Artykuł metodologiczny

Rekombinowana ekspresja, krystalizacja i badania biofizyczne pirofosforylazy nukleotydowej konserwowanej przez Bacillus, BcMazG

DOI:

10.3791/55576

⸱

16 maja 2017

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacillus anthracis jest obowiązkowym patogenem śmiertelnego wąglika wziewnego, więc badania nad jego genami i białkami są ściśle regulowane. Alternatywnym podejściem jest badanie genów ortologicznych. Opisujemy badania biofizykochemiczne ortologa B. anthracis w B. cereus, bc1531, wymagające minimalnego sprzętu doświadczalnego i pozbawione poważnych obaw dotyczących bezpieczeństwa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przezwyciężyć ograniczenia i przepisy bezpieczeństwa podczas badania genów i białek prawdziwych patogenów, można badać ich homologi. Bacillus anthracis jest obowiązkowym patogenem, który powoduje śmiertelnego wąglika wziewnego. Bacillus cereus jest uważany za użyteczny model do badania B. anthracis ze względu na jego bliskie pokrewieństwo ewolucyjne. Klaster genów ba1554 - ba1558 B. anthracis jest wysoce konserwatywny z klastrem bc1531-bc1535 w B. cereus, a także z klastrem bt1364-bt1368 w Bacillus thuringiensis, co wskazuje na krytyczną rolę powiązanych genów w rodzaju Bacillus. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania i scharakteryzowania produktu białkowego pierwszego genu (ba1554) z klastra genów w B. anthracis przy użyciu rekombinowanego białka jego ortologa w B. cereus, bc1531.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekspresja białek rekombinowanych jest powszechnie stosowana do rozwiązywania problemów związanych z naturalnymi źródłami białka, takich jak ograniczone ilości białka i szkodliwe zanieczyszczenie. Co więcej, w badaniach genów i białek chorobotwórczych można wykorzystać alternatywny szczep laboratoryjny, który nie wymaga dodatkowych środków ostrożności. Na przykład Bacillus cereus jest użytecznym modelem do badania Bacillus anthracis ze względu na ich bliskie pokrewieństwo ewolucyjne1.

B. anthracis jest obowiązkowym patogenem, który powoduje śmiertelne wdychanie wąglika u ludzi i zwierząt gospodarskich i może być potencjalnie używany jako broń biologiczna2. W związku z tym badania laboratoryjne nad B. anthracis są ściśle regulowane przez amerykańskie Centra Kontroli Chorób, wymagające praktyk poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3), które nakazują segregację obszaru laboratoryjnego przy ujemnym ciśnieniu w pomieszczeniu. W przeciwieństwie do B. anthracis, B. cereus jest klasyfikowany jako środek BSL-1, a zatem ma minimalne obawy dotyczące bezpieczeństwa. B. cereus jest oportunistycznym patogenem, który po zakażeniu powoduje zatrucie pokarmowe, które można leczyć bez pomocy medycznej. Ponieważ jednak B. cereus dzieli wiele krytycznych genów z B. anthracis, funkcje białek B. anthracis można badać przy użyciu odpowiednich homologów B. cereus1.

Klaster genów ba1554 - ba1558 B. anthracis jest wysoce konserwatywny z klastrem bc1531- bc1535 B. cereus, jak również z klastrem bt1364-bt1368 Bacillus thuringiensis, pod względem organizacji i sekwencji genów. Co więcej, pierwsze geny (ba1554, bc1531 i bt1364) odpowiednich klastrów są absolutnie konserwatywne (tj. 100% identyczność sekwencji nukleotydów), co sugeruje krytyczną rolę produktu genu w gatunkach Bacillus. Ze względu na swoją lokalizację w tych klastrach genów, ba1554 został błędnie zidentyfikowany jako domniemany regulator transkrypcji3. Jednak analiza sekwencji aminokwasów produktu ba1554 wskazuje, że należy on do rodziny MazG, która ma aktywność pirofosfohydrolazy nukleotydowej i nie jest związana z aktywnością czynnika transkrypcyjnego4,5. Chociaż białka należące do rodziny MazG są zróżnicowane pod względem ogólnej sekwencji i długości, mają wspólną domenę MazG o długości ~100 reszt charakteryzującą się motywem EXXE12-28EXXD ("X" oznacza dowolną resztę aminokwasową, a liczba wskazuje liczbę reszt X).

