Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekspresja, oczyszczanie i aktywność przeciwdrobnoustrojowa S100A12

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55557

⸱

13 maja 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life and Physical Sciences, Fisk University, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs, 3Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University Medical School, 4Department of Biochemistry, Vanderbilt University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę wyrażania i oczyszczania S100A12 (kalgranulina C). Opisujemy protokół pomiaru jego aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec ludzkiego patogenu H. pylori.

Streszczenie

Białka kalgranuliny są ważnymi mediatorami odporności wrodzonej i należą do klasy S100 rodziny białek wiążących wapń EF-hand. Niektóre białka S100 mają zdolność wiązania metali przejściowych o wysokim powinowactwie i skutecznego sekwestrowania ich przed atakującymi patogenami drobnoustrojów w procesie, który określa się mianem "odporności odżywczej". S100A12 (EN-RAGE) wiąże zarówno, jak i miedź i występuje w dużych ilościach we wrodzonych komórkach odpornościowych, takich jak makrofagi i neutrofile. Przedstawiamy udoskonaloną metodę ekspresji, wzbogacania i oczyszczania S100A12 w jej aktywnej, wiążącej metale konfiguracji. Wykorzystanie tego białka w analizach wzrostu i żywotności bakterii ujawnia, że ma S100A12 działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko patogenowi bakteryjnemu, Helicobacter pylori. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa opiera się na aktywności wiążącej przez S100A12, która chelatuje jako składnik odżywczy, pozbawiając w ten sposób H. pylori, który potrzebuje do wzrostu i namnażania.

Wprowadzenie

Białka S100 to klasa z rodziny białek wiążących wapń EF-hand o zróżnicowanym wachlarzu funkcji1. Są one wyrażane w sposób specyficzny dla tkanki i komórki oraz regulują szerokie spektrum funkcji komórkowych2,3. Unikalne dla białek wiążących wapń, białka S100 wykazują zarówno funkcje wewnątrzkomórkowe, jak i zewnątrzkomórkowe4,5. W komórce wiązanie Ca2+ indukuje zmianę konformacyjną, która odsłania hydrofobową powierzchnię, która jest specyficznie ukierunkowana na partnerów wiążących białka6. Ten wewnątrzkomórkowy mechanizm reguluje ważne procesy, takie jak proliferacja komórek, różnicowanie i metabolizm energetyczny. W środowisku zewnątrzkomórkowym białka S100 pełnią dwie funkcje7. W jednym z nich działają jako białka wzorca molekularnego związanego z uszkodzeniem (DAMP) i inicjują prozapalną odpowiedź immunologiczną poprzez interakcję z receptorami rozpoznawania wzorców8,9. Ponadto kilku członków klasy białek S100 sekwestruje metale przejściowe, funkcję, która służy do głodzenia patogenów mikrobiologicznych w procesie zwanym odpornością odżywczą10,11.

S100A12 (znany również jako kalgranulina C i EN-RAGE) ulega silnej ekspresji w makrofagach i neutrofilach i został zidentyfikowany jako potencjalny biomarker chorób zapalnych12,13. Oprócz wiązania wapnia w miejscach EF-Hand, S100A12 ma dwa miejsca wiązania metali przejściowych o wysokim powinowactwie zlokalizowane na przeciwległych końcach interfejsu dimerów14,15. Każde miejsce wiązania składa się z trzech reszt histydyny i jednej reszty kwasu asparaginowego i może chelatować lub miedź16,17. Niedawno informowaliśmy, że zależny od S100A12 głód jest ważny w regulacji wzrostu Helicobacter pylori i aktywności prozapalnych czynników wirulencji18.

H. pylori infekuje żołądek około połowy światowej populacji ludzkiej, co czyni go prawdopodobnie jednym z najbardziej skutecznych patogenów bakteryjnych19. Zakażenie H. pylori może prowadzić do poważnych skutków chorób żołądka, w tym zapalenia błony śluzowej żołądka, wrzodu trawiennego i dwunastnicy, chłoniaka tkanki limfatycznej związanej z błoną śluzową (MALT) i inwazyjnego gruczolakoraka żołądka (rak żołądka). Rak żołądka jest główną przyczyną zgonów niezwiązanych z rakiem włóknistego na świecie, a największym pojedynczym czynnikiem ryzyka raka żołądka jest zakażenie H. pylori.

