Artykuł metodologiczny

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

DOI:

10.3791/55587

⸱

12 maja 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Applied Stem Cell Technologies, University of Twente

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiomiocyty mogą być teraz uzyskiwane z dużą wydajnością zarówno z ludzkich embrionalnych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). Kardiomiocyty pochodzące z hPSC (hPSC-CMs) są coraz częściej uznawane za mające wielką wartość w modelowaniu chorób sercowo-naczyniowych u ludzi, zwłaszcza zespołów arytmii. Wykazały one również znaczenie jako systemy in vitro w przewidywaniu reakcji na leki, co czyni je potencjalnie przydatnymi w badaniach przesiewowych i odkrywaniu leków, farmakologii bezpieczeństwa, a być może ostatecznie w medycynie spersonalizowanej. Byłoby to ułatwione dzięki wyprowadzeniu hPSC-CM od pacjentów lub osób podatnych na zakażenie jako hiPSC. Jednak we wszystkich zastosowaniach precyzyjny pomiar i analiza właściwości elektrycznych hPSC-CM są niezbędne do identyfikacji zmian spowodowanych mutacjami kanałów jonowych serca i/lub lekami, które celują w kanały jonowe i mogą powodować nagłą śmierć sercową. W porównaniu z ręcznym zaciskiem krosowym, urządzenia z matrycą wieloelektrodową (MEA) mają tę zaletę, że umożliwiają zapisy o średniej i wysokiej przepustowości. Protokół ten opisuje, w jaki sposób dysocjować hodowle komórkowe 2D hPSC-CM na małe agregaty i pojedyncze komórki oraz umieszczać je na MEA, aby rejestrować ich spontaniczną aktywność elektryczną jako potencjał pola. Opisano tu również metody analizy zarejestrowanych danych w celu wyodrębnienia określonych parametrów, takich jak odstępy QT i RR. Zmian tych parametrów można oczekiwać w przypadku hPSC-CM zawierających mutacje odpowiedzialne za zaburzenia rytmu serca i po dodaniu specyficznych leków, co pozwoli na wykrycie tych, które niosą ze sobą ryzyko kardiotoksyczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają zdolność do samoodnawiania się i generowania praktycznie każdego typu komórek ludzkiego ciała poprzez różnicowanie1,2. Opisano szczegółowe protokoły dotyczące kierowania różnicowaniem hPSC na kilka linii serca (kardiomiocyty komorowe, przedsionkowe, kardiomiocyty podobne do rozrusznika serca)3,4,5,6,7. Kardiomiocyty są komórkami aktywnymi elektrycznie, a szczegółowa wiedza na temat ich aktywności elektrofizjologicznej może być niezwykle pouczająca dla zrozumienia rozwoju i chorób serca8. Specyficzne dla pacjenta kardiomiocyty pochodzące z hiPSC (hiPSC-CMs) zostały z powodzeniem wykorzystane do modelowania i badania cech komórkowych, molekularnych i elektrycznych kilku zaburzeń rytmu serca, w tym zespołu długiego odstępu QT (LQTS)9,10,11,12,13, zespół Brugadów14 i polimorficzny katoloaminergiczny częstoskurcz komorowy15,16. Ponadto do chorych hiPSC-CM dodano wiele leków, aby podsumować interwencję terapeutyczną i uratować komórkowe patologiczne fenotypy10,15,20,21,22. Niedawno opracowano platformy przesiewowe oparte na hiPSC-CM WT, w odpowiedzi na zapotrzebowanie na systemy ludzkie we wczesnych fazach odkrywania leków23,24,25 ponieważ kardiomiocyty gryzoni różnią się znacznie od ludzi pod względem ekspresji kanałów jonowych i biofizyki26.

W tym celu opracowywane i wdrażane są technologie odpowiednie dla aplikacji o średniej i wysokiej przepustowości. Obejmują one optyczne zapisy potencjału błonowego, stanów nieustalonych i odkształceń Ca2+, pomiary impedancji (jako pośrednia miara kurczliwości komórek) oraz pomiary potencjału pola zewnątrzkomórkowego (FP) (w celu przeglądu patrz odniesienie24). Urządzenia z matrycami wieloelektrodowymi (MEA) umożliwiają rejestrację sygnałów fal elektrycznych (lub FP) generowanych i kształtowanych przez monowarstwy lub małe skupiska kardiomiocytów. Kontur FP koreluje z potencjałem czynnościowym serca i w pewnym stopniu z zapisami elektrokardiogramu (EKG)27; zazwyczaj wykazują początkowy szybki skok w górę odpowiadający napływowi Na + i depolaryzacji błony (pik R / Q), fazę wolnej fali / plateau prawdopodobnie odpowiadającą napływowi Ca2 + oraz fazę repolaryzacji odpowiadającą dominującemu wypływowi K + (pik T). Perturbacja przebiegu FP może być skorelowana ze zmianami w określonych fazach potencjału czynnościowego28.

Chociaż zapisy potencjałów czynnościowych z zaciskami krosowymi mogłyby być bardziej pouczające, szczególnie dla parametrów takich jak prędkość ruchu w górę i spoczynkowy potencjał membranowy, ręczne pomiary nie są możliwe do przeprowadzenia eksperymentów na średnim i wysokim poziomie przepustowości, podczas gdy automatyczny zacisk krosowy został dopiero niedawno zastosowany do hPSC-CMs29. Ponieważ jednak długotrwałe zapisy na MEA pozwalają na badanie zarówno ostrego, jak i przewlekłego narażenia na związki, obecnie możliwe jest wykorzystanie platform hPSC-CM do badań przesiewowych leków, discovery24,30 oraz do farmakologii bezpieczeństwa31,32. To obietnica przyszłej medycyny precyzyjnej lub spersonalizowanej33.

