In vitro Metody porównywania wiązania celu i indukcji CDC między przeciwciałami terapeutycznymi: zastosowania w analizie biopodobieństwa

Podsumowanie

Ten protokół opisuje porównanie in vitro dwóch kluczowych cech funkcjonalnych rytuksymabu: wiązania celu i indukcji cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC). Metody te wykorzystano do bezpośredniego porównania referencyjnego rytuksymabu z rytuksymabem biopodobnym. Testy te mogą być stosowane podczas opracowywania leków biopodobnych lub jako kontrola jakości w ich produkcji.

Streszczenie

Terapeutyczne przeciwciała monoklonalne (mAb) są istotne w leczeniu różnych patologii, w tym nowotworów. Rozwój biopodobnych przeciwciał monoklonalnych przez firmy farmaceutyczne jest szansą rynkową, ale jest to również strategia mająca na celu zwiększenie dostępności leków i obniżenie kosztów związanych z terapią. Szczegółowo opisane tutaj protokoły opisują ocenę wiązania celu i indukcji CDC przez rytuksymab w komórkach Daudiego. Te dwie funkcje wymagają różnych regionów strukturalnych przeciwciała i są istotne dla efektu klinicznego wywołanego przez rytuksymab. Protokoły umożliwiają bezpośrednie porównanie referencyjnego rytuksymabu z dostępnym do obrotu biopodobnym rytuksymabem. Oceniane produkty wykazały różnice zarówno w wiązaniu celu, jak i indukcji CDC, co sugeruje, że istnieją podstawowe różnice fizykochemiczne i podkreśla potrzebę analizy wpływu tych różnic w warunkach klinicznych. Przedstawione tu metody stanowią proste i niedrogie modele in vitro do oceny aktywności leków biopodobnych do rytuksymabu. Tym samym mogą być przydatne podczas opracowywania leków biopodobnych, a także do kontroli jakości w produkcji leków biopodobnych. Ponadto przedstawione metody można ekstrapolować na inne terapeutyczne przeciwciała monoklonalne.

Wprowadzenie

Przeciwciała terapeutyczne to rekombinowane przeciwciała monoklonalne (mAb) opracowane do leczenia różnych patologii, w tym nowotworów, chorób autoimmunologicznych i przewlekłych, zaburzeń neurologicznych i innych¹. Obecnie FDA zatwierdziła ponad 40 terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych, a oczekuje się, że kolejne trafią na rynek w nadchodzących latach.

Rytuksymab jest chimerycznym przeciwciałem monoklonalnym IgG1 o wysokim powinowactwie, zatwierdzonym do leczenia chłoniaka nieziarniczego CD20⁺ B-komórkowego (NHL), pęcherzyka CD20⁺ NHL, przewlekłej białaczki limfocytowej i reumatoidalnego zapalenia stawów^2,3. Rozpoznanie CD20, który ulega nadekspresji w komórkach B, przez rytuksymab indukuje apoptozę; aktywacja dopełniacza; oraz cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC)3. Patenty na ten lek wygasły w Europie i USA odpowiednio w 2013 i 2016 roku. W związku z tym firmy farmaceutyczne na całym świecie opracowują leki biopodobne do rytuksymabu. Podobnie jak w przypadku każdego innego leku przeznaczonego do spożycia przez ludzi, leki biopodobne wymagają zatwierdzenia przez agencje regulacyjne. Międzynarodowe wytyczne wskazują, że w przypadku przeciwciał monoklonalnych biopodobieństwo należy wykazać poprzez porównanie charakterystyki fizykochemicznej, farmakokinetyki, skuteczności i bezpieczeństwa produktów nowych i referencyjnych⁴.

W związku z tym, metodologie używane w takich porównaniach muszą oceniać strukturalne i funkcjonalne cechy mAb, szczególnie te o znaczeniu klinicznym. W tym celu testy in vitro wykazują kilka zalet w porównaniu z eksperymentami in vivo (przegląd w Chapman i wsp.)⁵: i) badania in vitro są bardziej wrażliwe na różnice między proponowanym produktem biopodobnym a produktem referencyjnym; (ii) należy przeprowadzić badania in vivo na odpowiednich gatunkach, którymi w przypadku wielu przeciwciał monoklonalnych są naczelne inne niż ludzie; oraz (iii) ponieważ mechanizm działania, toksykologia przedkliniczna i skutki kliniczne produktu referencyjnego są dobrze znane, badania in vivo z użyciem leków biopodobnych mogą nie dostarczyć dodatkowych użytecznych informacji. W związku z tym wytyczne Unii Europejskiej dotyczące leków biopodobnych umożliwiają kandydatom udział w badaniach klinicznych opartych wyłącznie na solidnych danych in vitro⁶.

