośredniczy w selektywnej cytotoksyczności w stosunku do komórek nowotworowych z cechami raka neuroendokrynnego25. Zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu A hamują replikację wirusa zapalenia wątroby typu C i mogą prowadzić do wyzdrowienia z wirusowego zapalenia wątroby typu C26. Latencja wirusa opryszczki zapewnia symbiotyczną ochronę przed infekcją bakteryjną27. Glikoproteina otoczka ludzkiego endogennego retrowirusa HERV-W indukuje oporność komórkową na wirusa martwicy śledziony28. Wirus tolerancji termicznej Curvularia (CThTV) z endofitu grzyba bierze udział w wzajemnym oddziaływaniu między tym grzybem a tropikalną trawą paniki29. W związku z tym wiedza na temat interakcji między nowo odkrytymi wirusami a ich gospodarzami powinna stworzyć nowe spojrzenie na ich biologię i leczenie. Jednak nowe wirusy, zwłaszcza ukryte wirusy nie wykazujące oczywistych objawów typowych dla ostrej infekcji, rzadko były badane i potrzebujemy rurociągu i protokołów, aby zbadać wpływ nowo odkrytych wirusów na ich gospodarzy.

Poprzednio informowaliśmy o występowaniu nowego monosensownego densowirusa Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2) u robaka bawełnianego, Helicoverpa armigera, i przedstawiliśmy dowody na wzajemny związek między HaDV2 a bawełnianym bollworm30,31. W tym artykule opiszemy protokół laboratoryjny do szczegółowego zbadania interakcji między HaDV2 a jego gospodarzem bawełnianym robakiem. Przedstawiony tutaj protokół może być również bardzo istotny dla badaczy badających rolę innych wirusów przenoszonych drogą pokarmową, zwłaszcza u szkodników z rzędu Lepidoptera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa Kolonii Robaków Bawełnianych wolnych od HaDV2

  1. Hodować larwy robaka bawełnianego (H. armigera) na sztucznej diecie32 w pomieszczeniu o kontrolowanym wzroście lub komorze ze sztucznym klimatem w temperaturze 25 ± 1 °C, przy 14 h światłach/10 h ciemności i wilgotności względnej 60%.
  2. Wspomagaj krycie pojedynczą parą nowo zamkniętych, używając plastikowej klatki na parę (10 cm wysokości, 5 cm średnicy) pokrytej bawełnianą gazą, aby zapewnić dobrą wentylację i służyć jako podłoże do składania jaj. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania kolonii wolnej od wirusa, wykorzystaj co najmniej 30 par kojarzeń jednoparowych. Nakarm dorosłe 10% roztworem cukru i 2% roztworu witamin32 namoczonego na waciku i codziennie uzupełnianego.
  3. Gdy dorosłe samice składają jaja na bawełnianej gazie około 2 dni po kryciu, należy codziennie zmieniać gazę. Zbieraj i utrzymuj jaja zawierające gazę w tym samym pomieszczeniu do wzrostu (lub sztucznej komorze klimatycznej) co dorosłe, aż do wyklucia się jaj.
  4. Nowo wyklute larwy należy natychmiast przenieść na nowe 24-dołkowe płytki, po jednym osobniku na studzienkę.
  5. Pięć dni po dacie pierwszego złożenia jaj zbierz rodzicielskie i przechowuj je w ciekłym azocie.
    UWAGA: Zbieranie ciem 5 dni po dacie pierwszego złożenia jaj zapewnia, że rodzice są żywi w momencie zbioru, a tym samym pozwala uniknąć ewentualnego wpływu użycia martwych na dokładność ekstrakcji DNA.
  6. Wyizoluj genomowe DNA z tych próbek za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Amplifikuj fragment genu aktyny o długości 574 pz za pomocą starterów aktyny F / aktyny R (aktyna F: 5-CATCTACGAGGGTTACGC-3 i aktyna R: 5-CATCTGTTGGAAGGTGGA-3). Wizualizacja produktów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym zgodnie ze standardowymi protokołami; udana amplifikacja genu aktyny zapewnia, że DNA jest dobrej jakości.