H. pylori utrzymuje się w niszy żołądkowej pomimo silnej odpowiedzi immunologicznej na patogen, podkreślając potrzebę lepszego zrozumienia mechanizmów immunologicznych kontroli tej infekcji bakteryjnej20,21,22,23. Zapalenie związane z H. pylori charakteryzuje się głębokim naciekaniem komórek wielojądrzastych lub neutrofili, które w miejscu infekcji odkładają repertuar białek przeciwdrobnoustrojowych, w tym S100A12, w miejscu infekcji18,24,25. Starając się zrozumieć złożony dialog między gospodarzem a patogenem, staraliśmy się udoskonalić technikę oczyszczania S100A12 i wykorzystać ją do badania wpływu przeciwdrobnoustrojowego, jaki wywiera na ten istotny z medycznego punktu widzenia patogen. Poniższy protokół przedstawia ulepszoną technikę oczyszczania S100A12 w stanie biologicznie aktywnym; Zdolny do wiązania metali odżywczych o wysokim powinowactwie i chelatowania ich przed inwazyjnymi mikroorganizmami. Co więcej, poniższe metody podkreślają użyteczność tego białka jako krytycznego odczynnika do badania mechanizmu, za pomocą którego wrodzone cząsteczki przeciwdrobnoustrojowe ograniczają wzrost patogenów bakteryjnych.

Białka z rodziny S100A zyskały uznanie jako ważna grupa wrodzonych cząsteczek układu odpornościowego, które uczestniczą w sygnalizacji immunologicznej, jak również w obronie gospodarza27. Najlepiej zbadaną z nich jest kalprotektyna (MRP-8/14, kalgranulina A/B, S100A8/A9)28,29,30. Kalprotektyna jest białkiem związanym z neutrofilami, które tworzy heterodimer podjednostek S100A8 i S100A9, który wiąże metale przejściowe na granicy dimerów31. Wykazano, że kalprotektyna posiada dwa miejsca wiązania metali: Miejsce 1 może wiązać Zn2+, Mn2+ lub Fe2+, a Miejsce 2 może wiązać Zn2+ 31,32. Liczne doniesienia wykazały, że kalprotektyna ma działanie przeciwdrobnoustrojowe przeciwko różnym patogenom, w tym Staphylococcus aureus, Candida albicans, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli i H. pylori, oraz że działanie hamujące wynika z aktywności chelatacji metalu calprotectin25,28,29.

Poprzednia praca wykazała, że kalprotektyna wywiera liczne działania na H. pylori, w tym zmienia strukturę lipidu A w błonie zewnętrznej, hamuje system wydzielania cag-Type IV (który jest głównym prozapalnym czynnikiem wirulencji w H. pylori), indukuje tworzenie biofilmu oraz hamuje wzrost i żywotność H. pylori w sposób zależny od dawki25,33. Co więcej, testy genetyczne i biochemiczne wykazały, że działanie przeciwbakteryjne kalprotektyny przeciwko H. pylori wynikało w dużej mierze z jej zdolności do wiązania składników odżywczych25. H. pylori wymaga, jak stwierdzono w poprzednich badaniach, w których wykorzystano chemicznie zdefiniowane podłoże w celu ustalenia zapotrzebowania na mikroelementy dla tego patogenu do wzrostu i namnażania się34. Ponadto kalprotektyna była bardzo obfita w tkankach zakażonych H. pylori i była związana z naciekami neutrofilowymi, co wskazuje, że gospodarz może stosować kalprotektynę jako strategię przeciwdrobnoustrojową podczas infekcji i późniejszego stanu zapalnego25,35.

Ostatnie dowody z bezstronnych technik przesiewowych proteomiki sugerują, że w warunkach, w których reaktywne formy tlenu są obfite, kalprotektyna ulega modyfikacjom potranslacyjnym, które zmieniają miejsce wiązania heksa-histydyny, hamując tym samym aktywność wiązania metali przez białko36. W związku z tym postawiliśmy hipotezę, że inne białka z rodziny S100A spośród szerokiego repertuaru tych cząsteczek mogą potencjalnie działać jako pomocnicze chelatory metali. Wybraliśmy S100A12 do dalszych badań, ponieważ nie został zidentyfikowany we wspomnianym wcześniej badaniu przesiewowym pod kątem modyfikacji potranslacyjnej, ma zdolność wiązania i występuje bardzo obficie w tkankach ludzkich pochodzących od osób zakażonych H. pylori.