Domena MazG nie zawsze bezpośrednio odpowiada za określoną aktywność katalityczną. Członek MazG z Escherichia coli (EcMazG) posiada dwie domeny MazG, ale tylko C-końcowa domena MazG jest aktywna enzymatycznie 6. Co więcej, specyficzność substratowa enzymów MazG waha się od niespecyficznych trifosforanów nukleozydów (dla EcMazG) do specyficznych dCTP/dATP (dla MazG związanych z integrynami) i dUTP (dla dUTPaz)6,7,8,9. W związku z tym konieczne są analizy biofizykochemiczne białka BA1554 w celu potwierdzenia jego aktywności NTPazy i rozszyfrowania jego specyficzności substratowej.

Tutaj udostępniamy krok po kroku protokół, który większość laboratoriów bez urządzenia BSL-3 może zastosować, aby scharakteryzować produkt białkowy genu B. cereus bc1531, który jest ortologiem B. anthracis ba1554, na poziomie molekularnym. Krótko mówiąc, rekombinowany BC1531 (rBC1531) uległ ekspresji w E. coli i został oczyszczony za pomocą znacznika powinowactwa. W przypadku eksperymentów krystalograficznych rentgenowskich warunki krystalizacji białka rBC1531 zostały przebadane i zoptymalizowane. Aby ocenić aktywność enzymatyczną rBC1531, aktywność NTPazy monitorowano kolorymetrycznie, aby uniknąć radioaktywnie znakowanych nukleotydów, które były tradycyjnie stosowane. Ostatecznie analizy uzyskanych danych biofizykochemicznych pozwoliły na określenie stanu oligomeryzacji i parametrów katalitycznych rBC1531, a także na uzyskanie danych dyfrakcji rentgenowskiej z kryształu rBC1531.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja i oczyszczanie rekombinowanego białka rBC1531

