Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym

13.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55586

⸱

8 kwietnia 2017

 ,  ,  , 
1Cancer & Stem Cell Biology Programme, Duke-NUS Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Opisana tutaj technika genotypowania, która łączy reakcję łańcuchową fluorescencyjnej polimerazy (PCR) z elektroforezą żelu kapilarnego, pozwala na wysokoprzepustowe genotypowanie klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Omija ograniczenia, z jakimi borykają się inne techniki genotypowania, i jest bardziej opłacalna niż metody sekwencjonowania.

Streszczenie

Rozwój programowalnych narzędzi do edycji genomu ułatwił wykorzystanie genetyki odwrotnej do zrozumienia ról określonych sekwencji genomowych w funkcjonowaniu komórek i całych organizmów. Przyczyna ta została ogromnie wsparta przez niedawne wprowadzenie systemu CRISPR/Cas9 – wszechstronnego narzędzia, które pozwala naukowcom manipulować genomem i transkryptomem w celu, między innymi, wybijania, powalania lub wbijania genów w ukierunkowany sposób. W celu wyeliminowania genu, pęknięcia dwuniciowe za pośrednictwem CRISPR/Cas9 rekrutują niehomologiczny szlak naprawy DNA łączący się z końcem, aby wprowadzić powodującą przesunięcie ramki insercji lub delecję nukleotydów w miejscu pęknięcia. Jednak pojedynczy przewodnik RNA może powodować niepożądane efekty poza celem i aby je wykluczyć, konieczne jest użycie wielu przewodników RNA. Ta mnogość celów oznacza również, że wymagane są zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe klonów, co z kolei wymaga zastosowania wydajnej techniki wysokoprzepustowej do genotypowania klonów z nokautem. Obecne techniki genotypowania albo mają nieodłączne ograniczenia, albo wiążą się z wysokimi kosztami, co sprawia, że nie nadają się do celów o wysokiej przepustowości. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół stosowania fluorescencyjnego PCR, który wykorzystuje genomowe DNA z surowego lizatu komórkowego jako matrycę, a następnie rozpuszczanie fragmentów PCR za pomocą kapilarnej elektroforezy żelowej. Technika ta jest wystarczająco dokładna, aby rozróżnić jedną różnicę w parach zasad między fragmentami, a zatem jest odpowiednia do wskazania obecności lub braku przesunięcia ramki w sekwencji kodującej docelowego genu. Ta precyzyjna wiedza skutecznie wyklucza konieczność sekwencjonowania potwierdzającego i pozwala użytkownikom zaoszczędzić czas i koszty w procesie. Co więcej, technika ta okazała się wszechstronna w genotypowaniu różnych komórek ssaków o różnym pochodzeniu tkankowym, do których kierowane są przewodnikowe RNA przeciwko licznym genom, jak pokazano tutaj i gdzie indziej.

Wprowadzenie

Odwrotne podejście genetyczne pozwoliło naukowcom wyjaśnić wpływ określonych zmian w genomie na komórkę lub cały organizm. Na przykład, ekspresja określonego genu może być osłabiona przez knockdown1,2 (częściowa redukcja) lub nokaut genu3,4 (całkowita ablacja) w celu określenia wpływu, jaki ma to na funkcję komórki lub na rozwój organizmu.

Eksperymenty z nokautem genów stały się łatwiejsze od czasu wprowadzenia programowalnych nukleaz specyficznych dla sekwencji, takich jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów nukleazy (TALENs). Jednak stosunkowo niedawna charakterystyka systemu CRISPR/Cas9 z regularnie przeplatanymi krótkimi powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR)/Cas9 sprawiła, że każde laboratorium na całym świecie może niezwykle łatwo przeprowadzać eksperymenty z nokautem genów. Zasadniczo system CRISPR/Cas9 składa się z dwóch podstawowych składników - pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA), który rozpoznaje i wiąże się poprzez komplementarność zasad z określoną sekwencją w genomie, oraz endonukleazy zwanej Cas9. Pokłosiem specyficznego wiązania i działania kompleksu sgRNA-Cas9 na genomowe DNA jest dwuniciowe rozszczepienie DNA. To z kolei uruchamia mechanizm odpowiedzi na uszkodzenie DNA w komórce, który jest następnie naprawiany za pośrednictwem niehomologicznych szlaków łączenia końców (NHEJ) lub rekombinacji homologicznej (HR). Ponieważ mechanizm naprawy NHEJ (ale nie mechanizm HR) często powoduje losową insercję lub delecję nukleotydów w miejscu naprawy, co skutkuje mutacjami insercji/delecji (indel), może to spowodować przesunięcie ramki odczytu eksonu. Może to następnie spowodować znokautowanie genu z powodu przedwczesnego zakończenia translacji i rozpadu, w którym pośredniczy nonsens5,6,7.

