Method Article

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

DOI:

10.3791/55544

⸱

March 27th, 2017

 ,  , 
1Division of Cancer Biology and Genetics, Queen's University Cancer Research Institute, 2Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednowarstwowa hodowla komórkowa nie modeluje odpowiednio zachowania tkanek in vivo, co wiąże się ze złożonymi interakcjami komórka-komórka i komórka-macierz. Techniki trójwymiarowych (3D) hodowli komórkowych są najnowszą innowacją opracowaną w celu wyeliminowania niedociągnięć w przylegającej hodowli komórek. Chociaż opracowano kilka technik wytwarzania analogów tkanek in vitro, metody te są często złożone, kosztowne do ustalenia, wymagają specjalistycznego sprzętu i są na ogół ograniczone przez kompatybilność tylko z niektórymi typami komórek. Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół agregacji komórek w wielokomórkowe sferoidy 3D o stałej wielkości, który jest zgodny ze wzrostem różnych nowotworów i normalnych linii komórkowych. Wykorzystujemy różne stężenia surowicy i metylocelulozy (MC), aby promować niezależne od zakotwiczenia wytwarzanie sferoidów i zapobiegać tworzeniu się monowarstw komórkowych w wysoce powtarzalny sposób. Optymalne warunki dla poszczególnych linii komórkowych można osiągnąć poprzez dostosowanie stężeń MC lub surowicy w pożywce do tworzenia sferoidów. Wygenerowane sferoidy 3D mogą być zbierane do wykorzystania w szerokim zakresie zastosowań, w tym w badaniach nad sygnalizacją komórkową lub ekspresją genów, badaniami przesiewowymi potencjalnych leków lub w badaniu procesów komórkowych, takich jak inwazja i migracja komórek nowotworowych. Protokół jest również łatwo przystosowany do generowania sferoid klonalnych z pojedynczych komórek i może być dostosowany do oceny niezależnego od zakotwiczenia wzrostu i odporności na anoikis. Ogólnie rzecz biorąc, nasz protokół zapewnia łatwo modyfikowalną metodę generowania i wykorzystywania sferoid komórek 3D w celu podsumowania mikrośrodowiska 3D tkanek i modelowania wzrostu in vivo komórek prawidłowych i nowotworowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologicznie istotna ocena zachowania komórek nowotworowych jest wyzwaniem przy użyciu tradycyjnych dwuwymiarowych (2D) metodologii hodowli komórkowych, częściowo dlatego, że nie odzwierciedlają one odpowiednio mikrośrodowiska komórkowego występującego in vivo. Alternatywne podejścia włączające składniki macierzy zewnątrzkomórkowej do hodowli (np. testy w komorze Boydena) są bardziej fizjologicznie reprezentatywne dla środowiska tkankowego in vivo. Mogą one jednak ograniczać się do oceny zachowania poszczególnych komórek i nie podsumowują złożonych kombinacji in vivo interakcji komórka-macierz i komórka-komórka, które przyczyniają się do wzrostu tkanki lub guza1,2,3.

Użycie sferoid wielokomórkowych to nowe podejście, które dokładniej odtwarza zwartą architekturę wzrostu komórek in vivo1,4. Sferoidy mogą być używane do badania interakcji komórka-macierz normalnych komórek, ale mogą również działać jako analogi guza do modelowania cech progresji guza, takich jak wzrost przerzutowy lub oporność na leki4.

Sferoidy mogą powstawać w wyniku proliferacji pojedynczych komórek osadzonych w matrycy5, lub szybciej, poprzez promowanie agregacji wielu komórek w celu utworzenia pojedynczego klastra komórkowego (np. wisząca kropla, metody wirowania)6,7. Istniejące techniki agregacji komórek mogą wymagać kosztownych materiałów lub specjalistycznego sprzętu. Ponadto sferoidy te mają szeroki zakres rozmiarów i morfologii i mogą być trudne do wyprodukowania w dużych ilościach, co utrudnia porównania między warunkami wzrostu lub zabiegami. Wreszcie, sferoidy generowane tymi metodami mogą być trudne do wyizolowania z białkowej macierzy zewnątrzkomórkowej, w której są osadzone, do wykorzystania w innych zastosowaniach.

