Transfekcja małego RNA w pierwotnych ludzkich komórkach Th17 za pomocą elektroporacji nowej generacji

Podsumowanie

Elektroporacja nowej generacji to skuteczna metoda transfekcji ludzkich komórek Th17 z małymi RNA w celu zmiany ekspresji genów i zachowania komórek.

Streszczenie

Limfocyty T CD4⁺ mogą różnicować się w kilka podzbiorów efektorowych limfocytów pomocniczych T w zależności od otaczającego środowiska cytokin. Limfocyty Th17 mogą być generowane z naiwnych limfocytów T CD4 ⁺ in vitro poprzez ich aktywację w obecności cytokin polaryzujących IL-1β, IL-6, IL-23 i TGFβ. Komórki Th17 koordynują odporność przeciwko zewnątrzkomórkowym bakteriom i grzybom, ale ich nieprawidłowa aktywność jest również związana z kilkoma chorobami autoimmunologicznymi i zapalnymi. Komórki Th17 są identyfikowane przez receptor chemokiny CCR6 i definiowane przez ich główny czynnik transkrypcyjny, RORγt, i charakterystyczną cytokinę efektorową, IL-17A. Zoptymalizowane warunki hodowli pod kątem różnicowania komórek Th17 ułatwiają mechanistyczne badania biologii ludzkich limfocytów T w kontrolowanym środowisku. Stanowią one również warunki do badania znaczenia określonych genów i programów ekspresji genów poprzez interferencję RNA lub wprowadzenie naśladowców lub inhibitorów mikroRNA (miRNA). Protokół ten zapewnia łatwą w użyciu, powtarzalną i wysoce wydajną metodę przejściowej transfekcji różnicujących się pierwotnych ludzkich komórek Th17 z małymi RNA przy użyciu urządzenia do elektroporacji nowej generacji.

Wprowadzenie

Limfocyty T CD4⁺ są kluczowymi koordynatorami adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Naiwne limfocyty T CD4 ⁺ są zdolne do rozwinięcia się w kilka różnych efektorowych limfocytów T (np. Th1, Th2, Th17 itp.), z których każdy ma własny zestaw charakterystycznych cytokin i czynników transkrypcyjnych, w zależności od lokalnego mikrośrodowiska¹. Decyzje dotyczące linii genetycznej podejmowane przez limfocyty T mają kluczowe znaczenie zarówno dla odporności ochronnej, jak i tolerancji na siebie. Komórki Th17 są jednym z podzbiorów limfocytów T, o których wiadomo, że zwalczają zewnątrzkomórkowe bakterie i grzyby, ale ich niewłaściwe odpowiedzi są również związane z patogenezą wielu chorób autoimmunologicznych i zapalnych, takich jak stwardnienie rozsiane i łuszczyca^2,3. Ludzkie komórki Th17 mogą być generowane z naiwnych limfocytów T CD4⁺ in vitro, zapewniając im odpowiednie środowisko polaryzacyjne⁴. Różne kombinacje cytokin IL-1β, IL-23, TGFβ i IL-6 zostały wykorzystane do rozwoju ludzkich komórek Th17. Ludzkie komórki Th17 wyrażają CCR6, receptor chemokiny, który jest powszechnie używany do identyfikacji tej populacji komórek i jest definiowany przez ekspresję ich głównego czynnika transkrypcyjnego, RORγt (kodowanego przez RORC)^5,6. Komórki Th17 mają zdolność do ekspresji wielu cytokin, ale IL-17A jest cytokiną efektorową definiującą linię wytwarzaną przez te komórki. Zbadaliśmy ekspresję wszystkich trzech markerów związanych z Th17 (CCR6, RORγt, IL-17A), aby ocenić solidność naszego ludzkiego testu różnicowania Th17 in vitro. Dodatkowo hodowaliśmy ludzkie limfocyty T CD4 ⁺ w warunkach niepolaryzacyjnych, w których do pożywki hodowlanej nie dodano cytokin ani przeciwciał blokujących w celu użycia jako kontroli negatywnej, ponieważ ekspresja tych markerów Th17 powinna być bardzo niska lub nieobecna.