    2. Oceń obecność HaDV2 w rodzicielskich za pomocą PCR ze specyficznymi starterami: DVVPF (GGATTGGCCTGGGAAATGAC) i DVVPR (CGTTGTTTTTATATCCGAGG)31.
  7. Po zidentyfikowaniu czystej pary, należy wychować potomstwo z tej pojedynczej pary hodowlanej niezakażonej HaDV2 przez co najmniej pięć pokoleń i utrzymywać ją jako kolonię wolną od HaDV2 (szczep NONINF); kolonię zakażoną HaDV2 definiuje się jako szczep INF.
  8. Aby potwierdzić status infekcji HaDV2 w szczepie NONINF (i wykluczyć wpływ znanych bakterii lub wirusów na rozwój gospodarza), należy ocenić status infekcji dla HaDV2, Wolbachia i wirusa polihedrozy nukleozy H. armigera (HaNPV) u ośmiu losowo wybranych osobników larw szczepu NONINF za pomocą PCR (ze specyficznymi starterami: DVVPF/DVVPR dla HaDV2, NPVF/NPVR dla HaNPV, oraz 81F/691R dla Wolbachia31,33).
    UWAGA: Wiadomo, że niektóre wirusy mogą być utajone w zakażonym gospodarzu, a ich poziom jest niewykrywalny nawet przy użyciu techniki opartej na PCR. Technologie NGS mogą być wykorzystane do potwierdzenia, że w próbkach genomowego DNA nie ma sekwencji wirusowych.

2. Przygotowanie płynnych płynów zawierających HaDV2

UWAGA: Wykazaliśmy, że próba oczyszczenia cząsteczek wirusa HaDV2 hamuje ich zakaźność i aktywność31; dlatego następujący protokół jest wykonywany w celu uzyskania zakaźnego roztworu HaDV2 poprzez filtrowanie osób zainfekowanych HaDV2.

  1. Zbieraj dorosłe pojedynczo i natychmiast przechowuj je w ciekłym azocie.
  2. Całkowicie zmiel zebrane pojedyncze w ciekłym azocie za pomocą wysterylizowanego moździerza i tłuczka. Przenieś około 10 μg zanieczyszczeń do czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Pozostałe zanieczyszczenia przenieść do nowej probówki i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Wyodrębnić DNA z 10 μg szczątków, postępując zgodnie z protokołami dostarczonymi przez producenta. Po wyizolowaniu DNA sprawdź, czy nie ma HaDV2 za pomocą protokołu, jak opisano w kroku 1.6.
  4. Zgodnie z wynikami uzyskanymi w kroku 2.3 podziel pozostałe szczątki na dwie grupy: HaDV2-dodatnie i HaDV2-ujemne, w zależności od ich statusu infekcji. Dodać 1 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 i 1,5 mM KH2PO4; pH 7,5) do każdej osoby, aby całkowicie rozpuścić pozostałe szczątki larw.
  5. Odwirować homogenat (od etapu 2.4) w temperaturze 6 500 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przefiltrować ciekły supernatant za pomocą filtra membranowego o wielkości 0,22 μm. Zebrać przefiltrowane ciecze (200 μl na probówkę) i natychmiast przechowywać je w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Filtr membranowy 0,22 μm odfiltruje większość niepożądanych cząstek, bakterii i grzybów. Najpierw należy schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C. Wykonać wszystkie protokoły związane z działaniem przefiltrowanej cieczy na lodzie, aby zapobiec brązowieniu i koagulacji homogenatu.