Nasza praca wskazuje, że S100A12 może hamować wzrost i żywotność H. pylori w sposób zależny od dawki w szczepie G27 H. pylori, oraz że aktywność przeciwbakteryjna tego białka może być odwrócona przez dodanie nadmiaru odżywczego. Praca ta uzupełnia nasze wcześniejsze prace wskazujące S100A12 wywierają aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko szczepom PMSS1 i 7.13 H. pylori, wykazując jej szeroką aktywność przeciwbakteryjną przeciwko licznym izolatom klinicznym i laboratoryjnie przystosowanym szczepom H. pylori18. Łącznie wyniki te potwierdzają znaczenie S100A12 jako mechanizmu kontrolującego wzrost i namnażanie się bakterii poprzez odporność żywieniową. Przyszłe badania nad tą ważną interakcją gospodarz-bakteria mogą obejmować wykorzystanie aktywności S100A12 w celu zmniejszenia obciążenia bakteryjnego w tkankach gospodarza lub określenie udziału tego białka w sygnalizacji immunologicznej w kontekście zakażenia H. pylori.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wyrażenie S100A12

  1. Przekształć kompetentne komórki BL21 DE3 za pomocą plazmidu pGEMEX-S100a12 przy użyciu standardowego protokołu szoku cieplnego18. Dodaj 1 do 5 μl plazmidu do 50 μl bakterii w probówce mikrowirówkowej na lodzie. Inkubować przez 20 minut.
  2. Szok termiczny ogniw w temperaturze 42 °C przez 30 s.
  3. Inkubować komórki na lodzie przez 2 minuty.
  4. Dodaj 500 μl pożywki SOC do komórek. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min na wytrząsarce orbitalnej przez 1 godzinę.
  5. Płytka 150 μL reakcji przemiany na pożywce LB-agar (uzupełniona 100 μg/ml ampicyliny). Inkubować przez 12-16 godzin w temperaturze 37 °C.
  6. Wybierz jedną kolonię. Zaszczepić 2 ml LB (uzupełnione 100 μg/ml ampicyliny).
  7. Inkubować przez 4-6 godzin w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej (300 obr./min). OD600 powinien wskazywać od 1 do 3 jednostek absorbancji.
  8. Dodaj 500 μl kultury starterowej do 50 ml pożywki do autoindukcji ZYM-5052 26 uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny. Aby uzyskać najlepsze napowietrzenie i maksymalną ekspresję, należy użyć kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml z przegrodą. Wstrząsać (300 obr./min) przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
  9. Przenieś zawiesinę bakteryjną do probówki wirówkowej. Granulować komórki przez odwirowanie (4 000 x g, 10 min) w temperaturze 4 °C.
  10. Zdekantować pożywkę, zarejestrować próbkę i przechowywać pastę komórkową w temperaturze -80 °C. Próbka jest stabilna przez lata.