Jednym ze sposobów badania prawidłowego rozwoju i biologii ludzkich limfocytów T jest manipulowanie ekspresją genów podczas ich rozwoju. Krótko-interferujące RNA (siRNA) to syntetyczne małe cząsteczki RNA, które celują w mRNA kodujące białka i mogą być wykorzystane do zmniejszenia ekspresji określonych genów. MikroRNA (miRNA) to endogenne, niekodujące małe RNA, o których wiadomo, że modulują ekspresję genów po transkrypcji. Wykazano, że miRNA odgrywają ważną rolę zarówno w biologii mysich, jak i ludzkich limfocytów T, w tym w komórkach Th17^7,8,9. Kluczowe znaczenie ma posiadanie wiarygodnych metod manipulowania aktywnością małych RNA w ludzkich limfocytach T, aby zbadać ich wpływ na ekspresję genów, a ostatecznie na biologię ludzkich limfocytów T. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu, spójny i niezawodny protokół, który opracowaliśmy w celu wprowadzenia małych syntetycznych RNA i zablokowanych kwasów nukleinowych (LNA, chemicznie modyfikowanych kwasów nukleinowych o zwiększonej stabilności) do komórek odpornościowych, a konkretnie do ludzkich komórek Th17.

Istnieje kilka alternatywnych metod wprowadzania małych RNA do komórek ssaków, które zazwyczaj mieszczą się w kategoriach chemicznych, biologicznych lub fizycznych¹⁰. Powszechnie stosowane metody chemiczne, w tym transfekcje na bazie lipidów i transfekcje wapniowo-fosforanowe, polegają na tworzeniu kompleksów chemiczno-DNA, które są bardziej efektywnie pobierane przez komórki. Ogólnie rzecz biorąc, metody chemiczne nie są tak skuteczne w transfekcji pierwotnych limfocytów T. Najpowszechniejszą metodą biologiczną jest użycie wektora wirusowego (np. retrowirusa lub lentiwirusa), który bezpośrednio wprowadza obce RNA do gospodarza w ramach jego naturalnego cyklu replikacji. Transdukcja wirusa zwykle trwa dłużej, zwłaszcza gdy weźmie się pod uwagę czas na klonowanie molekularne plazmidów prowirusowych. Ponadto wektory transdukcji wirusa mogą być potencjalnie szkodliwe dla badaczy zajmujących się ludźmi. Elektroporacja to fizyczna metoda indukowania przepuszczalności błony poprzez poddawanie komórek impulsom wysokiego napięcia, co pozwala kwasom nukleinowym przejściowo dostać się do komórki, gdzie mogą działać na swój cel. Tradycyjne narzędzia do elektroporacji nie były skuteczne w transfekcji limfocytów pierwotnych. Jednak zoptymalizowana elektroporacja nowej generacji okazała się zdolna do transfekcji limfocytów T z bardzo wysoką wydajnością, zwłaszcza gdy materiałem, który ma być transfekowany, jest małe RNA. Termin "następna generacja" jest luźno używany w celu odróżnienia dwóch nowszych platform (np. Neon, Amaxa) od tradycyjnych maszyn do elektroporacji. Ponadto metoda ta jest łatwo skalowalna w przypadku badań przesiewowych o umiarkowanej przepustowości z maksymalnie 120 małymi RNA w jednym eksperymencie, często przy użyciu zwalidowanych odczynników syntetycznych. Co ważne, udane transfekcje można osiągnąć już po 16 godzinach od aktywacji limfocytów T. Wadą tej metody jest jednak to, że nie powoduje ona stabilnej inkorporacji genomowej, a zatem jest przejściowa. Dlatego warto podjąć dodatkowy wysiłek, aby stworzyć stabilny konstrukt ekspresji, który można zapakować w wektor wirusowy i z powodzeniem wyrazić w komórkach T w przypadkach, gdy wymagana jest długotrwała ekspresja małego RNA.

Użyliśmy transfekcji nowej generacji (np. Neon) do dostarczania różnorodnych narzędzi do syntezy oligonukleotydów jedno- lub dwuniciowych RNA lub LNA do różnych celów^11,12,13. Wydajna interferencja RNA może być indukowana w pierwotnych mysich i ludzkich limfocytach T za pomocą dwuniciowego, krótko-interferującego RNA (siRNA). Protokół ten opisuje zoptymalizowane warunki stosowania tej techniki w ludzkich komórkach Th17. Oprócz siRNA, dostępne na rynku syntetyczne mimimiki i inhibitory mogą być stosowane do badania przyrostu i utraty funkcji miRNA. Naśladownictwo miRNA to dwuniciowe cząsteczki RNA bardzo podobne do siRNA, ale zaprojektowane z sekwencją endogennych dojrzałych miRNA. Inhibitory miRNA to chemicznie modyfikowane jednoniciowe oligonukleotydy na bazie RNA i / lub LNA, które wiążą się z natywnymi miRNA i antagonizują ich funkcję. Odkryliśmy, że wszystkie te narzędzia mogą być skutecznie stosowane w hodowlanych pierwotnych limfocytach T, w tym między innymi w ludzkich komórkach Th17.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi UCSF dotyczącymi etyki badań na ludziach.