3. Budowa kolonii robaków bawełnianych zainfekowanej HaDV2

  1. Zdolność transmisji poziomej HaDV2
    1. Wygeneruj krzywą standardową HaDV2.
      1. Amplifikować fragmenty zawierające startery (VPF: CTGGTGAGGCGATGGACATG; VPR: TGACAAGATCCAGCGTAGACATC) i sondę (VP-probe: GCCACCACTAGAGGACCCACCAGATG), które są używane do oznaczania ilościowego wirusa HaDV2, ze starterami de novo (PF: GGACAATGCTGGTGAGGC; Żądanie ściągnięcia: AATCCTCTTTGTCCGTTATCTATG). Użyj następującego programu: 30 s w 94 °C, 30 s w 53 °C i 60 s w 72 °C przez 40 cykli na maszynie PCR31. Dodać 1 μl genomowego DNA zawierającego genom HaDV2 (krok 2.3) do 25-μl reakcji PCR jako matrycowy DNA. Sklonuj amplifikowane fragmenty do wektora klonowania zgodnie z protokołami producenta.
      2. Oblicz liczbę kopii plazmidów za pomocą następującego równania: kopie/μL = (NA × C) / (n × M × 109), gdzie NA to liczba Avogadro (6,02 × 1023 cząsteczki/mol); C jest stężeniem masowym plazmidów (ng/μL), które można zmierzyć za pomocą mikrospektrofotometrii; n jest długością rekombinowanego plazmidu zawierającego produkt PCR (5,195 pz); a M jest masą cząsteczkową średniej pary zasad dwuniciowego DNA (660 g/mol).
      3. Przygotować sześć 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń w 1,5 ml probówkach do mikrowirówek o stężeniach 1,5 ×10 9, 1,5 × 108, 1,5 × 107, 1,5 × 106, 1,5 × 105 i 1,5 × 104 liczba kopii/μl.
      4. Przeprowadź ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) w czasie rzeczywistym przy użyciu specyficznych starterów (VPF/VPR) i sondy (sondy VP) w celu wygenerowania wartości progu cyklu (CT) plazmidów opisanych w kroku 3.1.1.3. Wykonaj trzy niezależne powtórzenia techniczne i uśrednij je w celu dalszych obliczeń.
      5. Korzystając z powyższych wyników, wygeneruj krzywą standardową korelującą stężenia HaDV2 przekształcone w log2 z powiązanymi uśrednionymi wartościami CT.
    2. Określić ilościowo HaDV2 w przefiltrowanych płynach ciekłych.
      1. Odpipetować 100 μl próbki testowej przefiltrowanego płynu ciekłego (krok 2.6) zawierającego HaDV2 do ekstrakcji DNA.
      2. Użyj qPCR w czasie rzeczywistym, aby uzyskać wartości CT dla ciekłych płynów i oblicz liczbę kopii za pomocą krzywej wzorcowej w kroku 3.1.1.
    3. Określ skuteczność infekcji jamy ustnej za pomocą przefiltrowanych cieczy zakażonych HaDV2 o różnych stężeniach.
      1. Rozcieńczyć płyn zawierający HaDV2 do następujących stężeń: 108, 107, 106, 105, 104 i 0 liczby kopii/μl.
      2. Sztuczną dietę rozprowadzić równomiernie na szalce Petriego o średnicy 9 cm przed zestaleniem. Równomiernie rozprowadzić przefiltrowaną ciecz zawierającą HaDV2 (200 μl) dla każdego stężenia na powierzchni stałej sztucznej diety. Zrób to w dygestorium.
      3. Przenieś 100 świeżo wyklutych larw do sztucznej diety zawierającej HaDV2 na szalce Petriego. Delikatnie uderz w bawełnianą gazę (w tym świeżo wyklute larwy), aby przenieść larwy z gazy na arkusz białego papieru. Delikatnie ubij papier, aby larwy obróciły jedwab i "balon" z papieru. Użyj wysterylizowanych kleszczy, aby dotknąć jedwabiu i przenieść larwy na szalkę Petriego.