  1. Przygotowanie plazmidu o ekspresji rekombinowanego białka BC1531 (rBC1531)
    1. Przygotuj genomowe DNA B. cereus10.
    2. Amplifikuj gen bc1531 z matrycy genomowego DNA B. cereus za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), używając starterów do przodu i do tyłu (patrz Lista materiałów) w celu utworzenia odpowiednio miejsc enzymów restrykcyjnych BamHI i Sal10.
    3. Trawić produkt PCR i zmodyfikowany wektor pET49b (pET49bm) przy użyciu BamHI i SalI, zgodnie z opisem11.
    4. Wymieszaj strawiony produkt PCR i wektor (stosunek 3:1) z kroku 1.1.3 przy użyciu ligazy DNA T4 w reakcji 10 μl, zgodnie z opisem11. Inkubować w temperaturze 18 °C przez 30 minut.
    5. Odpipetować 3 μl reakcji ligacji do 50 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli DH5α w probówce. Delikatnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół, a następnie umieść na lodzie na 30 minut. Szok termiczny przez 45 s w temperaturze 42 °C. Dodać 1 ml pożywki Luria-Bertani (LB) i hodować komórki, energicznie wstrząsając (250 obr./min, 37 °C, 45 min).
    6. Pobrać 100 μl przekształconych komórek z kroku 1.1.6 i rozprowadzić je na płytkach LB-agar ze 100 μg/ml kanamycyny (Kan). Inkubować przez ~18 h w temperaturze 37 °C.
    7. Zbierz kolonie za pomocą sterylnej końcówki i hoduj komórki w 3 ml pożywki LB ze 100 μg/ml Kan; energicznie wstrząsnąć (250 obr./min, 37 °C, 18 h).
    8. Przygotuj plazmidowe DNA przy użyciu alkalicznej metody lizy SDS, zgodnie z opisem10.
    9. Potwierdź sekwencję nukleotydów konstruktu ekspresji rBC1531 za pomocą sekwencjonowania DNA12.
  2. Nadekspresja białka rBC1531
    1. Ponownie przekształć szczep E. coli BL21 (DE3) z plazmidem o ekspresji rBC1531, jak opisano w krokach 1.1.5-1.1.6, w celu nadekspresji.
    2. Wybierz kolonię i hoduj ją w 10 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml Kan (LB+Kan); wstrząsać energicznie przez 18 godzin w temperaturze 37 °C.
    3. Zaszczepić 10 ml nocnej hodowli w 1 l pożywki LB+Kan i rosnąć w temperaturze 37 °C, aż OD600 (gęstość optyczna przy 600 nm) osiągnie ~0,7.
    4. Zanurz kulturę w lodowatej wodzie na ~15 minut, aby schłodzić temperaturę do 18 °C i dodaj do kultury izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) o końcowym stężeniu 1 mM w celu ekspresji rekombinowanego białka. Hoduj kulturę w temperaturze 18 °C przez dodatkowe ~16-18 godzin.
  3. Oczyszczanie rBC1531
    1. Zebrać komórki przez odwirowanie (5 000 x g, 4 °C, 30 min). Supernatant należy ostrożnie wyrzucić, aby nie naruszyć pracy komórek. Ponownie zawiesić komórki w 50 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem (PBS) zawierającego 10 mM imidazolu.
    2. Dwukrotnie poddać komórki lizie za pomocą sonikacji na lodzie, aby zapobiec przegrzaniu lizatów komórkowych (czas: 2 min 30 s; cykl wł.: 5 s; cykl wyłączony: 10 s; amplituda: 38%).
    3. Usunąć lizat komórkowy przez odwirowanie (~25 000 x g, 4 °C, 30 min).
    4. Zmieszać 3 ml kulek niklowych i 60 ml PBS zawierającego 10 mM imidazolu i grawitacyjnie przepuścić dodatkowy bufor w celu osadzenia zrównoważonych kulek niklu w szklanej kolumnie chromatograficznej o wymiarach 2,5 x 10 cm.
    5. Odpipetować do przeniesienia supernatantu z etapu 1.3.3 do kolumny ze wstępnie zrównoważonymi kulkami niklu i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny na kołowrotku z niską prędkością (~20 obr./min).
    6. Pozostawić supernatant do grawitacyjnego spłynięcia i trzykrotnie przemyć kulki niklu w kolumnie 100 ml PBS zawierającego 10 mM imidazolu.
    7. Elute białko rBC1531 poprzez zastosowanie 4 x 5 ml PBS zawierającego 250 mM imidazolu.
    8. Weź 15 μl elucji z kroku 1.3.7 i uruchom ją na 15% SDS-PAGE. Zwizualizuj pasma białkowe na żelu za pomocą Coomassie blue staining10.
  4. Usuwanie znaczników powinowactwa białka rBC1531 przez proteolizę trombiny
    1. Odpipetować frakcje do probówki dializacyjnej (masa cząsteczkowa odcięta: 3 kDa) i umieścić probówkę w zlewce zawierającej 4 litry buforu kompatybilnego z rozszczepianiem trombiny (20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl i 1,5 mM β-merkaptoetanolu) w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Odpipetować frakcje i przenieść je do stożkowej probówki.
    3. Zmierz absorbancję przy 280 nm i oszacuj stężenie białka rBC1531, zgodnie z opisem13.
    4. Weź 50 μg rBC1531 do probówki o pojemności 0,5 ml i dodaj różne ilości trombiny (tj. 2, 1, 0,6 i 0,3 jednostki). Inkubować reakcje rBC1531 i trombiny w temperaturze 20 °C przez ~ 3 godziny, aby określić najmniejszą ilość trombiny wymaganą do rozszczepienia N-końcowego znacznika powinowactwa.
    5. Uruchom reakcje rBC1531 i trombiny na 15% SDS-PAGE i określ najniższą ilość trombiny (np. 0,3 jednostki trombiny na 50 μg rBC1531), która całkowicie trawi N-końcowy znacznik powinowactwa i wytwarza wolny od znaczników rBC1531.
    6. Dodać 10 mg białka rBC1531 i 60 jednostek trombiny do probówki o pojemności 15 ml i inkubować w temperaturze 20 °C przez ~ 3 godziny w celu przeprowadzenia reakcji trombiny-proteolizy.
    7. Zastosuj wzorce filtracji żelowej do kolumny chromatografii wykluczającej wielkość (SEC), aby przygotować wzorcową krzywą mas cząsteczkowych i objętości elucji, zgodnie z opisem13.
    8. Umieścić białko rBC1531 trawione przez trombinę z kroku 1.4.6 w odśrodkowej probówce filtrującej (odcięta masa cząsteczkowa: 3 kDa) i odwirować przy 3 000 g w temperaturze 4 °C do zmniejszenia do objętości mniejszej niż 5 ml.
    9. Nałóż skoncentrowane białko rBC1531 do kolumny SEC i zbierz 60 eluowanych frakcji w 0,5 ml na probówkę13.
    10. Weź 15 μl każdej frakcji, uruchom je na 15% SDS-PAGE i zabarwij żel za pomocą roztworu barwiącego Coomassie (0,15% (w/v) błękitu brylantowego Coomassie, 40% (v/v) metanolu i 10% (v/v) lodowatego kwasu octowego) zgodnie z opisem10.
    11. Odpipetować frakcje zawierające rBC1531 i zebrać je do jednej probówki.

