Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55583

⸱

29 maja 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Affiliated Dermatology & Affiliated Laboratories, Midwestern University Osteopathic Postdoctoral Training Institute, Midwestern University, 2Department of Microbiology & Immunology, Arizona College of Osteopathic Medicine, Midwestern University, 3Biomedical Sciences Program, College of Health Sciences, Midwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

Guzy skórne są często usuwane po operacji mikrograficznej Mohsa. Opisano tutaj protokół, który umożliwia personelowi pomocniczemu klinicznemu skuteczne przetwarzanie i przechowywanie próbek guzów skóry (np. raka płaskonabłonkowego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka) do dalszych zastosowań laboratoryjnych bez zakłócania operacji klinicznych.

Streszczenie

Częstość występowania raka skóry (np. raka płaskonabłonkowego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka) wzrasta w ciągu ostatnich kilku lat. Oczekuje się, że równolegle będzie istniało zapotrzebowanie na próbki nowotworów skóry do badań biomedycznych. Dostępność tkanek jest jednak ograniczona ze względu na koszty utworzenia biorepozytorium oraz brak dostępnych protokołów pobierania próbek klinicznych, które nie kolidują z operacjami klinicznymi. Ustanowiono protokół pobierania i przetwarzania próbek krwi i śliny guza skóry oraz związanych z nim próbek krwi i śliny, który ma minimalny wpływ na rutynowe procedury kliniczne w dniu operacji Mohsa. Próbki guza są pobierane i przetwarzane od pacjentów poddawanych pierwszej warstwie operacji Mohsa z powodu potwierdzonych biopsją nowotworów złośliwych skóry przez histotechnologa Mohsa. Sąsiednia normalna tkanka jest pobierana w momencie chirurgicznego zamknięcia. Dodatkowe próbki, które można pobrać, to wymazy z krwi pełnej i policzkowe. Wykorzystując próbki tkanek, które zwykle są wyrzucane, stworzono biorepozytorium, które oferuje kilka kluczowych zalet dzięki temu, że znajduje się w klinice w porównaniu z warunkami laboratoryjnymi. Obejmują one szeroki zakres pobieranych próbek; dostęp do zanonimizowanych kart pacjentów, w tym raportów patologicznych; oraz, w przypadku typowego dawcy, dostęp do dodatkowych próbek podczas wizyt kontrolnych.

Wprowadzenie

Badania nad rakiem i biomarkerami opierają się na dostępie do wysokiej jakości próbek tkanek ludzkich, a ich ograniczona podaż utrudnia prowadzenie prac badawczych1,2. Wiele badań dermatologicznych jest ograniczonych przez niewystarczającą ilość, zmienną jakość oraz koszty związane z wykorzystaniem ludzkich tkanek. Koszt stworzenia dużego, wyspecjalizowanego biobanku szacuje się na około dwa miliony dolarów3, a wydatki te sprawiają, że korzystanie z ludzkich tkanek jest nieosiągalne dla wielu badaczy. Ponadto proces pozyskiwania i przechowywania próbek badawczych niesie ze sobą ryzyko zakłócenia operacji klinicznych i opóźnienia opieki nad pacjentem, jeśli nie zostanie przeprowadzony z należytą starannością. Utworzono kosztowo efektywne repozytorium biologiczne w ramach kliniki, które koncentruje się na próbkach raka skóry, zgodnie z zalecanymi najlepszymi praktykami oraz walidacją próbek4,5,6.

Niniejszy protokół został opracowany w klinice dermatologicznej, w której wykonuje się dużą liczbę mikrochirurgicznych operacji Mohsa w celu usunięcia raka kolczystokomórkowego (SCC), raka podstawnokomórkowego (BCC) oraz czerniaka skóry. Ochotniczy dawcy mogą być rekrutowani z tej populacji pacjentów. Ważne jest, aby biobank został utworzony w miejscu pobierania materiału, co pozwala na szybkie pozyskanie tkanek i krwi od pacjentów, którzy wyrazili zgodę, bez opóźniania leczenia. Gromadzenie próbek w tej samej klinice minimalizuje różnice w technikach pobierania oraz zmienność jakości próbek, co może być problematyczne w przypadku dalszych analiz7,8.

