In vitro Metody porównywania wiązania celu i indukcji CDC między przeciwciałami terapeutycznymi: zastosowania w analizie biopodobieństwa

Summary

Ten protokół opisuje porównanie in vitro dwóch kluczowych cech funkcjonalnych rytuksymabu: wiązania celu i indukcji cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC). Metody te wykorzystano do bezpośredniego porównania referencyjnego rytuksymabu z rytuksymabem biopodobnym. Testy te mogą być stosowane podczas opracowywania leków biopodobnych lub jako kontrola jakości w ich produkcji.

Abstract

Terapeutyczne przeciwciała monoklonalne (mAb) są istotne w leczeniu różnych patologii, w tym nowotworów. Rozwój biopodobnych przeciwciał monoklonalnych przez firmy farmaceutyczne jest szansą rynkową, ale jest to również strategia mająca na celu zwiększenie dostępności leków i obniżenie kosztów związanych z terapią. Szczegółowo opisane tutaj protokoły opisują ocenę wiązania celu i indukcji CDC przez rytuksymab w komórkach Daudiego. Te dwie funkcje wymagają różnych regionów strukturalnych przeciwciała i są istotne dla efektu klinicznego wywołanego przez rytuksymab. Protokoły umożliwiają bezpośrednie porównanie referencyjnego rytuksymabu z dostępnym do obrotu biopodobnym rytuksymabem. Oceniane produkty wykazały różnice zarówno w wiązaniu celu, jak i indukcji CDC, co sugeruje, że istnieją podstawowe różnice fizykochemiczne i podkreśla potrzebę analizy wpływu tych różnic w warunkach klinicznych. Przedstawione tu metody stanowią proste i niedrogie modele in vitro do oceny aktywności leków biopodobnych do rytuksymabu. Tym samym mogą być przydatne podczas opracowywania leków biopodobnych, a także do kontroli jakości w produkcji leków biopodobnych. Ponadto przedstawione metody można ekstrapolować na inne terapeutyczne przeciwciała monoklonalne.

Introduction

Przeciwciała terapeutyczne to rekombinowane przeciwciała monoklonalne (mAb) opracowane do leczenia różnych patologii, w tym nowotworów, chorób autoimmunologicznych i przewlekłych, zaburzeń neurologicznych i innych¹. Obecnie FDA zatwierdziła ponad 40 terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych, a oczekuje się, że kolejne trafią na rynek w nadchodzących latach.

Rytuksymab jest chimerycznym przeciwciałem monoklonalnym IgG1 o wysokim powinowactwie, zatwierdzonym do leczenia chłoniaka nieziarniczego CD20⁺ B-komórkowego (NHL), pęcherzyka CD20⁺ NHL, przewlekłej białaczki limfocytowej i reumatoidalnego z....

Protocol

1. Ocena wiązania celu za pomocą cytometrii przepływowej

1. Przygotowanie materiałów biologicznych i odczynników
   1. Przygotuj 500 ml pożywki hodowlanej RPMI uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (H-IFBS).
   2. Hodowla komórek chłoniaka Daudiego Burkitta (Daudi) i komórek Daudi GFP⁺ przy użyciu RPMI i kolb hodowlanych o średnicy 75 cm². Utrzymuj kultury w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej 5% CO₂ , aż osiągną 6 - 9 x 10⁵ komórek/ml.
   3. Sporządzić 50 ml buforu barwiącego, rozcieńczając 1/100 H-IFBS w PBS; bufor ten jest stabilny w temperaturze....

Results

Korzystając z opisanych powyżej protokołów, wiązanie celu i indukcja CDC referencyjnego rytuksymabu zostały porównane równolegle z tymi w przypadku biopodobnego rytuksymabu produkowanego i komercyjnie dostępnego w Azji.

W komórkach Daudiego oba mAb wiążą CD20 w sposób zależny od stężenia (Rysunek 1D). Regresje nieliniowe danych dotyczących wiązania wykazały r² wynoszące 0,978 i 0,848 odpowiednio dla r.......

Discussion

Wygaśnięcie patentu na terapeutyczny przeciwciała monoklonalne sprzyja rozwojowi leków biopodobnych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na proste metody, które mogą zidentyfikować różnice w klinicznie istotnych działaniach tych produktów. Hodowane komórki CD20⁺ wykorzystano do oceny dwóch kluczowych cech funkcjonalnych rytuksymabu: wiązania celu i indukcji CDC. Pierwsza aktywność wymaga rozpoznania CD20 przez region Fab mAb, podczas gdy druga zależy głównie od interakcji regionu Fc z jego dopełniaczem

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 pożywka	ATCC	30-2001	Modyfikuj hodowlę w zależności od linii komórkowej
Roztwór błękitu trypanowego	Sigma	T8154	0,4%, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowej
Komórki chłoniaka Daudiego Burkitta	ATCC	CCL-213	Możesz modyfikować linię komórkową w zależności od interesującego przeciwciała
Surowica bydlęca płodu (FBS)	GIBCO	16000-044	Możesz modyfikować źródło surowicy w zależności od wymagań linii komórkowej
Normalny ludzki dopełniacz surowicy	Quidel	A113	Dlatego nadaje się do stosowania w eksperymentach biokompatybilności, w tym w opracowywaniu leków, testowaniu biomateriałów i innych zastosowaniach
7AA-D	BDPharmigen	559925	Możesz użyć szerokiej gamy opcji kolorystycznych, kompatybilnych z większością konfiguracji instrumentów, aby przeanalizować żywotność.
PECy5 Mysz Anty-ludzka IgG	BDPharmigen	551497	Zmień fluorochrom w zależności od filtra i lasera cytometru przepływowego
Kontrola izotypu ludzkiej IgG	ThermoFisher Scientific	07-7102	Zmiana w zależności od mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Bufor utrwalający do cytometrii przepływowej (1 - 4% formaldehydu lub paraformaldehydu)
PBS pH 7,4 10x (Bufor fosforanowy sól fizjologiczna)	GIBCO	70011-044	Bufor fosforanowy bez Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4] i wolne od endotoksyn.
Płytki do hodowli komórkowych 96-dołkowe, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm okrągłe probówki lub 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania V- lub U-bottom
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Produkt referencyjny
Rytuksymab	indyjski	—	Produkt biopodobny
Stożkowe probówki wirówkowe 15 lub 50 ml	Corning	430290 lub 430052	—
Końcówki do pipet	Eppendorf	—	Konieczne są konfiguracje wielu woluminów
Pipety	Eppendorf	—	Niezbędne są pipety o regulowanej objętości
Wirówka 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Wirówka z chłodzeniem o zmiennej prędkości obrotowej (4 do 25 stopni; C) o prędkościach od 10 do 30 130 i razy; g
Cytometr przepływowy	BD Dickinson	—	BD FACSAria III lub inny cytometr przepływowy
Mikroskop optyczny i świetlny Olympus	Olympus	—	Ilościowe określenie i ocena wzrostu komórek
Inkubator	SANYO	—	Inkubator do kontroli temperatury i CO2 do hodowli komórek
Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego	CHC BIOLUS	—	Szafa bezpieczeństwa biologicznego, która służy do ochrony badacza, produktu i środowiska.