Tutaj opisujemy solidną i łatwo modyfikowalną metodologię agregacji komórek do szybkiego tworzenia sferoid komórkowych o stałej wielkości przy użyciu dostępnych na rynku płytek odstraszających komórki w kształcie litery U i obojętnej matrycy promującej adhezję, metylocelulozy. Po uformowaniu te wielokomórkowe sferoidy są łatwo izolowane do użytku w szerokim zakresie zastosowań. Protokół można również łatwo dostosować do generowania sferoid poprzez proliferację komórek, które można wykorzystać do oceny innych procesów komórkowych. Tutaj pokazujemy testy inwazji komórek, oznaczane ilościowo za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, oraz test anoikis, jako przykładowe zastosowania tych dwóch różnych protokołów tworzenia sferoidów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne są wymienione na Liście Materiałów.

1. Produkcja sferoidów przez agregację komórek

  1. Roztwór metylocelulozy: Przygotować 100 ml 100 mg/ml metylocelulozy.
    1. Podgrzać 50 ml ultraczystegoH2Odo temperatury 80 °C. Dodać 10 g sproszkowanej metylocelulozy i mieszać, aż cząstki zostaną równomiernie rozproszone.
    2. Doprowadzić do końcowej objętości zimnym, ultraczystymH2Oi mieszać w temperaturze 4 °C, aż roztwór stanie się klarowny, słomkowy i nie będzie zawierał widocznych ciał stałych.
    3. Przepuść przez filtr 0,45 μm, aby usunąć nierozpuszczone ciała stałe. Przygotowany roztwór można podamelować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 12 miesięcy.
      UWAGA: Metyloceluloza służy jako niecytotoksyczny, obojętny środek zawieszający w celu zwiększenia adhezji komórka-komórka i zniechęcenia do tworzenia przylegającej monowarstwy komórek. Metyloceluloza jest rozpuszczalna w wodzie i może zostać wypłukana po wytworzeniu sferoidów.
  2. Formacja sferoidowa pożywka
    UWAGA: Bezpośrednio przed użyciem przygotować pożywkę do tworzenia sferoidów. Nie przechowywać.
    1. Rozcieńczyć roztwór metylocelulozy do 1-5 mg/ml w odpowiedniej pożywce hodowlanej.
    2. Przepuść przez filtr 0,22 μm, aby wysterylizować i usunąć nierozpuszczone ciała stałe.
  3. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) firmy Dulbecco
    1. Rozcieńczyć do 1x i przepuścić przez filtr 0,45 μm przed użyciem. Przygotowany roztwór można przechowywać w nieskończoność w temperaturze pokojowej.
  4. Produkcja sferoidów komórkowych (ryc. 1)
    UWAGA: Przygotuj wszystkie odczynniki z wyprzedzeniem. Ważne jest, aby unikać zanieczyszczenia roztworów kurzem, włóknami lub innymi nierozpuszczalnymi cząstkami. Obecność tych zanieczyszczeń niekorzystnie wpłynie na tworzenie się sferoidów. Pożywkę hodowlaną i inne roztwory należy przepuścić przez filtr 0,45 μm, aby usunąć te cząstki, jeśli to możliwe. Unikaj używania pipet z filtrem bawełnianym podczas przenoszenia roztworów, ponieważ mogą one wprowadzić dodatkowe włókna.
    1. Monowarstwy komórek hodowlanych do 70% konfluencji w odpowiedniej pożywce hodowlanej uzupełnionej 10% surowicą. Odessać pożywkę hodowlaną i spłukać 1x PBS, aby usunąć zanieczyszczenia. Dodać 3 ml buforu dysocjacyjnego trypsyna-EDTA (0,05% trypsyny) do 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowej i inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Sprawdź komórki pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu, aby potwierdzić oderwanie. Zneutralizować bufor dysocjacyjny za pomocą 7 ml pożywki hodowlanej uzupełnionej surowicą.