Celem tego protokołu jest dostarczenie niezbędnych informacji do dysocjacji i powlekania hPSC-CM na chipach MEA oraz mierzenia ich FP. W tej procedurze każdy krok został zoptymalizowany, zapewniając optymalną przeżywalność i regenerację komórek po dysocjacji, optymalne przyleganie komórek do płytki MEA oraz standaryzowaną analizę i kwantyfikację parametrów. W szczególności wyjaśniono i zilustrowano procedurę zewnątrzkomórkowego zapisu FP, analizę odstępów QT i RR oraz ocenę działania leku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów i odczynników

  1. Przygotować pożywkę hodowlaną hPSC-CM przy użyciu niskoinsulinowej, albuminy surowicy bydlęcej, alkoholu poliwinylowego, niezbędnych lipidów (LI-BPEL) pożywki34,35,36, łącząc odczynniki opisane w Tabeli 1. Przefiltrować pożywkę przez filtr porowy 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  2. Przygotować ludzki roztwór podstawowy rekombinowanej fibronektyny, rozpuszczając 1 mg ludzkiej rekombinowanej fibronektyny w 5 ml sterylnej wody destylowanej do osiągnięcia stężenia 200 μg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Przygotuj 1% (w/v) roztwór detergentu enzymatycznego (patrz Tabela materiałów), aby pomóc w usunięciu resztek komórek z chipa mikromacierzy, rozpuszczając 1 g enzymatycznego detergentu w proszku w 100 ml ciepłej (~40-45 °C) dejonizowanej wody. Pozostawić roztwór do ostygnięcia i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego roku.

2. Sterylizacja chipów MEA (Rysunek 1A)

UWAGA: Dostępnych jest kilka różnych konfiguracji MEA, z formatami jedno- lub wielodołkowymi. Opisany tutaj protokół wykorzystuje pojedynczą komorę MEA zawierającą 60 elektrod rejestrujących w układzie siatki 8 x 8 (patrz tabela materiałów). Średnica elektrody wynosi 30 μm, a odległość między elektrodami 200 μm. Obecna jest również jedna elektroda referencyjna.

  1. Dokładnie spłucz chip wodą dejonizowaną.
  2. Umieść chipsy MEA w szklanej szalce Petriego, którą można sterylizować w autoklawie. Zawiń naczynie w folię aluminiową.
  3. Sterylizuj frytki w szybkowarze laboratoryjnym przez 6 minut. Poczekaj, aż naczynia ostygną przed otwarciem.
    UWAGA: Alternatywnie wióry można sterylizować, zanurzając je w 1 ml 80% (v/v) etanolu w temperaturze pokojowej na 15-30 minut.
  4. Umieść wióry w kapturze do hodowli komórkowych i wystawiaj powierzchnię na działanie światła UV przez około 30 minut.

3. Powlekanie wiórów MEA (Rysunek 1B i 1C)

  1. Umieść czyste frytki w standardowej sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 10 cm Ø.
  2. Dodać 8 ml sterylnej wody destylowanej do szalki Petriego, aby utworzyć wilgotną komorę, która zapobiegnie wyschnięciu małej objętości pożywki hodowlanej na chipie po umieszczeniu w inkubatorze.
  3. Użyj niestandardowych pierścieni z politetrafluoroetylenu (PTFE) (rysunek 1B), aby zapewnić posiew kardiomiocytów w środku chipa, gdzie znajduje się układ elektrod. (Pierścienie PTFE są wcześniej przechowywane w 80% etanolu.) W kapturze hodowlanym wyjmij pierścienie z etanolu, umieść je na sterylnej szalce Petriego bez pokrywki i pozwól pierścieniom wyschnąć w kapturze.
  4. Umieść suchy pierścień w jednym chipie MEA za pomocą pęsety sterylizowanej płomieniowo (Rysunek 1C).
    UWAGA: Alternatywnie użyj 80% etanolu do umycia pęsety i pozostaw do wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowych przed ich użyciem.
  5. Rozmrozić jedną podwielokrotność ludzkiej rekombinowanej fibronektyny (200 μg/ml w wodzie destylowanej) i rozcieńczyć w PBS z Ca2+ i Mg2+ do uzyskania roztworu roboczego 40 μg/ml. Pokryj elektrody, dodając 50 μl fibronektyny 40 μg/ml do wnętrza pierścienia.
    UWAGA: Powlekanie przy użyciu ludzkiej rekombinowanej fibronektyny zapewnia optymalne przyleganie hPSC-CM. Można jednak stosować inne rodzaje białek powlekających, takie jak fibronektyna bydlęca lub mieszaniny białek macierzy zewnątrzkomórkowej.
  6. Zamknąć pokrywę plastikowej szalki Petriego o średnicy 10 cm i ostrożnie przenieść szalkę zawierającą chip MEA do inkubatora. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C O/N.
  7. Przenieść naczynie zawierające chip MEA do okapu do hodowli komórkowych. Przed użyciem chipa MEA należy odessać 50 μl fibronektyny za pomocą pipety P200 lub systemu próżniowego w kapturze, bez przesuwania pierścienia PTFE. Na tym etapie użyj plastikowych końcówek. Upewnij się, że żadne ciała stałe (np. końcówki pipet) nie dotykają wnętrza naczynia, ponieważ może to spowodować uszkodzenie elektrod.
    UWAGA: Przedłuży to żywotność chipów MEA.
  8. Delikatnie dodać 950 μl podłoża LI-BPEL (patrz Tabela 1 i Tabela materiałów), upewniając się, że jest równomiernie rozprowadzone i że pierścień nie unosi się na wodzie. Włóż naczynie z powrotem do inkubatora.

4. Dysocjacja i poszycie hPSC-CMs (Rysunek 2)

UWAGA: Opisany tutaj protokół wykorzystuje hPSC-CM, które zostały zróżnicowane w hodowli jednowarstwowej za pomocą cytokin34 po ~18 dniach od rozpoczęcia różnicowania. Udowodniono jednak, że nadaje się do każdej hodowli 2D i 3D HPSC-CM. W przypadku stosowania zróżnicowanych kultur we wcześniejszych lub późniejszych punktach czasowych może być konieczne dostosowanie czasu inkubacji enzymu dysocjującego (patrz tabela materiałów). Poniższe objętości przeznaczone są dla pojedynczego dołka o formacie płytki 12-dołkowej (3,8cm2).