Pomimo wygody, jaką daje wprowadzenie systemu CRISPR/Cas9 w eliminowaniu genu, genotypowanie klonów docelowych komórek pozostaje wąskim gardłem, zwłaszcza w środowisku o wysokiej przepustowości8,9. Istniejące techniki albo mają poważne ograniczenia, albo są kosztowne finansowo. Na przykład test SURVEYOR lub T7E1, który jest testem enzymatycznym, który wykrywa niezgodności w dupleksach DNA10, nie jest w stanie odróżnić klonów typu dzikiego od mutantów homozygotycznych (klonów, których allele są identycznie zmutowane), ponieważ te klony mają identyczne allele, a zatem nie wykazują niezgodności w swojej sekwencji DNA11. Ponadto stosowanie sekwencjonowania Sangera, które jest uważane za złoty standard w genotypowaniu zmutowanych klonów, w konfiguracji o wysokiej przepustowości jest niepożądane ze względu na jego wysoki koszt. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół techniki fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej w żelu PCR, który może obejść ograniczenia innych istniejących technik genotypowania i jest szczególnie przydatny w przeprowadzaniu wysokoprzepustowego badania przesiewowego klonów nokautujących za pośrednictwem nukleazy. Ta metoda jest technicznie prosta do wykonania i oszczędza czas i koszty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Uzyskiwanie klonów jednokomórkowych ukierunkowanych na CRISPR/Cas9

  1. Wysiewaj komórki HEPG2 na 6-dołkowej płytce po 500 000 komórek na studzienkę w 2 ml bezantybiotykowego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Komórki transfekcyjne z plazmidem koeksprymującym Cas9 i specyficznym sgRNA przeciwko genowi będącemu przedmiotem zainteresowania przy użyciu odpowiedniego odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Na przykład, sgRNA można sklonować do wektora pSpCas9(BB)-2A-GFP, jak opisano wcześniej4.
  3. Zastąp pożywkę hodowlaną 4 - 16 godzin po transfekcji 2 ml świeżej pożywki wolnej od antybiotyków.
  4. Około 48 godzin po transfekcji zebrać zawiesinę jednokomórkową przez trypsynizację komórek.
    1. Trypsynizować komórki w 0,2 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 1 ml pożywki i dokładnie zawiesić.
  5. Posortuj komórki pod kątem klonów GFP-dodatnich, jak opisano wcześniej12, i zbierz około 3 500 komórek.
  6. Posortowane komórki z dodatnim wynikiem GFP ułożyć na 10-centymetrowych szalkach po 500, 1000 i 2000 komórek na szalkę w 8 ml pożywki hodowlanej uzupełnionej penicyliną/streptomycyną. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , wymieniając pożywkę co pięć dni, aż wyrosną w kolonie jednokomórkowe wystarczająco duże, aby były widoczne gołym okiem. W przypadku większości linii komórek rakowych trwa to około dwóch tygodni od dnia posiewu.
  8. Gdy kolonie są odpowiedniej wielkości (tj. widoczne gołym okiem), przenieś poszczególne kolonie do studzienek 96-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej 200 μl DMEM uzupełnionego 10% FBS.
    1. Odessać kolonie jednokomórkowe za pomocą pipety o pojemności 200 μl z niewielką objętością podłoża. Dokładnie zawiesić komórki w poszczególnych studzienkach, kilkakrotnie rozcierając.
  9. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , wymieniając pożywkę co pięć dni, aż osiągną 50 - 90% zbieżności. W przypadku większości linii komórek nowotworowych trwa to około 24 - 48 godzin.