2. Oczyszczanie S100A12 za pomocą chromatografii niskociśnieniowej

  1. Zawieś komórki w 30 ml 20 mM Tris, pH 8,0.
  2. Sonizuj zawiesinę na lodzie w celu lizy komórek. Użyj mocy wyjściowej ~20 W, 5 s cyklu włączania i 5 s wyłączania przez 5 minut.
  3. Przenieś roztwór do probówek wirówkowych o dużej prędkości. Klarować lizat komórkowy przez odwirowanie, 20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Zdekantować supernatant i przenieść do czystej zlewki polipropylenowej o pojemności 100 ml. Schłodzić roztwór, umieszczając zlewkę na lodzie. Dodaj mieszadło i powoli dodawaj 11,20 g siarczanu amonu. Pozostaw roztwór do mieszania na lodzie przez dodatkowe 1 godzinę. W ten sposób powstanie 60% roztwór siarczanu amonu i wytrąci się większość endogennych białek E. coli. S100A12 pozostaną rozpuszczalne.
  5. Odwirować roztwór w temperaturze 4 °C, 20 000 x g przez 20 minut w celu osadzenia wytrąconego białka.
  6. Zdekantować supernatant i przenieść do rurki dializacyjnej (MWCO 3 500 kDa). Dializować w stosunku do 1 l 20 mM Tris, pH 8,0 w 4 °C. Zmienić dwukrotnie bufor dializacyjny. Odczekaj 4 godziny między zmianami.
  7. Chromatografia anionitowa
    1. Przeprowadzić chromatografię w układzie niskociśnieniowym. Typowe natężenie przepływu wynosi 1 ml/min.
    2. Zrównoważyć 5 ml sefarozy z 10 ml 20 mM Tris, pH 8,0.
    3. Załadować ~40 ml roztworu S100A12 za pomocą pompy do próbki (zebrać przepływ).
    4. Przemyć kolumnę 10 ml 20 mM Tris, pH 8.
    5. Rozwiń kolumnę z gradientem 0-30% (bufor B to 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) w 19 objętościach kolumny (CV, 95 mL). Zbierz 5 ml frakcji.
    6. Pobrać 10 μl podwielokrotności każdej frakcji i przeanalizować za pomocą MES SDS PAGE z barwieniem Coomassie. Uruchamiać żel przy stałym napięciu (20 V/cm) przez 30 minut.
    7. Frakcje zbiorcze zawierające S100A12. S100A12 działa przy białku ~10 kDa na żelu denaturującym.
    8. Zagęścić frakcje do 5 ml za pomocą urządzenia do ultrafiltracji (MWCO 10 kDa). Wirować przy 3.000 x g przez ~8 min. Weź górną frakcję.
  8. Chromatografia wykluczania wielkości
    1. Zrównoważyć kolumnę S75 z 1 CV (120 ml) 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl.
    2. Wstrzyknąć < 5 ml skoncentrowanych frakcji S100A12 (z chromatografii jonowymiennej).
    3. Rozwiń kolumnę przy natężeniu przepływu 1 ml/m na 120 ml. Zbierz 5 ml frakcji.
    4. Pobrać 10 μl podwielokrotności każdej frakcji i przeanalizować za pomocą SDS PAGE z barwieniem Coomassie. Zweryfikuj tożsamość białka za pomocą western blot lub spektrometrii mas (obliczona masa cząsteczkowa podjednostki monomerycznej 10 575,0 Da, mierzona 10575,4 Da).
  9. Frakcje puli
    1. Zmierzyć absorbancję białka A280 za pomocą spektrofotometru. Użyj bufora SEC jako pustego miejsca. Obliczony współczynnik ekstynkcji dla S100A12 homodimeru wynosi 5960 M-1 cm-1,
      UWAGA: Typowe plony to 35-45 mg S100A12 na 50 ml kultury.
    2. Podwielokrotność porcji S100A12 do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (1 mg/probówkę), błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Testy aktywności przeciwdrobnoustrojowej

  1. Smuga H. pylori odcedzić G27 na tryptycznych płytkach sojowych uzupełnionych 5% krwią owczą (płytki z agarem z krwią). Rośnie 2-3 dni w temperaturze 37 °C w powietrzu wypełnionym 5% dwutlenkiem węgla.
  2. Zaszczep H. pylori w bulionie z brucelozy uzupełnionym 1x cholesterolem. Hodowla przez noc wytrząsanie (250 obr./min) w temperaturze 37 °C w powietrzu pokojowym uzupełnionym 5% dwutlenkiem węgla.
  3. Rozcieńczyć H. pylori w stosunku 1:10 w 50% bulionie Brucella, 50% buforze kalprotektyny plus 1x cholesterol i kulturę w samym pożywce lub uzupełnioną 100 μM chlorku plus 0, 100 lub 1,000 μg/ml oczyszczonej S100A12. Hodowla przez noc wytrząsanie (250 obr./min) w temperaturze 37 °C w powietrzu pokojowym uzupełnionym 5% dwutlenkiem węgla.
  4. Następnego dnia wykonaj seryjne rozcieńczenia i płytkę na płytkach z agarem z krwią. Pozostawić kolonie bakteryjne do wzrostu przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C w powietrzu pokojowym uzupełnionym 5% dwutlenkiem węgla. Wylicz jednostki tworzące kolonie, aby obliczyć wzrost bakterii w obecności lub braku S100A12 i/lub egzogennego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ekspresja i oczyszczanie S100A12