Celem techniki mikrochirurgii Mohsa jest zapewnienie usunięcia całej tkanki nowotworowej przy jednoczesnym zachowaniu jak największej ilości zdrowej tkanki. Procedura polega na stopniowym usuwaniu cienkich warstw tkanki guza. Każda kolejna warstwa jest badana histologicznie (po kriosekcjonowaniu tkanki guza i przeprowadzeniu barwienia H&E) przez dermatologa w celu ustalenia, czy cała tkanka nowotworowa została usunięta. Wycięcie i badanie kolejnych warstw tkanek odbywa się w czasie, gdy pacjent pozostaje w gabinecie. Technikę tę uznaje się za najlepszą opcję leczenia SCC9. Na tym etapie rana zostaje zamknięta, a w celu poprawy gojenia i efektu kosmetycznego często wycina się sąsiadującą tkankę prawidłową (ANT). Zatem ta procedura chirurgiczna usuwania guza jest idealnie dostosowana do pobierania histologicznie scharakteryzowanej tkanki do przyszłych badań.

Procedura pozyskiwania próbek tkanki nowotworowej, sąsiadującej tkanki prawidłowej, śliny oraz krwi została zaprojektowana tak, aby w minimalnym stopniu wpływać na codzienne obowiązki personelu (Rycina 1). Asystenci medyczni pobierają krew podczas przygotowywania pacjenta do zabiegu. Po zakończeniu procedury Mohsa histotechnolog wykonuje dodatkowe preparaty histologiczne z próbki i przekazuje tkankę do biorepozytorium. Koszty związane z utworzeniem biorepozytorium obejmują zakup zamrażarek do kriokonserwacji, wydzielenie niewielkiej przestrzeni laboratoryjnej oraz opracowanie programu do śledzenia inwentarza.

Przebieg pobierania próbek; schemat blokowy; rejestracja pacjenta, wymaz, pobranie krwi, wycięcie guza.
Rycina 1: Kolejność pobierania próbek i personel odpowiedzialny. Po zarejestrowaniu pacjenta i uzyskaniu jego zgody, asystent medyczny pobiera wymaz z policzka oraz krew. Następnie dermatolog i asystent medyczny wycinają guz i zamykają ranę, podczas czego pobierane są odpowiednio próbki SCC i ANT. Wyznaczony technik laboratoryjny przetwarza krew oraz wykonuje sekcjonowanie próbek SCC i ANT w celu hodowli tkankowej, konserwacji i wprowadzenia do biorepozytorium. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Różnorodność pobranych próbek umożliwia zastosowanie wielu podejść eksperymentalnych (Rysunek 2). Próbki pobrane od pacjenta to wymazy z policzków (w razie potrzeby można również pobrać ślinę), krew pełna oraz wycięta tkanka. Wymazy z policzków i próbka krwi pełnej są przechowywane bez obróbki do genotypowania i dopasowania tkanek. Krew pełną rozdziela się na frakcje leukocytów (WBC) i osocza do dalszych analiz. Po opracowaniu metodą Mohsa zamrożony guz jest umieszczany bezpośrednio w ciekłym azocie, a następnie przenoszony do zamrażarki -80 °C. Świeże, żywe próbki tkanki nowotworowej oraz ANT są hodowane z zastosowaniem modyfikacji wcześniejszych technik10,11, a następnie krio konserwowane. Podczas pobierania liczba próbek każdego typu jest zapisywana w arkuszu kalkulacyjnym przed wprowadzeniem do programu śledzenia zapasów, aby ułatwić dokładne przetwarzanie (Tabela 1).