2. Badanie przesiewowe krystalizacji i optymalizacja rBC1531

  1. Warunki przesiewowe krystalizacji białka rBC1531
    1. Zagęścić rBC1531 od kroku 1.4.11 do ~18.5 mg/ml za pomocą odśrodkowej rurki filtracyjnej, jak opisano w kroku 1.4.8.
    2. Dodać 50 μl każdego roztworu do przesiewania krystalizacji (patrz sekcja 2.2)14 do studzienek 96-dołkowych płytek krystalizacyjnych. Umieścić 0,5 μl 18,5 mg/ml roztworu białka rBC1531 na łóżku wypoczynkowym. Wymieszaj roztwór białka z 0,5 μl roztworu studzienki, powtarzając proces dla całej płytki.
    3. Przykryj płytkę przezroczystą folią samoprzylepną. Umieścić 96-dołkowe płytki w temperaturze 18 °C i pozostawić do dyfuzji pary.
    4. Skanuj krople w powiększeniu 20-40X za pomocą mikroskopu świetlnego, aby monitorować tworzenie się kryształów codziennie przez 2-3 tygodnie.
    5. Zbierz dane dyfrakcji rentgenowskiej12 za pomocą otrzymanych kryształów białka rBC1531.
  2. Optymalizacja warunków krystalizacji rBC1531
    1. Przygotować 500 μl wybranego roztworu do wstępnej krystalizacji (np. 0,1 M kakodylanu sodu, pH 6,5 i 1,0 M cytrynianu sodu) i napełnić 24-dołkową płytkę krystalizacyjną dla kropli do siedzenia.
    2. Dodać 0,5 μl roztworu białka rBC1531 o stężeniu 18,5 mg/ml do łóżka siedzącego, wymieszać z 0,5 μl roztworu studzienki i natychmiast przykryć płytkę przezroczystą folią klejącą. Umieścić płytkę w temperaturze 18 °C.
    3. Obserwuj wzrost kryształów pod mikroskopem świetlnym przez tydzień.
    4. Zoptymalizuj różne warunki krystalizacji, zmieniając pH (tj. pH 5,5-6,8) 0,1 M kakodylanu i zmieniając stężenie soli (tj. 0,9-1,2 M) cytrynianu sodu w celu uzyskania pojedynczych kryształów. Monitoruj wzrost kryształów przez ~1 tydzień i zbieraj dane dyfrakcji rentgenowskiej12.