Trzystopniowe oczyszczanie pozwoliło na uzyskanie ~40 mg rekombinowanego białka S100A12 z 50 mL kultury bakteryjnej. Pierwszym etapem było wytrącanie endogennych białek E. coli za pomocą siarczanu amonu. Następnie przeprowadzono chromatografię wymiany anionowej (Rycina1A). Obecność białka monitorowano za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z barwieniem Coomassie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiono skuteczny protokół zarówno do odciągania, jak i oczyszczania S100A12 ludzkiego. System ekspresji E. coli jest najpowszechniejszym narzędziem wykorzystywanym do produkcji białek rekombinowanych, szczególnie gdy do badań biochemicznych i biofizycznych wymagane są ilości mg. Kluczowym ulepszeniem opisanej tutaj procedury jest zastosowanie pożywki autoindukcyjnej26, która zwiększa wydajność oczyszczonego białka prawie trzydziestokrotnie w porównaniu z ekspresją za pomocą standardowej pożywki bulionowej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Departament ds. Weteranów Nagroda Rozwoju Kariery 1IK2BX001701, UL1TR000445 z nagrodą CTSA od National Center for Advancing Translational Sciences, National Science Foundation Award Numbers 1547757 i 1400969, oraz grant NIH GM05551. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Center for Advancing Translational Sciences lub National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
S100A12 Ekspresja
Komórki ekspresji
BL 21 (DE3) kompetentne komórkiNew England BiolabsC25271
Składniki
Ekstrakt drożdżowyResearch Products InternationalY20020-250.0
NaClResearch Products InternationalS23020-500.0
TryptoneResearch Products InternationalT60060-250.0
FeCl3Sigma-AldrichF2877
MgSO4Research Products InternationalM65240-100.0
Na2HPO4Research Products InternationalS23100-500.0
KH2PO4Research Products InternationalP41200-500.0
NH4ClResearch Products InternationalA20424-500.0
Na2SO4Research Products InternationalS25150-500.0
Glycerol ResearchProducts InternationalG22020-1.0
D-glucoseResearch Products InternationalG32040-500.0
laktozaSigma-AldrichL2643
Agent selekcyjny
ampicillinResearch Products InternationalA40040-5.0
S100A12 System chromatografii
AKTA StartGE29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast FlowGE17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HRGE17-1166-01
Spektrofotometr Nanodrop liteThermo Fisher ScientificND-LITE
Tris BaseResearch Products InternationalT60040-1000.0
H. pylori Culture
Płytki agarowe z krwiąLab Supply CompanyBBL221261
Bulion z brucelliSigma-AldrichB3051
Cholesterol (250x)Thermo Fisher Scientific12531018
NaClSigma-Aldrich793566
CaCl2Sigma-AldrichC4901
β-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250
Tris BaseSigma-AldrichT1503
ChlorekSigma-Aldrich229997
pożywki autoindukcyjnej

Bibliografia

  1. Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354(2013).
  2. Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (2), e0115828(2015).
  3. Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).
  4. Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
  5. Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).
  6. Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).
  7. Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).
  8. Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
  9. Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).
  11. Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).
  12. Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12 (6), e1005705(2016).
  13. Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).
  14. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
  15. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).
  16. Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).
  17. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).
  18. Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).
  19. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).
  20. Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).
  21. Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).
  22. Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).
  23. de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).
  24. Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).
  25. Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10 (10), e1004450(2014).
  26. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  27. Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).
  28. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
  29. Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).
  30. Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).
  31. Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).
  32. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).
  33. Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).
  34. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
  35. Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).
  36. Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie S100A12sekwestracja cynkuwytr canie siarczanem amonuchromatografia wymiany anionowejchromatografia wykluczania cz steczkowegoanaliza SDS PAGEtest z H pyloribia ko wi ce metaleodporno ywieniowa
Ekspresja, oczyszczanie i aktywność przeciwdrobnoustrojowa S100A12
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.