Schemat przetwarzania próbek pacjentów w mikrochirurgii Mohsa, wirowanie, analiza histologiczna.
Rysunek 2: Schemat pobierania i przetwarzania próbek w klinicznym biorepozytorium. Od pacjenta pobiera się wymaz z policzka oraz próbkę krwi, które są przechowywane do późniejszego genotypowania i dopasowania tkanek. Krew pełna jest dalej przetwarzana w celu izolacji białych krwinek (WBC) i analizy CTC, a także w celu pobrania osocza i analizy biopsji płynnej. Tkanka wycięta podczas procedury Mohsa jest przetwarzana histologicznie do celów diagnostycznych, po czym preparaty histologiczne mogą być wykorzystane eksperymentalnie do dalszych analiz immunohistochemicznych. Jeśli wycięta próbka tkanki jest wystarczająco duża, część świeżej tkanki jest pobierana i sekcjonowana w celu izolacji białek i RNA oraz do ustanowienia linii komórkowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Data pobrania:
Pacjent 1Pacjent 2Pacjent 3Pacjent 4Pacjent 5
Inicjały i data urodzenia
Kolor oczu
Rodzaj próbki
Miejsce pobrania próbki
Ślina
Krew pełna
Osocze
Żywa tkanka guza
Żywa tkanka prawidłowa
Guz (metoda Mohsa), ciekły azot
Tkanka prawidłowa, ciekły azot
Preparaty histologiczne

Tabela 1: Lista kontrolna do rejestracji pobrania próbek. Dane śledzone i zapisywane przy każdej pobranej próbce obejmują inicjały pacjenta, datę urodzenia i kolor oczu (do typowania skóry), a także miejsce pobrania materiału. Liczba próbek śliny, objętości pobranej krwi oraz liczba pobranych żywych i utrwalonych próbek tkanek są również zapisywane jako referencje do późniejszego przydziału. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Aby zwalidować procedury pobierania próbek, każdy rodzaj próbki został przetestowany w dalszych zastosowaniach. Wykorzystując modyfikacje poprzednich technik12, guz oraz ANT zostały z powodzeniem wykorzystane do izolacji białek i RNA, a potencjalnie mogą być użyte do izolacji DNA. Żywiołowe eksplantaty przygotowane z przekrojów tkankowych zostały ocenione za pomocą mikroskopii, natomiast przechowywane preparaty histologiczne wykorzystano do immunohistochemii i immunofluorescencji.

Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, możliwe jest rozszerzenie tego modelu na inne kliniki dermatologiczne, inne typy nowotworów (takie jak czerniak) oraz inne specjalizacje i praktyki chirurgiczne w celu pozyskiwania próbek tkanek ludzkich do wieloaspektowych badań nad nowotworami u ludzi. W przypadku innych praktyk prawdopodobnie konieczne będą niewielkie modyfikacje tego protokołu, lecz w zasadzie jest on możliwy do zastosowania w każdej praktyce chirurgicznej, w której rutynowo utylizuje się próbki pobrane od pacjentów w toku leczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na próbkach tkanek ludzkich zostały zatwierdzone przez Western IRB (Protokół WIRB #20142461). Jedynym kryterium pobierania tkanek do tych procedur jest potwierdzone biopsją diagnoza SCC. W pierwotnym protokole IRB nie określono żadnych kryteriów wykluczenia, ale nie wykorzystano próbek od pacjentów ze stwierdzoną chorobą zakaźną przenoszoną przez krew. Świadomą zgodę uzyskano przed pobraniem tkanki skórnej, krwi i śliny. Midwestern Institutional Review Board zatwierdziła prace walidacyjne z próbkami biorepozytorium klinicznego na Uniwersytecie Środkowo-Zachodnim (AZ#807).

1. Przetwarzanie tkanki nowotworowej skóry

UWAGA: To ma być wykonane przez histotechnologa Mohsa.