      4. Po 48 godzinach przenieś larwy na sztucznej diecie na 24-dołkowe płytki (jeden osobnik na studzienkę).
      5. Larwy zaszczepione HaDV2 w powyższych stężeniach należy wyhodować do stadium dorosłego.
      6. Zbierz dorosłe, wyekstrahuj DNA i wykryj HaDV2 za pomocą PCR, jak opisano w kroku 1.5.
        UWAGA: Tutaj uzyskaj 100% wskaźnik infekcji HaDV2 robaków bawełnianych za pomocą liczby 108 kopii / μL i w ten sposób ustal kolonię zakażoną HaDV2 (szczep INF).
  2. Zdolność transmisji pionowej HaDV2
    1. Wybierz dorosłe ze szczepów NONINF i INF, aby wygenerować pojedyncze pary ♀ -/♂-, ♀ +/♂-, ♀ -/♂+ i ♀ +/♂+ (+: dodatnie dla infekcji HaDV2; -: ujemne dla infekcji HaDV2).
    2. Przenieść potomstwo z powyższych par na wolne od wirusów 24-dołkowe płytki; wyhodować larwy do trzeciego stadium rozwojowego.
    3. Wyodrębnić DNA z pobranych larw w trzecim stadium rozwojowym, aby użyć go jako matrycy do określenia obecności HaDV2, jak opisano w kroku 1.5.

4. Dystrybucja tkankowa HaDV2

  1. Aby zapobiec zanieczyszczeniu wirusami i bakteriami, trzykrotnie wysterylizuj kleszcze i nożyczki w 75% etanolu, a następnie podgrzej je w płomieniu lampy alkoholowej.
    UWAGA: Sterylizacja kleszczami jest konieczna, gdy dojdzie do zanieczyszczenia.
  2. Za pomocą wagi analitycznej zważyć puste probówki, które mają być używane do przechowywania tkanek.
  3. Larwy i dorosłe ze szczepu INF umieścić na lodzie na około 5 minut.
  4. Wypreparuj następujące tkanki pod mikroskopem stereoskopowym u larw, dorosłych samic i dorosłych samców na czystej szalce Petriego zawierającej bufor PBS.
    1. W przypadku larw pipetuj hemolimfę i rozpreparuj jelito przednie, środkowe, tylne, ciało tłuszczowe i kanaliki malpighian (ryc. 1A). Natychmiast przenieś każdą tkankę do probówek w ciekłym azocie.
      1. Przymocuj zamrożone larwy do cystosepimentu za pomocą dwóch szpilek owadzich (o średnicy 200 μm, długości 20 mm), wkładając je w błony międzysegmentowe w pobliżu głowy i ostatniego segmentu odwłoka (ryc. 1A).
      2. Przeciąć przednóżek w tylnym odwłoku larw tak, aby wypłynęła hemolimfa larwy. Odpipetować hemolimfę larwalną w ciągu 10 sekund za pomocą mikropipety, aby zapobiec brązowieniu i koagulacji hemolimfy.
        UWAGA: Fenylotiomocznik (50 μg/ml) można mieszać w stosunku 1:20 obj./obj. z hemolimfą, aby zapobiec melanizacji.
      3. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w naskórku, począwszy od ostatniej błony międzysegmentowej do głowy. Wypreparuj wszystkie pozostałe tkanki pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą dwóch kleszczy; rysunek dla każdej tkanki pokazano na rysunku 1A.
      4. Wymieszaj próbki tkanek od trzech osób razem jako jedną replikę.
      5. Aby zapobiec zanieczyszczeniu pozostałych tkanek hemolimfą podczas sekcji, należy trzykrotnie przemyć wypreparowane tkanki w buforze PBS. Następnie przetestuj status infekcji HaDV2 PBS używanego do mycia. Jeśli końcowy bufor do płukania jest wolny od HaDV2, tkanka powinna być oczyszczona z zanieczyszczenia hemolimfą.