2. Ekstrakcja surowego genomowego DNA metodą bezpośredniej lizy

  1. Gdy komórki osiągną 50-90% konfluencji, usuń jak najwięcej pożywki hodowlanej z dołków za pomocą wielokanałowego odsysania próżniowego lub wielokanałowej pipety.
  2. Dodać 25 μl 0,05% trypsyny-EDTA (bez czerwieni fenolowej) do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 7 minut.
  3. Dokładnie zawiesić trypsynizowane komórki, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że są oderwane od plastikowej powierzchni.
  4. Stworzyć replikę poszczególnych klonów, przenosząc około 5 μl zawiesiny jednokomórkowej na pustą 96-dołkową płytkę hodowlaną. Dodać 200 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki i utrzymywać komórki do momentu zidentyfikowania dodatnich klonów za pomocą fluorescencyjnej elektroforezy w żelu kapilarnym PCR (patrz poniżej). Stopniowo rozszerzaj komórki do 10-centymetrowych szalek lub dowolnej innej wybranej skali (patrz sekcja 7).
  5. Dodaj 5 μl zawiesiny jednokomórkowej z kroku 2.3 do 10 μl domowego buforu do bezpośredniej lizy (10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mM EDTA, 0,2 M NaCl, 0,15% SDS i 0,3% Tween-20)12 do 96-dołkowej płytki PCR i dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Krótko odwirować (aby sprowadzić ciecz na dno studzienek).
  6. Dodać 200 μl pożywki hodowlanej do pozostałych ~ 15 μl zawiesiny komórek z etapu 2.3 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , razem z powtórzoną formą z kroku 2.4.
  7. Poddawać lizaty z kroku 2.5 następującemu programowi cykli termicznych, aby zapewnić całkowitą lizę komórek i uwolnienie genomowego DNA: 65 °C przez 30 s, 8 °C przez 30 s, 65 °C przez 1,5 min, 97 °C przez 3 min, 8 °C przez 1 min, 65 °C przez 3 min, 97 °C przez 1 min, 65 °C przez 1 min i 80 °C przez 10 min. Krótko odwirować lizaty.
  8. Rozcieńczyć lizaty, dodając 40 μl wody wolnej od nukleaz i dokładnie wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego. Krótko odwirować. Rozcieńczone lizaty można zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy bez znaczącej utraty jakości.

3. Przeprowadzanie fluorescencyjnego PCR w celu wzmocnienia regionów docelowych CRISPR/Cas9

  1. Zaprojektuj dwa znakowane fluoroforem startery do przodu (oba oznaczone na końcu 5') dla każdego regionu docelowego CRISPR/Cas9; miejsca cięcia, które są oddalone od siebie o więcej niż 300 pz, należy traktować jako dwa oddzielne regiony docelowe (np. zielony starter znakowany fluoroforem do nieukierunkowanej kontroli typu dzikiego i niebieski starter znakowany fluoroforem dla klonów ukierunkowanych na CRISPR/Cas9; patrz tabela materiałów).
    1. Zaopatrz się odpowiednio w te oznakowane startery do przodu i nieoznakowane startery odwrotne. Należy pamiętać, że startery można zaprojektować przy użyciu dowolnego narzędzia, a amplikony powinny mieć długość 200 - 500 pz.
  2. Wykonaj PCR zgodnie z wcześniejszym opisem12, aby wzmocnić regiony docelowe za pomocą oznaczonych starterów.
    1. Użyć 3 μl rozcieńczonych lizatów z kroku 2.8 w reakcji 20 μl (patrz tabela 1) i następujący program cykli termicznych: 94 °C przez 10 min (1 cykl); 94 °C przez 10 s, 64 °C przez 30 s, 68 °C przez 1 min (4 cykle); 94 °C przez 10 s, 61 °C przez 30 s, 68 °C przez 1 min (4 cykle); 94 °C przez 10 s, 58 °C przez 30 s, 68 °C przez 1 min (4 cykle); 94 °C przez 10 s, 55 °C przez 30 s i 68 °C przez 1 minutę (35 cykli).
  3. Rozpuść 5 μl amplikonów PCR na 1% żelu agarozowym, aby sprawdzić wielkość i względną ilość amplikonów12.
    UWAGA: Wykonanie tego kroku dla wszystkich próbek jest zalecane, ale nie jest to konieczne; Rozdzielczość wybranej liczby próbek jest wystarczająca do oszacowania ogólnej ilości amplikonów obecnych w próbkach.