    3. Odwirować zawiesinę komórek o masie 500 x g przez 10 minut, aby delikatnie osadzać komórki.
    4. Usunąć supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki sferoidalnej za pomocą pipety p1000 z końcówką filtrującą.
      UWAGA: Zawiesina komórkowa powinna być wolna od grudek.
      1. Aby rozdrobnić osad z komórek, należy docisnąć końcówkę pipety do dna probówki pod niewielkim kątem, jednocześnie pipetując w celu ścinania osadu komórkowego. Unikaj rozcierania więcej niż 3-5 razy, ponieważ może to uszkodzić komórki. Pipetę należy pipetować powoli i nie wyrzucać całej zawartości końcówki pipety, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    5. Policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńczonej zawiesiny komórek do 1 x 104 komórek/ml.
      UWAGA: Liczba komórek może być zoptymalizowana w celu generowania sferoid o różnych rozmiarach. Barwienie uszkodzonych komórek błękitem trypanowym może być stosowane w celu potwierdzenia żywotności ponownie zawieszonych komórek.
    6. Przenieś zawiesinę komórek do sterylnego, bezpyłowego wielokanałowego zbiornika na pipety i za pomocą końcówek filtrujących dozuj 100 μl do każdej studzienki 96-dołkowej płytki odstraszającej komórki w kształcie litery U.
      1. Wypłucz zbiornik przefiltrowanym ultraczystymH2O, aby usunąć kurz i włókna.
      2. Zawiesinę komórkową należy okresowo mieszać podczas wysiewu, aby zapobiec osiadaniu komórek na dnie zbiornika. Aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, podczas mieszania i dozowania należy stosować technikę odwróconego pipetowania.
    7. Przenieść płytki do inkubatora do hodowli tkankowych (37 °C i 5% CO2 ) i codziennie sprawdzać pod kątem tworzenia się sferoidów. Komórki powinny osiąść na dnie każdej studzienki w ciągu 6 godzin i na ogół agregować się w sferoidę w ciągu 24-48 godzin (ryc. 2).
    8. Aby potwierdzić pomyślne tworzenie sferoidy, użyj końcówki p10 i delikatnie pipetuj pożywkę na sferoidę, obserwując pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu. Prawidłowo uformowane sferoidy odczepią się od płyty i będą się toczyć, potwierdzając swoją strukturę 3D.
      UWAGA: Stężenia metylocelulozy i w surowicy należy oznaczyć przez miareczkowanie dla każdej linii komórkowej, aby uzyskać powstanie pojedynczego sferoidu na studzienkę. Zoptymalizowane w ten sposób warunki dla wybranych linii komórkowych przedstawiono w tabeli 1, a przykłady utworzonych sferoid przedstawiono na rysunku 2B. Sferoidy mogą być uprawiane dłużej niż wskazano, ale w miarę jak stają się większe, stają się coraz trudniejsze w obsłudze bez fragmentacji. Jeśli komórki tworzą monowarstwę, sferoidy satelitarne lub nie osiądą na dnie studni, stężenie metylocelulozy i surowicy może wymagać dalszej regulacji w celu optymalnego tworzenia sferoidów (ryc. 3B). Nie używaj sferoid zawierających zanieczyszczenia, takie jak włókna lub kurz (Rysunek 3A). Wstępnie uformowane sferoidy można traktować związkami będącymi przedmiotem zainteresowania, takimi jak czynniki wzrostu, barwienie żywych komórek lub inhibitory do analizy.