  1. Dobrze odessać pożywkę z kultury hPSC-CMs.
  2. Podczas pracy pod kapturem do hodowli tkankowej dodaj 1-2 ml / studzienkę PBS bez Ca2 + / Mg2 +, aby umyć kulturę. Zassać PBS.
  3. Dodać 500 μl/basenik enzymu dysocjacyjnego. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać 1 ml li-bpel/basenik w celu rozcieńczenia enzymu. Delikatnie odczepić monowarstwę hPSC-CMs, delikatnie drapiąc za pomocą pipety P1000. Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.
  5. Przepłukać studzienkę 1 ml li-bpel, aby zebrać wszystkie pozostałe komórki i grudki komórek.
  6. Dodaj kolejne 2-3 ml LI-BPEL, aby osiągnąć końcową objętość 5-6 ml i delikatnie pipetuj w górę i w dół 3-5 razy pipetą 5 mL, aby zdysocjować grudki komórek.
    UWAGA: Dysocjacja na pojedyncze komórki w tym momencie nie jest konieczna, ponieważ wpłynie na przeżycie komórek. Obecność małych skupisk zapewni wyższą żywotność komórek.
  7. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy 300 x g.
  8. Usunąć supernatant, starając się usunąć większość nadmiaru płynu, ale bez usuwania osadu komórkowego.
  9. Zawiesić osad komórkowy w 250 μL LI-BPEL (używając P1000 i pipetując bardzo delikatnie).
  10. Rozprowadzić ~50 μl zawiesiny komórek na MEA (można przygotować do 5 MEA z jednego dołka płytki 12-dołkowej), pipetując zawiesinę ogniwa bezpośrednio do środka pierścienia PTFE, na górze układu elektrod.
    UWAGA: Na tym etapie komórki są trudne do policzenia ze względu na obecność klastrów komórek, a całkowita liczba komórek na MEA może się znacznie różnić, w zależności od użytego źródła hPSC-CM. Podczas powlekania upewnij się, że chmura zdysocjowanych komórek pokrywa obszar elektrod.
  11. Ostrożnie przenieść MEA do inkubatora w temperaturze 37 °C i pozwolić komórkom przyłączyć O/N

5. Usuwanie pierścienia i odświeżanie medium (Rysunek 3)

  1. Po 1 dniu od posiewu ostrożnie zdejmij pierścień w sterylnym środowisku za pomocą sterylnej pęsety (Rysunek 3A-3B).
  2. Opłucz pierścień w 80% (v/v) etanolu i przechowuj go w probówce o pojemności 50 ml zawierającej świeży 80% (v/v) etanol.
  3. Delikatnie usuń 500 μl podłoża z chipa MEA i dodaj 500 μl świeżego LI-BPEL.
  4. Przenieść MEA do inkubatora w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Komórki powinny zacząć bić 1-7 dni po usunięciu pierścienia i zmianie podłoża (ryc. 3C).
  5. Zmierz aktywność elektryczną hPSC-CM na MEA 1-7 dni po usunięciu pierścienia.

6. Sprawdź jakość sygnału (Rysunek 4)

  1. Włącz komputer i uruchom pakiet oprogramowania powiązany z konfiguracją MEA: TCX-Control, MC_MEA Select i MC_Rack. Ustaw temperaturę na 37 °C w TCX-Control, aby rejestrować pomiary w temperaturze fizjologicznej.
  2. Wyjąć z inkubatora naczynie zawierające chip MEA. Otwórz pokrywkę, wyjmij chip MEA i umieść go na chusteczce, aby wchłonąć resztki wody.
  3. Ostrożnie przetrzyj zewnętrzne styki płytki chusteczką i wyczyść je bawełnianym wacikiem zwilżonym 100% (v/v) etanolem, aby usunąć wszelkie resztki wody lub zanieczyszczeń, które mogą powodować szum sygnału.
  4. Przenieś płytkę MEA do podgrzewanego (37 °C) stopnia głównego nagrywającego, aby wykryć spontaniczną aktywność (np. sprzęt: patrz Table of Materials; oprogramowanie: MC_Rack).
    1. Otwórz MC_Rack: Kliknij "Edytuj" → "Dodaj MC_Card", aby utworzyć nowy protokół. Użyj menu rozwijanego "Edytuj", aby dodać różne okna rejestratora i wyświetlacza do protokołu.
      UWAGA: Zalecana jest częstotliwość próbkowania co najmniej 10 kHz. Używany przez nas protokół zawiera jedno narzędzie Longterm Display Tool, z pełnym układem całego chipa MEA, oraz jeden sorter Spike Sorter, niezbędny do uchwycenia działania leku w czasie rzeczywistym. Wycięcie kolca jest dostrojone za pomocą "Pre Trigger" wynoszącego 20 ms, "Post Trigger" trwającego 800 ms i "Dead Time" wynoszącego 2 ms. Protokół można zapisać jako plik ".rck" i ponownie załadować przed rozpoczęciem eksperymentów.
  5. Uruchom protokół w trybie odtwarzania, klikając przycisk 'play'.
    UWAGA: W tym momencie możliwe jest ponowne załadowanie protokołu zapisanego w kroku 6.5. W MC_Rack załaduj protokół (rozszerzenie pliku .rck), klikając "Plik" → "Otwórz".
  6. Jeśli sygnały wykazują wyraźnie widoczne piki R i piki T, odczekaj 10-15 minut, aby zakończyć fazę adaptacji. Przykłady śladów dobrej i złej jakości pokazano na rysunku 4.
    UWAGA: Jeśli w żadnej z elektrod nie można wykryć piku T, nie kontynuuj eksperymentu. Zwykle jest to wynikiem słabej aktywności elektrycznej hPSC-CM lub słabego przyłączenia ogniw do elektrod.

7. Rozpocznij eksperyment i nagrywanie

  1. Kliknij "nagraj", a następnie "odtwórz" i zbieraj dane przez 10 minut w warunkach bazowych, aby określić stan ustalony. Opisz elektrody, które mają najlepszy sygnał, aby można je było łatwo zidentyfikować i później wyeksportować do analizy.
  2. W celu oceny odpowiedzi na lek należy dodawać rosnące stężenia leku co 10 minut. Na przykład dodać bloker hERG E4031 w końcowym stężeniu 1 μM. W tym celu należy usunąć 100 μl pożywki i dodać taką samą objętość 10 μM E4031 rozpuszczonego w pożywce.
    UWAGA: Jak wcześniej wykazali Cavero i współpracownicy31, mądry wybór objętości, w której leki są rozpuszczone, jest ważny, ponieważ może to głęboko zmienić krzywą odpowiedzi na lek
    3. .
  3. Powtórzyć krok 7.2 dla wszystkich pozostałych stężeń leku będących przedmiotem zainteresowania.
  4. Kliknij "stop", aby zakończyć nagrywanie na końcu protokołu.

8. Czyszczenie MEA do ponownego użycia

  1. Po zakończeniu nagrywania eksperymentu delikatnie usuń podłoże za pomocą pipety P1000. Nie dotykaj wnętrza naczynia, ponieważ może to spowodować uszkodzenie elektrod. Wyrzuć zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa.
  2. Opłucz frytki MEA wodą dejonizowaną za pomocą butelki do mycia i powtórz krok prania 3-4x.
    UWAGA: W tym momencie nie jest konieczne, aby ogniwa były całkowicie odłączone od chipa.
  3. Dodać 1 ml roztworu detergentu enzymatycznego 1% (v/v) do każdego dołka i inkubować O/N w temperaturze 4 °C, aby umożliwić oderwanie komórek i usunięcie komórek.
  4. Dzień później dokładnie spłucz wióry MEA wodą dejonizowaną, aby usunąć enzymatyczny roztwór detergentu i resztki komórek, a następnie dodaj 1 ml wody dejonizowanej. Czyste wióry MEA można przechowywać zanurzone w wodzie dejonizowanej o temperaturze 4 °C.

