Ten protokół opisuje porównanie in vitro dwóch kluczowych cech funkcjonalnych rytuksymabu: wiązania celu i indukcji cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC). Metody te wykorzystano do bezpośredniego porównania referencyjnego rytuksymabu z rytuksymabem biopodobnym. Testy te mogą być stosowane podczas opracowywania leków biopodobnych lub jako kontrola jakości w ich produkcji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vitro Metody porównywania wiązania celu i indukcji CDC między przeciwciałami terapeutycznymi: zastosowania w analizie biopodobieństwa
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Terapeutyczne przeciwciała monoklonalne (mAb) są istotne w leczeniu różnych patologii, w tym nowotworów. Rozwój biopodobnych przeciwciał monoklonalnych przez firmy farmaceutyczne jest szansą rynkową, ale jest to również strategia mająca na celu zwiększenie dostępności leków i obniżenie kosztów związanych z terapią. Szczegółowo opisane tutaj protokoły opisują ocenę wiązania celu i indukcji CDC przez rytuksymab w komórkach Daudiego. Te dwie funkcje wymagają różnych regionów strukturalnych przeciwciała i są istotne dla efektu klinicznego wywołanego przez rytuksymab. Protokoły umożliwiają bezpośrednie porównanie referencyjnego rytuksymabu z dostępnym do obrotu biopodobnym rytuksymabem. Oceniane produkty wykazały różnice zarówno w wiązaniu celu, jak i indukcji CDC, co sugeruje, że istnieją podstawowe różnice fizykochemiczne i podkreśla potrzebę analizy wpływu tych różnic w warunkach klinicznych. Przedstawione tu metody stanowią proste i niedrogie modele in vitro do oceny aktywności leków biopodobnych do rytuksymabu. Tym samym mogą być przydatne podczas opracowywania leków biopodobnych, a także do kontroli jakości w produkcji leków biopodobnych. Ponadto przedstawione metody można ekstrapolować na inne terapeutyczne przeciwciała monoklonalne.
Wprowadzenie
Przeciwciała terapeutyczne to rekombinowane przeciwciała monoklonalne (mAb) opracowane do leczenia różnych patologii, w tym nowotworów, chorób autoimmunologicznych i przewlekłych, zaburzeń neurologicznych i innych1. Obecnie FDA zatwierdziła ponad 40 terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych, a oczekuje się, że kolejne trafią na rynek w nadchodzących latach.
Rytuksymab jest chimerycznym przeciwciałem monoklonalnym IgG1 o wysokim powinowactwie, zatwierdzonym do leczenia chłoniaka nieziarniczego CD20+ B-komórkowego (NHL), pęcherzyka CD20+ NHL, przewlekłej białaczki limfocytowej i reumatoidalnego z....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Ocena wiązania celu za pomocą cytometrii przepływowej
- Przygotowanie materiałów biologicznych i odczynników
- Przygotuj 500 ml pożywki hodowlanej RPMI uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (H-IFBS).
- Hodowla komórek chłoniaka Daudiego Burkitta (Daudi) i komórek Daudi GFP+ przy użyciu RPMI i kolb hodowlanych o średnicy 75 cm2. Utrzymuj kultury w temperaturze 37 °C w atmosferze nawilżonej 5% CO2 , aż osiągną 6 - 9 x 105 komórek/ml.
- Sporządzić 50 ml buforu barwiącego, rozcieńczając 1/100 H-IFBS w PBS; bufor ten jest stabilny w temperaturze....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zastosowano opisane powyżej protokoły, aby porównać wiązanie z celem oraz indukcję CDC referencyjnego rytuksymabu z tymi parametrami dla biosymilara rytuksymabu produkowanego i dostępnego komercyjnie w Azji.
W komórkach Daudi oba przeciwciała monoklonalne (mAbs) wiązały CD20 w sposób zależny od stężenia (Rysunek 1D). Regresje nieliniowe danych wiązania wykazały wartość r2 wynoszącą odpowiednio 0,978 d.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wygaśnięcie patentu na terapeutyczny przeciwciała monoklonalne sprzyja rozwojowi leków biopodobnych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na proste metody, które mogą zidentyfikować różnice w klinicznie istotnych działaniach tych produktów. Hodowane komórki CD20+ wykorzystano do oceny dwóch kluczowych cech funkcjonalnych rytuksymabu: wiązania celu i indukcji CDC. Pierwsza aktywność wymaga rozpoznania CD20 przez region Fab mAb, podczas gdy druga zależy głównie od interakcji regionu Fc z jego dopełniaczem
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
N. Salinas-Jazmín, E. González-González i S. M. Pérez-Tapia są pracownikami firmy UDIBI, która przeprowadza badania biopodobieństwa dla kilku firm farmaceutycznych.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 pożywka | ATCC | 30-2001 | Modyfikuj hodowlę w zależności od linii komórkowej |
| Roztwór błękitu trypanowego | Sigma | T8154 | 0,4%, płynny, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowej |
| Komórki chłoniaka Daudiego Burkitta | ATCC | CCL-213 | Możesz modyfikować linię komórkową w zależności od interesującego przeciwciała |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | GIBCO | 16000-044 | Możesz modyfikować źródło surowicy w zależności od wymagań linii komórkowej |
| Normalny ludzki dopełniacz surowicy | Quidel | A113 | Dlatego nadaje się do stosowania w eksperymentach biokompatybilności, w tym w opracowywaniu leków, testowaniu biomateriałów i innych zastosowaniach |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | Możesz użyć szerokiej gamy opcji kolorystycznych, kompatybilnych z większością konfiguracji instrumentów, aby przeanalizować żywotność. |
| PECy5 Mysz Anty-ludzka IgG | BDPharmigen | 551497 | Zmień fluorochrom w zależności od filtra i lasera cytometru przepływowego |
| Kontrola izotypu ludzkiej IgG | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Zmiana w zależności od mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Bufor utrwalający do cytometrii przepływowej (1 - 4% formaldehydu lub paraformaldehydu) |
| PBS pH 7,4 10x (Bufor fosforanowy sól fizjologiczna) | GIBCO | 70011-044 | Bufor fosforanowy bez Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4] i wolne od endotoksyn. |
| Płytki do hodowli komórkowych 96-dołkowe, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm okrągłe probówki lub 96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania V- lub U-bottom |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Produkt referencyjny |
| Rytuksymab | indyjski | — | Produkt biopodobny |
| Stożkowe probówki wirówkowe 15 lub 50 ml | Corning | 430290 lub 430052 | — |
| Końcówki do pipet | Eppendorf | — | Konieczne są konfiguracje wielu woluminów |
| Pipety | Eppendorf | — | Niezbędne są pipety o regulowanej objętości |
| Wirówka 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Wirówka z chłodzeniem o zmiennej prędkości obrotowej (4 do 25 stopni; C) o prędkościach od 10 do 30 130 i razy; g |
| Cytometr przepływowy | BD Dickinson | — | BD FACSAria III lub inny cytometr przepływowy |
| Mikroskop optyczny i świetlny Olympus | Olympus | — | Ilościowe określenie i ocena wzrostu komórek |
| Inkubator | SANYO | — | Inkubator do kontroli temperatury i CO2 do hodowli komórek |
| Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego | CHC BIOLUS | — | Szafa bezpieczeństwa biologicznego, która służy do ochrony badacza, produktu i środowiska. |
Bibliografia
- Schimizzi, G. F. Biosimilars from a practicing rheumatologist perspective: An overview. Autoimmun Rev. 15 (9), 911-916 (2016).
- Cuello, H. A., et al. Comparability of Antibody-Mediated Cell Killing Activity Between a P....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