2. Test inwazji sferoidów (Rysunek 4)

  1. Zneutralizowany kolagen
    1. Schłodzić wszystkie płyny do 4 °C i trzymać lód podczas pracy z kolagenem, aby zapobiec niepożądanej polimeryzacji.
    2. Przygotować świeże roztwory 0,1 M i 0,01 M NaOH oraz świeże 0,1 M HCl w ultraczystymH2O. Wszystkie roztwory przepuścić przez filtry 0,22 μm.
    3. Wymieszaj kolagen bydlęcy typu 1 (3,1 mg / ml bulionu), 0,01 M NaOH i 10x PBS (stosunek objętościowy 8:1:1) i dostosuj do pH 7,4 za pomocą zimnego 0,1 M NaOH i HCl. Końcowe stężenie kolagenu wynosi 2,5 mg/ml.
    4. Przygotuj wystarczającą ilość zneutralizowanego kolagenu, aby wypełnić naczynie obrazowe na głębokość 2-3 mm. Wymagane jest co najmniej 100 μl dla każdej studzienki 8-dołkowej komory do hodowli tkankowej wymienionej w wykazie materiałów.
  2. Osadzanie sferoid w kolagenie (ryc. 4)
    1. Pokryj dno każdego dołka 8-dołkowej komory do hodowli tkankowej co najmniej 50 μl zobojętnionego kolagenu.
      1. Użyj techniki odwróconego pipetowania, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków w kolagenie. Użyj końcówki pipety, aby równomiernie rozprowadzić kolagen na powierzchni studzienki.
        UWAGA: Ta kolagenowa warstwa bazowa utrzymuje sferoidy w zawiesinie i ma zwykle grubość 1-2 mm. Warstwa podstawowa minimalizuje tworzenie się łąkotki na górnej warstwie kolagenu. Jeśli warstwa podstawowa jest zbyt cienka, sferoidy mogą stykać się z dnem szkiełka komory i tworzyć monowarstwę komórkową.
    2. Umieścić szkiełko komorowe i naczynie do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm wypełnione ultraczystymH2O, w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do polimeryzacji kolagenu, zwykle 1 godzina. Przechowuj pozostały zneutralizowany kolagen na lodzie.
      UWAGA: Naczynie wypełnione wodą o średnicy 35 mm zapewni wilgotność i zapobiegnie wysuszeniu. Szkiełko komory powinno pozostać w tej komorze wilgotności przez cały czas trwania testu. Warstwę bazową kolagenu można pozostawić do polimeryzacji na noc. Dłuższe inkubacje zazwyczaj skutkują bardziej sztywnym żelem.
    3. Używając końcówki filtra p1,000, zbierz wstępnie uformowane sferoidy (krok 1.4.7) z 96-dołkowej płytki odstraszającej dolne komórki w kształcie litery U w probówkach zatrzaskowych o pojemności 1,5 ml. Pipetować powoli i unikać wielokrotnego lub energicznego pipetowania, aby zminimalizować ścinanie sferoid przez płyn. Wiele sferoid można zebrać w jednej probówce w celu przeniesienia do jednego dołka 8-dołkowego szkiełka do hodowli tkankowej.
    4. Odwirować zebrane sferoidy w mikrowirówce stołowej o sile 2 000 x g przez 2-5 s i usunąć supernatant za pomocą pipety p200. Unikaj wirowania dłużej niż jest to wymagane, ponieważ może to spowodować rozpadnięcie się sferoid lub zlepianie się ze sobą.
      UWAGA: Po odpipetowaniu większości supernatantu, probówkę można ostrożnie odwrócić na czystym ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. Nie dopuścić do wyschnięcia sferoid.
    5. Używając końcówki p200 o szerokim otworze, delikatnie ponownie zawieś sferoidy w 50 μl zneutralizowanego kolagenu. Zrób to dla każdej probówki zebranych sferoid, zanim jakiekolwiek sferoidy zostaną przeniesione do szkiełka komory. Sferoidy, które zostały ponownie zawieszone w zneutralizowanym kolagenie, należy przechowywać na lodzie, aż będą gotowe do przeniesienia do szkiełek komorowych.
    6. Wyjmij szkiełko komory z inkubatora i ostrożnie odpipetuj mieszaninę sferoidów i kolagenu na wierzchu warstwy bazowej kolagenu. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do polimeryzacji kolagenu.
      1. Nie dozuj całej zawartości pipety, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Pipetowanie kroplami zmniejsza ryzyko naruszenia warstwy podstawowej kolagenu.
    7. Powoli dodawać co najmniej 100 μl podgrzanej pożywki hodowlanej zawierającej pożądane chemoatraktanty, inhibitory lub inne zabiegi do każdej studzienki szkiełka komory. Warstwa kolagenu zawierająca sferoidy może się rozerwać, jeśli płyn zostanie na nią dociśnięty zbyt energicznie. Pożywkę hodowlaną można powoli dozować po ścianie studzienki, aby uniknąć naruszenia kolagenu.
    8. Szkiełko w komorze inkubacyjnej w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby umożliwić inwazję komórek. Inwazję komórek do otaczającego kolagenu można zaobserwować za pomocą obrazowania w jasnym polu lub fluorescencji i określić ilościowo różnymi metodami przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej, konfokalnej lub świetlnej.