  1. Przetwarzanie tkanki świeżego raka płaskonabłonkowego (SCC) na RNA i hodowlę eksplantatów
    1. Po wycięciu tkanki przez chirurga Mohsa, przed dalszym przetwarzaniem należy pobrać próbkę tkanki o wielkości od 10 do 50 mg (≥10 mm3) ze środka wierzchołkowej strony tkanki podczas relaksacji (czyli procesu manipulowania tkanką, aby mogła leżeć płasko na szkiełku) przed dodatkowym przetwarzaniem.
      UWAGA: Jest to możliwe tylko wtedy, gdy guz jest wystarczająco duży, aby umożliwić usunięcie próbki o wielkości 10-50 mg (≥10 mm2) przed oceną histologiczną, która jest częścią procedury Mohsa. Jeśli guz nie jest wystarczająco duży, aby umożliwić usunięcie co najmniej 2mm3, nie przystępuj do przetwarzania RNA (pomiń krok 5).
    2. Przenieść żywotną tkankę do znakowanej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę hodowlaną (mieszanina 1:1 DMEM:Ham's F-12, 25 mM HEPES, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) za pomocą pęsety i upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w pożywce. Przechowywać probówkę w temperaturze 4 °C przed dalszą obróbką.
    3. Tkankę należy wykorzystać do izolacji RNA i analizy ekspresji (patrz krok 5) i/lub do założenia kultury eksplantatów (patrz krok 6) w ciągu 24 godzin.
    4. Umieść pozostałą część próbki guza, która została usunięta od pacjenta (krok 1.1.1) na uchwycie na tkanki kriostatu (lub "chuck"). Zanurzyć tkankę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), zamrażając tkankę w posiadaczu, aby umożliwić zakończenie badań histologicznych metodą Mohsa i przygotowanie dodatkowych szkiełek histologicznych do analizy eksperymentalnej.
  2. Przygotowanie preparatów histologicznych
    1. Wytnij skrawki tkanki o grubości 7 μm za pomocą kriostatu i utwórz dwa (lub więcej) szkiełka dla każdej próbki guza. Upewnij się, że każdy szkiełko zawiera do trzech sekcji całego guza.
      UWAGA: Jeden z dwóch preparatów zostanie wybarwiony przy użyciu H&E przez histotechnologa Mohsa, a dodatkowe szkiełka mogą być przetworzone za pomocą analizy IF, IHC lub FISH.
    2. Umieść szkiełka w acetonie na 1-2 sekundy, aby utrwalić tkankę. Odłóż te szkiełka na bok do wyschnięcia. Nie należy barwić szkiełka ani szkiełka nakrywkowego H&E, które ma być wykorzystane do przyszłej analizy immunofluorescencji (IF), immunohistochemii (IHC) lub hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH), w zależności od protokołu eksperymentalnego.
  3. Przetwarzanie tkanek po Mohsie
    1. Po zakończeniu przetwarzania metodą Mohsa (kroki 1.1-1.2) należy pracować w komorze kriostatu i podważyć próbkę z podłoża do zatapiania w kriogenicznym roztworze i umieścić tkankę w oznakowanej probówce kriogenicznej.
    2. Umieścić oznakowaną fiolkę w ciekłym azocie przed rozmrożeniem tkanki. Jeżeli próbki mają być wykorzystane do analizy białka i/lub DNA, mogą one zostać przeniesione do ciekłego azotu lub zamrażarki o temperaturze -80 °C w ciągu kilku minut w celu przechowywania do przyszłej analizy ekspresji białek i mutacji DNA (patrz kroki 4-5).
      UWAGA: Jeśli pożądane jest nienaruszone RNA z próbki po Mohsie, ważne jest, aby próbka była zamrożona podczas usuwania z pożywki kriozatapiającej. Jeśli na tym etapie nie zostanie zachowana szczególna ostrożność, próbka po badaniu Mohsa powinna być zarezerwowana do analizy białka i/lub DNA.
  4. Przetwarzanie świeżych mrówek
    1. W momencie zamknięcia Mohsa uzyskaj ANT od chirurga Mohsa.
    2. Usunąć równą lub większą ilość ANT, jaka została pobrana z próbki SCC (patrz wyżej) ze strony wierzchołkowej normalnej tkanki i przenieść ją do znakowanej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę hodowlaną (mieszanina 1:1 DMEM:Ham's F-12 uzupełniona 25 mM HEPES, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) za pomocą pęsety.
    3. Całkowicie zanurzyć tkankę w tej samej pożywce hodowlanej i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu późniejszego przetwarzania (patrz kroki 4-6).