4. Przygotowanie próbek do elektroforezy w żelu kapilarnym

  1. Rozcieńczyć amplikony typu dzikiego (nieukierunkowane komórki rodzicielskie) i DNA ukierunkowane na CRISPR/Cas9 w wodzie wolnej od nukleaz do około 2,5 ng/μl. Upewnij się, że rozcieńczyłeś wystarczającą ilość próbki DNA typu dzikiego, aby została dodana do każdej docelowej próbki DNA (wymagane jest co najmniej 0,5 μl rozcieńczonej próbki typu dzikiego na docelową próbkę).
  2. Wymieszać rozcieńczone próbki DNA typu dzikiego i docelowego w równych proporcjach (np. zmieszać 1 μl próbki typu dzikiego z 1 μl próbki docelowej).
  3. Dodać 1 μl zmieszanych amplikonów do 8,7 μl dejonizowanego formamidu i 0,3 μl wzorca wielkości znakowanego barwnikiem na 96-dołkowej płytce PCR, która jest kompatybilna z analizatorem genetycznym.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie mieszanki wzorcowej formamidu i wzorca wielkości (tj. przygotowanie premiksu formamidu i wzorca wielkości w stosunku 29:1 przed dodaniem amplikonów w celu zapewnienia standaryzowanych ilości).
  4. Szczelnie zamknąć płytkę i podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 3 minuty za pomocą termocyklera PCR.
  5. Umieść płytkę na lodzie natychmiast po etapie podgrzewania i inkubuj przez co najmniej 3 minuty.