9. Eksport danych

  1. Otwórz oprogramowanie MC_Data Tool połączone z konfiguracją MEA.
  2. Kliknij "Plik" → "Otwórz MCD".
  3. Kliknij "Narzędzia" → "Konwertuj MCD na ABF".
  4. Wybierz elektrody z najlepszymi sygnałami rejestracyjnymi, które mają zostać wyeksportowane do analizy. Wybierz katalog, w którym chcesz zapisać wyeksportowane pliki i kliknij "Zapisz". Procedura eksportu może trwać kilka minut, w zależności od liczby wyeksportowanych elektrod i całkowitego rozmiaru plików zapisu.

10. Analiza danych

  1. Pobierz i zainstaluj program do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych (np. pClamp). Po zakończeniu uruchom oprogramowanie analityczne (np. Clampfit).
  2. Obliczanie interwału RR (rysunek 5).
    1. Umieść dwa pionowe kursory, aby zdefiniować obszar zainteresowania na trasie. Wybierz "Wykrywanie zdarzeń" → "Wyszukiwanie progowe". Kursor poziomy powinien przecinać wszystkie zdarzenia, które muszą zostać określone ilościowo, jak pokazano na rysunku 5A.
    2. Kliknij "OK", a następnie "Zaakceptuj całą kategorię". Następnie oprogramowanie przeszuka ślad w poszukiwaniu wszystkich odpowiednich zdarzeń. Nad wydarzeniami zostaną umieszczone niebieskie oznaczenia.
    3. Dostosuj czułość automatycznego wyboru, dostrajając parametry w głównym oknie wykrywania zdarzeń
      4. .
    4. Po automatycznej identyfikacji wszystkich zdarzeń przejdź do okna wyników (Okno → Wyniki) i skopiuj kolumnę zatytułowaną "Interwał interwału", która zawiera dane dotyczące częstotliwości (Rysunek 5B).
  3. Obliczanie odstępu QT (ryc. 6-9):
    1. Umieść jeden kursor tuż przed i jeden po pojedynczym FP w stanie ustalonym. Wybierz opcję "Wykrywanie zdarzeń" → "Utwórz szablon" (Rysunek 6).
    2. Sprawdź, czy FP jest poprawnie zidentyfikowany i kliknij "Dodaj". Szablon zostanie przeniesiony do dolnego panelu.
    3. Zapisz szablon jako plik ".atf". W ten sposób utworzono szablon śladu, który będzie przeszukiwany przez oprogramowanie przez cały czas trwania nagrania (rysunek 7). Utwórz jeden szablon dla każdego schorzenia, ponieważ działanie leku może zmienić kształt FP. W razie potrzeby nieznacznie przefiltruj ślad, aby uwzględnić maksymalnie 10 000 punktów w obrębie dwóch kursorów.
    4. Po zapisaniu szablonu z rozszerzeniem ".atf" wybierz "Wykrywanie zdarzeń" → "Wyszukiwanie szablonów" i załaduj szablon.
    5. Dostosuj "Próg dopasowania szablonu", aby poprawnie zidentyfikować wszystkie FP w wybranym interwale.
    6. Gdy wszystkie zdarzenia zostaną poprawnie zidentyfikowane, zapisz je w nowym pliku ".abf".
  4. Otwórz plik z oprogramowaniem analitycznym i automatycznie oblicz "czas szczytu" zarówno dla pików Q/R, jak i T (rysunki 8, 9). Jeśli ślady są bardzo głośne, zastosuj filtr. Oblicz odstęp QT, odejmując wartość Q/R od wartości T w wybranym edytorze arkuszy kalkulacyjnych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzień po dysocjacji i posiewaniu, warstwa hPSC-CMs będzie widoczna jako gęsty i biały film pokrywający środek komory MEA (Rysunek 3A). Po zdjęciu pierścienia (rysunek 3B) warstwa powinna pozostać na swoim miejscu, a badanie pod mikroskopem świetlnym pokaże, że elektrody MEA są pokryte (kurczącą się) warstwą hPSC-CM (rysunek 3C). Ze względu na fizyczne i elektryczne sprzężenie ogniw, do analizy zostanie użyta tylko jedna elektroda (złota elektroda).

Alternatywnie, podczas pracy ze strukturami 3D, takimi jak ciała embrionalne lub mikrotkanki, można je poszczepić tak, aby były fizycznie i elektrycznie rozłączone. Oględziny pod mikroskopem mogły potwierdzić brak fizycznego związku między gromadami, a niezsynchronizowane fale R w MEA potwierdzają brak sprzężenia elektrycznego. W takim przypadku można analizować wiele niezależnych elektrod.

Typowe nagrania śladów FP są pokazane na rysunku 4. W szczególności ślad dobrej jakości można zdefiniować przez obecność wyraźnego piku odpowiadającego napływowi Na+ i depolaryzacji błony (pik R/Q), wyraźnej fazie repolaryzacji odpowiadającej wypływowi K+ (pik T) oraz wysokiemu stosunkowi sygnału do szumu (Rysunek 4A, po lewej: zwróć uwagę na skalę osi y i rysunek 4B). Ślady złej jakości (Rysunek 4A, środek) mogą być wynikiem niepowodzenia połączenia hPSC-CM z płytką MEA lub słabej aktywności elektrycznej hPSC-CM. Odczekanie 1-3 dni na lepsze mocowanie może poprawić sygnał; jednakże, jeśli nie jest widoczna poprawa sygnału, zaleca się wykluczenie tego MEA z eksperymentów. Ślady zaszumienia (Rysunek 4A, po prawej) mogą być analizowane po filtrowaniu.