2. Przetwarzanie krwi, śliny i wymazów z policzka

  1. Uzyskać około 10 ml krwi w probówkach do pobierania EDTA przez nakłucie żyły.
  2. Przenieść krew z probówek zbiorczych do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 lub 50 ml. Usunąć około 200 μl do probówki kriogenicznej o pojemności 1,5 ml, unikając pęcherzyków; Próbkę krwi pełnej należy przechowywać w temperaturze -80 °C, aby w razie potrzeby wykorzystać ją do przyszłego genotypowania i dopasowania tkanek.
    1. Odwiruj pozostałą krew o masie 1 000 x g przez 30 minut i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami, aby pobrać frakcję osocza.
    2. Podwielokrotnić osocze na porcje o wielkości 1 ml w probówkach kriogenicznych o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania podczas przyszłych analiz biopsji płynnej.
  3. Użyj sterylnego wacika, aby uzyskać wymaz z policzka sample i przechowuj wymazówkę w sterylnej probówce w temperaturze pokojowej.
  4. W razie potrzeby pobrać próbkę śliny i przechowywać w sterylnej probówce w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Próbki te mogą być wykorzystane do przyszłego genotypowania i dopasowania tkanek, jeśli zajdzie taka potrzeba.

3. Ewidencja próbek

  1. Przesyłanie informacji z listy kontrolnej próbek pobranych od pacjentów do bazy danych biorepozytorium. Dołącz informacje o pacjencie i diagnozę z karty pacjenta.
  2. Wydrukuj etykiety z kodem kreskowym dla każdej próbki i zapisz ją w bazie danych, aby połączyć każdą pobraną próbkę z danymi pacjenta.
  3. Rejestruj rozmieszczenie próbek pozbawionych elementów pozwalających na identyfikację w bazie danych biorepozytorium przed przekazaniem próbek do laboratorium badawczego.

4. Izolacja białek i analiza Western Blot

  1. Umieścić każdą próbkę tkanki (SCC i/lub ANT) w fiolce zawierającej 500 μl buforu do lizy komórek zawierającego inhibitory proteazy na 100 mg tkanki w celu lizy tkanki.
    UWAGA: Użyliśmy buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA), składającego się z 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% deoksycholanu sodu, 1,0% NP-40 i 0,1% SDS. Można stosować inne do lizy komórek.
  2. Homogenizować tkanki za pomocą homogenizatora tkankowego przez 5 minut w odstępach 20 s w temperaturze 4 °C. Wirować próbki w temperaturze 21 000 x g i 4 °C przez 20 minut i zebrać supernatant zawierający białko do świeżej probówki. Ponownie odwirować supernatant w tych samych warunkach i zebrać końcowy supernatant do świeżej probówki.
  3. Elektroforeza 30-50 μg białka z każdej próbki przy użyciu 4-20% żelu gradientowego SDS-poliakrylamidowego. W razie potrzeby zabarwić żel kolorem Coomassie Blue, aby uwidocznić pasma białkowe.
  4. Jeśli potrzebna jest analiza Western blot białek eksprymowanych, należy przenieść białka z żelu do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) zgodnie ze standardowymi protokołami. Po przeniesieniu Ponceau wybarwia membranę PVDF, aby w razie potrzeby uwidocznić pasma białkowe.
  5. Zablokuj błonę PVDF i sondę, aby wykryć interesujące białka zgodnie ze standardowymi protokołami. Należy stosować przeciwciała pierwszorzędowe specyficzne dla białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania, wraz z odpowiadającymi im przeciwciałami drugorzędowymi specyficznymi dla przeciwciał pierwszorzędowych, w stężeniach zalecanych przez producenta do analizy Western blot.
  6. Wystaw sondowaną membranę za pomocą podłoża chemiluminescencyjnego i zobrazuj membranę za pomocą systemu obrazowania.