5. Wykonywanie elektroforezy w żelu kapilarnym na analizatorze genetycznym

  1. Skonfiguruj parametry testu, protokół instrumentu i protokół wywoływania rozmiaru w oprogramowaniu do elektroforezy kapilarnej w żelu podłączonym do analizatora genetycznego.
    UWAGA: Ten krok jest wymagany tylko w przypadku pierwszego uruchomienia elektroforezy; Program można zapisać do wykorzystania w przyszłości. W przypadku kolejnych uruchomień przejdź od razu do kroku 5.2.
    1. Kliknij ikonę "Utwórz nową płytę" na pulpicie nawigacyjnym oprogramowania.
    2. Nadaj przebiegowi fikcyjną nazwę i wybierz następujące opcje: Liczba studni, 96; Typ płyty, fragment; Długość kapilary, 50 cm; i polimer, POP7. Kliknij przycisk "Przypisz zawartość płyty".
    3. W sekcji "Testy" kliknij "Utwórz nowy test"; pojawi się nowy panel.
    4. Nazwij test "Test FPCR-CGE" i sprawdź, czy "Typ aplikacji" jest poprawnie ustawiony na "Fragment".
    5. Skonfiguruj protokół instrumentu, klikając przycisk "Utwórz nowy" w sekcji "Protokół instrumentu".
      1. Ustaw lub wybierz następujące opcje i parametry w odpowiednich obszarach: Typ aplikacji, Fragment; Długość kapilary, 50 cm; Polimer, POP7; Zestaw barwników, G5; Uruchom moduł, FragmentAnalysis; Nazwa protokołu, FPCR-CGE Instrument Protocol; Temperatura piekarnika, 60 °C; napięcie pracy, 19,5 kV; Napięcie wstępnego uruchomienia, 15 kV; napięcie wtrysku, 1,6 kV; Czas trwania, 1,330 s; Czas przed uruchomieniem, 180 s; Czas wtrysku, 15 s; i opóźnienie danych, 1 s.
    6. Kliknij przycisk "Zastosuj do testu", a następnie przycisk "Zapisz w bibliotece", aby zapisać program. Zamknij panel, aby kontynuować.
    7. Skonfiguruj protokół wywoływania rozmiaru, klikając przycisk "Utwórz nowy" w sekcji "Protokół wywoływania rozmiarów".
      1. Ustaw lub wybierz następujące opcje i parametry w odpowiednich obszarach: Nazwa protokołu, Protokół połączenia rozmiarów FPCR-CGE; Rozmiar standardowy, GS500(-250)LIZ; Size-caller, SizeCaller v1.1.0; Ustawienia analizy,-; Zakres analizy, pełny; Zakres rozmiarów, pełny; Metoda wywoływania rozmiaru, lokalna południowa; Szczyt podkładowy, obecny; Kanały niebieski, zielony, pomarańczowy (sprawdź); Minimalna wysokość piku, 175 dla wszystkich kanałów; Użyj wygładzania, brak; Użyj linii bazowej (okno linii bazowej (pkt)), (sprawdź) 51; minimalna połowa szerokości piku, 2; Wielkość okna szczytowego, 15; Stopień wielomianu, 3; Początek szczytu progu nachylenia, 0,0; Koniec szczytu progu nachylenia, 0,0; Ustawienia kontroli jakości, -; Jakość rozmiaru, -; Niepowodzenie, jeśli wartość wynosi <0,25; Pozostanie, jeśli wartość wynosi <0,75; Przyjmij liniowość od 0 pz do 800 pz; i aktywuj flagę Pull-Up, jeśli współczynnik podciągania ≤ 0,1 i skanowanie podciągania ≤ 1.
    8. Kliknij przycisk "Zastosuj do testu", a następnie przycisk "Zapisz w bibliotece", aby zapisać program. Zamknij panel, aby kontynuować.
    9. Upewnij się, że test został zapisany, klikając ponownie przycisk "Zapisz w bibliotece" i wyjdź z panelu, klikając przycisk "Zamknij".
    10. Wróć na stronę "Przypisz zawartość płyty" i kliknij łącze "Utwórz nową konwencję nazw plików" w sekcji "Konwencje nazw plików".
    11. Nazwij program "FPCR-CGE Nazwa pliku".
    12. W sekcji "Dostępne atrybuty" wybierz żądane atrybuty, które pojawią się w nazwie pliku (takie jak "Data uruchomienia", "Czas uruchomienia", "Pozycja odwiertu" i "Nazwa próbki"). Wybierz żądaną lokalizację pliku, w której będą przechowywane wyniki przebiegu.
    13. Kliknij przycisk "Zastosuj do testu", a następnie przycisk "Zapisz w bibliotece", aby zapisać program. Zamknij panel, aby kontynuować.
    14. Wróć na stronę "Przypisz zawartość płyty" i kliknij łącze "Utwórz nową grupę wyników" w sekcji "Grupy wyników".
    15. Nazwij program "Grupy wyników FPCR-CGE".
    16. W sekcji "Dostępne atrybuty" wybierz żądane atrybuty, które pojawią się w nazwie pliku (na przykład "Nazwa testu"). Wybierz żądaną lokalizację pliku, w której będą przechowywane wyniki przebiegu.
    17. Kliknij przycisk "Zastosuj do testu", a następnie przycisk "Zapisz w bibliotece", aby zapisać program. Zamknij panel, aby kontynuować.
  2. Skonfiguruj program do uruchomienia elektroforezy, wykonując poniższe czynności.
    1. Przejdź do deski rozdzielczej i kliknij ikonę "Utwórz nową płytę".
    2. Nazwij przebieg zgodnie z potrzebami (dla łatwego odniesienia dołącz datę, linię komórkową i nazwę genu). Wybierz następujące opcje: Liczba studni, 96; Typ płyty, fragment; Długość kapilary, 50 cm; i polimer, POP7. Kliknij przycisk "Przypisz zawartość płyty".
    3. Oznacz każdą studzienkę próbki zgodnie z potrzebami (np. próbka może być nazwana "NC", aby wskazać, że studzienka jest kontrolą ujemną).
    4. W polach "Testy", "Konwencje nazw plików" i "Grupy wyników" kliknij łącze "Dodaj z biblioteki" i wybierz programy utworzone w krokach od 5.1.3 do 5.1.17.
    5. Zaznacz wszystkie studnie do analizy i wybierz odpowiednie programy w sekcjach "Testy", "Konwencje nazw plików" i "Grupy wyników", zaznaczając pola obok nich.
  3. Przed załadowaniem płytki na tackę analizatora genetycznego nałóż gumową uszczelkę na płytkę 96-dołkową i umieść zapieczętowaną płytkę w plastikowej walizce dołączonej do analizatora genetycznego.
  4. Naciśnij przycisk "Tacka" z przodu analizatora genetycznego, a gdy tacka dotrze do przodu urządzenia, otwórz drzwi i załaduj zamkniętą płytkę na tacę. Upewnij się, że płyta jest zablokowana na swoim miejscu, a następnie zamknij drzwi.
  5. Kliknij przycisk "Połącz płytę do uruchomienia".
  6. Na stronie "Load Plates for Run" (Załaduj płyty do uruchomienia) wykonaj ostateczną kontrolę, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki i warunki są prawidłowe i w porządku.
  7. Kliknij przycisk "Rozpocznij uruchamianie". Każda seria 24 próbek (pierwsze dołki 3x8 płytki 96-dołkowej) zajmuje mniej niż 55 minut.