1. Przygotowanie hodowli limfocytów T, izolacja limfocytów T CD4⁺ i polaryzacja Th17

1. W dniu 0 pokryć 6-dołkowe płytki hodowli tkankowej 1,5 ml na studzienkę anty-ludzkiego CD3 (2 μg/ml) i anty-ludzkiego CD28 (4 μg/ml) w PBS wapniem i magnezem przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C.
   1. Alternatywnie, płytki należy pokryć przez noc w temperaturze 4 °C. Zawinąć płytki w parafilm.
2. Przygotować jednojądrzaste komórki krwi pępowinowej (CBMC) przez wirowanie w gradionym gradionym gęstości zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Pracuj ostrożnie i upewnij się, że podczas pracy z ludzką krwią noszone są odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), aby uniknąć ryzyka narażenia na patogeny przenoszone przez krew.
3. Po wyizolowaniu i umyciu komórek jednojądrzastych należy przeprowadzić izolację ludzkich limfocytów T CD4 ^{+ przez} selekcję negatywną przy użyciu komercyjnego zestawu ludzkich limfocytów T CD4 ⁺.
   UWAGA: Jeśli po izolacji komórek jednojądrzastych występuje zanieczyszczenie krwinek czerwonych, przed etapami izolacji komórek T CD4 ⁺ można przeprowadzić opcjonalną lizę krwinek czerwonych. Ponownie zawiesić komórki jednojądrzaste w 1 ml buforu izolacyjnego (2% FBS w PBS). Dodaj 5 ml 1x roztworu lizującego. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 5 ml buforu izolacyjnego i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
   1. Zawiesić komórki jednojądrzaste o gęstości 50 x 10,6 na 500 μl w buforze izolacyjnym w nowej probówce o pojemności 5 ml.
   2. Dodać 100 μl FBS i 100 μl mieszanki przeciwciał na probówkę, a następnie inkubować każdą probówkę w temperaturze 4 °C przez 20 minut na wytrząsarce orbitalnej, aby dobrze wymieszać.
   3. Po inkubacji dodać 3-4 ml buforu izolacyjnego, aby przepłukać komórki. Odwirować komórki przy 300 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek. Ostrożnie zassać supernatant.
   4. Podczas tego wirowania umyj wstępnie kulki magnetyczne. Przenieś żądaną ilość kulek magnetycznych do nowej probówki (używanej w stosunku 1:1 z komórkami) i dodaj równą objętość buforu izolacyjnego, aby umyć kulki. Dobrze wymieszaj za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml, a następnie umieść probówkę w magnesie na co najmniej 1 minutę. Ostrożnie zassać supernatant. Ponownie zawiesić kulki magnetyczne w tej samej objętości, które zostały pierwotnie przeniesione przed praniem.
   5. Zawiesić komórki w każdej probówce za pomocą 500 μl buforu izolacyjnego i dodać 500 μl wstępnie umytych kulek magnetycznych.
   6. Inkubować komórki z kulkami magnetycznymi przez 15 minut na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej (18 °C do 25 °C), aby dobrze wymieszać.
   7. Po inkubacji dokładnie odpipetować komórki za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml co najmniej 10 razy. Następnie dodaj 3-4 ml buforu izolacyjnego i umieść każdą probówkę w magnesie na 2 minuty.
   8. Ostrożnie przenieś ujemnie wybrane limfocyty T CD4 ⁺ znajdujące się w supernatancie do nowej probówki.
4. Po zakończeniu izolacji limfocytów T CD4 ⁺ policz komórki za pomocą hemocytometru i utrzymuj komórki na lodzie.
5. Umyć płytki pokryte przeciwciałami dwa razy PBS. Następnie dodaj 1,5 ml 2x mieszanki pożywki polaryzującej Th17 do każdej studzienki: anty-ludzkiego IFNγ (20 μg/ml), anty-ludzkiego IL-4 (20 μg/ml), ludzkiego TGFβ (10 ng/ml), ludzkiego IL-1β (40 ng/ml), ludzkiego IL-23 (40 ng/ml), ludzkiego IL-6 (50 ng/ml) rozcieńczonego w pożywce bazowej bez surowicy (uzupełnionej 2 mM L-glutaminą, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu i 100 μM 2-merkaptoetanolu).
   UWAGA: Transfekcja i interferencja RNA działają w pożywkach zawierających surowicę. Celem stosowania pożywek bez surowicy z tym protokołem jest osiągnięcie lepszej produkcji IL-17A.
6. Odwirować ludzkie limfocyty T CD4⁺ przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzania komórek. Ostrożnie zassać supernatant. Następnie ponownie zawieś komórki w pożywce bazowej bez surowicy i pokryj komórki gęstością 3 x 10⁶ w 1,5 ml na studzienkę, tak aby końcowa objętość wynosiła 3 ml na dołek, a cytokiny polaryzujące miały teraz stężenie końcowe 1x.
   1. Umieścić płytki w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ i temperaturze 37 °C na dwa dni.