Udaną analizę interwału RR można stwierdzić poprzez wizualne oględziny ekranu pokazującego wykrywanie piku (Rysunek 5A, 5B). W przedziale czasu określonym przez pionowe kursory powinny znajdować się niebieskie znaki odpowiadające każdemu szczytowi. W przypadku, gdy program nie zidentyfikuje jednego lub więcej pików, spróbuj przesunąć kursor w poziomie i ponownie uruchomić analizę lub dostosować ustawienia wykrywania. Podobnie, pomyślną analizę odstępu QT można stwierdzić poprzez oględziny ekranu pokazującego wykrywanie FP (ryc. 7). W przedziale czasu określonym przez pionowe kursory powinny znajdować się niebieskie znaczniki odpowiadające każdemu wykryciu FP. W przypadku, gdy program nie zidentyfikuje co najmniej jednego FP, spróbuj ponownie zdefiniować szablon FP (Rysunek 6) lub dostosować ustawienia wykrywania i ponownie uruchomić analizę.

Wyodrębnione pojedyncze ślady FP lub ich średnia (Rysunek 8) mogą być użyte do uzyskania wartości odstępu QT z określonymi ustawieniami, jak na Rysunku 9. Analiza zależności QT-RR jest wskazana i ma znaczenie w przypadku chorych i WT linii hPSC (ryc. 10A) oraz w celu oceny potrzeby i/lub wpływu korekt odstępu QT (ryc. 10B-10D). hPSC-CM przenoszące mutacje powodujące LQTS mają wydłużone odstępy QT w porównaniu z kontrolami WT (Figura 11A). Leczenie hPSC-CM blokerem hERG powoduje wydłużenie odstępu QT (ryc. 11B); i odwrotnie, leczenie aktywatorem hERG powoduje skrócenie odstępu QT (ryc. 11C). Wreszcie, leczenie lekami wpływającymi na częstotliwość dudnienia hPSC-CM powinno być widoczne jako zmiana w interwale RR (Figura 11D, skrócenie odstępu RR).

figure-results-1
Rysunek 1: Sterylizacja i powlekanie wiórów MEA. (A) Schemat przedstawiający proces sterylizacji, w tym umieszczenie chipa MEA na szklanej szalce Petriego z możliwością sterylizacji w autoklawie, zawinięcie w folię aluminiową, gotowanie na parze przez 6 minut i wystawienie na działanie promieniowania UV przez 30 minut. (B) Widok z góry (lewy panel) i z boku (panel środkowy) niestandardowego pierścienia PTFE; pierścień ma średnicę zewnętrzną 1,2 cm, w tym 4 klapki, które umożliwiają jego ustawienie w środku chipa MEA, a średnica wewnętrzna wynosi 0,4 cm (prawy panel). (C) Schemat przedstawiający przygotowanie chipa MEA, w tym umieszczenie chipa na standardowej plastikowej szalce Petriego, dodanie 8 ml wody dejonizowanej na zewnątrz komory MEA, umieszczenie pierścienia PTFE w środku komory i pokrycie układu elektrod fibronektyną. Po czasie inkubacji fibronektyna jest usuwana i zastępowana pożywką hodowlaną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Dysocjacja i posiewanie hPSC-CM. Schemat przedstawiający procesy dysocjacji enzymatycznej, wirowania, ponownego zawieszania i powlekania hPSC-CMs w środku komory MEA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Chipy MEA z warstwą hPSC-CM. (A) Widok z góry chipa MEA zawierającego pierścień i warstwę hPSC-CM. (B) widok z boku chipa MEA po zdjęciu pierścienia. (C) Obraz w jasnym polu warstwy hPSC-CMs pokrytej na układzie mikroelektrod; 4-krotne powiększenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Rejestracja MEA hPSC-CM. (A) Reprezentatywne ślady zarejestrowane za pomocą MEA wykazujące ślad dobrej jakości z wyraźnie widocznymi pikami R/Q i T o wysokim stosunku sygnału do szumu (po lewej), ślad złej jakości bez wyraźnie widocznych pików R/Q i T (w środku) oraz ślad zaszumiony z wyraźnie widocznymi pikami R/Q i T, ale o niskim stosunku sygnału do szumu (po prawej). (B) Reprezentatywne przykłady dobrej jakości śladów FP o różnych morfologiach, które można zarejestrować podczas eksperymentów MEA z wykorzystaniem hPSC-CM. Zacieniony obszar reprezentuje odstęp QT zmierzony podczas analizy. Ponieważ FP w MEA przypomina pierwszą pochodną potencjału czynnościowego28, obliczyliśmy całkę śladu FP, pokazaną jako czerwona przerywana linia, jako teoretyczną demonstrację wyboru fali T bliskiej pełnej repolaryzacji potencjału czynnościowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Obliczanie interwału RR. (A) Przykład analizy interwałowej RR z automatycznym wykrywaniem pików (u góry) i ekstrakcją danych (u dołu) za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów). Kursory pionowe identyfikują interesujący nas przedział czasu, a kursor poziomy przecina wszystkie zdarzenia, które są wykrywane i identyfikowane za pomocą niebieskich znaczników. (B) Powiększona kolumna pokazuje wyodrębnione dane użyte do obliczenia przedziału RR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Tworzenie szablonu FP. Przykład wyboru szablonu za pomocą pionowych kursorów umieszczonych przed i po pojedynczym FP. Ten szablon służy do automatycznej identyfikacji FP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Automatyczna identyfikacja szablonu FP. Przykład wyszukiwania szablonów w interwale zdefiniowanym przez dwa pionowe kursory. Wszystkie wykryte zdarzenia są oznaczone niebieskimi znacznikami i są automatycznie nakładane na wstawkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Kwantyfikacja parametrów FP. Analiza zapisanych zdarzeń, przy czym pik R jest identyfikowany ręcznie w pierwszych dwóch kursorach, a pik T jest ręcznie identyfikowany w ciągu ostatnich dwóch kursorów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Okno analizy. Parametry używane w oknie Statystyki do wykrywania szczytu R. Aby wykryć pik T, zmień kursory i (jeśli to konieczne) polaryzację. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Zależność QT-RR. (A) Przykład różnej zależności między odstępami QT i RR między hPSC-CM WT (LQT1 corr) a zespołem długiego odstępu QT typu 1 (LQT1R190Q). Zacienione obszary pokazują, że to samo przesunięcie w odstępie RR generuje większe przesunięcie w odstępie QT chorej linii LQT1, co prawdopodobnie zwiększa podatność na arytmię. (B) Zależność między nieskorygowanymi odstępami QT i RR mierzonymi w MEA w CM z 7 różnych linii hPSC. Efekt korekcji odstępu QT dla wzorów Bazetta (C) lub Fridericii (D) jest pokazany i widoczny jako zmiana nachylenia zależności odstępu QT-RR. Rysunki zaczerpnięte z reference30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rycina 11: Zmiany odstępu QT i RR wywołane chorobą lub lekiem. (A) Przykład wydłużenia odstępu QT w hPSC-CM uzyskanego od pacjenta z mutacją zespołu długiego odstępu QT (LQTS) w porównaniu z izogeniczną kontrolą WT. (B) Przykład wydłużenia odstępu QT w hPSC-CM po farmakologicznym bloku hERG. (C) Skrócenie odstępu QT po leczeniu zwiększającymi się dawkami aktywatora hERG. Strzałka wskazuje kierunek skracania. (D) Przykład skrócenia odstępu RR wywołanego przez lek. Panel (C) został zaadaptowany z reference30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nisko-insulinowy, BSA, alkohol winylowy, niezbędne lipidy (LI-BPEL) Śred.
KomponentIlość na 100 ml
IMDM43 ml
F1243 ml
2-fosforan kwasu askorbinowego (5 mg/ml w wodzie destylowanej)1 ml
Suplement do hodowli komórkowych (bezpośredni substytut L-glutaminy)1 ml
Penicylina/Streptomycyna0,5 ml
Czerwień fenolowa1 mg
Hybrydoma bez białka Medium-II (PFHMII)5 ml
BSA (10% wag./obj. w IMDM)2,5 ml
PVA (5% wag./obj. w wodzie destylowanej)2,5 ml
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy (CDLC)1 ml
Insulina-Transferyna-Selen-Etanoloamina (ITS-X) 100X0,1 ml
α-Monotioglicerol (13 μL w 1 ml IMDM)0,3 ml
Połącz odczynniki, przefiltruj za pomocą filtra porowego 0,22 μm i przechowuj pożywkę w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.