Tutaj prezentujemy dwa szybkie, ekonomiczne i proste testy, które oceniają aktywność biologiczną rytuksymabu przy użyciu komórek hodowlanych CD20⁺. Testy te mogą zostać włączone do badania porównywalności kandydatów na leki biopodobne do rytuksymabu.

Protokół

1. Ocena wiązania celu za pomocą cytometrii przepływowej

1. Przygotowanie materiałów biologicznych i odczynników
   1. Przygotuj 500 ml pożywki hodowlanej RPMI uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (H-IFBS).
   2. Hodowla komórek chłoniaka Daudiego Burkitta (Daudi) i komórek Daudi GFP⁺ przy użyciu RPMI i kolb hodowlanych o średnicy 75 cm². Utrzymuj kultury w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej 5% CO₂ , aż osiągną 6 - 9 x 10⁵ komórek/ml.
   3. Sporządzić 50 ml buforu barwiącego, rozcieńczając 1/100 H-IFBS w PBS; bufor ten jest stabilny w temperaturze 2-8 °C przez co najmniej jeden miesiąc.
   4. Przygotować roztwory testowe dla wzorcowych i biopodobnych przeciwciał monoklonalnych. Wykonać dziesięć seryjnych rozcieńczeń 1:2 (po 500 μl każde) w buforze barwiącym, zaczynając od 5 μg/ml.
   5. Użyć buforu barwiącego, aby rozcieńczyć ludzką IgG (kontrolę izotypu) do 5 μg/ml i PE-Cy5 mysią anty-ludzką IgG (przeciwciało drugorzędowe) do stężenia sugerowanego przez producenta.
   6. Przygotować 4% paraformaldehydu w PBS (bufor utrwalający).
2. Powiązanie docelowe
   1. Zebrać zawiesiny komórek Daudiego i Daudiego GFP⁺ z kolb hodowlanych o średnicy 75^cm2 i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 400 x g przez 5 min.
   2. Umyj komórki, dodając 5 ml PBS i odwirowując zawiesinę komórek o sile 400 x g przez 5 minut.
   3. Ponownie zawiesić komórki w PBS i przeprowadzić analizę liczby komórek i żywotności za pomocą błękitu trypanowego. Do analizy należy użyć kultur o poziomie żywotności komórek ≥ 95%.
   4. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 4 x 10⁶ komórek/ml zimnym buforem barwiącym.
   5. W probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dodać 50 μl zawiesiny komórek do 100 μl różnych badanych stężeń referencyjnych lub biopodobnych mAb. Uwzględnij powtórzenia dla każdego warunku eksperymentalnego.
   6. Przygotować dodatkowe probówki do kontroli izotypu (ludzka IgG1 zamiast rytuksymabu) i kontroli ujemnej (przeciwciało drugorzędowe bez przeciwciała pierwszorzędowego).
   7. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 - 30 minut.
   8. Przemyć komórki, dodając 1 ml PBS i odwirowując zawiesinę komórek o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 10 °C. Odrzucić supernatant.
   9. Zawiesić komórki w 100 μl przeciwciała drugorzędowego i inkubować przez 20-30 minut w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
   10. Przemyć komórki dwukrotnie PBS i zawiesić je w 200 μl buforu utrwalającego.
   11. Przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym.
       UWAGA: Sygnał pozostaje stabilny przez kilka dni, jeśli próbki są przechowywane w temperaturze 4 °C i chronione przed światłem.
3. Akwizycja danych
   1. Otwórz dwa wykresy kropkowe na arkuszu roboczym oprogramowania operacyjnego cytometru przepływowego. Ustaw FSC-A i FSC-H w pierwszym, a FSC-A w SSA-A w drugim. Otwórz histogram kanału PE-Cy5.
   2. Na wykresie FSC-A versus FSC-H utwórz bramkę (R1) wybierającą zdarzenia singletowe (Rysunek 1A).
   3. Ustaw populację R1 na wykresie kropkowym FSC-A i SSA-A, a następnie utwórz nową bramkę (R2), wybierając komórki docelowe (rysunek 1B). Ustaw populację R2 na histogramie intensywności PE-Cy5, aby wyświetlić rozkład częstotliwości komórek.
   4. Dostosuj dolną granicę intensywności fluorescencji (FI) dla kanału PE-Cy5 za pomocą kontroli ujemnej i izotypu (rysunek 1C).
   5. Pozyskaj 10 000 zdarzeń w obrębie R2 z próbki o wyższym stężeniu produktu referencyjnego. FI w tej próbce powinien być najwyższy oczekiwany (rysunek 1C).
   6. Zdobądź pozostałe próbki.
   7. Dla każdej próbki uzyskaj medianę intensywności fluorescencji (MFI) w kanale PE-Cy5.
   8. W przypadku próbek z referencyjnym lub biopodobnym przeciwciałem monoklonalnym należy obliczyć różnicę między próbką MFI a próbą kontrolną izotypu (ΔMFI).