3. Kwantyfikacja inwazji: Mikroskopia Jasnego Pola

  1. W określonych odstępach czasu zobrazuj sferoidy zatopione w kolagenie w 10-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu jasnego pola (krok 2.2.8).
    UWAGA: W przypadku długoterminowych eksperymentów z żywymi komórkami można użyć podgrzewanego stolika mikroskopowego i komory regulowanej CO2 do utrzymania sferoid w temperaturze 37 °C i 5% CO2 podczas obrazowania.
  2. Określ ilościowo inwazyjność za pomocą oprogramowania, takiego jak ImageJ, aby zmierzyć liczbę komórek atakujących otaczający kolagen i średnią odległość zaatakowaną w każdym punkcie czasowym.

4. Kwantyfikacja inwazji: Mikroskopia fluorescencyjna z barwieniem żywych komórek

  1. Postępując zgodnie z krokiem 2.2.8, uzupełnij pożywkę w szkiełkach komory barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak DAPI, Calcein AM lub inny związek śledzący komórki odpowiedni dla linii komórkowej, zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Do ilościowego określenia inwazyjności jednorodne barwienie w całej sferoidzie nie jest konieczne. W przypadku zastosowań wymagających głębszej penetracji bejcy może być konieczna dłuższa inkubacja (>3 h).
  2. Usuń plamę i zastąp ją ciepłym 500 μl 1x PBS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby usunąć nadmiar plamy. Powtórz co najmniej dwa razy.
  3. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego uzyskaj przekroje optyczne przez atakujące sferoidy.
    UWAGA: Długotrwała ekspozycja na światło lasera powinna być zminimalizowana podczas powtarzalnego obrazowania, aby ograniczyć fototoksyczność i fotowybielanie.
  4. Użyj oprogramowania, takiego jak ImageJ, aby wygenerować projekcję Z, którą można wykorzystać do ilościowego określenia całkowitej powierzchni sferoidy, liczby atakujących komórek i odległości zaatakowanych w macierzy kolagenowej.
  5. Na przykład, aby określić ilościowo inwazję, dostosuj próg obrazu, aby wykluczyć tło, podświetlając tylko komórki sferoidalne i atakujące, a następnie zmierz ich obszar. Obszar pierwotnej sferoidy można odjąć od tej sumy, aby określić ilościowo inwazyjność.

5. Kwantyfikacja inwazji: immunofluorescencja

UWAGA: Wszystkie roztwory i powinny być przepuszczone przez filtr 0,45 μm przed użyciem w celu usunięcia zanieczyszczeń, które mogą negatywnie wpłynąć na barwienie.