Tabela 1: Skład medium Li-BBEL.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten pokazuje, jak dysocjować i przygotować hPSC-CM do pomiaru ich FP za pomocą MEA. hPSC-CM zwykle wykazują spontaniczną aktywność elektryczną, którą można zmierzyć jako FP i mogą dostarczyć istotnych danych w odniesieniu do częstotliwości dudnienia, czasu trwania odstępu QT i zdarzeń arytmicznych.

Dysocjacja 2D zróżnicowanych kultur serca jest potrzebna do odtworzenia warstwy dudnienia na MEA i stanowi krytyczny krok. Naprężenia mechaniczne spowodowane wielokrotnym pipetowaniem i/lub agresywnym leczeniem enzymami dysocjacyjnymi mogą powodować wysoką śmiertelność komórek, brak przyczepienia do płytki MEA i brak spontanicznej aktywności elektrycznej. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem kultur jednowarstwowych. Jednak podobne podejście można zastosować do kultur trójwymiarowych (3D) (np. ciał zarodkowych lub EB) z niewielkimi modyfikacjami, takimi jak pobieranie EB, a następnie płukanie PBS i dłuższy czas inkubacji z enzymem dysocjującym. Co ważne, zarówno w kulturach zróżnicowanych 2D, jak i 3D, im starsze są zróżnicowane komórki, tym dłuższy czas inkubacji może być wymagany do oderwania komórek z powodu zwiększonego odkładania się macierzy zewnątrzkomórkowej.

Opisany tutaj protokół do ilościowego określania parametrów FP może być wykorzystany do generowania krzywych dawka-odpowiedź dla leków kardioaktywnych. Jak niedawno opisali Cavero i wsp.31, początkowe stężenie leku może mieć głęboki wpływ na wynik pomiaru MEA. Dlatego, aby poprawić dokładność i wiarygodność wyników, sugerujemy, co następuje: 1) w przypadku nieodwracalnych aktywatorów/blokerów należy użyć stosunkowo dużych objętości pożywki zawierającej badany lek. Bardziej szczegółowo, usuń 10-50% objętości pożywki z chipa MEA i dodaj równą objętość podłoża, w którym lek został wcześniej rozpuszczony w odpowiednim stężeniu. W takim przypadku, aby obliczyć końcowe stężenie leku, należy wziąć pod uwagę zmianę stężenia po usunięciu pożywki. 2) W przypadku odwracalnych aktywatorów/blokerów należy dodać 10 μl każdej dawki leku z 100-krotnego roztworu podstawowego.

Większość protokołów różnicowania serca skutkuje zmienną mieszaną populacją kardiomiocytów węzłowych, przedsionkowych i komorowych, przy czym najbardziej reprezentowany jest typ komorowy. Może to stanowić ograniczenie podczas modelowania chorób serca wpływających na określony podtyp kardiomiocytów lub leków działających na kanały jonowe specyficzne dla podtypu serca. Chociaż w kilku badaniach zoptymalizowano warunki, aby skierować bardziej kontrolowaną specyfikację podczas różnicowania serca 3,5,37,38, ich szersze zastosowanie jest nadal badane.

Ponadto można zaobserwować zmienną efektywność różnicowania (w różnych doświadczeniach i w różnych liniach hPSC) 39,40,41,42,43,44. Strategie wzbogacania kardiomiocytów oparte na ekspresji białek powierzchniowych35,45 (przez sortowanie komórek wspomagane florescencją lub selekcję magnetyczną46,47) i selekcję metaboliczną44,48 mogą stanowić ważne strategie, które można zastosować do dowolnej (genetycznie zmodyfikowanej lub niezmodyfikowanej) linii hPSC przed posiewem hPSC-CM, w celu poprawy sygnału elektrycznego.

Chociaż hPSC-CM są notorycznie niedojrzałe w porównaniu z dorosłymi kardiomiocytami 4,49, okazały się cenne w rekapitulacji i identyfikacji specyficznych zmian związanych z chorobą (np. w kanałopatiach)19,20,50 i odpowiedzi wywołanych lekami (np. blokery kanałów jonowych serca)4,51. Co więcej, niedojrzałe komórki są łatwiejsze do dysocjacji i lepiej się regenerują niż dorosłe kardiomiocyty po dysocjacji i posiewie44, dlatego niedojrzałość hPSC-CM może być nagradzana jako zaleta w tym względzie. Jednak, aby móc podsumować np. choroby serca o późnym początku i wiernie odtwarzają odpowiedzi lekowe dorosłych kardiomiocytów, należy uzyskać bardziej dojrzały stan mechaniczny, metaboliczny i elektryczny hPSC-CM. Metody dojrzewania tych komórek obejmują wydłużony czas w hodowli52, naprężenie mechaniczne53, stymulację elektryczną54, dodanie małych cząsteczek55, hodowlę 3D56, wspólną hodowlę z innymi typami komórek57, a nawet kombinację tych podejść58; Do tej pory żadne z tych podejść nie doprowadziło do fenotypu podobnego do dorosłego.