5. Izolacja RNA i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR)

  1. Natychmiast umieść świeże próbki tkanek (SCC i/lub ANT) w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej roztwór stabilizujący RNA, a próbki tkanek po Mohsie umieść w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej zamrożony roztwór do przemiany tkankowej, postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona. Próbki te należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  2. Pobrać próbki RNA z temperatury -80 °C i rozmrozić na lodzie. Przenieść tkankę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml buforu do ekstrakcji RNA (tiocyjanian fenolu/guanidyny) na 50-100 mg tkanki.
  3. Poddać lizie tkanki za pomocą homogenizatora tkankowego. Przeprowadzić sześć cykli homogenizacji, po których następuje okres chłodzenia próbki; każdy cykl składa się z 20 s homogenizacji w temperaturze 4 °C i 40-sekundowego okresu chłodzenia. Po homogenizacji próbkę inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać 0,2 ml chloroformu na 1 ml buforu do ekstrakcji RNA i energicznie wstrząsać probówką ręcznie przez 15 s. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Wirować próbki w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut. Usunąć fazę wodną próbki i umieścić ją w nowej probówce o pojemności 1,5 ml.
  6. Dodać 0,5 ml 100% izopropanolu na 1 ml buforu do ekstrakcji RNA użytego w kroku 5.2 do fazy wodnej i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jeśli przewiduje się, że wydajność RNA będzie niska (tj. początkowa objętość tkanki jest mniejsza niż 10 mg), próbki można wytrącić przez noc w temperaturze -80 °C. Dodatkowo, podczas etapu wytrącania izopropanolu można dodać 5 μg glikogenu wolnego od RNaz na 500 μl buforu do ekstrakcji RNA w celu poprawy wydajności RNA.
  7. Wirować próbkę w temperaturze 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Usunąć supernatant i przemyć osad 1 ml 75% etanolu.
  8. Krótko wymieszać próbkę, a następnie wirować ją w temperaturze 7 500 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Wyrzucić umyte płuczki i suszyć granulki na powietrzu przez 5-10 minut.
  9. Zawiesić osad RNA w 20 μl wody wolnej od RNaz.
    1. W razie potrzeby oczyść każdą próbkę RNA za pomocą zestawu do czyszczenia RNA zgodnie z zaleceniami producenta.
      UWAGA: Małe RNA zostaną utracone z próbki, jeśli ten krok zostanie wykonany.
  10. Elektroforeza próbki o wielkości 1 μg przy użyciu 1,2% żelu agarozowego formaldehyd-MOPS w celu analizy jakości RNA.
    UWAGA: Alternatywnie należy przeanalizować próbki za pomocą bioanalizatora, aby uzyskać numer RIN13.
  11. Odwrotna transkrypcja RNA do cDNA przy użyciu protokołu odwrotnej transkrypcji do analizy qPCR docelowych mRNA (lub miRNA) będących przedmiotem zainteresowania.