  1. Przygotować bufor do płukania PBS+. Przygotować 1x PBS i dodać CaCl2 i MgCl2 do końcowego stężenia 0,1 mM. Nie należy autoklawować buforu po dodaniu CaCl2 i MgCl2. Roztwór może być sterylizowany przez filtr i przechowywany w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować neutralny bufor utrwalający formalinę (NBF). Dodać 5 kropli 1 M NaOH do 0,6 g paraformaldehydu. Doprowadzić do 20 ml za pomocą PBS+ i inkubować w temperaturze 60 °C aż do rozpuszczenia paraformaldehydu (około 1 godzina). Schłodzić do temperatury pokojowej i dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 M HCl.
    UWAGA: Bufor utrwalający NBF należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
  3. Przygotować bufor blokujący albuminę surowicy bydlęcej (BSA). Rozpuścić BSA w PBS+ w stężeniu 3% w/v. Roztwór może być sterylizowany filtrem i przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka dni, ale najlepiej przygotować go na świeżo. Nie podgrzewać.
  4. Przygotować bufor permeabilizacji. Rozcieńczyć Triton X-100 do 0,2% v/v w PBS+,
    UWAGA: Bufor permeabilizacyjny należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
  5. Opcjonalnie przygotuj podłoże montażowe MOWIOL. Połącz 2,4 g MOWIOL, 6 g glicerolu i 6 ml ultraczystegoH2O. Mieszaj przez 3 godziny w rotatorze w temperaturze pokojowej. Dodać 12 ml 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5). Inkubować z mieszaniem w temperaturze 50 °C przez 10 minut.
    1. Wirować przy 5 000 x g przez 15 minut w celu osadzenia nierozpuszczalnego materiału. Dodaj środek wybielający, taki jak 2,5% DABCO. Przechowywać w 500 μl porcji w temperaturze -20 °C.
  6. Barwienie immunofluorescencyjne sferoid (ryc. 5)
    UWAGA: Za pomocą pipety powoli dodawać lub usuwać płyny ze szkiełka komory. Unikaj stosowania aspiratora, ponieważ może to zakłócić warstwę kolagenu.
    1. Przygotować sferoidy i zatopić w szkiełkach komorowych wypełnionych kolagenem, jak opisano w punktach od 1 do 2.
      UWAGA: Autofluorescencję kolagenu można zminimalizować, stosując cienkie warstwy lub małe objętości kolagenu.
    2. Usuń jak najwięcej pożywki hodowlanej z każdego szkiełka komory.
    3. Krótko spłukać warstwę kolagenu buforem myjącym PBS+ o pojemności 500 μl, aby usunąć resztki podłoża.
    4. Dodać 500 μl świeżego buforu płuczącego PBS+ do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu przemycia sferoid. Powtórz dwa razy.
    5. Zastąp bufor płuczący PBS+ buforem utrwalającym NBF o pojemności 500 μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 - 25 minut.
    6. Usunąć bufor utrwalający NBF i przepłukać 500 μl PBS+ buforem do płukania. Myć przez 5 minut świeżym buforem do płukania PBS+ co najmniej 3 razy.
      UWAGA: Stałe sferoidy można przechowywać w temperaturze 4 °C w świeżym buforze do płukania PBS+ przez kilka dni. Do buforu płuczącego można dodać 0,01% azydku sodu w celu zahamowania rozwoju drobnoustrojów podczas przechowywania.
    7. Zastąp bufor płuczący PBS+ buforem przepuszczalnym o pojemności 500 μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-15 minut.
    8. Zastąp bufor permeabilizacyjny buforem blokującym BSA o objętości 500 μl i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