3. Charakterystyka aktywności trifosfatazy nukleozydowej (NTPazy) rBC1531

  1. Walidacja badania kolorymetrycznego zależnego od fosforanów nieorganicznych
    1. Przygotować zapas pirofosforanu (100 mM) i rozcieńczyć go do końcowych stężeń 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50, 100 i 250 μM w 200 μl buforu reakcyjnego (20 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; i 2 mM MgCl2) na zduplikowanych płytkach 96-dołkowych. Użyj pierwszej płytki jako kontrolnej (nie zawiera ona pirofosfatazy). Upewnij się, że druga płytka zawiera pirofosfatazę jako płytkę roboczą, zgodnie z zaleceniami w kroku 3.1.2.
    2. Dodać 0,01 jednostki pirofosfatazy nieorganicznej Saccharomyces cerevisiae (1 μl) do studzienek płytki roboczej i inkubować w temperaturze 20 °C przez 30-60 minut.
    3. Przygotować roztwór kwasu molibdenianowego, mieszając roztwory molibdenianu amonu (0,86% v/v) i kwasu askorbinowego (14% v/v) w stosunku 7:3. Dodać 16 μl roztworu kwasu molibdenianowego zarówno do studzienki roboczej, jak i kontrolnej i odczekać 15 minut.
    4. Odczytaj gęstość optyczną przy 690 nm (OD690nm).
  2. Kolorymetryczny test NTPazy
    1. Przygotować zapas 100 mM substratu trifosforanu nukleozydów (NTP) i rozcieńczyć do pożądanego stężenia (np. 0, 0,2, 4,4, 11, 22, 44, 88 lub 132 μM) w 180 μl buforu do oznaczania (20 mM HEPES, pH 7,4; 150 mM NaCl; i 2 mM MgCl2).
    2. Dodać 20 μg rBC1531 (1,5 mM) i substraty NTP z kroku 3.2.1 do 200 μl na reakcję na 96-dołkową płytkę i pipetować w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Przykryj płytkę pokrywką i umieść ją w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 30 minut w celu przeprowadzenia reakcji hydrolizy substratu.
    3. Przenieść płytkę do łaźni wodnej o temperaturze 70 °C i odstawić na 15 minut, aby zatrzymać reakcje katalityczne, w których pośredniczy rBC1531.
    4. Dodać 0,01 jednostki nieorganicznej pirofosfatazy S. cerevisiae (1 μl) do każdego dołka płytki reakcyjnej (z etapu 3.2.3) i inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 min. Dodać 16 μl roztworu kwasu molibdenianowego do płytki reakcyjnej w celu uzyskania koloru (~15 min). Odczyt przy OD690nm.
    5. Analizuj za pomocą równania Michaelisa-Mentena, zgodnie z opisem12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka białka będącego przedmiotem zainteresowania w tym badaniu rozpoczęła się od przygotowania wystarczającej ilości rekombinowanego białka B. cereus bc1531 (rBC1531), najlepiej więcej niż kilka miligramów. Fragment DNA kodujący białko BC1531 został przygotowany metodą PCR przy użyciu genomowego DNA B. cereus jako matrycy, ponieważ zawiera on geny ortologiczne identyczne z ba1554. rBC1531 ulegał nadekspresji jako rozpuszczalne białko w komórkach E...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad prawdziwymi patogenami są ograniczone ze względu na ograniczenia i przepisy bezpieczeństwa. Alternatywnie, patogeny można badać przy użyciu ewolucyjnie spokrewnionych gatunków niebędących patogenami lub mniej patogennych. Gen ba1554 jest uważany za krytyczny gen u B. anthracis. Na szczęście identyczny gen jest obecny u nieklinicznego B. cereus. Tak więc, bez poważnych obaw dotyczących bezpieczeństwa, rekombinowane białko BC1531 może być stosowane do charakterystyki biofizycznej i en...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zestawy danych dyfrakcji rentgenowskiej zostały zebrane na linii badawczej 7A w Laboratorium Akceleratora Pohang (Korea). Badanie to było wspierane przez Program Badań Podstawowych (Basic Science Research Program) zarządzany przez Narodową Fundację Badawczą Korei (NRF), finansowany przez Ministerstwo Nauki, ICT i Planowania Przyszłości (2015R1A1A01057574 do MH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bacillus cereus ATCC14579Koreańska kolekcja do hodowli tkankowych3624
Zestaw do przygotowania genomowego DNAGeneAll106-101Przygotowanie genomowego DNA
Starter do przoduMacrogenGAAGGATCCGGAAGCAAAAAA
CGATGAAAGATATGCA		em>BamHI strona jest podkreślona
Odwrotny starterMacrogenCTTGTCGACTTATTCTTTCTCT
CCCTCATCAATACGTG		SalI strona jest podkreślona
nPfu-ForteEnzynomicsP410PCR polimeraza
BamHIEnzynomicsR003S
SalIEnzynomicsR009S