W ramach cech niedojrzałości, hPSC-CM wykazują automatyzm elektryczny. W tym miejscu znajdują się szczegółowe informacje na temat dokładnego określania odstępów QT i RR. Jednym z ograniczeń pomiaru spontanicznej aktywności elektrycznej jest to, że porównanie odstępów QT może być trudne, gdy hPSC-CM wykazują różne częstotliwości dudnień. W takim przypadku można użyć wzorów Bazetta lub Fridericii w celu skorygowania odstępu QT dla danej częstotliwości. Jednak, jak wcześniej informowaliśmy30, zdecydowanie zalecamy przeprowadzenie analizy regresji osi głównej poprzez wykreślenie przedziału QT w funkcji odstępu QR zarówno dla danych surowych, jak i skorygowanych, aby wykluczyć wszelkie możliwe odchylenia wynikające z samej metody korekcji.

Przedstawiony tu protokół, wraz z wcześniej opisanymi metodami59,60, przyczynia się do standaryzacji procedur i analizy FP hPSC-CM, poprawiając odtwarzalność danych i umożliwiając lepsze porównanie wyników międzylaboratoryjnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.L.M. jest współzałożycielem i doradcą Pluriomics bv. Część kosztów publikacji została pokryta przez Multi Channel Systems.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez następujące granty: CVON (HUSTCARE): Holenderska Inicjatywa Badań Sercowo-Naczyniowych (Holenderska Fundacja Kardiologiczna, Holenderska Federacja Uniwersyteckich Centrów Medycznych, Holenderska Organizacja Badań i Rozwoju Zdrowia oraz Królewska Holenderska Akademia Nauk); Europejska Rada ds. Badań Naukowych (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC). Dziękujemy E. Giacomelli (LUMC) za pomoc w różnicowaniu serca metodą hPSC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora bezpieczeństwa biologicznego/okap z przepływem laminarnymSystem rejestracji Cleanair
MEA2100 in vitro Systemywielokanałowe
Inkubator kultur komórkowych CO2 WirówkaSanyoMCO-15A
Hitachihimac-CT6EL
Mikroskop stereoskopowy Leica MicrosystemsMS5
Pipeter ręczny (P-10 (10 μ L), P-200 (200 μ L), P-1000 (1,000 μ L))Gilson International
Końcówki filtrujące (10 μ L, 200μ L, 1,000μ L)Corning4807 (10 μ L), 4810 (200μ L), 4809 (1000μ L)
Jednorazowy filtr górny do butelki (0,22 i mu; m wielkość porów)MilliporeSCGVU02RE
Sterylna plastikowa pipetaGreiner Bio-One606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL)
PęsetaDumont
Autoklawowalne szalki PetriegoVWR/ Duran Group391-0860
MEASystemy wielokanałoweMEA200/30iR-Ti-gr
Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna (PBS) wapń, magnezThermo Fisher Scientific14040-091
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) bez wapnia, bez magnezuThermo Fisher Scientific14190-169
Ludzka rekombinowana fibronektynaTebu-BioJ64560
Wykonane na zamówienie pierścienie MEA z politetrafluoroetylenu (PTFE)LUMC: Dział Rozwoju
InstrumentówEnzym dysocjacyjny - TrypLE Select 1xThermo Fisher Scientific12563-029
Tergazyme detergent enzymatycznySigma-AldrichZ273287-1EA
Woda destylowanaThermo Fisher Scientific15230-089
NazwaCompanyNumer katalogowy Uwagi
>Odczynniki do podłoża LI-BPEL
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Thermo Fisher Scientific21056-023
F12 mieszanka odżywcza (szynka)Thermo Fisher Scientific31765-027
2-fosforan kwasu askorbinowegoSigma-AldrichA8960
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-038
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific15070-063
Phenol RedSigma-AldrichP3532
Bezbiałkowy hybrydoma Medium-II (PFHMII)Thermo Fisher Scientific12040-077
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Bovogen Biologicals AustraliaBSAS05
Poli(Alkohol winylowy) (PVA)Sigma-AldrichP8136
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy (CDLC)Thermo Fisher Scientific11905-031
Insulina-Transferyna-Selen-Etanoloamina (ITS-X) 100xThermo Fisher Scientific51599-056
&alfa;-MonotioglicerolSigma-AldrichM6145
NazwaCompanyWersja oprogramowaniaKomentarze
MC_RackSystemy wielokanałowe4.6.2Alternatywnie dane mogą być rejestrowane za pomocą Cardio2D lub MC_Experimenter (systemy wielokanałowe)
TCX ControlMulti Channel Systems1.3.4
MEA SelectMulti Channel Systemy1.3.0
MC_Data NarzędzieSystemy wielokanałowe2.6.15Alternatywnie, Multi Channel Data Manager (MultiChannel Systems) może być używany, gdy wymagany jest niestandardowy eksport danych (HDF5, EDF, etc.)
ClampfitMolecular Devices7.0.0Używany w kroku 10.1 do analizowania, tworzenia wykresów i formatowania wszystkich danych. Aby korzystać z Clampfit, pobierz i zainstaluj aplikację do zbierania danych elektrofizjologicznych i pClam (najnowsza wersja, 10.7.0), dostępną na stronie internetowej Molecular Devices. Po zakończeniu uruchom oprogramowanie Clampfit. Alternatywnie dane mogą być analizowane za pomocą Cardio2D (MultiChannel Systems) lub niestandardowego kodu MatLab.
Układ