    2. W przypadku dorosłych kobiet należy wypreparować głowę (mózg), mięśnie, ciało tłuszczowe, jelita, kanaliki malpighiego i jajnik (ryc. 1B) pod mikroskopem stereoskopowym w buforze PBS. W przypadku dorosłych mężczyzn należy wypreparować głowę (mózg), mięśnie, ciało tłuszczowe, jelita, kanaliki malpighiego i jądra (ryc. 1C) pod mikroskopem stereoskopowym w buforze PBS. Natychmiast przenieś każdą tkankę do probówek w ciekłym azocie.
      1. Za pomocą kleszczy i nożyczek usuń skrzydła dorosłych i trzykrotnie umyj pozostałe ciało, aby oczyścić łuski.
      2. Oddziel głowę, klatkę piersiową i brzuch za pomocą nożyczek.
      3. Usuń endoszkielet klatki piersiowej i zbierz mięsień.
      4. Za pomocą kleszczy usuń naskórek brzucha i wypreparuj inne tkanki zgodnie z rysunkami 1B i 1C.
      5. Wymieszaj próbki tkanek od trzech osobników razem jako jedną replikę. Umyć wypreparowane tkanki w buforze PBS trzy razy.
  5. Zważyć probówki i powyższe tkanki, gdy zostały zamrożone i upewnić się, że masy różnych tkanek są prawie równe.
    Masa (tkanki) = masa (probówki/próbka tkanki) - masa (tylko probówka)
  6. Wyekstrahuj DNA z tych tkanek i wykonaj qPCR, jak opisano w kroku 3.1.2.
  7. Obliczyć liczbę kopii na mg każdej tkanki, korzystając z krzywej wzorcowej wygenerowanej w kroku 3.1.1. Miano wirusa na jednostkę masy należy zastosować w celu skorygowania odchylenia próbki spowodowanego różnicą w ilości tkanki użytej do ekstrakcji DNA.
  8. Obliczyć procentową zawartość HaDV2 w określonej tkance w następujący sposób: procent HaDV2 dla każdej tkanki = liczba kopii HaDV2 na mg badanej tkanki/ (suma liczby kopii na mg wszystkich tkanek).

5. Testy biologiczne badające wpływ HaDV2 na rozwój gospodarza

  1. Umieść co najmniej 100 poczwarek lub nowo powstałych dorosłych ciem pochodzących ze szczepu NONINF w pokrytej bawełnianą gazą, 5-litrowej klatce z siatki drucianej. Po 2 dniach kryte dorosłe samice zaczną składać jaja na bawełnianej gazie. Zebrać i przechowywać bawełnianą gazę zawierającą jaja; Jaja wyklują się za około trzy dni.
  2. Inokulacja larw noworodków HaDV2.
    1. Przenieść larwy noworodków ze szczepu NONINF do sztucznej diety zawierającej HaDV2 (108 liczba kopii/μl) w celu ustalenia szczepu INF.
    2. Podobnie, przenieś larwy noworodków do sztucznej diety pokrytej przefiltrowaną cieczą wolną od HaDV2 (krok 2.4) w celu ustalenia grup kontrolnych (szczep NONINF). Włączyć co najmniej 240 larw do każdego zabiegu (ryc. 2A).
      UWAGA: Larwy używane do budowy szczepów NONINF i INF pochodzą z tej samej kohorty rodzicielskiej i wykluwają się w tym samym czasie, co zapewnia to samo tło genetyczne. Upewnij się, że szczepy NONINF i INF są przechowywane w tej samej komorze klimatycznej (w temperaturze 25 ± 1 °C, przy 14 godzinach światła/10 godzinach ciemności i wilgotności względnej 60%) w celu uzyskania synchronicznego tempa rozwoju; Szybkość może się różnić w zależności od temperatury i wilgotności. Z delikatnymi larwami należy obchodzić się delikatnie.