2. Elektroporacja spolaryzowanych ludzkich komórek Th17 in vitro

1. W dniu 2 pokryj 48-dołkowe płytki hodowli tkankowej 250 μl na studzienkę anty-ludzkiego CD3 (2 μg/ml) i anty-ludzkiego CD28 (4 μg/ml) w PBS wapniem i magnezem przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C.
   1. Alternatywnie, płytki należy pokryć przez noc w temperaturze 4 °C. Zawinąć płytki w parafilm.
2. Przygotuj małe RNA do transfekcji. Dla każdej transfekcji podamy 1 μl 5 μM roztworu podstawowego siRNA do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Uwzględnij odpowiednią, dopasowaną chemicznie kontrolę małego RNA. Trzymaj wszystkie probówki na lodzie.
3. Umyć płytki pokryte przeciwciałami dwa razy PBS. Następnie dodaj 500 μL 1X pożywki polaryzującej Th17 do każdej studzienki: anty-ludzkiego IFNγ (10 μg/ml), anty-ludzkiego IL-4 (10 μg/ml), ludzkiego TGFβ (5 ng/ml), ludzkiego IL-1β (20 ng/ml), ludzkiego IL-23 (20 ng/ml), ludzkiego IL-6 (25 ng/ml) rozcieńczonego w pożywce bazowej bez surowicy (uzupełnionej 2 mM L-glutaminą, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu i 100 μM 2-merkaptoetanolu).
4. Po przygotowaniu płytek hodowlanych i odczynników do transfekcji, ponownie zawiesić komórki za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml, delikatnie pipetując, ale upewniając się, że wszystkie komórki są odłączone od dna studzienek. Zebrać komórki w stożkowej probówce i odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: W przypadku okresów hodowli dłuższych niż czterodniowy protokół przedstawiony w niniejszym dokumencie, komórki powinny być transfekowane mniej więcej co 3 dni przy użyciu tego samego protokołu. Krok 2.4 powinien jednak zostać zmodyfikowany, ponieważ komórki traktowane różnymi małymi RNA nie powinny być łączone. Wszystkie badane warunki muszą być zebrane, policzone i transfekowane oddzielnie.
5. Ostrożnie odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w co najmniej 1 ml PBS w celu przemycia. Policz żywe komórki Th17 (np. za pomocą hemocytometru wykorzystującego wykluczenie błękitu trypanowego w celu oceny żywotności), a następnie przenieś komórki do probówki mikrowirówkowej.
6. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby granulować komórki.
7. Ostrożnie odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki za pomocą dostarczonego buforu do respodencji z zestawu 10 μl systemu do transfekcji o gęstości 2,5-4 x 10⁷ komórek na ml. Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Jako wskazówkę staraj się przygotować tylko tyle komórek, ile można przetransfekować w ciągu 30 minut. Można porównywać wiele partii.
8. Dodaj 9 μl komórek do 1 μl małego RNA w każdej probówce do mikrowirówki. Pipetuj raz, aby wymieszać komórki i małe RNA do transfekcji, a następnie załaduj do dostarczonej końcówki elektrody pipety.
   UWAGA: Zazwyczaj dodaje się 9,5 μl zawiesiny komórek, aby upewnić się, że mieszaniny jest wystarczająco dużo, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków na końcówce elektrody pipety przed transfekcją.
9. Napełnij dostarczoną kuwetę 3 ml buforu elektrolitycznego E. Umieść kuwetę w stacji pipetowej, a następnie umieść pipetę na miejscu wewnątrz kuwety.
10. Natychmiast poddaj elektroporację każdej 10 μl mieszanki komórek i małego RNA, używając następujących parametrów: napięcie impulsu 1,500-1,550 V, szerokość impulsu 10 ms i łącznie 3 impulsy na urządzeniu do transfekcji.
11. Po zakończeniu elektroporacji bezpośrednio dodać mieszaninę komórek do 500 μl pożywki polaryzującej 1X Th17 w przygotowanych dołkach płytki hodowlanej. Umieść płytki w inkubatorze o stężeniu 5%_CO2 i temperaturze 37 °C na kolejne dwa dni.
    UWAGA: Umyj końcówkę elektrody pipety, pipetując w górę i w dół w PBS pomiędzy każdą transfekcją.