6. Analiza elektroferogramu w celu określenia różnic między parami zasad

  1. Po zakończeniu elektroforezy kapilarnej w żelu otwórz oprogramowanie analityczne, aby przeanalizować wyniki.
  2. Kliknij ikonę "Dodaj próbki do projektu" i wyszukaj folder zawierający pliki uruchamiania. Przypomnij sobie przypisaną lokalizację plików wyników z kroku 5.1.12.
  3. Zaznacz wszystkie pliki wyników każdego wstrzyknięcia w zakończonym przebiegu i kliknij przycisk "Dodaj do listy"; nazwy tych plików zaczynają się od "Inj" i zawierają szczegóły przebiegu.
  4. Kliknij przycisk "Dodaj i analizuj", aby kontynuować analizę.
  5. Wybierz wszystkie próbki w przebiegu, klikając pierwszą próbkę i przeciągając kursor w dół do ostatniej próbki, a następnie kliknij ikonę "Wyświetl wykresy".
  6. Aby sprawdzić jakość standardu rozmiaru, otwórz pomarańczowy kanał wyników, zaznaczając pomarańczową ikonę i odznaczając pozostałe kolorowe ikony; jest to ważne, aby upewnić się, że wywoływanie rozmiaru jest dokładne i niezawodne.
  7. Aby wyświetlić piki odpowiadające fragmentom pochodzącym z nieukierunkowanej kontroli i docelowych klonów, sprawdź niebieskie i zielone ikony, aby otworzyć odczyty z tych kanałów.
  8. Umieść kursor nad osią poziomą pierwszego wykresu wyników i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać "Pełny widok". Przewiń w dół, aby wyświetlić wszystkie wyniki na pierwszy rzut oka, aby określić, czy występuje jakiś poważny problem z przebiegiem. Aby powiększyć określony zakres wartości, kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiednią oś wykresu, wybierz "Powiększ do..." i wprowadź zakres interesujących Cię wartości.
    UWAGA: Jednym z potencjalnych poważnych problemów jest to, że wszystkie próbki dają piki o niskiej intensywności. Jest to zwykle spowodowane długotrwałym przechowywaniem amplikonów znakowanych fluoroforem przed przebiegiem elektroforezy kapilarnej lub nadmiernym rozcieńczeniem amplikonów, które można łatwo skorygować, powtarzając etap PCR lub rozcieńczając amplikony przy użyciu odpowiednio niższego współczynnika rozcieńczenia.
  9. Aby zapisać wyniki, wykonaj czynności opisane poniżej.
    1. Upewnij się, że niebieski i zielony kanał są zaznaczone i kliknij ikonę "Tabela rozmiarów".
    2. Zapisz tabelę wartości w formacie tekstowym rozdzielanym tabulatorami (.txt), otwierając "Plik" i wybierając "Eksportuj tabelę". Nazwij plik odpowiednio i wybierz żądaną lokalizację pliku.
    3. Aby zapisać wykresy przebiegu w formacie PDF, przejdź do "Plik" i kliknij opcję "Drukuj". Wybierz odpowiednią nagrywarkę PDF i naciśnij "Drukuj". Nazwij plik odpowiednio i wybierz żądaną lokalizację pliku.
  10. Aby obliczyć różnicę w rozmiarze fragmentów pochodzących z nieukierunkowanej kontroli typu dzikiego i klonów ukierunkowanych na CRISPR/Cas9, wykonaj czynności opisane poniżej.
    1. Otwórz plik tekstowy rozdzielany tabulatorami (.txt) z kroku 6.9.2 za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Tabela powinna zawierać te cztery ważne kolumny: "Barwnik/Pik próbki" (wskazujący niebieski lub zielony kanał), "Nazwa pliku próbki" (pierwsze znaki wskazują nazwę studni lub próbki), "Rozmiar" (wskazujący rozmiar wywoływanego fragmentu) i "Wysokość" (wskazujący intensywność fluorescencji piku).
    2. Aby wyodrębnić odpowiednie piki, wyklucz te, które nie mieszczą się w oczekiwanym zakresie rozmiarów.
      UWAGA: Zazwyczaj mutacje indel rzadko powodują różnicę wielkości większą niż 100 pz; W związku z tym wykluczone są piki, których wielkość różni się o więcej niż 100 pz od piku kontrolnego typu dzikiego (pik dominujący w kanale zielonym). Można to łatwo zrobić, korzystając z opcji "Pomiędzy" w funkcji "Formatowanie warunkowe" w arkuszu kalkulacyjnym.
    3. Aby usunąć niespecyficzne szczyty, które są nie do odróżnienia od poziomu tła, użyj opcji "Mniejsze niż" w funkcji "Formatowanie warunkowe" w programie arkusza kalkulacyjnego, aby wykluczyć szczyty, których wysokość jest mniejsza niż 2,000 jednostek. Ta wartość graniczna została określona empirycznie i dlatego może być dostosowana tam, gdzie zostanie to uznane za stosowne.
    4. Oblicz różnicę w wielkości fragmentu między każdym z wynikowych pików w kanale niebieskim (klony ukierunkowane na CRISPR/Cas9) a jedynym pikiem w kanale zielonym (nieukierunkowana kontrola typu dzikiego), odejmując ten drugi od pierwszego.
      UWAGA: Ważne jest, aby używać wartości przypisanych do każdej próbki elektroforezy kapilarnej, ponieważ mogą występować różnice między próbkami w wielkości fragmentu kontroli typu dzikiego.
    5. Zaokrąglij wartości do najbliższej liczby całkowitej, aby określić liczbę par zasad, które zostały wstawione lub usunięte z danej sekwencji genomowej, jeśli występują. Gdy wybicie genu jest interesujące, wybierz klony, których mutacje indel nie są wielokrotnościami 3 pz, aby upewnić się, że w sekwencji kodującej występuje przesunięcie ramki ramki.