  3. Po 48 godzinach przenieść larwy pojedynczo na płytki 24-dołkowe (po jednym osobniku na studzienkę) (ryc. 2B).
    1. Sekwencyjnie numeruj każdą larwę w każdej studzience i codziennie rejestruj stadium rozwoju i stan przeżycia.
    2. Około 5 dni później, gdy sztuczna dieta ulegnie pogorszeniu, jednocześnie przenieś te osoby na nową 24-dołkową płytkę zawierającą świeżą sztuczną dietę (ryc. 2C).
    3. Zważyć larwy od 7 do 11 dnia po wykluciu za pomocą wagi analitycznej z dokładnością do 0,0001 g. Po zważeniu pojedynczo umieść larwy z powrotem na 24-dołkowej płytce.
  4. Po linieniu do piątego stadium rozwojowego po czwartej ekdyzie (około dziesięciu dni po wykluciu) larwy przenieść do szklanych rurek (10 cm wysokości, 2 cm średnicy) (ryc. 2D); larwy w piątym stadium rozwojowym można również zidentyfikować po szerokości torebki głowy (około 2,6 mm).
    UWAGA: Przenieś osoby do szklanej rurki o tej samej porze każdego dnia.
    1. Oznacz każdą larwę jej oryginalnym numerem referencyjnym na szklanej rurce za pomocą farby lub markerów. Codziennie rejestruj stan larwalny; W szklanych probówkach larwy przepoczwarzają się po około pięciu dniach - stadium poczwarki trwa około 11 dni.
    2. Zapisz poczwarki i datę wylęgu dla każdego osobnika w szklanej probówce. Zapisz masę 3-dniowych poczwarek.
  5. Po ekluzji umieść jedną samicę i jednego samca w jednej klatce z 10% sacharozą i 2% roztworem witamin (ryc. 2E). Codziennie uzupełniaj roztwór sacharozy. Zapisz datę śmierci dla każdej.
  6. Po złożeniu jaj codziennie zmieniaj bawełnianą gazę. Natychmiast policz liczbę jaj. Policz nowo wyklute potomstwo podczas wykluwania.
  7. Podczas testów biologicznych losowo wybierz osiem osób do każdego leczenia, aby potwierdzić status infekcji HaDV2. Ekstrahować całkowite RNA z tych próbek za pomocą dostępnego w handlu odczynnika trypsyna zgodnie z protokołem producenta. Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA zgodnie z protokołem producenta i użyj jej jako szablonu do sprawdzenia, czy wirusy zostały pomyślnie transkrybowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potomstwo od rodziców, którzy byli wolni od HaDV2 (Rysunek 3A) było hodowane jako szczep NONINF. Udało nam się amplifikować gen aktyny przy użyciu tych samych matryc DNA, co sugeruje, że matryce DNA były dobrej jakości (Figura 3B). Ponadto losowo wybrane osiem prognien było również wolnych od HaDV2 (Figura 3C), HaNPV (Figura 3D) i Wolbachia (Figura 3E). Ponownie doszliśmy do wniosku, że ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku dekad większość badań nad interakcjami między owadami a wirusami koncentrowała się na zdrowiu pszczół miodnych34,35,36, wektorach chorób u ludzi37, wirusach roślinnych38 i niektórych wirusach chorobotwórczych owadów, które mają ogromny potencjał jako środki kontroli biologicznej39. Niewiele uwagi poświęcono ukrytym wirusom u owadów, z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badań Podstawowych Chin (nr 2013CB127602) oraz Fundusz Naukowy dla Kreatywnych Grup Badawczych Narodowej Fundacji Nauki Chin (nr 31321004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 24-dołkowaCorning07-200-740Dostępnych jest wielu dostawców.