3. Pobieranie ludzkich komórek Th17

1. Zawiesić komórki w pożywce hodowlanej za pomocą mikropipety, delikatnie pipetując, ale upewniając się, że wszystkie komórki są oderwane od dna studzienek. Przygotować komórki do testów funkcjonalnych i/lub ekspresji genów.
   UWAGA: Rutynowo z jednej studzienki transfekowanych komórek Th17 pobiera się wystarczającą ilość komórek, które można wykorzystać do analizy cytometrycznej przepływowej markera powierzchniowego i wewnątrzkomórkowego barwienia cytokiny i czynnika transkrypcyjnego lub do przygotowania RNA do analizy ekspresji genów.

Wyniki

Pierwszym krokiem w celu opracowania wiarygodnego systemu skutecznej elektroporacji ludzkich komórek Th17 było wygenerowanie stabilnych kultur ludzkich komórek Th17 różnicowanych in vitro. Komórki T hodowane w warunkach polaryzujących Th17 wykazywały ekspresję receptora chemokin CCR6 oraz czynnika transkrypcyjnego RORγt (Ryc. 1A, lewa). Markery te nie były eksponowane w przypadku hodowli komórek T w warunkach niepolaryzujących (ThN) (Ryc. 1A, pra...

Dyskusja

Protokół ten zapewnia ulepszoną metodę dostarczania małych RNA do ludzkich komórek Th17. Chociaż użyto tutaj ludzkich komórek Th17, ta metoda elektroporacji z małymi RNA może być stosowana z innymi pierwotnymi podzbiorami ludzkimi pomocnikami T, takimi jak Th1, Th2 i Treg. Nie działało to dobrze w przypadku naiwnych limfocytów T CD4 ⁺ , więc komórki muszą być aktywowane w hodowli przed transfekcją. W przypadku tego protokołu najpierw zoptymalizowaliśmy system hodowli in vitro w celu uzyskania lepszej ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
anty-ludzka IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Klon: eBio64DEC17
anty-ludzki IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Klon: 4S. B3
anty-ludzki CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Klon: SK3
mysz anty-ludzka CD196 (CCR6) BV421	BD nauki biologiczne	562515	Klon: 11A9
anty-ludzki RORgt AF647	BD biosciences	563620	Klon: Q21-559
anty-ludzki CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Klon: 2D1
Foxp3 / Barwienie czynnikiem transkrypcyjnym Zestaw buforowy	ebioscience	00-5523-00	Do barwienia wewnątrzkomórkowego czynnika transkrypcyjnego cytometrii przepływowej
Oczyszczony inhibitor wiązania Hu FcR	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF Pożywka do ekspansji komórek T	Technologie komórek macierzystych	10981	"Pożywka bazowa bez surowicy"
MACS CD28 czysta klasa funkcjonalna, ludzki	Klon Miltenyi Biotec	130-093-375	: 15E8
anty-ludzki CD3 Oczyszczony	rdzeń przeciwciała monoklonalnego UCSF	Nie dotyczy	Klon: OKT-3
LEAF oczyszczony anty-ludzki IL-4	Biolegend	500815	Klon: MP4-25D2
anty-ludzki IFNg, oczyszczony klasy funkcjonalnej	ebioscience	16-7318-85	Klon: NIB42
Rekombinowany ludzki IL-23	Peprotech	200-23
Rekombinowana ludzka IL-1β	Peprotech	200-01B
Rekombinowany ludzki TGF-β 1	Peprotech	100-21C
Rekombinowany ludzki IL-6	Peprotech	200-06
Pula kontrolna siGENOME, nieukierunkowana #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Ludzki RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Ludzki PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Zestaw nietkniętych ludzkich komórek T CD4	ThermoFisher Scientific	11346D	Ludzka komórka T CD4+ Zestaw izolacyjny
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Przyrząd do elektroporacji nowej generacji
Neon Tranfection System 10 μ L Zestaw	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Bufor do ponownego zawieszania T	ThermoFisher Scientific	Dostarczane w zestawie (MPK1096)	"Bufor do ponownego zawieszania transfekcji"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	# 07801	Gradient gęstości Medium
costar 6-dołkowe płytki poddane hodowli tkankowej	Corning	3516	płaskie płytki denne
Costar 48-dołkowe płytki poddane hodowli tkankowej	Corning	3548	płytki z płaskim dnem
Bufor lizujący BD Pharm Lyse, 10x	BD biosciences	555899	Przed użyciem należy przygotować 1x roztwór z wodą destylowaną