7. Weryfikacja statusu nokautu klonów

  1. Rozszerz poszczególne klony z nokautem z płytki 96-dołkowej (z etapów 2.4 i 2.6) do płytki 24-dołkowej, trypsynizując komórki przy użyciu 25 μl 0,25% trypsyny-EDTA i inkubując w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  2. Dodać 125 μl pożywki (DMEM uzupełnionej 10% FBS) do trypsynizowanych komórek i dokładnie zawiesić.
  3. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć jak najwięcej pożywki za pomocą odsysania próżniowego lub pipety, ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl pożywki i przenieść zawiesinę komórek do dołka na płytce 24-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do momentu, gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji.
  5. Rozwiń kolejno poszczególne klony z płytki 24-dołkowej na płytkę 6-dołkową i z płytki 6-dołkowej do 10-centymetrowej płytki, gdy osiągną 80-90% konfluencji, powtarzając kroki od 7.1 do 7.4, używając następujących objętości: 50 μl 0,25% trypsyny-EDTA i 150 μl pożywki (do rozprężania z płytki 24-dołkowej do płytki 6-dołkowej) oraz 200 μl 0,25% trypsyny-EDTA i 1 ml pożywki (do rozszerzania z płytki 6-dołkowej na 10-centymetrową szalkę).
  6. Zbierz klony, gdy osiągną 80 - 90% konfluencji, trypsynizując komórki przy użyciu 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  7. Dodaj 5 ml pożywki (DMEM uzupełnionej 10% FBS) do trypsynizowanych komórek i dokładnie zawieś.
  8. Przenieść zawiesinę komórek równomiernie do dwóch probówek o pojemności 15 ml, odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć pożywkę tak bardzo, jak to możliwe. Jedna część komórek służy do ekstrakcji genomowego DNA, a druga do całkowitej ekstrakcji białka.
  9. Aby zweryfikować za pomocą sekwencjonowania Sangera, wykonaj czynności opisane poniżej.
    1. Wyodrębnij genomowe DNA z klonów, jak opisano wcześniej12.
    2. Przeprowadzić amplifikację PCR regionu obejmującego miejsce docelowe CRISPR/Cas9, jak opisano w sekcji 3.2, ale użyj nieznakowanych starterów. Na tym etapie nie należy używać znakowanych starterów, ponieważ fluorescencja z tagu będzie zakłócać kolejny etap sekwencjonowania Sangera.
    3. Oczyść amplikony za pomocą zestawu do czyszczenia PCR, jak opisano wcześniej12.
    4. Zsekwencjonuj oczyszczone amplikony za pomocą starterów PCR użytych w kroku 7.9.2, aby określić genotyp klonów, jak opisano wcześniej12.
  10. W celu weryfikacji za pomocą analizy Western blot należy wyekstrahować białko całkowite z komórek typu dzikiego i docelowych klonów, jak opisano wcześniej12.
    1. Przeprowadzić analizę Western blot przy użyciu odpowiednich przeciwciał przeciwko białku docelowego genu, jak opisano wcześniej12; prawdziwy klon nokautujący jest pozbawiony ekspresji białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisana tutaj technika fluorescencyjnej elektroforezy kapilarnej w żelu po PCR powinna znaleźć zastosowanie w przypadku dowolnego regionu genomu w niemal każdej linii komórkowej podatnej na dostarczanie obcego DNA. Wcześniej zademonstrowaliśmy jej zastosowanie poprzez celowanie w trzy geny w linii komórkowej raka jelita grubego12. W niniejszej pracy wykazujemy jej skuteczność w genotypowaniu linii komórkowej raka wątrobowokomórkowego HEPG2, w której zastosowano kon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyeliminowanie określonego genu w wybranej przez siebie modelowej linii komórkowej stało się rutyną w celu wyjaśnienia roli, jaką gen odgrywa w tym konkretnym kontekście komórkowym. W rzeczywistości obecnie dostępnych jest kilka badań przesiewowych całego genomu, które wykorzystują system CRISPR/Cas9 do celowania w praktycznie wszystkie znane ludzkie geny w genomie 14,15,16. W przypadku tych badań przesiewowych na dużą skalę (lu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Pani Tan Shi Min, Pani Helen Ong i Dr. Zhao Yi za pomoc w eksperymentach z elektroforezą w żelu kapilarowym. Prace te były wspierane przez grant NMRC/IRG NMRC/1314/2011 oraz grant MOE AcRF Tier 2 Fund MOE2011-T2-1-051.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki HEPG2ATCCHB-8065
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)Thermo Fisher ScientificSH30022.01