Zestaw do ekstrakcji DNATIANGENDP304-03Dostępnych jest wielu dostawców.
termocyklerVeriti; Biosystemy stosowane4375786
PBSCorning21-040-CV
0,22 i mikro; m filtr membranowyMilliporeSLGS025NB
pEASY-T Klonowanie VectorTransGen, Pekin, ChinyCT301-02
PęsetaIDEAL-TEK2.SA
Premix Ex Taq (Sonda qPCR)TakaraRR390A
SondyInvitrogenNa zamówienie
PodkładyInvitrogenNa zamówienie
mikrospektrofotometria NanoDrop 2000c Termo naukowy niedostępne
System 7500 Real-Time PCRApplied Biosystemsniedostępny
stereoskop SZX-16Olympusniedostępny
sacharozaDostępnych jest wielu dostawców.
kompleksDostępnych jest wielu dostawców.
witamin

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, P., Chiu, C. Metagenomics for the discovery of novel human viruses. Future Microbiol. 5, 177-189 (2010).
  2. Rosario, K., Breitbart, M. Exploring the viral world through metagenomics. Curr. Opin. Virol. 1, 289-297 (2011).
  3. Hugenholtz, P., Tyson, G. W. Microbiology - metagenomics. Nature. 455, 481-483 (2008).
  4. Kristensen, D. M., Mushegian, A. R., Dolja, V. V., Koonin, E. V. New dimensions of the virus world discovered through metagenomics. Trends Microbiol. 18, 11-19 (2010).
  5. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7(2015).
  6. Ho, T., Tzanetakis, I. E. Development of a virus detection and discovery pipeline using next generation sequencing. Virology. 471, 54-60 (2014).
  7. Marx, C. J. Can you sequence ecology? Metagenomics of adaptive diversification. PLoS Biol. 11, e1001487(2013).
  8. Radford, A. D., et al. Application of next-generation sequencing technologies in virology. J. Gen. Virol. 93, 1853-1868 (2012).
  9. Liu, S. J., Chen, Y. T., Bonning, B. C. RNA virus discovery in insects. Curr. Opin. Insect Sci. 8, 54-61 (2015).
  10. Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Curr. Opin. Virol. 2, 63-77 (2012).
  11. Liu, S. J., Vijayendran, D., Bonning, B. C. Next generation sequencing technologies for insect virus discovery. Viruses-Basel. 3, 1849-1869 (2011).
  12. Cook, S., et al. Novel virus discovery and genome reconstruction from field RNA samples reveals highly divergent viruses in Dipteran hosts. PLoS ONE. 8, e80720(2013).
  13. Webster, C. L., et al. The discovery, distribution, and evolution of viruses associated with Drosophila melanogaster. PLoS Biol. 13, e1002210(2015).
  14. Granberg, F., et al. Metagenomic detection of viral pathogens in spanish honeybees: co-infection by aphid lethal paralysis, israel acute paralysis and lake sinai viruses. PLoS ONE. 8, e57459(2013).
  15. Runckel, C., et al. Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS ONE. 6, 20656(2011).
  16. Cox-Foster, D. L., et al. A metagenomic survey of microbes in honey bee colony collapse disorder. Science. 318, 283-287 (2007).
  17. Chandler, J. A., Liu, R. M., Bennett, S. N. RNA shotgun metagenomic sequencing of northern California (USA) mosquitoes uncovers viruses, bacteria, and fungi. Front. Microbiol. 6, 185(2015).
  18. Shi, C. Y., et al. A metagenomic survey of viral abundance and diversity in mosquitoes from Hubei province. PLoS ONE. 10, e0129845(2015).
  19. Nouri, S., Salem, N., Nigg, J. C., Falk, B. W. Diverse array of new viral sequences identified in worldwide populations of the Asian citrus psyllid (Diaphorina citri) using viral metagenomics. J. Virol. 90, 2434-2445 (2016).
  20. Dayaram, A., et al. Identification of diverse circular single-stranded DNA viruses in adult dragonflies and damselflies (Insecta Odonata) of Arizona and Oklahoma, USA. Infect. Genet. Evol. 30, 278-287 (2015).
  21. Jakubowska, A. K., et al. Simultaneous occurrence of covert infections with small RNA viruses in the lepidopteran Spodoptera exigua. J.Invert. Pathol. 121, 56-63 (2014).