      1. Opcjonalnie usuń bufor blokujący BSA. Za pomocą skalpela lub nożyczek wyciąć sferoidy i otaczającą je powierzchnię 3 mm x 3 mm od warstwy kolagenu. Używając końcówki p1000 o szerokim otworze, usuń wycięty blok kolagenu, delikatnie spłukując go świeżym buforem blokującym BSA. Przenieś blok kolagenowy do probówki o pojemności 1,5 ml.
      2. Odwirować przy 2 000 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant. Rurkę można ostrożnie odwrócić na czystym ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu.
    9. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe do sferoid i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Dodać wystarczającą objętość przeciwciała pierwszorzędowego, tak aby cała warstwa kolagenu była równomiernie zanurzona. Powyższe opcjonalne kroki (5.6.8.1-5.6.8.2) zazwyczaj pozwalają na użycie mniejszych objętości przeciwciał.
    10. Zanurzyć w komorze zanurzeniowej wsunąć do pojemnika z co najmniej 10 ml buforu do płukania PBS+ na 10 minut w celu umycia. Powtórz co najmniej dwa razy.
      1. Opcjonalnie, jeśli sferoidy zostały wcześniej wycięte z warstwy kolagenu (krok 5.6.8.1), dodaj co najmniej 1 ml buforu do płukania PBS+ do probówki o pojemności 1,5 ml i delikatnie wymieszaj. Pozostaw do namoczenia na minimum 10 minut.
      2. Usuń jak najwięcej buforu płuczącego PBS+ i powtórz mycie buforem płuczącym PBS+ co najmniej dwa razy. Wirować przy 2,000 x g przez kilka minut, aby uzyskać blok kolagenowy.
        UWAGA: Oczyść zewnętrzne powierzchnie zjeżdżalni komory, przecierając ją 70% etanolem przed zanurzeniem w buforze myjącym.
    11. Powtórzyć kroki 5.6.9-5.6.10, stosując odpowiednie przeciwciało drugorzędowe.
      UWAGA: Jeśli sferoidy zostały zabarwione bezpośrednio w naczyniu obrazowym, przejdź do kroku 5.6.13.
    12. Opcjonalnie, jeśli sferoidy zostały wcześniej wycięte z warstwy kolagenu (krok 5.6.8.1), wyczyść szkiełka podstawowe i szkiełka nakrywkowe kompatybilne z mikroskopią konfokalną 70% etanolem.
      1. Usuń jak najwięcej buforu myjącego z bloku kolagenowego i ponownie zawieś w ultraczystymH2O. Wykonaj ten krok bezpośrednio przed montażem. Nie pozostawiaj poplamionych bloków moczących się w wodzie.
      2. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką chwyć krawędź bloku kolagenowego i przenieś na szkiełko podstawowe.
      3. Używając kleszczy do przytrzymywania kolagenu na miejscu, użyj czystego bawełnianego wacika, aby odprowadzić nadmiar płynu z bloku kolagenowego, uważając, aby nie dotykać kolagenu bezpośrednio.
        UWAGA: Jeśli kolagen przyklei się do wacika, można go delikatnie usunąć za pomocą kleszczy lub zanurzając w wodzie.
    13. Stosując technikę odwróconego pipetowania, dozować 100 μl pożywki montażowej MOWIOL na blok kolagenowy i umieścić szkiełko nakrywkowe na próbce.
      1. Za pomocą bawełnianego wacika lub ręcznika papierowego usuń nadmiar podłoża montażowego MOWIOL i wodę spod szkiełka nakrywkowego.
      2. Pozostawić podłoże montażowe MOWIOL do stwardnienia przez noc w temperaturze 4 °C. Uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci.
    14. Obrazowanie barwionych sferoid za pomocą mikroskopii konfokalnej lub fluorescencyjnej w celu obserwacji lokalizacji interesujących białek, tworzenia struktur inwazyjnych itp. (Ryc. 5B, 5C).
      UWAGA: Poplamione sferoidy należy chronić przed światłem, aby zapobiec fotowybielaniu.