6. Tkankowe kultury eksplantatów

  1. Wysterylizuj wyciętą tkankę przed hodowlą, zanurzając tkankę w 70% etanolu.
  2. Umieść tkankę na szkiełku lub szalce i dodaj tyle pożywki hodowlanej (mieszanina 1:1 DMEM: Ham's F-12 uzupełniona 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IU / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny), aby pokryć tkankę (aby zapobiec wysuszeniu tkanki). Ostrożnie pokrój tkankę na fragmenty (<1 mm3) za pomocą ostrza skalpela.
  3. Przenieść fragmenty tkanek do 35-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej i dodać około 20 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na wierzch każdego fragmentu.
  4. Pozostaw naczynie otwarte w okapie hodowlanym na 20-30 minut lub do prawie wyschnięcia.
  5. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej (mieszanina 1:1 DMEM:Ham's F-12 uzupełniona 10% FBS, 25 mM HEPES, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny) do każdej szalki i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Subkultura lub subklonuj kultury, jeśli to konieczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tumor oraz ANT zostały z sukcesem wykorzystane w izolacji białek i przetestowane metodą Western blotting. Jak pokazano na Rysunku 3, markery raka płaskonabłonkowego skóry (Muc114, FHL-115 oraz p4016,17) mogą być wykrywane w próbkach pacjentów pobranych i przechowywanych w naszym klinicznym biorepozytorium.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zgodnie z wiedzą autora, niniejszy protokół jest pierwszym tego rodzaju rozwiązaniem koncentrującym się na klinicznym pozyskiwaniu próbek tkanki skórnej w sposób kosztowo efektywny i szybki. Pacjenci poddawani mikrochirurgii Mohsa są zazwyczaj planowani w określonych blokach czasowych, a pobieranie próbek ogranicza się do tych okresów. Proces zbierania próbek wymaga zaangażowania asystenta medycznego opiekującego się pacjentem, histotechnika specjalizującego się w metodzie Mohsa, który przetwarza próbki guza, oraz wyznac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z Midwestern University College of Health Sciences Research Facilitation Grant, przyznany EEH, oraz Midwestern University Office of Research and Sponsored Programs Intramural Grant, przyznany KJL. Dodatkowe wsparcie zostało zapewnione przez Affiliated Laboratories i Affiliated Dermatology. Dziękujemy Sarah Potekhen, Jamie Barto, Stefani Fawks, Cody'emu Jordingowi, Stacie Schimke, Heather Kissel i Ali Zaidi za ich pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BD Vacutainer Plastikowe probówki do pobierania krwi z K3EDTAThermoFisher Scientific02-685-2B
Mikroskopia elektronowa Sciences Ostrza o podwójnej krawędziThermoFisher Scientific50-949-411
Zakrzywione średniopunktowe kleszcze ogólnego przeznaczeniaThermoFisher Scientific16-100-110
Premium Probówkido mikrowirówekThermoFisher Scientific05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratynocyte MediumThermoFisher ScientificNC9791321
Mikroskopia elektronowa Tissue TEK OCT CompoundThermoFisher Scientific50-363-579
Leica CM1950 CryostatLeica Biosystems14047743909
Matowe szkiełka mikroskopoweThermoFisher Scientific12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H& E Zestaw do barwienia sekcji mrożonychThermoFisher Scientific99-900-01
Probówki kriogeniczne do długotrwałego przechowywaniaNalgene ThermoFisher Scientific03-337-7X
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 mlThermoFisher Scientific14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab ThermoFisher ScientificNC9679349
Cell Signaling Technology 10x bufor RIPAThermoFisher Scientific50-195-822
proteazy i fosfatazy HaltThermoFisher ScientificPI78443
Mikrowirówka Eppendorf 5424RThermoFisher Scientific05-401-203
Akumulatorowy homogenizatordo granulek MorterThermoFisher Scientific12-141-3
Tłuczek do peletów bez RNAzyThermoFisher Scientific121-141-364
Forma Inkubator SteriCycle CO2ThermoFisher Scientific13-998-089
Hyklonowa płodowa surowica bydlęcaThermoFisher ScientificSH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12-634-028
Gibco Penicylina-StreptomycynaThermoFisher Scientific15140148
Gibco 1 M HepesThermoFisher Scientific15-630-130
Hodowla komórek Nunc 35 mm z odpowietrznikiemThermoFisher Scientific1256591
Klon przeciwciała monoklonalnego anty-CFH OX-24AbnovaMAB12583
Anti-p40 (p63 delta) przeciwciałoAbnovaABX-144A Przeciwciało
anty MUC-1Santa Cruz Biotechsc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246)AbcamAb63568
Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11034
Alexa Fluor 568 Sondymolekularne Phallodin A12380
ProLong Gold Antifade Mountant zsondami molekularnymi DAPI P36941
Mikroskop Zeiss Axio Imager Z1 z kamerą AxiocamZeiss4300009901
Olympus IX51 kontrast fazowy z kamerą DP72OlympusIX511F3
Koktajl inhibitorów