  22. Roossinck, M. J. Move over, Bacteria! Viruses make their mark as mutualistic microbial symbionts. J. Virol. 89, 6532-6535 (2015).
  23. Ryabov, E. V., Keane, G., Naish, N., Evered, C., Winstanley, D. Densovirus induces winged morphs in asexual clones of the rosy apple aphid, Dysaphis plantaginea. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 8465-8470 (2009).
  24. Roossinck, M. J. The good viruses: viral mutualistic symbioses. Nat. Rev. Microbiol. 9, 99-108 (2011).
  25. Venkataraman, S., et al. Structure of seneca valley virus-001: an oncolytic picornavirus representing a new genus. Structure. 16, 1555-1561 (2008).
  26. Deterding, K., et al. Hepatitis a virus infection suppresses hepatitis c virus replication and may lead to clearance of hcv. J. Hepatol. 45, 770-778 (2007).
  27. Barton, E. S., et al. Herpesvirus latency confers symbiotic protection from bacterial infection. Nature. 447, 326-329 (2007).
  28. Ponferrada, V. G., Mauck, B. S., Wooley, D. P. The envelope glycoprotein of human endogenous retrovirus herv-w induces cellular resistance to spleen necrosis virus. Arch. Virol. 148, 659-675 (2003).
  29. Márquez, L. M., Redman, R. S., Rodriguez, R. J., Roossinck, M. J. A virus in a fungus in a plant: three-way symbiosis required for thermal tolerance. Science. 315, 513-515 (2007).
  30. Xu, P. J., et al. Complete genome sequence of a monosense densovirus infecting the cotton bollworm, Helicoverpa armigera. J. Virol. 86, 10909-10909 (2012).
  31. Xu, P. J., Liu, Y. Q., Graham, R. I., Wilson, K., Wu, K. M. Densovirus is a mutualistic symbiont of a global crop pest (Helicoverpa armigera) and protects against a baculovirus and Bt biopesticide. PLoS Pathog. 10, e1004490(2014).
  32. Liang, G. M., Tan, W. J., Guo, Y. Y. An improvement in the technique of artificial rearing cotton bollworm. Plant Protec. 25, 15-17 (1999).
  33. Zhou, W. G., Rousset, F., O'Neill, S. Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences. P. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 265, 509-515 (1998).
  34. Mondet, F., de Miranda, J. R., Kretzschmar, A., Le Conte, Y., Mercer, A. R. On the front line: quantitative virus dynamics in honeybee (Apis mellifera L.) colonies along a new expansion front of the parasite Varroa destructor. PLoS Pathog. 10, e1004323(2014).
  35. Chen, Y. P., et al. Israeli acute paralysis virus: epidemiology, pathogenesis and implications for honey bee health. PLoS Pathog. 10, e1004261(2014).
  36. Hunter, W., et al. Large-scale field application of RNAi technology reducing israeli acute paralysis virus disease in honey bees (Apis mellifera, Hymenoptera: Apidae). PLoS Pathog. 6, e1001160(2010).
  37. Halstead, S. B. Dengue virus - mosquito interactions. Annu. Rev. Entomol. 53, 273-291 (2008).
  38. Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479-480, 278-289 (2015).
  39. Moscardi, F. Assessment of the application of baculoviruses for control of Lepidoptera. Annu. Rev. Entomol. 44, 257-289 (1999).
  40. Szelei, J., et al. Susceptibility of North-American and European crickets to Acheta domesticus densovirus (AdDNV) and associated epizootics. J. Invert. Pathol. 106, 394-399 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interakcja densowirusa z gospodarzemkolonia bawe nianego cieciadoustna inokulacja wirusaanaliza tablic yciatest dystrybucji tkankowejtest efektywno ci transmisjidetekcja wirusa metod PCRpobieranie hemolimfyprotok sekcji tkanekpomiar parametr w dostosowania

Powiązane artykuły