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Birket, M. J., et al. Expansion and patterning of cardiovascular progenitors derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (9), 970-979 (2015).
  4. Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1728-1748 (2016).
  5. Devalla, H. D., et al. Atrial-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells are a robust preclinical model for assessing atrial-selective pharmacology. EMBO Mol Med. 7 (4), 394-410 (2015).
  6. Lewandowski, J., Kolanowski, T. J., Kurpisz, M. Techniques for the induction of human pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. J Tissue Eng Regen Med. , (2016).
  7. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  8. Davies, M. P., An, R. H., Doevendans, P., Kubalak, S., Chien, K. R., Kass, R. S. Developmental changes in ionic channel activity in the embryonic murine heart. Circ Res. 78 (1), 15-25 (1996).
  9. Bellin, M., et al. Isogenic human pluripotent stem cell pairs reveal the role of a KCNH2 mutation in long-QT syndrome. EMBO J. 32 (24), 3161-3175 (2013).
  10. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  11. Ma, D., et al. Modeling type 3 long QT syndrome with cardiomyocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells. Int J Cardiol. 168 (6), 5277-5286 (2013).
  12. Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471 (7337), 230-U120 (2011).
  13. Limpitikul, W. B., et al. A Precision Medicine Approach to the Rescue of Function on Malignant Calmodulinopathic Long QT Syndrome. Circ Res. , (2016).
  14. Liang, P., et al. Patient-Specific and Genome-Edited Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Elucidate Single-Cell Phenotype of Brugada Syndrome. J Am Coll Cardiol. 68 (19), 2086-2096 (2016).
  15. Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Mol Med. 4 (3), 180-191 (2012).
  16. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. J Cell Mol Med. 16 (3), 468-482 (2012).
  17. Bellin, M., Mummery, C. L. Inherited heart disease - what can we expect from the second decade of human iPS cell research. FEBS Lett. 590 (15), 2482-2493 (2016).
  18. Sallam, K., Li, Y., Sager, P. T., Houser, S. R., Wu, J. C. Finding the rhythm of sudden cardiac death: new opportunities using induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 116 (12), 1989-2004 (2015).
  19. Sinnecker, D., Goedel, A., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: a versatile tool for arrhythmia research. Circ Res. 112 (6), 961-968 (2013).
  20. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).
  21. Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacol Ther. 143 (2), 246-252 (2014).
  22. Terrenoire, C., et al. Induced pluripotent stem cells used to reveal drug actions in a long QT syndrome family with complex genetics. J Gen Physiol. 141 (1), 61-72 (2013).
  23. Abi-Gerges, N., et al. Assessment of extracellular field potential and Ca2+ transient signals for early QT/pro-arrhythmia detection using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Pharmacol Toxicol Methods. 83, 1-15 (2016).
  24. Del Alamo, J. C., et al. High throughput physiological screening of iPSC-derived cardiomyocytes for drug development. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1717-1727 (2016).
  25. Blinova, K., et al. Comprehensive Translational Assessment of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes for Evaluating Drug-Induced Arrhythmias. Toxicol Sci. , (2016).
  26. Nerbonne, J. M. Studying cardiac arrhythmias in the mouse--a reasonable model for probing mechanisms? Trends Cardiovasc Med. 14 (3), 83-93 (2004).
  27. Halbach, M., Egert, U., Hescheler, J., Banach, K. Estimation of action potential changes from field potential recordings in multicellular mouse cardiac myocyte cultures. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 271-284 (2003).
  28. Tertoolen, L. G., Braam, S. R., van Meer, B. J., Passier, R., Mummery, C. L. Interpretation of field potentials measured on a multi electrode array in pharmacological toxicity screening on primary and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochem Biophys Res Commun. , (2017).
  29. Rajamohan, D., et al. Automated Electrophysiological and Pharmacological Evaluation of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25 (6), 439-452 (2016).
  30. Sala, L., et al. A new hERG allosteric modulator rescues genetic and drug-induced long-QT syndrome phenotypes in cardiomyocytes from isogenic pairs of patient induced pluripotent stem cells. EMBO Mol Med. 8 (9), 1065-1081 (2016).
  31. Cavero, I., Guillon, J. M., Ballet, V., Clements, M., Gerbeau, J. F., Holzgrefe, H. Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA): Pending issues for successful validation and implementation. J Pharmacol Toxicol Methods. , (2016).
  32. Sala, L., Bellin, M., Mummery, C. L. Integrating cardiomyocytes from human pluripotent stem cells in safety pharmacology: has the time come? Br J Pharmacol. , (2016).
  33. Chen, I. Y., Matsa, E., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells: at the heart of cardiovascular precision medicine. Nat Rev Cardiol. 13 (6), 333-349 (2016).
  34. Dambrot, C., et al. Strategies for rapidly mapping proviral integration sites and assessing cardiogenic potential of nascent human induced pluripotent stem cell clones. Exp Cell Res. 327 (2), 297-306 (2014).
  35. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8 (12), 1037-1040 (2011).
  36. Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies. Nat Protoc. 3 (5), 768-776 (2008).
  37. Karakikes, I., et al. Small molecule-mediated directed differentiation of human embryonic stem cells toward ventricular cardiomyocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (1), 18-31 (2014).
  38. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21 (4), 579-587 (2011).
  39. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. 107 (21), 2733-2740 (2003).
  40. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 108 (3), 407-414 (2001).
  41. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  42. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  43. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).
  44. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  45. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  46. Fuerstenau-Sharp, M., et al. Generation of highly purified human cardiomyocytes from peripheral blood mononuclear cell-derived induced pluripotent stem cells. PLoS One. 10 (5), e0126596(2015).
  47. Schwach, V., Passier, R. Generation and purification of human stem cell-derived cardiomyocytes. Differentiation. 91 (4-5), 126-138 (2016).
  48. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  49. Veerman, C. C., Kosmidis, G., Mummery, C. L., Casini, S., Verkerk, A. O., Bellin, M. Immaturity of human stem-cell-derived cardiomyocytes in culture: fatal flaw or soluble problem? Stem Cells Dev. 24 (9), 1035-1052 (2015).
  50. Karakikes, I., Ameen, M., Termglinchan, V., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes. Circ Res. 117 (1), 80-88 (2015).
  51. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).
  52. Otsuji, T. G., Minami, I., Kurose, Y., Yamauchi, K., Tada, M., Nakatsuji, N. Progressive maturation in contracting cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: Qualitative effects on electrophysiological responses to drugs. Stem Cell Res. 4 (3), 201-213 (2010).
  53. Mihic, A., et al. The effect of cyclic stretch on maturation and 3D tissue formation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 35 (9), 2798-2808 (2014).
  54. Lieu, D. K., et al. Mechanism-based facilitated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Arrhythm Electrophysiol. 6 (1), 191-201 (2013).
  55. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. J Mol Cell Cardiol. 72, 296-304 (2014).
  56. Mannhardt, I., et al. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. , (2016).
  57. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  58. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  59. Clements, M. Multielectrode Array (MEA) Assay for Profiling Electrophysiological Drug Effects in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Curr Protoc Toxicol. 68 (22), 1-22 (2016).
  60. Harris, K. A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte (hiPSC-CM) Multielectrode Array Assay for Preclinical Cardiac Electrophysiology Safety Screening. Curr Protoc Pharmacol. 71, 1-15 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja potencja w polowychprotok dysocjacji kom rekanaliza odst pu QTpomiar odst pu RRzastosowanie w przesiewaniu lek wcharakterystyka elektrofizjologicznatechnika wysiewania kardiomiocyt wanaliza danych MEA

Powiązane artykuły