2. Ocena CDC

1. Przygotowanie materiałów biologicznych i odczynników
   1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych i posaz komórki Daudiego i Daudi GFP⁺ zgodnie z powyższym opisem (kroki 1.1.1 - 1.1.2).
      UWAGA: Dodatkowo test CDC wymaga RPMI bez surowicy.
   2. Rozcieńczyć normalny dopełniacz ludzkiej surowicy (NHSC) w stosunku 1:2 za pomocą RPMI bez surowicy. Przygotuj 2,5 ml.
   3. Przygotować 1 ml inaktywowanego termicznie (30 min/56 °C) NHSC rozcieńczonego w stosunku 1:2 z RPMI.
   4. Przygotować zestawy roztworów testowych dla referencyjnych i biopodobnych przeciwciał monoklonalnych w RPMI bez surowicy. Wykonać dziesięć rozcieńczeń (po 200 μl każde) od 1 do 0,025 μg/ml.
2. Test CDC
   1. Zebrać komórki Daudiego i Daudiego GFP⁺ z kultur i określić ilościowo żywotność komórek (patrz kroki 1.2.1 - 1.2.3).
   2. Przygotuj zawiesinę komórkową z 4 x 10⁵ komórek/ml w RPMI bez surowicy.
   3. Dodać 50 μl zawiesiny komórkowej do 50 μl każdego referencyjnego lub biopodobnego stężenia testowego mAb w 96-dołkowych mikropłytkach ze stożkowym dnem (V). Uwzględnij powtórzenia dla każdego warunku eksperymentalnego.
   4. Przygotuj dodatkowe studzienki do kontroli ujemnej (tj. bez mAb), kontroli śmierci podstawowej (tj. inaktywowanej termicznie NHSC w obecności mAb) i barwienia kontroli pozytywnej (tj. komórki wystawione na działanie 50 μl 70% EtOH).
   5. Inkubować komórki przez 20 - 30 minut w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej 5% CO_{2 .}
   6. Dodać 50 μl NHSC (rozcieńczonego 1:2) do każdej studzienki i inkubować opsonizowane komórki przez 2,5 godziny w temperaturze 37 °C w 5% nawilżonej atmosferze_CO2. Użyj inaktywowanego termicznie NHSC w studzienkach kontroli śmierci podstawowej.
   7. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 10 °C. Odrzucić supernatant.
   8. Przemyć komórki, dodając 150 μl PBS i odwirowując zawiesinę komórek przez 5 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 10 °C. Odrzucić sklarowany sklaratant.
   9. Wybarwić próbki 7-aminoaktynomycyną (7-AAD), zgodnie z wcześniejszym opisem^7,8.
   10. Przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym tego samego dnia.
3. Akwizycja danych
   1. Otwórz dwa wykresy kropkowe na arkuszu roboczym oprogramowania operacyjnego cytometru przepływowego. Ustaw te wykresy jak w krokach 1.3.1 - 1.3.3 (Rysunek 2A-B). Utwórz trzeci wykres, który jest wykresem kropkowym dla GFP i 7-AAD w populacji R2.
   2. Zdefiniuj odpowiednie limity FI za pomocą komórek Daudiego, komórek Daudi GFP⁺ i pozytywnej kontroli śmierci (Figura 2C).
   3. Dla każdej próbki zmierz procent komórek docelowych 7-AAD⁺. Zdobądź co najmniej 5 000 wydarzeń z R2.
   4. Oblicz specyficzną cytotoksyczność indukowaną mAb, odejmując procent 7-AAD⁺ w podstawowej kontroli śmierci od procentu znalezionego w próbkach o różnych stężeniach mAb (Figura 2D).