pET49bNovagen71463Wektor ekspresji został zmodyfikowany w celu dodania znaczników powinowactwa i miejsc BamHI/SalI10
T4 Ligaza DNAEnzynomicsM001S
Memebrane do dializyThermofisher18265017
Suchy grzejnik blokowyJSRJSBL-02T
LB bulion (Luria-Bertani)Roztwór LPSLB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton, Dickinson and Company
KanamycynaLPS roztwórKAN025
Mini-zestaw przygotowawczyFavorgenFAPDE300Preparat plazmidowego DNA
BL21(DE3) Właściwa komórkaNovagen69450-3CN
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)Odczynniki Fisher50-213-378
Chlorek soduDaejung7548-4100Materiał PBS Chlorek
potasuDaejung6566-4405Materiał PBS
Fosforan potasuBio Basic IncPB0445Materiał PBS
Fosforan soduBio Basic IncS0404Materiał PBS
ImidazolBio Basic IncIB0277
SonicatorSonics VCX130
Ni-NTA agarosQiagen30210Koralik niklowy
RotatorFinepcrAG
Precision Plus Białko Dwukolorowe standardyBio-rad1610374SDS-PAGE wzorzec białkowy
Coonmassie Brilliant Blue R-250Fisher BioReagentsBP101-25Roztwór barwiący Coomassie
Alkohol metylowySubstancja chemiczna SamchunM0585Roztwór barwiący Coomassie
Kwas octowyDaejung1002-4105Roztwór barwiący Coomassie
Memebrane do dializyThermofisher68035
2-merkaptoetanolSigma-aldrichM6250
TrombinMerckmillipore605157-1KUCNPrzygotować podwielokrotności 20 μ L (1 jednostka na μ L) i przechowywać w temperaturze 70 stopni; C i rozmrozić przed użyciem
Superdex 200 16/600General Electric28989335Chromatografia wykluczająca rozmiar
Standard filtracji żelowejBio-rad151-1901
Filtr odśrodkowyAmiconUFC800396
Płytki krystralizacyjneHampton researchHR3-08396-dołkowa płyta opadająca
do siedzenia Podstawowy pakiet JCSG I-IVQiagen130924-130927Roztwór zabezpieczający krystalizację
MikroskopNikonSMZ745T
Płyty CryschemHampton researchHR3-15824-dołkowa siedząca płytka kroplowa
Nieorganiczna pirofosfatazaSigma10108987001
Roztwór molibdenianu amonuSigma13106-76-8
Kwas L-askorbinowySigma50-81-7
Podłoże NTPStartagene200415-51
SpektrofotometrBiotekSynergyH1mikropłytek
GraphPad Prism 5GraphPadPrism 5 do okna
< Wektor ekspresyjny czytnik

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
  2. Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
  3. Deli, A., et al. LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis. FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).
  4. Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. MazG -- a regulator of programmed cell death in Escherichia coli. Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).
  5. Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. House cleaning, a part of good housekeeping. Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).
  6. Lee, S., et al. Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response. J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).
  7. Moroz, O. V., et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential "house-cleaning" functions. J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).
  8. Robinson, A., et al. A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype. Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).
  9. Moroz, O. V., et al. The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the "basic module" for dimeric d(C/U)TPases. J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).
  10. Green, M., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory Manual. 1, John Inglis. (2012).
  11. Brown, T. A. Gene cloning an introduction. , Chapman & Hall. (1986).
  12. Kim, M. I., Hong, M. Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase. Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).
  13. Sheehan, D. Physical biochemistry: Principles and applications. , A John Wiley & Sons. (2009).
  14. Lesley, S. A., Wilson, I. A. Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics. J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).
  15. Jeon, Y. J., et al. Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase. J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Recombinant Protein ExpressionProtein CrystallizationEnzymatic KineticsNickel Affinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyThrombin DigestionSitting Drop Vapor DiffusionX ray CrystallographySpectrophotometric AnalysisBacillus Cereus

Powiązane artykuły