Bibliografia

  1. Baker, M. Biorepositories: Building better biobanks. Nature. 486, 141-146 (2012).
  2. Ambrosone, C. B., Nesline, M. K., Davis, W. Establishing a cancer center data bank and biorepository for multidisciplinary research. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 15, 1575-1577 (2006).
  3. Baird, P. M., Gunter, E. W., Vaught, J. Building a biobank. Biopreserv Biobank. 14, 87-88 (2016).
  4. National Cancer Institute. , Available from: http://biospecimens.cancer.gov/practices (2016).
  5. Caixeiro, N. J., Lai, K., Lee, C. S. Quality assessment and preservation of RNA from biobank tissue specimens: a systematic review. J Clin Pathol. 69, 260-265 (2016).
  6. Campbell, L. D., et al. Development of the ISBER best practices for repositories: Collection, storage, retrieval and distribution of biological materials for research. Biopreserv Biobank. 10, 232-233 (2012).
  7. Neumeister, V. M. Tools to assess tissue quality. Clin Biochem. 47, 280-287 (2014).
  8. Vaught, J., et al. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J Natl Cancer Inst Monogr. 2011, 1-7 (2011).
  9. Fu, T., Aasi, S. Z., Hollmig, S. T. Management of high-risk squamous cell carcinoma of the skin. Curr Treat Options Oncol. 17, (2016).
  10. Rasmussen, C., Thomas-Virnig, C., Allen-Hoffmann, B. L. Classical human epidermal keratinocyte cell culture. Methods Mol Biol. 945, 161-175 (2013).
  11. Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. Cancer cell culture: Methods and protocols. , Humana Press. 151-159 (2011).
  12. Berglund, S. R., Schwietert, C. W., Jones, A. A., Stern, R. L., Lehman, J., Goldberg, Z. Optimized methodology for sequential extraction of RNA and protein from small human skin biopsies. J Invest Dermatol. 127, 349-353 (2007).
  13. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 7, 1-14 (2006).
  14. Cooper, H. L., et al. Expression and glycosylation of MUC1 in epidermolysis bullosa-associated and sporadic cutaneous squamous cell carcinomas. Br J Dermatol. 151, 540-545 (2004).
  15. Riihila, P. M., et al. Complement factor H: a biomarker for progression of cutaneous squamous cell carcinoma. J Invest Dermatol. 134, 498-506 (2014).
  16. Ha Lan, T. T., et al. Expression of the p40 isoform of p63 has high specificity for cutaneous sarcomatoid squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 831-838 (2014).
  17. Alomari, A. K., Glusac, E. J., McNiff, J. M. p40 is a more specific marker than p63 for cutaneous poorly differentiated squamous cell carcinoma. J Cutan Pathol. 41, 839-845 (2014).
  18. Qiao, B., Johnson, N. W., Gao, J. Epithelial-mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma triggered by transforming growth factor-beta1 is Snail family-dependent and correlates with matrix metalloproteinase-2 and -9 expressions. Int J Oncol. 37, 663-668 (2010).
  19. Vaught, J. Developments in biospecimen research. Br Med Bull. 114, 29-38 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pr bki guz w sk rnychchirurgia Mohsapobieranie tkanekizolacja osocza krwiekstrakcja RNAanaliza Western blotelektroforeza elowaczenie z dokumentacj pacjent wopracowywanie p ynnej biopsji
Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.