HyClone Płodowa surowica bydlęcaThermo Fisher ScientificSV30160.03
plazmid pSpCas9(BB)-2A-GFPAddgenePX458
Lipofectamina 2000Thermo Fisher Scientific
Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientific25200056
Trypsin-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejThermo Fisher Scientific15400054
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher Scientific 15140122
Hyclone Water, klasa biologii molekularnejGE HealthcareSH30538.02
CRISPR sgRNA insert oligonukleotyd (sense)AITbiotechBrakSekwencja: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'CRISPR
sgRNA insert oligonukleotyd (anty-sens)AITbiotechBrakSekwencja: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'Nieoznakowana
amplifikacja PCR do przodu starterAITbiotechBrakSekwencja: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; ten starter jest również używany do sekwencjonowania alleli amplifikowanych PCR
Fluorescencyjny starter PCR znakowany 6-FAMAITbiotechBrakSekwencja: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'znakowany
HEX fluorescencyjny starter PCR do przoduAITbiotechBrakSekwencja: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'Nieoznakowany
odwrócony starter PCRAITbiotechBrakSekwencja: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq
PCR Core KitQIAGEN201223
Hi-Di FormamidThermo Fisher Scientific4311320
GeneScan 500 LIZ Rozmiar barwnika StandardowyThermo Fisher Scientific4322682
MicroAmp Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjnaThermo Fisher Scientific4306737
3500xL Genetyczny AnalizatorThermo Fisher Scientific 4405633
3500 Series 2 programThermo Fisher Scientific4476988
Gene Mapper 5program Thermo Fisher Scientific4475073
Gentra Puregene Cell KitQIAGEN1045696
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up SystemPrzeciwciało PromegaA9282
NAP1L1 ( N-term)AbgentAP1920b
Jądrowe białko macierzy jądrowej p84 przeciwciało [5E10]GeneTexGTX70220
Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch111-035-144
Peroksydaza AffiniPure Owca Anti-Mysz IgGJackson ImmunoResearch515-035-003
11668027

Bibliografia

  1. Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312(2016).
  2. O'Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014).
  3. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
  4. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  5. Perez, E. E., et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).
  6. Santiago, Y., et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
  7. Sung, Y. H., et al. Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting. Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).
  8. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
  9. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509, 487-491 (2014).
  10. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).
  11. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).
  12. Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci. Rep. 5, 15587(2015).
  13. Liu, C. C., et al. Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy. Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).
  14. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
  15. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350, 1096-1101 (2015).
  16. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).
  17. Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
  18. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).
  19. Dahlem, T. J., et al. Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome. PLoS Genet. 8, e1002861(2012).
  20. Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9, 114632(2014).
  21. Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat. Commun. 5, 3157(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nokaut CRISPR Cas9wysokoprzepustowe genotypowaniewykrywanie mutacji typu indelprojektowanie starter wmatryca z lizatu kom rkowegoanaliza wielko ci fragment wsekwencjonowanie metod Sangeraanaliza Western blot
Wykorzystanie techniki fluorescencyjnej elektroforezy żelowej kapilarnej PCR do genotypowania mutantów nokautujących za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w formacie wysokoprzepustowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.