3. Analiza biopodobieństwa

1. Wprowadź wartości stężenia i odpowiedzi do oprogramowania do tworzenia wykresów.
2. Generuj wykresy i obliczaj regresje nieliniowe, biorąc pod uwagę następujące kwestie: i) użyj transformacji logarytmicznej stężenia mAb jako "X"; ii) zastosować model matematyczny o zmiennym nachyleniu (Y = minimalna odpowiedź + (maksymalna odpowiedź - minimalna odpowiedź)/ 1+10^((LogEC_50-X)*Nachylenie wzgórza)); oraz iii) ogranicz dolne wartości do zera, ponieważ odpowiedź podstawowa została odjęta.
   UWAGA: Oczekiwane są krzywe o symetrycznym kształcie sigmoidalnym.
3. Porównaj oba pasowania nieliniowe z pasowaniem globalnym za pomocą testu F (wiele programów do tworzenia wykresów zawiera tę funkcję).
   UWAGA: Takie testy ustalają jako hipotezę zerową, że maksymalna odpowiedź, logEC₅₀ i nachylenie wzgórza są takie same dla dwóch zestawów danych, co odpowiada pytaniu biologicznemu, które ma być rozwiązane.

Wyniki

Z zastosowaniem opisanych powyżej protokołów porównano wiązanie do celu oraz indukcję CDC referencyjnego rytuksymabu równolegle z tymi parametrami biosymilarnego rytuksymabu produkowanego i dostępnego komercyjnie w Azji.

W komórkach Daudi oba przeciwciała monoklonalne (mAbs) wiązały CD20 w sposób zależny od stężenia (Rysunek 1D). Regresje nieliniowe danych dotyczących wiązania wykazały r² odpowiednio ...

Dyskusja

Wygaśnięcie patentu na terapeutyczny przeciwciała monoklonalne sprzyja rozwojowi leków biopodobnych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na proste metody, które mogą zidentyfikować różnice w klinicznie istotnych działaniach tych produktów. Hodowane komórki CD20⁺ wykorzystano do oceny dwóch kluczowych cech funkcjonalnych rytuksymabu: wiązania celu i indukcji CDC. Pierwsza aktywność wymaga rozpoznania CD20 przez region Fab mAb, podczas gdy druga zależy głównie od interakcji regionu Fc z jego dopełniaczem

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RPMI-1640 pożywka	ATCC	30-2001	Modyfikuj hodowlę w zależności od linii komórkowej
Roztwór błękitu trypanowego	Sigma	T8154	0,4%, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowej
Komórki chłoniaka Daudiego Burkitta	ATCC	CCL-213	Możesz modyfikować linię komórkową w zależności od interesującego przeciwciała
Surowica bydlęca płodu (FBS)	GIBCO	16000-044	Możesz modyfikować źródło surowicy w zależności od wymagań linii komórkowej
Normalny ludzki dopełniacz surowicy	Quidel	A113	Dlatego nadaje się do stosowania w eksperymentach biokompatybilności, w tym w opracowywaniu leków, testowaniu biomateriałów i innych zastosowaniach
7AA-D	BDPharmigen	559925	Możesz użyć szerokiej gamy opcji kolorystycznych, kompatybilnych z większością konfiguracji instrumentów, aby przeanalizować żywotność.
PECy5 Mysz Anty-ludzka IgG	BDPharmigen	551497	Zmień fluorochrom w zależności od filtra i lasera cytometru przepływowego
Kontrola izotypu ludzkiej IgG	ThermoFisher Scientific	07-7102	Zmiana w zależności od mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Bufor utrwalający do cytometrii przepływowej (1 - 4% formaldehydu lub paraformaldehydu)
PBS pH 7,4 10x (Bufor fosforanowy sól fizjologiczna)	GIBCO	70011-044	Bufor fosforanowy bez Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4] i wolne od endotoksyn.
Płytki do hodowli komórkowych 96-dołkowe, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm okrągłe probówki lub 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania V- lub U-bottom
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Produkt referencyjny
Rytuksymab	indyjski	—	Produkt biopodobny
Stożkowe probówki wirówkowe 15 lub 50 ml	Corning	430290 lub 430052	—
Końcówki do pipet	Eppendorf	—	Konieczne są konfiguracje wielu woluminów
Pipety	Eppendorf	—	Niezbędne są pipety o regulowanej objętości
Wirówka 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Wirówka z chłodzeniem o zmiennej prędkości obrotowej (4 do 25 stopni; C) o prędkościach od 10 do 30 130 i razy; g
Cytometr przepływowy	BD Dickinson	—	BD FACSAria III lub inny cytometr przepływowy
Mikroskop optyczny i świetlny Olympus	Olympus	—	Ilościowe określenie i ocena wzrostu komórek
Inkubator	SANYO	—	Inkubator do kontroli temperatury i CO2 do hodowli komórek
Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego	CHC BIOLUS	—	Szafa bezpieczeństwa biologicznego, która służy do ochrony badacza, produktu i środowiska.