6. Test Anoikisa

UWAGA: Protokół tworzenia sferoidów można łatwo dostosować do ilościowego określenia niezależnego od zakotwiczenia wzrostu i odporności na anoikis w różnych typach komórek.

  1. Komórki wysiewające do testu anoikis (ryc. 6)
    1. Postępować zgodnie z instrukcjami dotyczącymi wytwarzania sferoidów w sekcji 1.4, ale do przygotowania pożywki do tworzenia sferoidów należy użyć co najmniej 30 mg/ml metylocelulozy.
      UWAGA: Po podgrzaniu 30 mg/ml metylocelulozy powinno wytworzyć gęsty żel, który utrzymuje komórki w zawiesinie.
    2. Inkubuj komórki przez kilka dni do tygodni i regularnie sprawdzaj przy 10-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu. Komórki, które są odporne na anoiki, powinny się namnażać i tworzyć kolonie.
    3. Określ ilościowo anoikis, mierząc liczbę i wielkość kolonii utworzonych w każdym dołku.
      UWAGA: Po utworzeniu kolonii można je umyć w celu usunięcia metylocelulozy i wykorzystać do testów opartych na sferoidach, zgodnie z opisem.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy elastyczną i efektywną metodę generowania dyskretnych sferoid za pomocą płytek odpychających komórki i pożywek do tworzenia sferoidów uzupełnionych MC. W odpowiednich warunkach MC i surowicy poszczególne komórki osiadają i przylegają do siebie w środku studzienki, tworząc sferoidy o minimalnym przyleganiu do dna studzienki. Korzystając z tego protokołu, sferoidy zostały wygenerowane z różnych linii komórkowych (ryc. 2B). Miareczkowanie MC i stężeń w surowicy jes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy szybką i elastyczną metodę wytwarzania sferoid komórkowych 3D do modelowania architektury tkanek in vivo przy użyciu niedrogich i powszechnie dostępnych odczynników. Nasz protokół wykorzystuje niecytotoksyczne i promujące adhezję właściwości MC 8,9, aby pośredniczyć w agregacji komórek i minimalizować tworzenie monowarstw komórkowych. W przeciwieństwie do matryc opartych na białkach wyizolowanych ze źródeł zwierzęcych, MC jest obojętny, nie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują M. Gordonowi z Queen's University Biomedical Imaging Centre za pomoc. Praca ta była wspierana przez granty operacyjne z Kanadyjskiego Towarzystwa Badań nad Rakiem (19439) i Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (MOP-142303) (LMM), a także przez stypendia dla absolwentów Ontario i stypendia z Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research Research (SMM, EYL) oraz przez Craig Jury Summer Scholarshipship (SMM).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Buffers
10x Solanka solankowa buforowana fosforanamiThermo Fisher Scientific AM9625
Roztwór chlorku wapniaSigma-Aldrich21114Używany do buforu do płukania PBS+; Nie autoklawować buforu do płukania PBS+ po dodaniu chlorku wapnia
Roztwór chlorku magnezuSigma-AldrichM1028Używany do buforu do płukania PBS+; Nie autoklawować PBS+ przemywać buforu po dodaniu chlorku magnezu
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>Do tworzenia sferoidów
96-well U-bottom Cell-Repellent PlateGreiner Bio-One650970
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle's MediumSigma-AldrichD5546Do hodowli linii komórkowych SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1
F12K MediumThermo Fisher Scientific2112722Do hodowli linii komórkowej TT
Płodowa surowica bydlęcaSigma-AldrichF1051Filtruj przed użyciem w celu usunięcia zanieczyszczeń cząstkami stałymi
MetylocelulozaSigma-AldrichM7027Przygotować w wodzie do 100 mg/ml
Roswell Park Memorial Institute MediumSigma-AldrichR8758Do hodowli linii komórkowych HCT-116, BxPC-3
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605028Bufor dysocjacyjny
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Do testu inwazji
Bovine Type I CollagenCorning Incorporated354231Stock 3,1 mg / ml; Utrzymuj na lodzie podczas użytkowania
DMEM Phenol Red Free Low Glucose Thermo Fisher Scientific11054-20Mniejsza fluorescencja tła w porównaniu do pożywki uzupełnionej czerwienią fenolową
Czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowychPeprotech450-10Chemoatraktant
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Do mikroskopii immunofluorescencyjnej
#1.5 Szkło nakrywkoweMikroskopia elektronowa Sciences72225-01Do montażu wyciętych sferoid
Alexa-Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379Służy do barwienia aktyny w skali 1:200
Albumina surowicy bydlęcejBioshop Canada IncorporatedALB001Stosowany w buforze blokującym BSA
Dabco 33-LVSigma-Aldrich290734zapobiegający blaknięciu
 Bioshop Canada IncorporatedGLY001Używany w nośniku montażowym MOWIOL
ImageJ SoftwareFreeware, NIH-Useddo analizy obrazu 
MikroszkiełkaVWR International48312-024Do montażu sferoid wycinanych
MOWIOL 4-88EMD-Millipore475904Stosowany w podłożu montażowym MOWIOL
Paraformaldehyd EMD-MilliporePX0055-3Stosowany w buforze utrwalającym
Triton X-100Bioshop Canada IncorporatedTRX777Stosowany w buforze przepuszczalnym
Glicerol

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. A. Two-dimensional vs. three-dimensional in vitro tumor migration and invasion assays. Methods Mol Biol. 986 (986), 227-252 (2013).
  2. Albini, A., Noonan, D. M. The 'chemoinvasion' assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr Opin Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
  3. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  4. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
  5. Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. Methods Mol Biol. 695, 17-39 (2011).
  6. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. (51), (2011).
  7. Handschel, J. G., et al. Prospects of micromass culture technology in tissue engineering. Head Face Med. 3, 4(2007).
  8. Stuckhoff, A. P., DelValle, L. Neuronal Cell Culture Methods and Protocols Vol. 1078 Methods in Molecular Biology. Amini, S., White, M. K. 1078, Humana Press. 119-132 (2013).
  9. Stewart, G. J., Wang, Y., Niewiarowski, S. Methylcellulose protects the ability of anchorage-dependent cells to adhere following isolation and holding in suspension. Biotechniques. 19 (4), 598-604 (1995).
  10. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29(2012).
  11. Nagelkerke, A., Bussink, J., Sweep, F. C. G. J., Span, P. N. Generation of multicellular tumor spheroids of breast cancer cells: How to go three-dimensional. Anal. Biochem. 437 (1), 17-19 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Spheroid ProductionCell Aggregation MethodMethylcellulose MediumSerum ConcentrationU bottom PlatesCollagen EmbeddingSpheroid FormationAnchorage independent GrowthCell Line CompatibilityTumor Cell Invasion

Related Articles